<EMI ID=1.1>
La présente invention est relative à une matrice com-
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forme de perles.. Le terme matrice utilisé dans la présente demande signifie un support pour des enzymes immobilisées, pour la chromatographie par affinité, la filtration de gel, l'échange d'ions et d'autres applications sauf indications contraires.
Les matériaux de matrice utilisés jusqu' à présent, ont été essentiellement des polysaccharides. Parmi ceux-ci on peut citer la cellulose, le dextrane, l'amidon, l'agarose ainsi que leurs dérivés. Les matériaux idéaux de matrice utilisés pour le garnissage des colonnes telles que pour des applications d'enzymes immobilisées ou par chromatographie par affinité, doivent
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microbiologiquement, 3) rigides mécaniquement, 4) hydrophiles,
5) posséder une fonction chimique appropriée, 6) prêts à se coupler avec les enzymes et les ligands 7) avoir une forme sphérique pour laisser passer les liquides librement au-dessus d'eux, 8) ne pas présenter une adsorption non spécifique et
9) être obtenus à des coûts faibles, entre autres.
Aucun des matériaux connus antérieurement ne satisfait aux exigences mentionnées ci-dessus, et si le gel d'agarose est relativement satisfaisant, ce matériau est cependant désavantageux dans la mesure où il est 1) instable à l'encontre des acides, 2) ne supporte pas les températures élevées et
3) inapproprié pour la préparation de colonnes à grande capacité ayant de grandes hauteurs de garnissage en raison de sa forte compressibilité.
La demanderesse a effectué des recherches intensives en vue de remédier à ces inconvénients et a découvert que le
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perles de gel lorsqu'ils sont utilisés comme matrice pour des enzymes immobilisées ou dans la chromatographie par affinité, présentent d'excellentes propriétés de vitesse de circulation comme cela va être décrit dans les exemples de référence ainsi que des propriétés très souhaitables quand ils sont utilisés comme support dans la filtration de gel, dans l'échange d'ions ou d'autres applications. La présente invention est basée sur v
ces découvertes.
L'objet de-la présente invention est donc une matrice
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forme de perles, utile pour les eneymes immobilisées, la chromatographie par affinité, la filtration de gel, l'échange d'ions et d'autres applications.
Un autre objet de la présente invention est un procé-
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sous forme de perles avec des diamètres compris dans une gamme d'environ 5 à 1000 � .
D'autres objets apparaîtront à partir de la description ci-après.
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sables selon la présente invention on peut citer les polysaccharides élaborés par les microorganismes du genre Alcaligenes et du genre Agrobacterium tel que des polysaccharides élaborés par Alcaligenes faecalis var myxogenes 10C3K (Agricultural Biological Chemistry, Vol. 30, pages 196 et suivantes, 1966,
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tante U-19 (IFO 13126, ATCC 21679) (voir brevet des E.U.A.
3 754 925 et 3 822 250) appelé ci-après PS-2, le pachymane qui est présent dans les drogues brutes appelées Poria cocos
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rane qui est un ingrédient des algues brunes, le glucane qui est un des constituants de la paroi des cellules des levures , etc.. Parmi les procédés préférés pour la production de perles de glucane, on peut citer -le procédé consistant à extruder, à faire
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soluble dans l'eau dans un bain d'huile chauffé et à entraîner de cette façon la gélification du glucane (voir demande de brevet japonaise publiée n[deg.] 52953/1973) ; le procédé qui consiste
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solution aqueuse d'hydroxyde de sodium et à charger la solution résultante à travers un ajutage de gouttage dans une solution aqueuse de chlorure d'hydrogène pour la neutralisation et entraîner la gélification du glucane (voir brevet des E.U.A.
n[deg.] 3 899 480) et le procédé qui consiste à additionner une
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dans l'eau goutte à goutte un solvant organique qui n'est pas librement miscible à l'eau et à neutraliser la dispersion résultante avec un acide organique.
Dans cette dernière méthode, on peut utiliser à titre de solution aqueuse alcaline qui est capable de dissoudre le �-1,3-glucane non soluble dans l'eau, des solutions aqueuses d'hydroxyde de sodium , d'hydroxyde de potassium, d'hydroxyde de baryum, d'hydroxyde de calcium, d'hydroxyde de lithium , d'ammoniaque, etco
La gamme de pH de la solution aqueuse alcaline est généralement comprise entre 9 et 14 et de préférence entre
11 et 13 .
