Nouvelles substances antifongiques, leur préparation et le compositions qui les contiennent.
1
La présente invention concerne un nouveau a, ô-di ami no acide désigné
<EMI ID=1.1>
<EMI ID=2.1>
sous forme de son sel interne, de ses sels d'addition avec les acides et de ses sels avec les métaux alcalins ou alcalino-terreux et le lactame correspondant,
<EMI ID=3.1>
<EMI ID=4.1>
éventuellement sous forme de sel d'addition avec les acides, leur préparation et les compositions qui les contiennent.
Le 32 232 RP et le 35 391 RP présentent un intérêt tout particulier par suite de l'activité qu'ils manifestent sur les champignons et levures.
Le 32 232 RP, sous forme de sel interne, est caractérisé par les propriétés physiques suivantes :
- aspect : poudre amorphe blanche
- solubilité : facilement soluble dans l'eau, très peu soluble dans le méthanol et le diméthylformamide et pratiquement insoluble dans l'acétone (selon la. Pharmacopée française)
- point de fusion : (déterminé au bloc Maquenne) = 281[deg.]C.
La structure du 32 232 RP a été déterminée à partir des résultats suivants :
- composition centésimale :
<EMI ID=5.1>
- osmométrie : la masse moléculaire, déterminée par osmométrie dans l'eau à <EMI ID=6.1>
- titrage potentiométrique ; le titrage potentiométrique d'une solution aqueuse <EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
que est voisin de 390.
Le titrage potentiométrique d'une solution aqueuse de 32 232 RP au moyen de soude 0,1 M permet de mettre en évidence une fonction acide faible dont le pKa apparent est 9,8. L'équivalent potentiométrique est voisin de 400.
Le titrage potentiométrique d'une solution de 32 232 RP dans l'acide acétique au moyen d'acide perchlorique 0,01 M dans l'acide acétique permet de mettre en évidence la présence d'un équivalent basique voisin de 130. Cette valeur est compatible, pour une masse moléculaire de 390, avec la présence de 3 fonctions basiques par molécule.
- spectre ultra-violet : détermination'à partir d'une solution à 10,35 mg/1 dans du tampon phosphate à pH 7 (0,1 M en ions phosphates).
17
<EMI ID=9.1>
1cm
Le spectre est représenté par la figure 1.
- spectre infra-rouge : (détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr) Ce spectre est représenté par la figure 2 sur laquelle on a porté en abscisses, d'une part les longueurs d'ondes exprimées en microns (échelle
<EMI ID=10.1>
en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau I, on indique les principales bandes d'absorption infra-rouge pour ce produit exprimées en nombre
<EMI ID=11.1>
TABLEAU I
<EMI ID=12.1>
- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton dans l'eau lourde :
ce spectre, qui est représenté par la figure 3, a été enregistré sur un spectro-
<EMI ID=13.1>
dans -l'eau lourde. Il présente les caractéristiques suivantes (les déplacements chimiques sont comptés positivement en p.p.m. vers les champs faibles par rapport au TMS pris en référence externe) :
<EMI ID=14.1>
D'après ce spectre, l'antibiotique 32 232 RP contient 14 protons non échangeables*
- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton dans le diméthylsulfoxyde hexadeutérié : ce spectre, qui est représenté par la figure 4, a été enregistré sur un spectromètre CAMECA TSN-250 à la fréquence de 250 MHz à partir d'une solution à 44 mg/ml dans le diméthylsulfoxyde hexadeutérié. Il présente les caractéristiques suivantes (les déplacements chimiques sont comptés positivement en p.p.m. vers les champs faibles par rapport au TMS pris en référence interne) :
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
Ces spectres, qui ont été enregistrés sur un spectromètre CAMECA TSN-250 à la fréquence de 62,86 MHz à partir d'une solution dans l'eau lourde contenant une trace de dioxanne pris en référence interne, présentent des caractéristiques qui sont rassemblées dans le tableau suivant (les déplacements chimiques sont comptés positivement vers les champs faibles à partir du TMS ; le.dioxanne pris en référence interne donne dans le spectre totalement découplé un singulet compté à 66,59 ppm. par rapport au TMS) :
<EMI ID=17.1>
- spectre de résonance magnétique nucléaire du C dans le diméthylsulfoxyde hexadeutérié : ce spectre a été enregistré sur un spectromètre WH 90 Bruker à la fréquence de 22,63 MHz à partir d'une solution à 133 mg/ml dans le diméthylsulfoxyde hexadeutérié.
Il'présente les caractéristiques suivantes (les déplacements chimiques sont mesurés positivement vers les champs faibles par <EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1>
<EMI ID=20.1>
de carbone qui se répartissent en 4 atomes de carbone quaternaire (-�-),
<EMI ID=21.1>
- méthanolyse chlorhydrique : la méthanolyse chlorhydrique du 32 232 RP permet de mettre en évidence la présence d'adénine dans la molécule du.32 232 RP.
- migrations chromatographiques : Le 32 232 RP peut être caractérisé par chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice fluorescente
(254'nm) en utilisant divers mélanges de solvants. Après développement, le chromatogramme est examiné à 254 nm ou révélé par pulvérisation de ninhydrine dans un mélange de 20 cm3 d'acétone et de 1 cm3 d'acide acétique ; après chauffage, le 32 232 RP se révèle en mauve. Les mélanges de développement sont : <EMI ID=22.1> <EMI ID=23.1>
il peut être dilue :
<EMI ID=24.1>
Le lactame 35391 RP présente les propriétés physiques suivantes :
- aspect : poudre microcristalline blanche <EMI ID=25.1>
La* structure du 35 391 RP a été déterminée à partir des résultats suivants :
- composition centésimale voisine de
<EMI ID=26.1>
- titrage potentiométrique : le titrage potentiométrique d'une solution aqueuse de 35 391 RP au moyen d'acide chlorhydrique 0,1 M permet de mettre en évidence une fonction basique dont le pKa apparent est 7,7. L'équivalent potentiométrique est voisin de 370.
- spectre ultra-violet : détermination à partir d'une solution à 9,8.mg/1 dans du tampon phosphate à pH.7 (0,1 M en ions phosphates)
Le 35 391 RP présente un'maximum d'absorption à 258 nm
<EMI ID=27.1>
Le spectre est représenté par la figure 5.
<EMI ID=28.1>
KBr).
Ce spectre est représenté par la figure 6 sur laquelle on a porté en abscisses, d'une part, les longueurs d'ondes exprimées en microns (échelle
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
Dans le tableau II, on indique les principales bandes d'absorption
<EMI ID=31.1>
TABLEAU II '
<EMI ID=32.1>
- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton dans le diméthylsulfoxyde <EMI ID=33.1>
caractéristiques suivantes (les déplacements chimiques_-sont comptés positi-
<EMI ID=34.1>
-interne).
