"Procédé de purification d'héparine".
La présente invention concerne un procédé de purification d'héparine, ce procédé étant caractérisé en ce que l'héparine obtenue est très pure et possède une haute activité spécifique.
Depuis plusieurs dizaines d'années, l'héparine
a été utilisée dans le traitement médical. Elle est un des anticoagulants bien connus et elle est largement utilisée, notamment pour la prévention de la thrombose. L'héparine est un polysaccharide sulfaté que l'on peut préparer à partir de poumons ou de
mucus d'intestins d'animaux par des procédés relativement compliqués. Les préparations d'héparine utilisées actuellement en clinique contiennent une matière présentant une large variété de dimensions
<EMI ID=1.1>
L'activité spécifique est habituellement d'environ 130 unités/mg. Dès lors, les préparations actuellement disponibles dans le commerce sont très hétérogènes. La fréquence des effets secondaires lors de la thérapie à l'héparine est assez faible mais, lorsque ces effets secondaires se manifestent, ils posent très souvent de graves problèmes. Certains de ces effets secondaires sont probablement provoqués par les impuretés contenues dans la préparation d'héparine.
En conséquence, il y a de bonnes raisons pour
<EMI ID=2.1>
effectuées sur l'antithrombine, qui est un co-facteur de l'héparine, on a examiné les possibilités de fixer la protéine sur une gangue. De façon étonnante, on a constaté que l'antithrombine fixée à une gangue pouvait fixer spécifiquement la fraction moléculaire de l'héparine utilisée en thérapie et agissant comme support de l'effet de l'héparine, laquelle est cliniquement intéressante et constitue un prophylactique de la thrombose. En choisissant judicieusement
<EMI ID=3.1> héparine extraordinairement pure. Les activités spécifiques atteintes sont de 200-270 unités/mg contre environ 130 unités/mg de la matière de départ. La répartition des poids moléculaires dans l'héparine purifiée spécifiquement est de loin plus limitée que dans la matière primaire. Outre l'antithrombine qui est un cofacteur de l'héparine, on peut également utiliser avantageusement d'autres protéines fixant l'héparine, par exemple, l'inhibiteur d'inter-a-trypsine d'un poids moléculaire d'environ 150.000, que l'on obtient au cours de l'isolation du facteur de coagulation IX
<EMI ID=4.1>
obtient de l'héparine d'une qualité optimum avec des activités spécifiques allant jusqu'à 270 unités/mg.
Dès lors, on peut préparer de l'héparine ayant un très haut degré de pureté et d'activité spécifique par le procédé de l'invention qui est un procédé simple et applicable à une utilisation industrielle pour la préparation d'héparine ayant une activité spécifique supérieure à celle obtenue avec des préparations existantes. La détermination de l'activité spécifique de l'héparine a été effectuée comme décrit par Denson et Bonnar (1975, "Brit, J. Haematol.", 30, page 139).
Les exemples suivants illustrent l'invention, EXEMPLE 1
<EMI ID=5.1>
Procédé en colonne.
On prépare le gel adsorbant de la maniée suivant -3:
Activation
On dissout 3 g de BrCN dans 30 ml d'eau distillée. A la solution de BrCN, on ajoute 50 ml d'agarose décanté ("Sepharose 4B", marque commerciale déposée de "Pharmacia Fine Chemicals", Uppsala, Suède). Tout en agitant, on refroidit le mélange au bain
<EMI ID=6.1> maintient ce pH constant pendant 10 minutes. Ensuite, on lave le
<EMI ID=7.1>
Liaison
Au gel obtenu ci-dessus, on ajoute 200 mg d'antithrombine purifiée comme décrit par Miller-Andersson et al (1974,
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1>
à la température ambiante pendant une nuit, puis on la lave soigneusement avec des tampons à haute concentration ionique avec des pH alternativement élevés et faibles.