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l'eau ainsi employée a une influence sur le diamètre moyen des perles résultantes. Normalement celle-ci est choisie entre en-
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tion en P-l,3-glucane est basse plus le diamètre des perles résultantes est élevé.
En ce qui concerne le procédé de dispersion de la
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solvant organique qui est difficilement miscible avec l'eau , ladite solution est de préférence additionnée goutte à goutta sous agitation. Du fait qu'il n'y a pas de limite particulière
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goutte doit être effectuée, à l'exception que cette durée ne doit pas être trop longue et causer l'hydrolyse du P-l,3-glucane non soluble dans l'eau, une durée de 10 à 90 minutes est généralement appropriée. Dans cette opération, un agent de surface peut être additionné au solvant organique si nécessaire. D'une façon générale un tel agent de surface est de préférence non ionique quoique cela ne soit pas un choix exclusif. La concentration d'un agent de surface ainsi additionné par rapport au solvant organique peut varier entre 0,1 et 20 % et de préférence entre 0,2 et 10 % poids/volume.
Bien que le solvant organique utilisé puisse être tout solvant qui n'est aisément miscible avec de l'eau on peut mentionner à titre d'exemple typique les hydrocarbures aromatiques et leurs dérivés tels que par exemple : le benzène, le toluène le xylène, etc., les hydrocarbures aliphatiques et leurs dérivés tels que par exemple le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le dichloréthane, l'hexane, le cyclohexane, etc., les éthers tels que par exemple : le diéthyléther, l'isopropyléther, etc., les esters tels que par exemple : l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle. etc.; et les alcools tels que par exemple : le n-butanol, l'isobutanol, etc.
La vitesse de rotation de l'agitateur utilisé pour disperser les P-l,3-glucane non soluble dans l'eau dans le solvant organique susmentionné, a des effets significatifs sur le diamètre des produits en perles. D'une façon générale plus la vitesse-d'agitation est élevée plus le diamètre des produits en forme de perles est petit. Un procédé préféré pour gélifier la
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additionner un acide à la dispersion, ledit acide étart soluble dans ledit solvant organique non aisément miscible dans l'eau . Parmi les acides préférés on peut citer : l'acide formique , l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide benzoïque . Bien que cela dépende des conditions de fabrication, les diamètres des perles de gel de P-l,3-glucane non soluble dans l'eau, sont généralement compris entre 5 et 1000 � .
Dans l'application des perles de gel selon la présente invention comme matrice de filtration de gel leur diamètre généralement doit être de façon souhaitable plus faible en vue d'obtenir une efficacité de séparations plus élevée mais en considération de la chute de pression et d'autres facteurs, les diamètres des perles sont de préférence compris entre environ 5 et 500 �- et pour de meilleurs résultats encore dans la gamme comprise entre environ 30 et 150 Il -
Pour résoudre les problèmes résultant de l'application d'une matrice ou d'un support pour des enzymes immobilisées ou pour la chromatographie par affinité, la demanderesse a développé en plus un procédé d'encapsulation d'une matière constituant le noyau de faible diamètre avec le P-l,3-glucane non soluble dans l'eau. La demanderesse a ainsi réussi à préparer des perles de gel appelées ci-après microcapsules consistant en une matière formant un noyau petit et comme moyen d'encapsulation , ledit P-l,3-glucane insoluble dans l'eau, qui peut être préparé de telle façon soit à flotter sur l'eau soit à se déposer dans l'eau suivant la densité du matériel formant noyau particulier choisi. A titre de matériel formant noyau on peut utiliser des perles SIRASU , des pierres ponce, d'alumine, de silice, des perles de verre , des perles de verre creuses, etc.
Lorsque la densité du matériel formant noyau est plus élevée que 1 , les microcapsules constituant le garnissage dans une colonne présentent des propriétés de vitesse de circulation toujours supérieures à celles des perles de gel de P-l,3-glucane non solubles dans l'eau. Lorsque les microcapsules ont une densité inférieure à 1 une enzyme ou un ingrédient actif peut être attaché au noyau pour produire une préparation enzymatique immobilisée et si cette préparation est utilisée dans un système de réaction par étape où le produit de réaction se sépare par précipitation, l'enzyme immobilisée va flotter sur le mélange réactionnel et pour cette raison faciliter considérablement la séparation du produit de réaction. On a ainsi un procédé très avantageux du point de vue commercial.