<EMI ID=35.1>
Ce spectre montre que le 35 391 RP contient 14 protons non-échangeables.
<EMI ID=36.1> hexadeutérié : ce spectre a été enregistré sur un spectromètre. WH 90 Bruker à la fréquence de 22,63 MHz à partir d'une solution à 135 mg/cm3 dans le diméthylsulfoxyde hexadeutérié. Il présente les caractéristiques suivantes
<EMI ID=37.1>
les champs faibles par rapport au diméthylsulfoxyde hexadeutérié pris en référence interne à 39,5 p.p.m. du TMS et dans le tableau suivant ces déplacements sont exprimés en p.p.m. par rapport au TMS pris comme zéro).
<EMI ID=38.1>
Ce spectre montre que le 35 391 RP contient 15 atomes de carbone à savoir 4 atomes dé carbone quaternaire, 8 atomes de carbone tertiaire et 3 atonies de carbone secondaire.
- spectre de masse : en spectrométrie de masse en impact électronique on <EMI ID=39.1>
363, 1666 ; valeur calculée 363, 1655). Les fragments caractéristiques de la molécule de 35 391 RP sont : <EMI ID=40.1> la 16 2 4 (valeur trouvée : 228, 1102 ; valeur calculée 228, 1110)
-C 7 H 8 N 5 0 (valeur trouvée : 178, 0729 ; valeur calculée 178, 0729) <EMI ID=41.1>
- migrations chromatographiques : le 35 391 RP peut être caractérisé par chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice fluorescente (254 nm) en utilisant divers mélanges de solvants et en examinant le chromatpgramme à
254 nm après développement. Les mélanges de développement sont : <EMI ID=42.1>
Le 32232 RP et le 35391 RP sont, d'une manière générale, dépourvus d'activité bactériostatique vis-à-vis des bactéries.
<EMI ID=43.1> supérieure à 1000 mg/kg par voie orale et le 35 391 RP est atoxique à la dose de 1000 mg/kg par voie orale ou sous-cutanée.
- activité antifongique in vitro : L'activité antifongique du 32232 RP et du
35391 RP vis-à-vis d'un certain nombre de champignons a été déterminée par une des méthodes de dilution couramment employées à cet effet. Pour chaque champignon, on a déterminé la plus petite concentration de substance active qui, dans des conditions définies, entraîne 95 à 100 % d'inhibition du champignon <EMI ID=44.1>
tableau III ci-dessous où les concentrations minimales actives sont exprimées
<EMI ID=45.1>
TABLEAU III
<EMI ID=46.1>
TABLEAU III (suite)
<EMI ID=47.1>
- activité antifongique in vivo :
Sur la candidose généralisée, à Candida albicans, de la souris,
<EMI ID=48.1>
orale ou sous-cutanée à des doses comprises entre 25 mg/kg et 200 mg/kg par jour pendant 4 jours consécutifs.
<EMI ID=49.1>
appropriés d'un nouveau microorganisme identifié plus complètement ci-après, appartenant au genre Streptomyces et désigné par l'appellation Streptomyces incarnatus DS 26068.
<EMI ID=50.1>
Streptomyces qui a été isolée à partir d'un échantillon de terre prélevée en Inde, et à laquelle a été attribué le numéro DS 26068. Cet organisme
a été déposé au Northern Régional Research Laboratory de l'U.S. Department
<EMI ID=51.1>
le numéro NRRL 8089. Des échantillons peuvent être fournis par ce laboratoire à toute personne se référant à la publication du présent document.
L'isolement en a été effectué ensuivant la méthode générale qui consiste à mettre une petite quantité de terre en suspension dans de l'eau distillée stérile, à diluer la suspension à.différentes concentrations, et
à étaler un petit volume de chaque dilution sur la surface de boites de Pétri
<EMI ID=52.1>
<EMI ID=53.1>
veut isoler pour en poursuivre l'étude sont prélevées et repiquées sur des géloses nutritives afin d'en obtenir des cultures plus abondantes.
<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
Ses sporophores sont en grappes. En général ses chaînes de spores sont longues, comprenant jusqu'à plusieurs dizaines de spores, et montrent un certain degré de polymorphisme, certaines étant droites où plus ou moins flexueuses, d'autres se recourbant en forme de crochet ou même s'enroulant en décrivant une spirale plus ou moins ouverte de un à occasionnellement quelques tours. Par son mode de sporulation, Streptomyces incarnatus DS 26068 se situe dans la Section Retinaculum Apertum de la classification de Pridham.
<EMI ID=56.1>
37[deg.]C, mais pas à 50[deg.]C. Il présente.un mycélium aérien sporulé de couleur rose clair.
La coloration de son mycélium végétatif va, suivant les milieux, de jaune brun ou brun jaune à brun très foncé. Il donne en général une produc-
<EMI ID=57.1>
particulier sur la gélose spéciale tyrosine- extrait de levure de Waksman
(Melanin formation medium) ; sur les milieux synthétiques gélosés il produit le plus souvent du pigment soluble brun, plus ou moins foncé suivant le cas.
Dans ses cultures, effectuées à 26[deg.]C, il présente les caractères biochimiques suivants :
<EMI ID=58.1>
Les caractères culturaux de Streptomyces incarnatus PS 26068 sont
<EMI ID=59.1> <EMI ID=60.1>
tives et des bouillons habituellement utilisés pour déterminer les caractères morphologiques des souches de streptomyces, les cultures sur milieux gélosés étant effectuées sur des géloses inclinées. Un certain nombre des milieux de culture employés ont été préparés d'après les formules indiquées dans "The Actinomycetes", S.A. WAKSMAN, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950 ; dans ce cas ils sont indiqués par la lettre W suivie
du numéro qui leur a été attribué dans "The Actinomycetes". Les références
ou constitutions des autres milieux de culture sont les suivantes :
- Réf. A. "Hickey and Tresner's Agar"-T.G. PRIDHAM et col.- Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950
- Réf. B. "Bennett's Agar" - S.A. WAKSMAN - The Actinomycètes, vol. 2, p. 331, n[deg.] 30 - The Williams and Wilkins Company,.Baltimore, 1961. <EMI ID=61.1>
- Réf. D. "Yeast Extract Agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual
1956 - 1957, p. 950
- Réf. E. "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G.PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 950 <EMI ID=62.1> p. 333 - n[deg.] 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961
- Réf.G. W.E. GRUNDY et col. - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952
- Réf. H. "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 951
- Réf. I. W.E. GRUNDY et col. - Antibiotics and Chem. 1, 310, 1951
- Réf.
