Souche de cellules et culture de virus.
La présente invention concerne la préparation d'une nouvelle souche de cellules, la culture de virus dans cette souche, ainsi que la préparation de vaccins à partir de ces virus.
Bien que l'on utilise fréquemment des cellules animales primaires comme milieux de culture pour la croissance des virus, on sait habituellement que ces cellules sont généralement inopportunes, car il est nécessaire de répéter la production des cultures à partir de tissus frais - ce qui est incommode du point de vue <EMI ID=1.1> tes pour la préparation industrielle de vaccins. De même,
les cellules primaires véhiculent fréquemment des impuretés bactériennes et virales.
Des recherches sont constamment effectuées afin de découvrir des lignes de cellules ou des souches
de cellules stables viables et économiquement appropriées pour la propagation des virus en vue de la préparation de vaccins humains et vétérinaires. On a trouvé un certain nombre de cultures de cellules, mais très peu d'entre elles sont acceptables pour l'une ou plusieurs raisons. Par exemple, certaines de ces cultures deviennent instables
après une certaine période et elles ne maintiennent pas des taux de croissance uniformes. D'autres acquièrent un potentiel de carcinogénèse. Pour certaines encore, les taux
de multiplication et les rapports de scission d'un passage
au suivant sont insatisfaisants.
On a trouvé une nouvelle souche de cellules que l'on peut soumettre à une culture et une sous-culture jusqu'à environ 35 passages sans observer aucun changement dans les caractéristiques, cette souche étant appropriée
pour la croissance d'un certain nombre de virus destinés
à la préparation de vaccins. La nouvelle souche de cellules de la présente invention est une souche de cellules diploldes dérivant de tissus embryonnaires de pommons canins.
Les cellules dérivent tout d'abord de poumons hachés dans
un milieu de croissance, de préférence, un milieu MEM
d'Eagle additionné de sérum de veau foetal et contenant
des antibiotiques, ainsi qu'un fongicide. On congèle la matière cellulaire maîtresse de la quinzième sous-culture
s et, à partir de cette matière cellulaire maîtresse, on
obtient des cultures de cellules après vingt passages sup- <EMI ID=2.1>
cultures étant conservées en vue d'études de caractérisation. Le doublement de la population de cellules lors de chaque passage a lieu entre 2-4 jours à 35-37[deg.]C.
Les caractéristiques suivantes (obtenues d'après des études effectuées sur des cellules provenant de la matière cellulaire maîtresse et de la matière cellulaire maîtresse + 20 passages) définissent la nouvelle souche de cellules de la présente invention :
1. Les cellules sont analogues à des fibroblastes.
2. Les cellules sont diploldes comme le démontre leur
caryologie.
3. Les cellules sont exemptes de bactéries, de champignons et d'agents viraux accidentels.
<EMI ID=3.1>
5. Le nombre modal de chromosomes diploïdes de 78 et les
tests d'immunofluorescence confirment que les cellules sont des cellules canines.
La présenta invention concerne également un
<EMI ID=4.1>
cellules diploldes de poumon canin foetal dans un milieu nutritif approprié pour la croissance d'un certain nombre de virus. De préférence, ce système de culture de cellules comprend du sérum de veau foetal. Une composition préférée du système de culture de cellules comprend un inoculum d'environ 4 x 10 cellules de poumon canin foetal dans
une solution comprenant environ 80 à 90 % de milieu MEM d'Eagle, environ 0,15 % de milieu BSS d'Earle avec
du bicarbonate et entre 10 et 20 % de sérum de veau
foetal (de préférence 20 %). On peut utiliser des milieux de cultures de tissus ayant d'autres formulations pour supporter les cellules de poumon canin foetal.
<EMI ID=5.1>
la présente invention peut être utilisé pour la culture de différents virus, notamment les rhabdovirus, par
<EMI ID=6.1>
les paramyxovirus, par exemple, le virus de parainfluenza type 3 et le virus de la maladie des chiens (souche de Cabasso) ; les orbivirus, par exemple, le virus de la
langue bleue et les virus herpès, par exemple, le virus de rhinotrachéite bovine infectieuse. En combinaison avec le milieu nutritif, la souche de cellules de la présente invention a démontré une nette supériorité vis-à-vis
d'un certain nombre d'autres lignes de cellules ou souches de cellules concernant son aptitude à supporter la croissance d'un certain nombre de virus, en particulier, le
virus rabique, en donnant des titres très élevés du
virus. De même, un intérêt particulier réside dans l'uti- lisation de ce système de culture de cellules pour la
<EMI ID=7.1>
propriês non seulement pour la médecine vétérinaire, mais également pour la médecine humaine.