Les techniques de filtration de gel connues, sont compatibles avec les perles de gel suivant la présente invention. Suivant une technique exemplaire, une colonne est garnie
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et puis une solution tampon appropriée est amenée à passer à travers la colonne à une vitesse de circulation appropriée pour laver le lit. On applique ensuite une quantité prédéterminée
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colonne. L'élution est effectuée en utilisant une solution tampon similaire à une vitesse de circulation prédéterminée et l'éluat est collecté en fractions. Ce procédé peut être appliqué
à la séparation de mélanges et pour la détermination du poids moléculaire de protéines, de polysaccharides ou d'autres substances.
Lorsque les perles de gel selori la présente invention sont utilisées à titre de support pour des.enzymes immobilisées ou pour la chromatographie par affinité il,a été trouvé que plus le diamètre des perles est petit , plus la quantité d'en-
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sont utilisées à titre de garnissage dans une colonne, la chute de pression doit être à nouveau prise en considération. A cet égard le diamètre des perles est de préférence compris entre
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tats entre environ 30 et 300 � .
Pour préparer des enzymes immobilisées ou un complexe support-ligand utilisable dans la chromatographie par affinité, le procédé décrit dans la demande allemande publiée n[deg.]25 51438 peut par exemple être utilisé. Ainsi une partie des perles de
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d'un halogénure de cyanogène. Sous agitation à une température qui peut varier entre 0[deg.] et 50[deg.]C, le pH du mélange réactionnel est augmenté jusqu'à 11 par une addition goutte à goutte d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 2N en prenant soin de
ne pas causer la dissolution des perles de gel (à une vitesse d'environ 0,5 unité de pH/minute). Le mélange est maintenu à
un pH de 11 pendant un quart d'heure supplémentaire au cours duquel la réaction d'activation est effectuée complètement . Après achèvement de la réaction, les solides sont récupérés par filtration, rincés avec 10 fois leur volume en eau. Les perles de gel activées ainsi obtenues sont insolubles dans l'eau et dans les solutions aqueuses d'alcali et ne gélifient pas à la chaleur, les dimensions et la résistance des perles individuelles sont appropriées, suffisamment pour entraîner une vitesse
et une circulation suffisantes lorsqu'ils sont utilisés comme garnissage dans des colonnes.
Des complexes 'support-ligands peuvent également être fabriqués en utilisant ces perles de gel activées. Un procédé pour confectionner de tels complexes consiste à faire réagir lesdites perles de gel activées avec une substance contenant des groupements amino secondaires ou primaires comme par exemple
une enzyme, une protéine , un peptide, un amino acide, un coenzyme, un substrat d'enzyme ou inhibiteur, un antigène, un anticorps, une hormone, etc.. de préférence dans une solution aqueuse faiblement alcaline ayant une température choisie entre environ 0[deg.]C et environ 50[deg.]C.
Les exemples de référence et de mise en oeuvre de l'invention suivants sont destinés à illustrer celle-ci et en particulier les mises en oeuvre préférées sans pour autant constituer une limitation de la portée de la présente invention Exemple de référence 1
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(méthode thermique) a été examinée en utilisant des colorants
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qués dans le tableau 1 .
Tableau 1
Essai de coloration
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Exemple de référence 2
11 applicabilité des perles de gel PS-1 selon l'exemple 1, indiqué ci-après à titre de support pour des enzymes immobilisées ou pour la chromatographie par affinité a été examiné.
a) les perles de gel ci-dessus sont chargées dans une colonne ayant un diamètre interne de 21,1 mm pour préparer un lit ayant une hauteur de 50 mm. De l'eau est amenée à passer à travers le. lit au moyen d'une pompe volumétrique et on examine la relation entre la vitesse de flux par rapport à la chute de pression.
Les résultats sont indiqués dans le tableau 2.