J. correspond à la formule W-1, ou 30 g de saccharose sont remplacés par 15 g de glucose <EMI ID=63.1> par 15 g. de glycérine
- Réf. L. correspond à la formule W-18, où 30 g de saccharose sont remplacés par 15 g.. de glucose <EMI ID=64.1> placé par de petites bandes de papier filtre immergées partiellement dans le liquide. <EMI ID=65.1> <EMI ID=66.1> du fabricant. <EMI ID=67.1>
<EMI ID=68.1>
TABLEAU IV
(Voir pages ; 26 - 27 - 28 - 29)
La capacité de Streptomyces incarnatus DS 26068 à utiliser diverses sources de carbone et d'azote pour assurer son développement a été
<EMI ID=69.1>
Bact. 56, 107-114, 1948) ; le degré de développement a été observé, après un
<EMI ID=70.1>
auteurs en remplaçant soit le glucose par les diverses sources de carbone res-
<EMI ID=71.1>
tivement essayées. Les résultats sont indiqués dans le tableau V suivant :
TABLEAU V
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
Streptomyces incarnatus DS 26068 présente un ensemble de caractères qui ne coïncide exactement avec aucun de ceux des souches déjà décrites, et c'est pourquoi on doit le considérer comme une espèce nouvelle.
Eh considérant les espèces décrites dans "The Actinomycetes"
<EMI ID=74.1>
ainsi que dans le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7ème édition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957), l'espèce dont Streptomyces incarnatus DS 26068 se rapprocherait le plus est Streptomyces venezuelae qui, comme lui, forme des pigments mélaniques sur les milieux organiques, présente un mycélium végétatif allant de jaune à brun suivant les milieux de culture, et un mycélium aérien sporulé de couleur rose. Toutefois, il doit être distingué de cette espèce dont le séparent un certain nombre de différences qui sont indiquées dans le tableau VI ci-après :
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
M.v.= mycélium végétatif M.a.= mycelium aérien
Le procédé de préparation du 32232 Ri consiste essentiellement à cultiver Streptomyces incarnatus DS 26068 ou ses mutants producteurs, sur un milieu et dans des conditions appropriés et à séparer le produit formé au cours de la culture.
La culture de Streptomyces incarnatus DS 26068 peut être effectuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont d'un usage courant dans l'industrie des fermentations.
<EMI ID=77.1>
duite des opérations :
<EMI ID=78.1>
Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement une source de carbone et'une source d'azote assimilables, des éléments minéraux, en particulier des chlorures, et éventuellement des facteurs de croissance, tous ces.éléments pouvant être apportés sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes, tels qu'on en rencontre dans des produits biologiques d'origines diverses.
Comme sources de carbone assimilable , on peut utiliser les hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, le maltose, les dextrines, l'amidon ou d'autres substances carbonées comme des sucres alcools (glycérol) ou comme certains acides organiques : acides lactique, citrique. Certaines huiles animales ou végétales comme l'huile de lard ou l'huile de soja peuvent remplacer avantageusement ces différentes sources carbonées
ou leur être adjointes.
<EMI ID=79.1>
riées. Elles peuvent être des substances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium, l'urée, certains acides aminés. Elles peuvent aussi être apportées par des substances complexes contenant principalement de l'azote sous forme protidique : caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farine de soja, d'arachide, de poisson, extraits de viande, de levure, distiller's solubles, corn-steep.
Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium ou de magnésium. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement de Streptomyces incarnatus DS 26068 et à l'élaboration du 32232 RP comme les chlorures et sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux.Enfin certains agissent plus spécialement comme activateurs des réactions métaboliques de Streptomyces incarnatus DS 26068, ce sont les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse.
Les facteurs de croissance sont des produits de nature vitaminique tels que la riboflavine, l'acide folique, l'acide pantothénique.
Le pH du milieu de fermentation au départ de la culture doit être compris entre 5,8 et 7,8 et de préférence entre 6,2 et 7,4. La température opti-
<EMI ID=80.1>
satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 23 et 33[deg.]C.
L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On
a cependant trouvé que des aérations de 0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal en
32232 RP est obtenu après 2 à 8 jours de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu* utilisé.
L'antibiotique 32232 RP peut être isolé des moûts de fermentation de la manière suivante :
Le moût de fermentation peut être filtré en présence d'un-agent de filtration à un pH qui est généralement celui du milieu à la fin de la phase
de production.
Le 3223? RP qui est présent dans le filtrat et dans les eaux de lavage du gâteau de filtration est ensuite fixé sur un support qui peut être constitué par une résine cationique ou anionique, ou une résine adsorbante.
L'antifongique 32232 RP est ensuite isolé de son support par lavage de ce dernier au moyen d'un éluant convenable, tel que l'eau ou l'eau additionnée d'un électrolyte ou d'un solvant miscible à l'eau.
<EMI ID=81.1>
par addition de celle-ci à un mauvais solvant tel que l'acétone ou un mélange méthanol-acétone.
Le 32232 RP ainsi obtenu peut être éventuellement purifié par filtrations ou fixations sur divers supports, ces dernières suivies d'élutions par des éluants convenables et précipitations au moyen d'un mauvais solvant ou non-solvant miscible à l'eau.
Le 35391 RP peut être prépare par chauffage du 32232 RP dans un solvant organique tel qu'un, hydrocarbure aromatique à une température comprise
<EMI ID=82.1>
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique.
'L'activité des mélanges contenant eu 32232 RP est déterminée à l'aide de la méthode microbiologique de diffusion en utilisant comme germe sensible Saccharomyces ellipsoideus et par rapport au 32232 RP titrant
<EMI ID=83.1>
pour les solutions.
Exemple 1
<EMI ID=84.1>
Le pH est égal à 7,0 . On stérilise le milieu..par barbotage de vapeur à 122[deg.]C pendant 40 minutes. Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 117 litres ; on le complète à 120 litres par addition de 3 litres d'une solution aqueuse stérile contenant :
glucose monohydraté : 1200 g.
<EMI ID=85.1>
culture en erlenmeyer agité de Streptomyces incarnatus DS 26068. La culture est développée à 30[deg.]C pendant 26 heures en agitant et un aérant avec de l'air stérile ; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice.
La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes :
<EMI ID=86.1>
Le pH du milieu est alors de 6,50. On stérilise le bouillon par barbotage de vapeur à I22[deg.]C pendant 40 minutés. Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 500 litres. Le pH du milieu est 6, 85.
On ensemence alors avec 50 litres de la culture inoculum en fermentation de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est développée à 30[deg.]C pendant 90 heures en agitant avec une turbine tournant à 160 tours/mn et en aérant avec un volume d'air stérile de 30 m3/h. En fin d'opération, le pH de
la culture est de 8,00 et le volume de 480 litres . La production de 32232 RP est de 36 ug/cm3.