La production de vaccins rentre également dans le cadre de la présente invention. Les virus cultivés à partir du système de culture de cellules de la présente invention sont soumis à un traitement complémentaire en vue d'obtenir des vaccins par des procédés connus dans la technique. Dès lors, le produit final d'une culture de-virus peut être utilisé tel quel ; de même, il peut Être atténué ou rendu inactif par n'importe quel procédé connu afin d'obtenir une matière antigène non pathogène que l'on peut incorporer sous une forme de dosage administrable comme vaccin afin de stimuler la production d'anti- <EMI ID=8.1> forme de dosage peut contenir des préparations appropriées pour l'administration intranasale, orale ou parentérale et elle peut contenir des adjuvants physiologiquement
<EMI ID=9.1>
que des sels et/ou des agents tampons.
La souche de cellules de poumon canin
<EMI ID=10.1>
"American Type Culture Collection", Rockville, Maryland
20852, sous le No. A.T.C.C. CL-175.
<EMI ID=11.1>
des exemples ci-après:
<EMI ID=12.1>
On hache finement le tissu de poumon obtenu d'un foetus femelle prélevé dans des conditions aseptiques chez une chienne ayant atteint à peu près son 50ème jour de gestation, on le soumet à une trypsinisation pendant
5 minutes à 37[deg.]C en utilisant une solution de trypsine
à 0,25 %, puis on le laisse croître dans un flacon de
75 cm<3> dans un milieu constitué de 89,85 % de milieu
MEM d'Eagle dans 0,15 % de milieu BSS d'Earle avec du bicarbonate de sodium (1,43 g/1) additionné de 10 %
de sérum bovin foetal. On incorpore des antibiotiques
(pénicilline, 100 unités/ml, et streptomycine, 100 mcg/ml), de même qu'un fongicide (amphotëricine B, 2,5 mcg/ml).
<EMI ID=13.1>
35-37[deg.]C entre deux et trois jours. Après la trypsinisation et la culture dans le même milieu pendant deux passages supplémentaires, on obtient une meilleure croissance
des cellules en portant la teneur en sérum bovin foetal
<EMI ID=14.1>
la quinzième sous-culture, on modifie davantage .le milieu <EMI ID=15.1>
les cellules obtenues dans la quinzième sous-culture
afin d'obtenir une matière cellulaire maîtresse d'ensemencement que l'on utilise dans le même milieu modifié et que l'on .soumet à une sous-culture pendant 20 passages supplémentaires (matière cellulaire maîtresse + 20). Ensuite, on caractérise les cellules du quinzième passage
(matière cellulaire maîtresse) et les cellules du 35ème passage (matière cellulaire maîtresse + 20).
Les cellules du quinzième passage et du
35ème passage sont toutes deux analogues à des fibroblastes et elles sont exemptes de levure, de bactéries et de champignons suivant les déterminations conformes à la norme P-72 du "United States Department of Agriculture
(USDA) Animal & Plant Health Inspection Service, APHIS, Veterinary Services (antérieurement "Veterinary Biologics Services" (VBS) (= Ministère de l'Agriculture des EtatsUnis d'Amérique, Service d'Inspection Sanitaire des Animaux et des Plantes, Service Vétérinaire (antérieurement Service Biologique Vétérinaire).
Les résultats de 1 ' analyse des chromosomes des cellules sont indiqués dans le tableau Ici-après:
ces résultats démontrent que les cellules sont des cellules canines et ils révèlent également la rétention du caryotype diplolde.
<EMI ID=16.1>
<EMI ID=17.1>
<EMI ID=18.1> .............
norme VBS- P-72 démontrent que les cellules sont exemptes d'agents viraux accidentels.
<EMI ID=19.1>
et d'oncogénicité sur des hamsters stressés à la cortisone conformément à la norme VBS P-72, annexe B, publiée par "The Veterinary Biologics Division of the USDA, 1er juillet 1970." On n'a observé aucune formation de tumeur et l'on n'a détecté aucune anomalie dans les poches des joues, non plus que dans les organes des cavités du corps des hamsters. L'essai de détermination de cellules non canines par la technique d'immuno-fluorescence suivant la norme VBS P-72, annexe D, publiée le ler juillet 1970, a confirmé l'identité canine de la souche de cellules et a démontré l'absence de contamination par des espèces de cellules hétérologues utilisées concurremment dans les laboratoires de la demanderesse.