Tableau 2
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Les résultats indiqués dans le tableau 2 démontrent clairement que les perles de gel selon la présente invention ont d'excellentes propriétés de vitesse de flux qui font qu'elles sont très appropriées pour être utilisées comme support en chromatographie.
b) Dans un procédé d'activation de perles de gel,
100 ml d'eau distillée sont additionnés à 133 ml de perles de gel correspondant à 5 g de poudre PS-1 pour obtenir une suspension. Par ailleurs 5 g de BrCN sont dissous dans 100 ml d'eau distillée. La suspension et la solution sont combinées et le pH est amené à croître graduellement par addition de NaOH 5N jusqu'à ce que l'on atteigne un pH de 11. Le système est maintenu à un pH de 11 pendant 15 minutes pour obtenir un <EMI ID=27.1>
verre et le gâteau est rincé avec 500 ml d'eau distillée.
En vue d'examiner la capacité du produit ci-dessus de retenir des vitesses de flux élevées dans des conditions expérimentales de chromatographie sur colonne, les chutes de pression ont été déterminées de la façon suivante. Le produit est chargé dans une colonne chromatographique ayant un diamètre de 19,5 mm et une hauteur de 229 mm et l'eau a été amenée à passer à travers cette colonne en faisant varier les vitesses de circulation au moyen d'une pompe volumétrique dans le but de déterminer la modification des hauteurs du lit et les-chutes de pression. Les résultats sont représentés dans le tableau 3.
Tableau 3
<EMI ID=28.1>
On constatera que les perles ont une rigidité et une non.compressibilité élevées et que comme représenté sur la figure 1
(où la chute de pression est exprimée en considération que la hauteur du lit'de perles est égale à 1 mètre) les propriétés de vitesse de flux des perles sont supérieures à celles du gel d'agarose qui est le produit le plus utilisé actuellement, ce qui démontre que les perles selon la présente invention sont mieux appropriées, pour être utilisées comme support en chromatographie.
c) L'exemple est relatif à la production d'une préparation d'enzymes immobilisées en utilisant des perles de gel PS-1 , 126 ml de perles de gel PS-1 activées mentionnées ci- <EMI ID=29.1>
(voir demande japonaise n[deg.] 25388/1972 (traité-CMC, lyophilisé). Après l'addition de 50 ml d'un tampon au phosphate 0,2M (pH 8,0) de 24 ml d'eau distillée le mélange est agité à 5[deg.]C et pH 8 pendant 20 heures. Le mélange réactionnel est filtré et le gâteau est lavé avec une solution de glycine 0,2M, de chlorure de sodium aqueuse 0,5M et d'eau distillée dans cet ordre pour préparer une préparation d'enzymes immobilisées.
Par le procédé indiqué ci-dessus 95 % des protéines ont été immobilisés . L'activité de l'enzyme de cette opération
a été déterminée en basant l'ensemble sur la vitesse d'hydrolyse du D-phénylglycine méthyl éther. Selon cet essai, 90 % de l'activité a été trouvé comme étant immobilisée.
Exemple de référence 3
On examine l'applicabilité des perles de gel PS-1 à
la' filtration de gel.
<EMI ID=30.1>
a été chargée avec des perles de gel PS-1 selon l'exemple 4 cidessous à une hauteur de 415 mm et lavée avec un tampon de tris-
<EMI ID=31.1>
30 ml/heure..
TTn ml de cette même solution tampon à laquelle on a additionné 3 mg de l'un quelconque des échantillons mentionnés dans le tableau 4 a été appliqué à la colonne et le développement a ensuite été effectué avec la même solution de tampon à une vitesse de plus de 30 ml/heure. L'effluent est collecté dans des
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bleau 4 montrant que les échantillons émergent des colonnes dans l'ordre de leur poids moléculaire démontrent l'utilité des perles comme tamis moléculaire. La relation entre le poids moléculaire et le coefficient de distribution est tel que représenté sur la figure 2 pour le gel PS-1, la limite d'exclusion dans la gamme des poids moléculaires pour des protéines globulaires a <EMI ID=33.1>
Tableau 4
<EMI ID=34.1>
Exemple de référence 4
<EMI ID=35.1>
suivant l'exemple 19 indiqué ci-dessus comme support pour enzymes immobilisées.