B - Extraction
880 1 de moût obtenu comme indiqué précédemment et titrant 30 ug/cm3 sont filtrés sur filtre presse après addition de 45 kg d'adjuvant de filtration. Le gâteau de filtration est lavé sur le filtre par 200 1 d'eau.
Le filtrat et le lavage sont réunis et chromatographiés sur une colonne contenant 40 1 de résine cationique "Amberlite IR 120", cycle Na+.
La résine est lavée sur la colonne par 120 1 d'eau distillée. L'effluent et
le lavage sont jetés.
La résine est reprise par 200 1 d'eau sous agitation et le pH est ajusté à 11 par addition de 1 litre de soude 6 N.
<EMI ID=87.1>
et lavée sur le filtre par 50 1 d'eau distillée à une température voisine de
20[deg.]C.
L'éluat et le lavage sont réunis et le pH est ajusté à 6 par addition de 580 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N. La solution est concentrée sous
<EMI ID=88.1>
On ajoute alors 6 1 de méthanol et on précipite le 32232 RP en versant la solution dans 60 1 d'acétone sous agitation.
Le précipité est séparé par filtration, lavé sur le filtre par 2 1 d'acétone et séché sous pression réduite à 35[deg.]C.
On obtient ainsi 175 g de 32232 RP brut titrant 110 ug/mg.
<EMI ID=89.1>
175 g du produit brut obtenu précédemment sont inis en solution dans 1 1 d'eau..L'insoluble est éliminé par filtration.
La solution est chromatographiée sur une colonne contenant 3 1 de
<EMI ID=90.1>
lonne par 3 1 d'eau distillée.
La résine est mise-en suspension dans 3 1 d'eau ajustée à pH 11 par addition de 30 cm3 de soude 6 N.
<EMI ID=91.1>
on obtient un 1er éluat.
La résine est reprise dans les mêmes conditions pour obtenir un 2ème éluat.
Les deux éluats sont réunis, neutralisés jusqu'à pH 7 par addition de 50 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N et concentrés sous pression réduite jusqu'à un volume de 900 cm3.
<EMI ID=92.1>
résine "Amberlite XAD2".
La résine est lavée sur la colonne par 5 1 d'eau, l'effluent et le lavage étant collectés par factions de 250 ml.
Les fractions 1 à 10 sont réunies puis concentrées sous pression réduite jusqu'à un volume de 110 cm3.
On ajoute 300 cm3 de méthanol et on précipite le 32232 RP en versant lentement la solution dans 800 cm3 d'acétone sous agitation.
Le précipité est filtré, lavé sur le filtre par 100 cm3 d'acétone et séché sous pression réduite (5 mm de mercure) pendant 15 heures à 35[deg.]C.
On obtient ainsi 27,2 g de 32232 RP titrant 411 ug/mg.
Ce produit est mis en solution dans 300 cm3 d'eau et la solution est chromatographiée sur une colonne contenant 1 1 de résine cationique "Amberlite IRC 50",
<EMI ID=93.1>
La résine est-lavée par 1 1 d'eau.
<EMI ID=94.1>
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1> <EMI ID=97.1>
<EMI ID=98.1>
ne sous agitation.
Le précipité est filtré, lavé sur le filtre par 50 cm3 d'acétone et séché sous pression réduite (5 mm de mercure) pendant 15 heures à 35[deg.]C.
On obtient 10,5 g de 32232 RP titrant 812 ug/mg.
10 g de 32232 RP obtenu précédemment sont mis en solution dans
100 cm3 d'eau et passés à travers une colonne contenant 1 kg de gel de dextrane "Séphadex G 25" gonflé dans l'eau.
L'élution est effectuée par de l'eau.
L'effluent et l'éluat sont recueillis par fractions de 20 cm3.
Les fractions actives sont sélectionnées par mesure de la densité optique à 260 nm.
Les 220 premières fractions (4400 cm3) sont éliminées et les
53 suivantes (1060 cm3)sont concentrées sous pression réduite jusqu'à un volume de 120 cm3.
La solution est lyophylisée. On obtient ainsi 6,94 g de 32232 RP pur.
Exemple 2
On met en suspension 2 g de 32232 RP dans 250 cm3 de toluène puis chauffe au reflux, tout en agitant, pendant 76 heures en éliminant l'eau au fur et à mesure de sa formation par distillation azéotropique et en recyclant
<EMI ID=99.1>
en suspension est séparé par filtration puis séché sous pression réduite (15 mm de mercure) à 35[deg.]C pendant 15 heures. On obtient ainsi 1,8 g d'un produit qui
<EMI ID=100.1>
pendant 48 heures, les cristaux apparus sont séparés par filtration, lavés
avec 1 cm3 d'eau distillée, puis séchés sous pression réduite (5 mm de mercure). On obtient ainsi 0,95 g de 35 391 RP cristallisé.
La présente invention concerne également les compositions médicinales contenant l'un au moins des antifongiques 32232 RP et 35391 RP en association avec tout autre produit compatible qu'il soit inerte ou physiologiquement actif. Ces compositions peuvent être utilisées par voie orale, parentérale, ou rectale ou par traitement topique. Elles contiennent habituellement de 99,9 à 0,01 % de
<EMI ID=101.1>
Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions, le produit actif selon l'invention est mélangé à un ou plusieurs . '-diluants ou adjuvants inertes, tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de magnésium.
Comme compositions liquides pour administration orale, on peut
-utiliser des solutions pharmaceutiquement acceptables, des suspensions, des émulsions, des sirops et des élixirs contenant des diluants inertes tels que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants.
Les compositions pour administration parentérale peuvent être
des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule. on peut employer le propylèneglycol, le polyéthylèneglycol, les huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, émulsifiants ou dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs fa-
<EMI ID=102.1>
composition des agents stérilisants, par irradiation.ou par chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou
tout autre milieu stérile injectable.
Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao ou la suppo-cire.
Les compositions pour le traitement topique peuvent se présenter sous forme de lotions, pommades, crèmes, laits, poudres ou aérosols. Ces compositions peuvent contenir en outre des additifs tels qu'agents déodorants ou antiperspirants.
<EMI ID=103.1>
<EMI ID=104.1>
Les lotions sont soit des solutions aqueuses, soit des solutions
<EMI ID=105.1>
de 35391 RP.
Les crèmes et les pommandes sont des émulsions d'une huile minérale,
<EMI ID=106.1>
fongique 32232 RP et/ou d'antifongique 35391 RP.
Les compositions sous forme de poudres contiennent entre 0,01 et 5 % en poids de 32232 RP et/ou de 35391 RP en mélange avec du talc et un ou plusieurs agents antiagglomérants.