EXEMPLE 2. Procédé général de culture de virus dans la
souche de cellules.
On infecte des cellules de tissus embryonnaires de poumons canins en suspension ou après formation d'une monocouche confluente dans des récipients de culture tels que des tubes ou des flacons de 907 grammes. Dans les récipients de culture contenant les cellules, on ajoute des virus en dilution appropriée, par exemple, sous
<EMI ID=20.1>
représentant une multiplicité d'infection de 0,0001 à 1,0. Si l'on ajoute le virus aux cellules en suspension, il faut
<EMI ID=21.1>
virus dilue que l'on ajoute aux monocouches de cellules, reste en contact avec les cellules pendant une période comprise entre 0,5 et 1 heure à 34-37[deg.]C afin que l'adsorp- tion puisse avoir lieu.
<EMI ID=22.1>
croissance constitué d'environ 80-85 % de milieu MEM
<EMI ID=23.1>
environ 0,15 %, additionnée de 15 à 20 % de sérum de veau foetal, fournit les éléments nutritifs nécessaires pour permettre la formation de monocouches. L'exclusion d'impuretés microbiennes est favorisée par la présence de combinaisons de formulations antibiotiques telles'que
100 unités de pénicilline/ml et 100 mcg de streptomycine/
ml ou 30 unités de néomycine/ml et 30 unités de polymyxine/ ml plus 2,5 mcg d'amphotéricine/ml. On règle le pH du milieu de croissance et de maintien par l'addition de tarapon HEPES 0,01 M et de bicarbonate de sodium à 0,19 %.
Après incubation à 34-37[deg.]C pendant une période suffisante pour permettre la reproduction virale,
on récolte des fluides infectés lorsque, dans le cas de virus cytolytiques, 70 à 90 % des cellules infectées exercent un effet cytopathogène typique. Pour les virus non cytolytiques, les fluides infectés sont récoltés lorsqu'on
a atteint le maximum de croissance virale comme indiqué
par des titrages préalables de courbes de croissance, soit spécifiquement 2-7 jours après l'infection. On peut également envisager des cycles multiples de récoltes vi- rales de fluides infectés dans le cas de virus non ; cytolytiques en éliminant le milieu usé, en ajoutant un milieu frais et en poursuivant l'incubation des cellules infectées jusqu'à ce qu'on ait atteint un nouveau maximum
de croissance virale en 1-3 jours.
EXEMPLE 3. Culture de rhabdovirus dans la souche de
cellules.
Afin d'adapter des rhabdovirus au système
de culture de cellules, on cultive des souches PV-12 ou
HEP Flury de virus rabique dans des cellules de tissus <EMI ID=24.1> afin de préparer un virus d'ensemencement. Trois ou quatre jours après l'infection des cellules en suspension, lorsque les essais aux anticorps fluorescents indiquent
10 à 50 % de cellules fluorescentes, on détache les cellules infectées de la paroi en verre du récipient de culture avec une solution de trypsine/acide éthylènediamine-tétracétique et on les remet en suspension dans le milieu de croissance. On ajoute les cellules provenant de chaque récipient de culture utilisé dans le premier cycle de croissance dans chacun des deux récipients de
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
les essais aux anticorps fluorescents auxquels on soumet les cellules infectées, indiquent une valeur de 100 %
de cellules positives aux antigènes rabiques. On récolte les fluides infectés, on les rassemble et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Les titres de ces récoltes
<EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
lules.
On prépare le virus de parainfluenza type
3 à partir de cellules ATCC pu-=15 infectées de virus, cette matière représentant 3-4 transferts de culture de tissu
du virus. Quatre à six jours après l'inoculation des cultures de cellules de tissus embryonnaires de poumons canins, les cellules manifestent une nette dégénérescence au moment de leur récolte. On rassemble les cellules et les fluides et on les conserve en parties aliquotes.â
-70[deg.]C. Les titres de ces récoltes de virus se situent <EMI ID=29.1>
de culture de tissu).