On additionne dans un procédé d'activation de perles de gel, 100 ml d'eau distillée à 115 ml de perles de gel (correspondant à 5 g de poudre PS-1) pour obtenir une suspension. Par ailleurs 5 g de BrCN sont dissous dans 100 ml d'eau distillée. La suspension et la solution sont combinées et le pH est amené à croître graduellement par addition de NaOH 5N jusqu'à ce qui on atteigne un pH de 11. Le système est maintenu à un pH de 11 pendant 15 minutes, on obtient un gel activé de PS-1.
Le gel est filtré à travers un filtre de verre et le gâteau est rincé avec 500 ml d'eau distillée. 126 ml des perles de gel activés
(correspondant à 5 g de PS-1 en poudre) sont combinés avec une solution dans 50 ml d'eau distillée de 50,9 mg de l'hydrolase de l'ester de l'acide a-amino de Xanthomonas citri (IFO 3835)
(demande de brevet japonaise publiée n[deg.] 25388/1972) traitéCMC, lyophilisé). Après l'addition de 50 ml d'un tampon au
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lange est agité à 5[deg.]C et à un pH de 8 pendant 20 heures. Le mélange réactionnel est filtré , le gâteau est ensuite lavé avec une solution de glycine 0,2M, de chlorure de sodium 0,5M et de l'eau distillée dans cet ordre pour préparer une préparation d'enzymes immobilisées.
On obtient par le procédé ci-dessus 92,9 % de protéines immobilisées . L'activité enzymatique de cette préparation est déterminée en se basant sur la vitesse d'hydrolyse du D-phényl glycine méthyl ester. Suivant ce test 90% de l'activité ont été trouvés comme étant immobilisés.
Exemple de référence 5
On examine l'applicabilité des perles de gel de PS-1 obtenues dans l'exemple 19 ci-après à la filtration de gel.
Une colonne en verre ayant un diamètre intérieur de 15
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nuit à une vitesse de flux de 21 ml/heure.
Un ml de la même solution tampon à laquelle on additionne 3 mg de l'un des échantillons mentionnés dans le tableau 5, ont été appliqués à la colonne et on a effectué le développement avec la même solution tampon avec une vitesse de flux de 21 ml/h . L'effluent est collecté dans des fractions de
<EMI ID=38.1>
ception que la méthode à l'acide sulfurique-phénol a été utilisée pour le dextrane.
Les résultats indiqués dans le tableau 5 montrent que les échantillons sortent des colonnes dans l'ordre de leur poids moléculaire ce qui démontre l'utilité des perles à titre de tamis moléculaire. La relation entre le poids moléculaire et le coefficient de distribution est telle que la limite d'exclusion dans la gamme des poids moléculaires pour des protéines
<EMI ID=39.1>
Tableau 5
<EMI ID=40.1>
Exemple de référence 6
On additionne à 125 ml de PS-1 sous forme de perles
(diamètre des particules 50-200 microns) (équivalent à envi-
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de bromure de cyanogène à 5 % (poids/volume) .
On additionne goutte à goutte au moyen d'un titreur automatique en des quantités telles à accroître le pH graduel-
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de sodium 2N, à 25[deg.]C et sous agitation. Le système est maintenu à ce pH égal à 11 pendant environ 15 minutes, temps au cours duquel la réaction est effectuée jusqu'à la fin. A la suite de cette réaction, la matière solide est récupérée par filtration et rincée avec 500 ml d'eau distillée. Le procédé ci-dessus permet d'obtenir du PS-1 en forme de perles activées (poids sec : 5,1 g).
1 g de perles de gel de PS-1 activé ci-dessus (en
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tampon au phosphate 0,05 M (pH 8,0) pour préparer une suspension.
On additionne à cette suspension 20 ml de ladite solution tampon au phosphate dans laquelle 200 mg de �-amino-, caproyl-D-tryptophan méthyl ester à titre de liant ont été dissous. Le mélange est amené à réagir à 5[deg.]C sous agitation douce pendant 20 heures.
La matière solide est ensuite récupérée au moyen d'un filtre de verre et lavée avec 500 ml d'un tampon au phosphate
<EMI ID=45.1>
lavage, on calcule le pourcentage d'immobilisation du liant comme étant égal à 22 % .