Les compositions sous forme d'aérosols contiennent une solution hydroalcoolique de 32232 RP et/ou de 35391 RP et au moins un gaz propulseur comprimé ou liquéfié sous pression.
En thérapeutique humaine ces compositions sont particulièrement actives sur les maladies à levures et plus spécialement sur les candidoses telles que les candidoses buccales et intestinales, toutes les mycoses profondes
(pulmonaires, sinusiennes, biliaires, urinaires ou généralisées), les candidoses cutanéo-muqueuses et les infections génitales à Candida albicans.
<EMI ID=108.1>
D'une façon générale, :le médecin déterminera la posologie qu'il estime la plus appropriée en fonction de l'age, du poids, du degré de l'infection et des autres facteurs propres au sujet à traiter. Généralement, les doses sont comprises entre 1 et 10 g par jour par voie orale pour un adulte.
L'exemple suivant, donné a titre ion limitatif, illustre . - coinposition selon l'invention.
Exemnle 3
<EMI ID=107.1>
Exemple 4
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1>
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
New antifungal substances, their preparation and the compositions which contain them.
1
The present invention relates to a novel α,--di ami no acid designated
<EMI ID = 1.1>
<EMI ID = 2.1>
in the form of its internal salt, of its addition salts with acids and of its salts with alkali or alkaline earth metals and the corresponding lactam,
<EMI ID = 3.1>
<EMI ID = 4.1>
optionally in the form of an addition salt with the acids, their preparation and the compositions which contain them.
The 32,232 RP and the 35,391 RP are of very particular interest because of the activity they exhibit on fungi and yeasts.
32 232 RP, as an internal salt, is characterized by the following physical properties:
- appearance: white amorphous powder
- solubility: easily soluble in water, very slightly soluble in methanol and dimethylformamide and practically insoluble in acetone (according to the. French Pharmacopoeia)
- melting point: (determined at the Maquenne block) = 281 [deg.] C.
The structure of the 32,232 RP was determined from the following results:
- percentage composition:
<EMI ID = 5.1>
- osmometry: the molecular mass, determined by osmometry in water at <EMI ID = 6.1>
- potentiometric titration; potentiometric titration of an aqueous solution <EMI ID = 7.1>
<EMI ID = 8.1>
that is close to 390.
The potentiometric titration of an aqueous solution of 32,232 RP using 0.1 M sodium hydroxide makes it possible to demonstrate a weak acid function, the apparent pKa of which is 9.8. The potentiometric equivalent is close to 400.
The potentiometric titration of a solution of 32 232 RP in acetic acid using 0.01 M perchloric acid in acetic acid makes it possible to demonstrate the presence of a basic equivalent close to 130. This value is compatible, for a molecular mass of 390, with the presence of 3 basic functions per molecule.
- ultra-violet spectrum: determination from a solution at 10.35 mg / 1 in phosphate buffer at pH 7 (0.1 M in phosphate ions).
17
<EMI ID = 9.1>
1cm
The spectrum is shown in Figure 1.
- infrared spectrum: (determination from tablets mixed with KBr) This spectrum is represented by FIG. 2 on which we plotted on the abscissa, on the one hand the wavelengths expressed in microns (scale
<EMI ID = 10.1>
on the ordinate the optical densities. In Table I, the main infrared absorption bands are indicated for this product, expressed in number
<EMI ID = 11.1>
TABLE I
<EMI ID = 12.1>
- nuclear magnetic resonance spectrum of the proton in heavy water:
this spectrum, which is represented by figure 3, was recorded on a spectro-
<EMI ID = 13.1>
in heavy water. It has the following characteristics (chemical shifts are counted positively in p.p.m. towards weak fields compared to TMS taken as an external reference):
<EMI ID = 14.1>
According to this spectrum, the antibiotic 32,232 RP contains 14 non-exchangeable protons *
- nuclear magnetic resonance spectrum of the proton in hexadeuterated dimethylsulphoxide: this spectrum, which is represented by FIG. 4, was recorded on a CAMECA TSN-250 spectrometer at the frequency of 250 MHz from a solution at 44 mg / ml in hexadeuterated dimethyl sulfoxide. It has the following characteristics (chemical shifts are counted positively in p.p.m. towards weak fields compared to TMS taken as internal reference):
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
These spectra, which were recorded on a CAMECA TSN-250 spectrometer at the frequency of 62.86 MHz from a solution in heavy water containing a trace of dioxane taken as an internal reference, exhibit characteristics which are collected in the following table (chemical shifts are counted positively towards weak fields from TMS; dioxane taken as an internal reference gives in the totally decoupled spectrum a singlet counted at 66.59 ppm. compared to TMS):
<EMI ID = 17.1>
- C nuclear magnetic resonance spectrum in hexadeuterated dimethylsulfoxide: this spectrum was recorded on a WH 90 Bruker spectrometer at a frequency of 22.63 MHz from a solution at 133 mg / ml in hexadeuterated dimethylsulfoxide.
It has the following characteristics (chemical shifts are measured positively towards weak fields by <EMI ID = 18.1>
<EMI ID = 19.1>
<EMI ID = 20.1>
of carbon which are divided into 4 quaternary carbon atoms (- �-),
<EMI ID = 21.1>
- hydrochloric methanolysis: hydrochloric methanolysis of 32 232 RP makes it possible to demonstrate the presence of adenine in the molecule of 32 232 RP.
- chromatographic migrations: 32 232 RP can be characterized by ascending chromatography on a thin layer of fluorescent silica gel
(254'nm) using various mixtures of solvents. After development, the chromatogram is examined at 254 nm or revealed by spraying ninhydrin in a mixture of 20 cm3 of acetone and 1 cm3 of acetic acid; after heating, 32 232 RP turns purple. Development mixes are: <EMI ID = 22.1> <EMI ID = 23.1>
it can be diluted:
<EMI ID = 24.1>
Lactam 35391 RP has the following physical properties:
- appearance: white microcrystalline powder <EMI ID = 25.1>
The structure of the 35,391 RP was determined from the following results:
- percentage composition close to
<EMI ID = 26.1>
- potentiometric titration: the potentiometric titration of an aqueous solution of 35,391 RP using 0.1 M hydrochloric acid makes it possible to demonstrate a basic function, the apparent pKa of which is 7.7. The potentiometric equivalent is close to 370.
- ultraviolet spectrum: determination from a solution at 9.8 mg / 1 in phosphate buffer at pH 7 (0.1 M in phosphate ions)
The 35391 RP exhibits a maximum absorption at 258 nm
<EMI ID = 27.1>
The spectrum is shown in Figure 5.
<EMI ID = 28.1>
KBr).