<EMI ID=30.1>
de la maladie des chiens (souche de Cabasso) à partir
de suspensions d'embryons de poulets à infection virale, cette matière représentant 40-45 transferts de souscultures du virus. Trois à quatre jours après l'inoculation de la suspension de cellules de tissus embryonnaires de poumons canins, les cellules présentent une certaine dégénérescence au moment de leur récolte. On rassemble
les cellules et les fluides et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Les titres de ces récoltes de virus
<EMI ID=31.1>
EXEMPLE 5. Culture du virus herpès dans la souche de
cellules.
On prépare le virus de rhinotrachéite bovine infectieuse à partir de cellules primaires infectées de reins de bovidés, cette matière représentant 3-4 transferts de culture de tissus du virus. Quatre à six jours après l'inoculation des cultures de tissus embryonnaires de poumons canins, environ 75 % des cellules sont affectées au moment de leur récolte. On rassemble les cellules et les fluides et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Le titrage des récoltes de virus indique spécifiquement un intervalle de
<EMI ID=32.1>
EXEMPLE 6. Culture d'orbivirus dans la souche de cellules.
On prépare le virus de la langue bleue à partir d'une suspension d'embryons de poulets à infection virale, cette matière représentant 45-50 transferts de sous-cultures du virus. Quatre à sept jours après l'inoculation des cultures de tissus embryonnaires de poumons canins, environ 75 % des cellules sont affectées au moment <EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Le titrage des récoltes de virus indique spécifiquement un intervalle de 105,0 à 106,5 TCID50/ml.
REVENDICATIONS
1. Système de culture de cellules approprié pour la production de virus, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules diploldes d'une souche de cellules de poumon canin foetal dans un milieu de culture nutritif.
2. Système de culture de cellules suivant
Cell strain and virus culture.
The present invention relates to the preparation of a new strain of cells, the culture of viruses in this strain, as well as the preparation of vaccines from these viruses.
Although primary animal cells are frequently used as culture media for the growth of viruses, it is usually known that these cells are generally inconvenient, since it is necessary to repeat the production of cultures from fresh tissue - which is <EMI ID = 1.1> inconvenient from the point of view of industrial vaccine preparation. Likewise,
primary cells frequently carry bacterial and viral impurities.
Research is constantly being done to discover cell lines or strains
viable and economically suitable stable cells for the propagation of viruses for the preparation of human and veterinary vaccines. A number of cell cultures have been found, but very few are acceptable for one or more reasons. For example, some of these cultures become unstable
after a certain period and they do not maintain uniform growth rates. Others acquire a potential for carcinogenesis. For some still, the rates
multiplication and split ratios of a pass
to the next are unsatisfactory.
A new strain of cells has been found which can be cultured and subcultured to about 35 passages without observing any change in characteristics, this strain being suitable.
for the growth of a number of viruses intended
to the preparation of vaccines. The novel cell strain of the present invention is a diploid cell strain derived from embryonic tissues of canine pommons.
The cells first derive from chopped lungs in
growth medium, preferably MEM medium
Eagle with fetal calf serum and containing
antibiotics, as well as a fungicide. The master cell material of the fifteenth subculture is frozen
s and, from this master cellular material, we
obtains cell cultures after twenty sup- <EMI ID = 2.1>
cultures being kept for characterization studies. The doubling of the cell population with each passage takes place between 2-4 days at 35-37 [deg.] C.
The following characteristics (obtained from studies performed on cells from master cell material and master cell material + 20 passages) define the novel cell strain of the present invention:
1. Cells are like fibroblasts.
2. The cells are diploid as demonstrated by their
karyology.
3. The cells are free from bacteria, fungi and accidental viral agents.
<EMI ID = 3.1>
5. The diploid chromosome modal number of 78 and the
Immunofluorescence tests confirm that the cells are canine cells.
The present invention also relates to a
<EMI ID = 4.1>
Fetal canine lung diploid cells in a nutrient medium suitable for the growth of a number of viruses. Preferably, this cell culture system comprises fetal calf serum. A preferred composition of the cell culture system comprises an inoculum of about 4 x 10 fetal canine lung cells in
a solution comprising about 80 to 90% Eagle's MEM medium, about 0.15% Earle's BSS medium with
bicarbonate and between 10 and 20% calf serum
fetal (preferably 20%). Tissue culture media having other formulations can be used to support fetal canine lung cells.