Une colonne en verre ayant un diamètre de 20 mm a été garnie avec une matrice d'affinité obtenue par le procédé cidessus sur une hauteur de 100 mm et équilibrée avec un tampon
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d'a-chymotrypsine (fabriqué par Worthington Biochemical, Co . U.S.A.) ont été dissous, sont appliqués sur la colonne et
le lavage est effectué avec 100 ml de la même solution tampon.
8 % des produits originaux émergent par le procédé cidessus (déterminés quantitativement par l'absorbance 280 m�) l'activité de l'a-chymotrypsine.- déterminée sous forme de l'esterase en utilisant le benzoyl-L-tyrosine éthyl ester à titre de substrat n'a pas été rencontrée.
L'élution a été effectuée avec 100 ml d'acide acétique
<EMI ID=48.1> et l'on récupère 96 % de l'activité.
Exemple 1
<EMI ID=49.1>
de en poudre on additionne 270 ml d'eau purifiée, l'on agite de façon à préparer une bouillie. A cette bouillie on additionne
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une solution aqueuse de PS-1 et d'hydroxyde de sodium. Un bécher d'une capacité de 2. litres a été rempli avec 1200 ml de
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Nihon Emulsion CO Japon; qui est un agent de surface dérivé d'huile de ricin polyoxyéthylène hydrogéné) et sous agitation
<EMI ID=52.1>
tion aqueuse de PS-1 susnommée et de l'hydroxyde de sodium sont additionnés goutte à goutte à température ambiante. La dispersion de PS-1 résultante est additionnée à un mélange de 2000ml de toluène et 100 ml d'acide acétique sous agitation à 800 tours/ minute suivie par une agitation pendant encore une heure supplémentaire. Le mélange est ensuite maintenu au repos pendant 3 heures , temps au bout duquel le produit en forme de gel s'est déposé. Le solvant est éliminé par décantation et les sédiments résiduels sont rincés 5 fois avec des portions de 2 litres d'eau purifiée pour amener le pH jusqu'à neutralité, le solvant organique est de cette façon complètement éliminé. On obtient par ce procédé 240 ml de gel de PS-1.
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<EMI ID=54.1>
Chaque particule a été trouvée comme ayant une forme similaire à une perle. Une photomicrographie de ces perles de
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sont égales à 100 �) .
Exemple 2
Par un procédé similaire à celui décrit dans l'exemple 1 on dispèrse une solution aqueuse contenant de l'hydroxyde de sodium .-et PS-1 préparé à partir de 10 g de PS-1 en poudre,
<EMI ID=56.1> <EMI ID=57.1>
cide acétique. Par le procédé ci-dessus on obtient 206 ml de perles de gel ayant un diamètre de 50 à 150 � . Ce produit est approprié pour être utilisé comme matrice.
Exemple 3
'On répète le procédé décrit dans l'exemple 1 à l'exception que l'on utilise à titre d'agents de surface 6 g d'Emalex�HC-40 (vendu sous cette marque par Nihon Emulsion Co. Ltd. Japon) pour obtenir 265--ml de perles de gel ayant un diamètre compris entre 50 et 250 � . Ces perles sont appropriées pour être utilisées comme -matrice.
Exemple 4
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Ltd. Japon) on répète le procédé décrit dans l'exemple 1 pour
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Exemple
En utilisant 6 g d'Emale C-40 (marque d'un produit vendu par Nihon Emulsion Co. Ltd. Japon) qui est un dérivé de l'huile de ricin polyoxyéthylèné) on répète le procédé de l'exemple 1 pour obtenir 312 ml de perles de gel ayant un diamètre de 15 à 100 il . Ces perles à nouveau sont appropriées pour être utilisées comme matrice .
Exemple 6
En utilisant 6 g de Tween 60 comme agent de surface le procédé de l'exemple 1 est répété pour obtenir des perles de gel
<EMI ID=60.1>
pour être utilisées comme matrice.
Exemple 7
En utilisant du benzène à la place du toluène à titre
de véhicule de dispersion on répète le procédé décrit dans l'exemple 1 pour obtenir 240 ml de perles de gel ayant un diamètre compris entre 100 et 300 � . Ces perles sont appropriées pour être utilisées comme matrice .