This spectrum is represented by FIG. 6 on which we plotted on the abscissa, on the one hand, the wavelengths expressed in microns (scale
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
In Table II, the main absorption bands are indicated
<EMI ID = 31.1>
TABLE II '
<EMI ID = 32.1>
- nuclear magnetic resonance spectrum of the proton in dimethyl sulfoxide <EMI ID = 33.1>
following characteristics (chemical shifts_-are counted positi-
<EMI ID = 34.1>
-internal).
<EMI ID = 35.1>
This spectrum shows that the 35,391 RP contains 14 non-exchangeable protons.
<EMI ID = 36.1> hexadeuterated: this spectrum was recorded on a spectrometer. WH 90 Bruker at the frequency of 22.63 MHz from a solution of 135 mg / cm3 in hexadeuterated dimethyl sulfoxide. It has the following characteristics
<EMI ID = 37.1>
the weak fields with respect to the hexadeuterated dimethyl sulfoxide taken as an internal reference to 39.5 p.p.m. of the TMS and in the following table these shifts are expressed in p.p.m. with respect to the TMS taken as zero).
<EMI ID = 38.1>
This spectrum shows that the 35391 RP contains 15 carbon atoms, namely 4 quaternary carbon atoms, 8 tertiary carbon atoms and 3 secondary carbon atoms.
- mass spectrum: in electron impact mass spectrometry on <EMI ID = 39.1>
363, 1666; calculated value 363, 1655). The characteristic fragments of the 35,391 RP molecule are: <EMI ID = 40.1> 16 2 4 (found value: 228, 1102; calculated value 228, 1110)
-C 7 H 8 N 5 0 (found value: 178, 0729; calculated value 178, 0729) <EMI ID = 41.1>
- chromatographic migrations: 35391 RP can be characterized by ascending chromatography on a thin layer of fluorescent silica gel (254 nm) using various mixtures of solvents and examining the chromatogram at
254 nm after development. Development mixes are: <EMI ID = 42.1>
The 32232 RP and the 35391 RP are, in general, devoid of bacteriostatic activity towards bacteria.
<EMI ID = 43.1> greater than 1000 mg / kg orally and the 35,391 RP is non-toxic at a dose of 1000 mg / kg orally or subcutaneously.
- antifungal activity in vitro: The antifungal activity of 32232 RP and
35391 RP against a number of fungi was determined by one of the dilution methods commonly used for this purpose. For each fungus, the lowest concentration of active substance was determined which, under defined conditions, results in 95 to 100% inhibition of the fungus <EMI ID = 44.1>
Table III below where the minimum active concentrations are expressed
<EMI ID = 45.1>
TABLE III
<EMI ID = 46.1>
TABLE III (continued)
<EMI ID = 47.1>
- antifungal activity in vivo:
On generalized candidiasis caused by Candida albicans in mice,
<EMI ID = 48.1>
oral or subcutaneous at doses between 25 mg / kg and 200 mg / kg per day for 4 consecutive days.
<EMI ID = 49.1>
appropriate from a new microorganism identified more fully below, belonging to the genus Streptomyces and designated by the name Streptomyces incarnatus DS 26068.
<EMI ID = 50.1>
Streptomyces which has been isolated from a soil sample taken in India and assigned the number DS 26068. This organism
was deposited at the Northern Regional Research Laboratory of the U.S. Department
<EMI ID = 51.1>
NRRL number 8089. Samples may be supplied by this laboratory to anyone referring to the publication of this document.
Isolation was carried out by following the general method of suspending a small amount of soil in sterile distilled water, diluting the suspension to different concentrations, and
to spread a small volume of each dilution on the surface of Petri dishes
<EMI ID = 52.1>
<EMI ID = 53.1>
wants to isolate for further study are taken and subcultured on nutrient agar in order to obtain more abundant cultures.
<EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
Its sporophores are in clusters. In general its spore chains are long, comprising up to several dozen spores, and show a certain degree of polymorphism, some being straight or more or less flexible, others curving in the shape of a hook or even coiling in describing a more or less open spiral of one to occasionally a few turns. By its mode of sporulation, Streptomyces incarnatus DS 26068 is located in Section Retinaculum Apertum of the Pridham classification.
<EMI ID = 56.1>
37 [deg.] C, but not at 50 [deg.] C. It has a light pink sporulated aerial mycelium.
The coloring of its vegetative mycelium ranges, depending on the environment, from yellow-brown or yellow-brown to very dark brown. It generally gives a produc-
<EMI ID = 57.1>
particular on special tyrosine agar- Waksman's yeast extract
(Melanin formation medium); on synthetic agar media it most often produces soluble brown pigment, more or less dark depending on the case.
In its cultures, carried out at 26 [deg.] C, it presents the following biochemical characters:
<EMI ID = 58.1>
The cultural traits of Streptomyces incarnatus PS 26068 are
<EMI ID = 59.1> <EMI ID = 60.1>
tives and broths usually used to determine the morphological characters of strains of streptomyces, the cultures on agar media being carried out on agar slants. A number of the culture media employed were prepared according to the formulas given in "The Actinomycetes", S.A. WAKSMAN, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950; in this case they are indicated by the letter W followed by
of the number assigned to them in "The Actinomycetes". The references
or constitutions of other culture media are as follows:
- Ref. A. "Hickey and Tresner's Agar" -T.G. PRIDHAM et al. - Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950
- Ref. B. "Bennett's Agar" - S.A. WAKSMAN - The Actinomycetes, vol. 2, p. 331, n [deg.] 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961. <EMI ID = 61.1>
- Ref. D. "Yeast Extract Agar" - T.G. PRIDHAM et al. - Antibiotics Annual
1956 - 1957, p. 950
- Ref. E. "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G.PRIDHAM et al. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 950 <EMI ID = 62.1> p. 333 - n [deg.] 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961
- Ref.G. W.E. GRUNDY et al. - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952
- Ref. H. "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. PRIDHAM et al. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 951
- Ref. I. W.E. GRUNDY et al. - Antibiotics and Chem. 1, 310, 1951
- Ref.
J. corresponds to formula W-1, where 30 g of sucrose are replaced by 15 g of glucose <EMI ID = 63.1> per 15 g. glycerin
- Ref. L. corresponds to formula W-18, where 30 g of sucrose is replaced by 15 g .. of glucose <EMI ID = 64.1> placed by small strips of filter paper partially submerged in the liquid. <EMI ID = 65.1> <EMI ID = 66.1> from the manufacturer. <EMI ID = 67.1>
<EMI ID = 68.1>
TABLE IV
(See pages; 26 - 27 - 28 - 29)
The ability of Streptomyces incarnatus DS 26068 to use various sources of carbon and nitrogen for development has been
<EMI ID = 69.1>
Bact. 56, 107-114, 1948); the degree of development was observed, after a
<EMI ID = 70.1>
authors by replacing either glucose by the various carbon sources res-
<EMI ID = 71.1>
tively tried. The results are shown in the following Table V:
TABLE V
<EMI ID = 72.1>
<EMI ID = 73.1>
Streptomyces incarnatus DS 26068 exhibits a set of characters which does not exactly coincide with any of the strains already described, and therefore it should be considered a new species.