Purification d'héparine
On charge le gel adsorbant contenant de l'antithrombine fixée à une gangue dans une colonne et on l'équilibre
<EMI ID=10.1>
<EMI ID=11.1>
tion ainsi obtenue dans la colonne. Ensuite, on lave le gel avec le tampon précité, puis on désorbe l'héparine adsorbée avec un
<EMI ID=12.1>
rine éluée par filtration sur gel dans de l'eau distillée et dans
<EMI ID=13.1>
Des études de répartition des poids moléculaires démontrent que cette héparine présente une répartition de poids moléculaires beaucoup plus limitée que l'héparine primaire.
On effectue l'analyse des hydrates de carbone
<EMI ID=14.1>
EXEMPLE 2
<EMI ID=15.1>
Procédé discontinu.
On prépare la gangue d'antithrombine comme décrit à l'exemple 1.
Purification d'héparine
On dissout 500 mg d'héparine (Vitrum, activité spécifique : 130 unités/mg) dans 300 ml d'un tampon Tris 0�05M�
<EMI ID=16.1>
300 ml d'antithrombine décantée et fixée à une gangue, puis on sèche par essorage. On ajoute l'adsorbant à la solution d'héparine que l'on agite ensuite à la température ambiante pendant une heure.
On sèche le gel par essorage sur un filtre en verre et on le lava avec 10 x 200 ml d'un tampon Tris 0,05M, NaCl 0,15M, pH : 7,4.
<EMI ID=17.1>
<EMI ID=18.1>
éluée moyennant un séchage par évaporation de glace. On élimine
<EMI ID=19.1>
l'eau distillée, puis on sèche l'héparine par évaporation de glace.
<EMI ID=20.1>
EXEMPLE 3
<EMI ID=21.1>
Préparation du gel adsorbant
Au cours de la purification du facteur de coagu-
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
constituant la protéine de fixation d'héparine. Son poids moléculaire est d'environ 150.000. On dissout 250 mg de cette protéine
<EMI ID=24.1> déposée), décantée et activée avec du BrCN conformément au procédé décrit à l'exemple 1. On agite modérément la suspension de gel/ protéine à la température ambiante pendant une nuit. Ensuite, on lave le gel comme décrit à l'exemple 1.
Purification d'héparine
On charge, dans une colonne, le gel adsorbant contenant la protéine fixée à une gangue. On dissout 300 mg
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
On lave le gel avec le tampon précité, puis on désorbe l'héparine
<EMI ID=27.1>
le sel de l'héparine par filtration sur gel de "Sephadex G 25<1><1> dans de l'eau distillée, puis on sèche l'héparine par évaporation de glace. L'activité spécifique de l'héparine purifiée est de 230 unités/%-.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'héparine ayant une haute activité spécifique, caractérisé en ce que, comme adsorbants, on utilise des protéines de plasma fixant l'héparine et fixées à une gangue.
"Heparin Purification Process".
The present invention relates to a process for the purification of heparin, this process being characterized in that the heparin obtained is very pure and has a high specific activity.
For several decades, heparin
has been used in medical treatment. It is one of the well-known anticoagulants and it is widely used, in particular for the prevention of thrombosis. Heparin is a sulfated polysaccharide that can be prepared from the lungs or from
mucus from animal intestines by relatively complicated methods. Heparin preparations in clinical use today contain material of a wide variety of sizes.
<EMI ID = 1.1>
The specific activity is usually about 130 units / mg. Consequently, the preparations currently available on the market are very heterogeneous. The frequency of side effects during heparin therapy is quite low, but when these side effects do occur they very often cause serious problems. Some of these side effects are probably caused by the impurities in the heparin preparation.
Accordingly, there are good reasons for
<EMI ID = 2.1>
carried out on antithrombin, which is a co-factor of heparin, we examined the possibilities of fixing the protein on a matrix. Surprisingly, it was found that the gangue-attached antithrombin could specifically bind the molecular fraction of heparin used in therapy and acting as a support for the effect of heparin, which is clinically interesting and constitutes a prophylactic of heparin. thrombosis. By choosing wisely
<EMI ID = 3.1> extraordinarily pure heparin. The specific activities achieved are 200-270 units / mg versus about 130 units / mg of the starting material. The molecular weight distribution in the specifically purified heparin is far more limited than in the primary material. In addition to antithrombin which is a heparin cofactor, other heparin-binding proteins can also be used advantageously, for example the inhibitor of inter-α-trypsin with a molecular weight of about 150,000, which is obtained during the isolation of coagulation factor IX
<EMI ID = 4.1>
obtains heparin of optimum quality with specific activities of up to 270 units / mg.