Exemple 8
Sous agitation à 1200 tours/minute on répète le procédé décrit dans l'exemple 1 pour obtenir 223 ml de perles de gel a-
<EMI ID=61.1>
utiles comme matrice
Exemple 9
On répète le procédé de l'exemple 1 à l'exception que l'on utilise de l'acide formique à la place de l'acide acétique à titre d'agents de neutralisation et l'on obtient 250 ml de perles de gel ayant 40 à 200 �.comme diamètre qui sont appropriés pour être utilisés comme matrice .
Exemple 10
On additionne à 3 g de poudre de pachymane 90 ml d'eau purifiée et on agite ensuite pour obtenir une bouillie. Par addition de 10 ml de NaOH 5N le pachymane est dissous . Un bêcher ayant une capacité de 1 litre est rempli avec 500 ml
<EMI ID=62.1>
à 800 tours/minute ,la solution aqueuse susnommée de pachimane et l'hydroxyde de sodium est additionnée goutte à goutte à température ambiante.
La dispersion de pachymane résultante est additionnée à un mélange de 2000ml de toluène et 100 ml d'acide acétique, puis agitée pendant une heure. Le solvant est éliminé par décantation et le gel sédimenté est rincé avec de l'eau. On ob-
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un diamètre de 50 à 300 Il Ce produit est approprié pour être utilisé comme matrice.
Exemple 11
On répète le procédé tel que décrit dans l'exemple 1
à l'exception que l'on utilise une agitation de 2100 �ours/minu-
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5 à 50 microns. Ces perles sont appropriées pour être utilisées comme matrice .
Exemple 12
On répète le procédé tel que décrit dans l'exemple 1
à l'exception que l'on effectue une agitation à 400 tours/minute
<EMI ID=65.1>
me matrice .
Exemple 13
3 g de PS-1 en poudre sont dissous par addition de
144 ml d'eau purifiée et 16 ml de NaOH IN. A cette solution on additionne 9 g de perles de SIRASU (tamis de 40 - 80 mailles de 0,42 à 0,177 mm) vendu par Sanki Engineering Co. Ltd.Japon et l'on agite ensuite. On additionne goutte à goutte à ce mélange sous agitation à 360 tours/minute une solution de 600 ml de
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ne ensuite 15 ml d'acide acétique pour entraîner la gélification. Le mélange réactionnel est filtré à travers un tissu en nylon et le gâteau est rincé avec de l'eau. Comme cela apparaît à partir de la figure 4 (8 graduations de l'échelle correspondant à 100 �) un examen microscopique du gâteau montre que l'on a produit des microcapsules sphériques de tamis 20 à 40 mailles
(0,84 à 0,42 mm) comprenant chacune un noyau constitué d'une perle de SIRASU et une enveloppe de PS-1 .
Exemple 14
On répète le procédé de l'exemple 13 à l'exception que l'on utilise à la place du toluène du dichloroéthane. pour obtenir les microcapsules.
Exemple 15
On répète le procédé de l'exemple 13 à l'exception que l'on utilise de l'alumine moulée sous forme sphérique vendue par Mizusawa Industrial Chemicals Ltd. Japon dénommé Neo Bead C) de tamis 14-60 (mailles 1,41 - 0,25 mm) à la place des perles SIRASU pour obtenir des microcapsules.
Exemple 16
On répète le procédé décrit dans l'exemple 13 à l'exception que l'on remplace les perles de SIRASU par des perles de verre (vendues par Nippon Electric Glass Co. Ltd. Japon BH-W de tamis 150-200 (mailles 0,104 - 0,074 mm) pour obtenir des microcapsules.
Exemple 17
On répète le procédé décrit dans l'exemple 13 à l'exception que l'on remplace les perles de SIRASU par de la silice moulée sphériquement (vendues par Mizusawa Industrial Chemicals Ltd., dénommé Silbead W) , de tamis 4-6 (mailles 4,76 - 3,36 mm) , ce procédé permet d'obtenir des microcapsules.
Exemple 18
On-répète le procédé décrit dans l'exemple 13 à l'exception que'l'on utilise à la place des perles de SIRASU de
la pierre ponce vendue par Ishikawaraito, Co. Ltd. de
tamis 28-40, (mailles 0,589-0,42) pour obtenir des microcapsules.