Eh considering the species described in "The Actinomycetes"
<EMI ID = 74.1>
as well as in the Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7th edition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957), the species to which Streptomyces incarnatus DS 26068 would come closest is Streptomyces venezuelae which, like it, forms melanin pigments on organic media, has a vegetative mycelium ranging from yellow to brown depending on the culture media, and a sporulated aerial mycelium of pink color. However, it must be distinguished from this species, which separate it from a certain number of differences which are indicated in Table VI below:
<EMI ID = 75.1>
<EMI ID = 76.1>
M.v. = vegetative mycelium M.a. = aerial mycelium
The process for preparing 32232 Ri essentially consists in cultivating Streptomyces incarnatus DS 26068 or its producer mutants, on a medium and under suitable conditions and in separating the product formed during the culture.
The culture of Streptomyces incarnatus DS 26068 can be carried out by any aerobic method of surface or deep culture, but the latter is to be preferred for reasons of convenience. Various types of apparatus are used for this purpose which are in common use in the fermentation industry.
<EMI ID = 77.1>
pick of operations:
<EMI ID = 78.1>
The fermentation medium must essentially contain a source of carbon and a source of assimilable nitrogen, mineral elements, in particular chlorides, and possibly growth factors, all of these elements being able to be supplied in the form of well-defined products or by complex mixtures, such as are found in organic products of various origins.
As sources of assimilable carbon, it is possible to use carbohydrates such as glucose, sucrose, maltose, dextrins, starch or other carbonaceous substances such as sugar alcohols (glycerol) or as certain organic acids: acids lactic, citric. Certain animal or vegetable oils such as bacon oil or soybean oil can advantageously replace these different carbon sources.
or be their assistant.
<EMI ID = 79.1>
laughed. They can be very simple chemical substances like mineral or organic ammonium salts, urea, certain amino acids. They can also be provided by complex substances containing mainly nitrogen in protein form: casein, lactalbumin, gluten and their hydrolysates, soybean meal, peanut, fish, meat extracts, yeast, soluble distiller's, corn -steep.
Among the added mineral elements, some may have a buffering or neutralizing effect, such as alkaline or alkaline earth phosphates or calcium or magnesium carbonates. Others provide the ionic balance necessary for the development of Streptomyces incarnatus DS 26068 and for the production of 32232 RP, such as alkali and alkaline earth metal chlorides and sulphates. Finally, some act more specifically as activators of the metabolic reactions of Streptomyces incarnatus DS 26068, these are the salts of zinc, cobalt, iron, copper, manganese.
Growth factors are products of a vitamin nature such as riboflavin, folic acid, pantothenic acid.
The pH of the fermentation medium at the start of the culture should be between 5.8 and 7.8 and preferably between 6.2 and 7.4. Optimal temperature
<EMI ID = 80.1>
satisfactory is obtained for temperatures between 23 and 33 [deg.] C.
The aeration of the fermentation can vary between fairly wide values. We
has, however, found aeration of 0.3 to 3 liters of air per liter of broth per minute to be particularly suitable. The maximum yield in
32232 RP is obtained after 2 to 8 days of culture, this time depending essentially on the medium * used.
Antibiotic 32232 RP can be isolated from fermentation musts as follows:
The fermentation wort can be filtered in the presence of a filtration agent at a pH which is generally that of the middle to the end of the phase.
of production.
The 3223? RP which is present in the filtrate and in the water for washing the filter cake is then fixed on a support which may consist of a cationic or anionic resin, or an adsorbent resin.
The 32232 RP antifungal is then isolated from its support by washing the latter with a suitable eluent, such as water or water with the addition of an electrolyte or a water-miscible solvent.
<EMI ID = 81.1>
by adding the latter to a poor solvent such as acetone or a methanol-acetone mixture.
The 32232 RP thus obtained can optionally be purified by filtrations or fixations on various supports, the latter followed by elutions with suitable eluents and precipitation by means of a poor solvent or non-solvent miscible with water.
The 35391 RP can be prepared by heating the 32232 RP in an organic solvent such as an aromatic hydrocarbon at a temperature of
<EMI ID = 82.1>
The following examples, given without limitation, show how the invention can be put into practice.
'The activity of the mixtures containing eu 32232 RP is determined using the microbiological diffusion method using Saccharomyces ellipsoideus as sensitive germ and relative to the 32232 RP titrating
<EMI ID = 83.1>
for solutions.
Example 1
<EMI ID = 84.1>
The pH is equal to 7.0. The medium is sterilized by bubbling steam at 122 [deg.] C for 40 minutes. After cooling, due to the condensation of steam during sterilization, the volume of the broth is 117 liters; it is made up to 120 liters by adding 3 liters of a sterile aqueous solution containing:
glucose monohydrate: 1200 g.
<EMI ID = 85.1>
Shake Erlenmeyer culture of Streptomyces incarnatus DS 26068. The culture is grown at 30 [deg.] C for 26 hours with shaking and aeration with sterile air; it is then suitable for sowing the productive crop.
The productive culture is carried out in an 800 liter fermenter loaded with the following substances:
<EMI ID = 86.1>
The pH of the medium is then 6.50. The broth was sterilized by bubbling steam at 122 [deg.] C for 40 minutes. After cooling, due to the condensation of the steam during sterilization, the volume of the broth is 500 liters. The pH of the medium is 6.85.
50 liters of the 170 liter fermenting inoculum culture described above are then inoculated. The culture is developed at 30 [deg.] C for 90 hours while stirring with a turbine rotating at 160 rpm and aerating with a volume of sterile air of 30 m 3 / h. At the end of the operation, the pH of
the culture is 8.00 and the volume is 480 liters. The production of 32232 RP is 36 µg / cm3.
B - Extraction
880 l of must obtained as indicated above and titrating 30 μg / cm3 are filtered on a filter press after addition of 45 kg of filter aid. The filter cake is washed on the filter with 200 l of water.
The filtrate and the washing are combined and chromatographed on a column containing 40 l of cationic resin “Amberlite IR 120”, Na + cycle.
The resin is washed on the column with 120 l of distilled water. The effluent and
washing are discarded.
The resin is taken up in 200 1 of water with stirring and the pH is adjusted to 11 by adding 1 liter of 6N sodium hydroxide.