<EMI ID = 5.1>
the present invention can be used for the culture of various viruses, in particular rhabdoviruses, by
<EMI ID = 6.1>
paramyxoviruses, for example, parainfluenza virus type 3 and dog disease virus (Cabasso strain); orbiviruses, for example, the
blue tongue and herpes viruses, for example, infectious bovine rhinotracheitis virus. In combination with the nutrient medium, the cell strain of the present invention has demonstrated a clear superiority over
a number of other cell lines or cell strains relating to its ability to support the growth of a number of viruses, in particular,
rabies virus, giving very high titers of
virus. Likewise, of particular interest lies in the use of this cell culture system for the
<EMI ID = 7.1>
properties not only for veterinary medicine, but also for human medicine.
The production of vaccines is also within the scope of the present invention. Viruses cultivated from the cell culture system of the present invention are subjected to further processing to obtain vaccines by methods known in the art. Therefore, the final product of a virus culture can be used as it is; likewise, it can be attenuated or made inactive by any known method in order to obtain a non-pathogenic antigenic material which can be incorporated in a dosage form administrable as a vaccine to stimulate the production of anti- <. EMI ID = 8.1> dosage form may contain preparations suitable for intranasal, oral or parenteral administration and it may contain physiologically adjuvants
<EMI ID = 9.1>
as salts and / or buffering agents.
Canine lung cell strain
<EMI ID = 10.1>
"American Type Culture Collection", Rockville, Maryland
20852, under No. A.T.C.C. CL-175.
<EMI ID = 11.1>
examples below:
<EMI ID = 12.1>
Lung tissue obtained from a female fetus taken under aseptic conditions from a female dog having reached approximately her 50th day of gestation is finely chopped, subjected to trypsinization for
5 minutes at 37 [deg.] C using a trypsin solution
at 0.25%, then allowed to grow in a flask of
75 cm <3> in a medium consisting of 89.85% medium
Eagle MEM in 0.15% Earle's BSS Medium with sodium bicarbonate (1.43 g / l) added to 10%
of fetal bovine serum. We incorporate antibiotics
(penicillin, 100 units / ml, and streptomycin, 100 mcg / ml), as well as a fungicide (amphotericin B, 2.5 mcg / ml).
<EMI ID = 13.1>
35-37 [deg.] C between two and three days. After trypsinization and cultivation in the same medium for two more passages, better growth is obtained.
cells by carrying the fetal bovine serum content
<EMI ID = 14.1>
the fifteenth subculture, the medium is further modified <EMI ID = 15.1>
the cells obtained in the fifteenth subculture
in order to obtain a seeding master cell material which is used in the same modified medium and which is subcultured for an additional 20 passages (master cell material + 20). Then, we characterize the cells of the fifteenth passage
(master cellular material) and 35th passage cells (master cellular material + 20).
The cells of the fifteenth passage and
Passage 35 are both fibroblast-like and free from yeast, bacteria and fungi according to United States Department of Agriculture P-72 standard determinations.
(USDA) Animal & Plant Health Inspection Service, APHIS, Veterinary Services (formerly "Veterinary Biologics Services" (VBS) (= United States Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Veterinary Service (formerly Veterinary Biological Service).
The results of the chromosome analysis of the cells are shown in the table below:
these results demonstrate that the cells are canine cells and they also reveal the retention of the diploid karyotype.
<EMI ID = 16.1>
<EMI ID = 17.1>
<EMI ID = 18.1> .............
VBS-P-72 standard demonstrate that cells are free from accidental viral agents.
<EMI ID = 19.1>
and oncogenicity in hamsters stressed to cortisone according to VBS P-72, Appendix B, published by "The Veterinary Biologics Division of the USDA, July 1, 1970." No tumor formation was observed and no abnormalities were detected in the pockets of the cheeks, nor in the organs of the body cavities of the hamsters. The assay for the determination of non-canine cells by the immunofluorescence technique according to VBS P-72, Appendix D, published July 1, 1970, confirmed the canine identity of the cell strain and demonstrated the absence of contamination by heterologous cell species used concurrently in the applicant's laboratories.
EXAMPLE 2. General method of culturing viruses in the
cell strain.