Therefore, heparin having a very high degree of purity and specific activity can be prepared by the process of the invention which is a simple process and applicable to industrial use for the preparation of heparin having specific activity. greater than that obtained with existing preparations. The determination of the specific activity of heparin was carried out as described by Denson and Bonnar (1975, "Brit, J. Haematol.", 30, page 139).
The following examples illustrate the invention, EXAMPLE 1
<EMI ID = 5.1>
Column process.
The adsorbent gel is prepared as follows -3:
Activation
3 g of BrCN are dissolved in 30 ml of distilled water. To the BrCN solution was added 50 ml of decanted agarose ("Sepharose 4B", registered trademark of "Pharmacia Fine Chemicals", Uppsala, Sweden). While stirring, the mixture is cooled in the bath
<EMI ID = 6.1> maintains this pH constant for 10 minutes. Then we wash the
<EMI ID = 7.1>
Bonding
To the gel obtained above, 200 mg of purified antithrombin is added as described by Miller-Andersson et al (1974,
<EMI ID = 8.1>
<EMI ID = 9.1>
at room temperature overnight, then washed thoroughly with high ionic strength buffers with alternately high and low pH.
Heparin purification
Load the adsorbent gel containing gangue-attached antithrombin into a column and equilibrate
<EMI ID = 10.1>
<EMI ID = 11.1>
tion thus obtained in the column. Then the gel is washed with the aforementioned buffer, then the heparin adsorbed is desorbed with a
<EMI ID = 12.1>
rine eluted by gel filtration in distilled water and in
<EMI ID = 13.1>
Molecular weight distribution studies demonstrate that this heparin has a much more limited molecular weight distribution than primary heparin.
Carbohydrate analysis is performed
<EMI ID = 14.1>
EXAMPLE 2
<EMI ID = 15.1>
Batch process.
The antithrombin gangue is prepared as described in Example 1.
Heparin purification
500 mg of heparin (Vitrum, specific activity: 130 units / mg) are dissolved in 300 ml of a 0.05M Tris buffer.
<EMI ID = 16.1>
300 ml of antithrombin decanted and fixed to a matrix, then dried by draining. The adsorbent is added to the heparin solution which is then stirred at room temperature for one hour.
The gel was dried by suction on a glass filter and washed with 10 x 200 ml of 0.05M Tris, 0.15M NaCl, pH: 7.4.
<EMI ID = 17.1>
<EMI ID = 18.1>
eluted with ice evaporative drying. We eliminate
<EMI ID = 19.1>
distilled water, then the heparin is dried by evaporation of ice.
<EMI ID = 20.1>
EXAMPLE 3
<EMI ID = 21.1>
Preparation of the adsorbent gel
During the purification of the coagu-
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
constituting the heparin binding protein. Its molecular weight is around 150,000. 250 mg of this protein are dissolved
<EMI ID = 24.1> deposited), decanted and activated with BrCN according to the method described in Example 1. The gel / protein suspension is stirred moderately at room temperature overnight. Then, the gel is washed as described in Example 1.
Heparin purification
The adsorbent gel containing the matrix-attached protein is loaded into a column. 300 mg are dissolved
<EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
The gel is washed with the aforementioned buffer, then heparin is desorbed
<EMI ID = 27.1>
the heparin salt by gel filtration of "Sephadex G 25 <1> <1> in distilled water, then the heparin is dried by evaporation of ice. The specific activity of the purified heparin is 230 units /% -.
CLAIMS
1. Process for the preparation of heparin having high specific activity, characterized in that, as adsorbents, plasma proteins which bind heparin and which are attached to matrix are used.