<EMI ID = 87.1>
and washed on the filter with 50 1 of distilled water at a temperature close to
20 [deg.] C.
The eluate and the washing are combined and the pH is adjusted to 6 by adding 580 cm3 of 6N hydrochloric acid. The solution is concentrated under
<EMI ID = 88.1>
Then 6 l of methanol are added and the 32232 RP is precipitated by pouring the solution into 60 l of acetone with stirring.
The precipitate is filtered off, washed on the filter with 2 l of acetone and dried under reduced pressure at 35 [deg.] C.
175 g of crude 32232 RP are thus obtained, assaying 110 μg / mg.
<EMI ID = 89.1>
175 g of the crude product obtained above are dissolved in 1 l of water. The insoluble matter is removed by filtration.
The solution is chromatographed on a column containing 3 l of
<EMI ID = 90.1>
lonne per 3 1 of distilled water.
The resin is suspended in 3 l of water adjusted to pH 11 by adding 30 cm3 of 6N sodium hydroxide.
<EMI ID = 91.1>
a 1st eluate is obtained.
The resin is taken up under the same conditions to obtain a 2nd eluate.
The two eluates are combined, neutralized to pH 7 by adding 50 cm3 of 6N hydrochloric acid and concentrated under reduced pressure to a volume of 900 cm3.
<EMI ID = 92.1>
"Amberlite XAD2" resin.
The resin is washed on the column with 5 l of water, the effluent and the wash being collected in portions of 250 ml.
Fractions 1 to 10 are combined and then concentrated under reduced pressure to a volume of 110 cm3.
300 cm3 of methanol are added and the 32232 RP is precipitated by slowly pouring the solution into 800 cm3 of acetone with stirring.
The precipitate is filtered off, washed on the filter with 100 cm3 of acetone and dried under reduced pressure (5 mm of mercury) for 15 hours at 35 [deg.] C.
27.2 g of 32232 RP are thus obtained, assaying 411 μg / mg.
This product is dissolved in 300 cm3 of water and the solution is chromatographed on a column containing 1 1 of cationic resin "Amberlite IRC 50",
<EMI ID = 93.1>
The resin is washed with 1 1 of water.
<EMI ID = 94.1>
<EMI ID = 95.1>
<EMI ID = 96.1> <EMI ID = 97.1>
<EMI ID = 98.1>
do under agitation.
The precipitate is filtered off, washed on the filter with 50 cm3 of acetone and dried under reduced pressure (5 mm of mercury) for 15 hours at 35 [deg.] C.
10.5 g of 32232 RP are obtained, assaying 812 μg / mg.
10 g of 32232 RP obtained previously are dissolved in
100 cm3 of water and passed through a column containing 1 kg of dextran gel “Sephadex G 25” swollen in water.
Elution is carried out with water.
The effluent and the eluate are collected in fractions of 20 cm3.
The active fractions are selected by measuring the optical density at 260 nm.
The first 220 fractions (4400 cm3) are discarded and the
The following 53 (1060 cm3) are concentrated under reduced pressure to a volume of 120 cm3.
The solution is lyophilized. This gives 6.94 g of pure 32232 RP.
Example 2
2 g of 32232 RP are suspended in 250 cm3 of toluene and then heated to reflux, while stirring, for 76 hours while removing the water as it is formed by azeotropic distillation and by recycling.
<EMI ID = 99.1>
suspension is separated by filtration and then dried under reduced pressure (15 mm Hg) at 35 [deg.] C for 15 hours. This gives 1.8 g of a product which
<EMI ID = 100.1>
for 48 hours, the crystals appearing are separated by filtration, washed
with 1 cm3 of distilled water, then dried under reduced pressure (5 mm of mercury). In this way 0.95 g of crystallized RP 35,391 is obtained.
The present invention also relates to medicinal compositions containing at least one of the antifungals 32232 RP and 35391 RP in combination with any other compatible product, whether inert or physiologically active. These compositions can be used orally, parenterally, or rectally or by topical treatment. They usually contain 99.9 to 0.01%
<EMI ID = 101.1>
As solid compositions for oral administration can be used tablets, pills, powders or granules. In these compositions, the active product according to the invention is mixed with one or more. '-diluents or inert adjuvants, such as sucrose, lactose or starch. These compositions can comprise substances other than diluents, for example a lubricant such as magnesium stearate.
As liquid compositions for oral administration, one can
-use pharmaceutically acceptable solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs containing inert diluents such as water or paraffin oil. These compositions can also comprise substances other than diluents, for example wetting, sweetening or flavoring products.
Compositions for parenteral administration can be
sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. As a solvent or vehicle. it is possible to use propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, in particular olive oil, and injectable organic esters, for example ethyl oleate. These compositions can also contain adjuvants, in particular wetting, emulsifying or dispersing agents. Sterilization can be done in several ways.
<EMI ID = 102.1>
composition of sterilizing agents, by irradiation or by heating. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions which can be dissolved at the time of use in sterile water or
any other sterile injectable medium.
The compositions for rectal administration are suppositories which may contain, in addition to the active product, excipients such as cocoa butter or suppo-wax.
The compositions for topical treatment can be provided in the form of lotions, ointments, creams, milks, powders or aerosols. These compositions can also contain additives such as deodorant or antiperspirant agents.
<EMI ID = 103.1>
<EMI ID = 104.1>
Lotions are either aqueous solutions or solutions
<EMI ID = 105.1>
from 35391 RP.
Creams and pommandes are emulsions of a mineral oil,
<EMI ID = 106.1>
fungal 32232 RP and / or antifungal 35391 RP.
The compositions in powder form contain between 0.01 and 5% by weight of 32232 RP and / or 35391 RP mixed with talc and one or more anti-caking agents.
The compositions in aerosol form contain a hydroalcoholic solution of 32232 RP and / or 35391 RP and at least one propellant gas which is compressed or liquefied under pressure.
In human therapy, these compositions are particularly active on yeast diseases and more especially on candidiasis such as oral and intestinal candidiasis, all deep mycoses
(pulmonary, sinus, biliary, urinary or generalized), cutaneous-mucous candidiasis and genital Candida albicans infections.
<EMI ID = 108.1>
In general,: the doctor will determine the dosage he considers the most appropriate according to the age, weight, degree of infection and other factors specific to the subject to be treated. Generally, the doses are between 1 and 10 g per day orally for an adult.
The following example, given by way of limitation, illustrates. - coinposition according to the invention.
Exemption 3
<EMI ID = 107.1>
Example 4
<EMI ID = 109.1>
<EMI ID = 110.1>
<EMI ID = 111.1>
<EMI ID = 112.1>
<EMI ID = 113.1>