Canine lung embryonic tissue cells are infected either suspended or after formation of a confluent monolayer in culture vessels such as tubes or 907 gram flasks. In the culture vessels containing the cells, viruses are added in appropriate dilution, for example, under
<EMI ID = 20.1>
representing a multiplicity of infection of 0.0001 to 1.0. If the virus is added to the cells in suspension, it is necessary
<EMI ID = 21.1>
Dilute virus, which is added to the cell monolayers, remains in contact with the cells for a period of 0.5 to 1 hour at 34-37 [deg.] C so that adsorption can take place.
<EMI ID = 22.1>
growth consisting of approximately 80-85% MEM medium
<EMI ID = 23.1>
about 0.15%, supplemented with 15-20% fetal calf serum, provides the necessary nutrients to allow the formation of monolayers. The exclusion of microbial impurities is favored by the presence of combinations of antibiotic formulations such as
100 units of penicillin / ml and 100 mcg of streptomycin /
ml or 30 units of neomycin / ml and 30 units of polymyxin / ml plus 2.5 mcg of amphotericin / ml. The pH of the growth and maintenance medium is adjusted by the addition of 0.01 M tarapon HEPES and 0.19% sodium bicarbonate.
After incubation at 34-37 [deg.] C for a period sufficient to allow viral reproduction,
Infected fluids are harvested when, in the case of cytolytic viruses, 70-90% of the infected cells exert a typical cytopathic effect. For non-cytolytic viruses, infected fluids are harvested when
has reached maximum viral growth as indicated
by prior titrations of growth curves, specifically 2-7 days after infection. Multiple cycles of viral harvests of infected fluids can also be considered in the case of non-virus; cytolytics by removing spent medium, adding fresh medium and continuing to incubate infected cells until a new maximum is reached
of viral growth in 1-3 days.
EXAMPLE 3. Culture of rhabdovirus in the strain of
cells.
In order to adapt rhabdoviruses to the system
cell culture, PV-12 strains or
HEP Flury of rabies virus into tissue cells <EMI ID = 24.1> to prepare seed virus. Three or four days after infection of the suspension cells, when fluorescent antibody tests indicate
10 to 50% fluorescent cells, the infected cells are detached from the glass wall of the culture vessel with a solution of trypsin / ethylenediaminetetraacetic acid and resuspended in the growth medium. Cells from each culture vessel used in the first cycle of growth are added to each of the two culture vessels.
<EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
fluorescent antibody tests to which infected cells are subjected show a value of 100%
cells positive for rabies antigens. The infected fluids are harvested, pooled and stored in aliquots at -70 [deg.] C. The titles of these harvests
<EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1>
lules.
The typical parainfluenza virus is prepared
3 from virus infected ATCC pu- = 15 cells, this material representing 3-4 tissue culture transfers
virus. Four to six days after inoculation of the canine lung embryonic tissue cell cultures, the cells show marked degeneration upon harvest. Cells and fluids are pooled and stored in aliquots.
-70 [deg.] C. The titers of these virus crops are <EMI ID = 29.1>
tissue culture).
<EMI ID = 30.1>
of dog disease (Cabasso strain) from
suspensions of virally infected chickens embryos, this material representing 40-45 transfers of virus subcultures. Three to four days after inoculation with the suspension of canine embryonic lung tissue cells, the cells show some degeneration at the time of harvest. We gather
cells and fluids and stored in aliquots at -70 [deg.] C. The titles of these virus crops
<EMI ID = 31.1>
EXAMPLE 5. Culture of the herpes virus in the strain of
cells.
Infectious bovine rhinotracheitis virus is prepared from infected primary cells of bovine kidneys, this material representing 3-4 tissue culture transfers of the virus. Four to six days after inoculation of embryonic canine lung tissue cultures, approximately 75% of the cells are affected at the time of harvest. Cells and fluids are pooled and stored in aliquots at -70 [deg.] C. The titration of the virus harvests specifically indicates an interval of
<EMI ID = 32.1>
EXAMPLE 6. Culture of orbivirus in the cell strain.
Blue tongue virus is prepared from a suspension of virally infected chicken embryos, which material represents 45-50 virus subculture transfers. Four to seven days after inoculation of embryonic canine lung tissue cultures, approximately 75% of cells are affected at time <EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
and stored in aliquots at -70 [deg.] C. Titration of the virus harvests specifically indicates a range of 105.0-106.5 TCID50 / ml.
CLAIMS
A cell culture system suitable for virus production, characterized in that it comprises diploid cells of a fetal canine lung cell strain in a nutrient culture medium.
2. Following cell culture system