<EMI ID=67.1>
distillée , puis on agite pour obtenir une suspension. Cette suspension est additionnée goutte à goutta à 2 litres d'huile de mâche chauffée à 80 - 85[deg.]C sous agitation avec un homomélangeur à 250 tours/minute suivi par l'agitation pendant 30 minutes supplémentaires. Après que la dispersion résultante de PS-1 ait été refroidie à température ambiante l'huile de mâche est éliminée par décantation et le gel sous forme de sédiment est rincé avec 400 ml de toluène. Ce rinçage est répété jusqu'à ce que l'on soit complètement débarrassé de l'huile
de salade.
Le toluène est éliminé de l'eau distillée par décantation. On obtient par ce procédé 460 ml de gel de PS-1. , gel qui a les diamètres suivants
<EMI ID=68.1>
Les perles Sirasu utilisées dans les.matrices suivant l'invention sont un sable de cendres volcaniques consistant en
<EMI ID=69.1>
d'oxyde ferrique (Fe203), 1,3 à 2,0% d'oxyde de calcium (CaO), 0,3 à 0,5% d'oxyde de magnésium MgO, 3,5 à 4,0% d'oxyde de sodium
(Na20) et 2,5 à 3,3% d'oxyde de potassium (KgO).
Tween 60 est une marque déposée pour le monostéarate de polyoxyéthylène sorbitan et vendue par Atlas Chemical Industries Inc. Wilmington U.S.A.
REVENDICATIONS
1. Matrice caractérisée par le fait qu'elle comprend
<EMI ID=70.1>
<EMI ID = 1.1>
The present invention relates to a matrix comprising
<EMI ID = 2.1>
pearl shape. The term matrix used in the present application means a support for immobilized enzymes, for affinity chromatography, gel filtration, ion exchange and other applications unless otherwise indicated.
The matrix materials used heretofore have been primarily polysaccharides. Among these, there may be mentioned cellulose, dextran, starch, agarose as well as their derivatives. Ideal matrix materials used for column packing such as for immobilized enzyme or affinity chromatography applications should
<EMI ID = 3.1>
microbiologically, 3) mechanically rigid, 4) hydrophilic,
5) possess an appropriate chemical function, 6) ready to couple with enzymes and ligands 7) have a spherical shape to allow liquids to pass freely above them, 8) not exhibit non-specific adsorption and
9) be obtained at low costs, among others.
None of the previously known materials meets the requirements mentioned above, and if the agarose gel is relatively satisfactory, this material is however disadvantageous insofar as it is 1) unstable against acids, 2) does not withstand not high temperatures and
3) Unsuitable for the preparation of large capacity columns with large packing heights due to its high compressibility.
The Applicant has carried out intensive research with a view to remedying these drawbacks and has discovered that the
<EMI ID = 4.1>
Gel beads when used as a template for immobilized enzymes or in affinity chromatography exhibit excellent flow rate properties as will be described in the Reference Examples as well as very desirable properties when used as a support in gel filtration, ion exchange or other applications. The present invention is based on v
these discoveries.
The object of the present invention is therefore a matrix
<EMI ID = 5.1>
bead form, useful for immobilized eneymes, affinity chromatography, gel filtration, ion exchange and other applications.
Another object of the present invention is a process
<EMI ID = 6.1>
in the form of beads with diameters ranging from about 5 to 1000 � .
Other objects will become apparent from the description below.
<EMI ID = 7.1>
sands according to the present invention, mention may be made of the polysaccharides produced by microorganisms of the Alcaligenes genus and of the Agrobacterium genus, such as polysaccharides produced by Alcaligenes faecalis var myxogenes 10C3K (Agricultural Biological Chemistry, Vol. 30, pages 196 and following, 1966,
<EMI ID = 8.1>
aunt U-19 (IFO 13126, ATCC 21679) (see U.S. Patent
3,754,925 and 3,822,250) hereafter called PS-2, the pachymane which is present in the crude drugs called Poria cocos
<EMI ID = 9.1>
rane which is an ingredient in brown algae, glucan which is one of the constituents of the cell wall of yeasts, etc. Among the preferred processes for the production of glucan beads, there may be mentioned -the process consisting in extruding, in to do
<EMI ID = 10.1>
soluble in water in a heated oil bath and thereby cause the gelation of the glucan (see Japanese Patent Application Laid-Open No. [deg.] 52953/1973); the process which consists
<EMI ID = 11.1>
aqueous sodium hydroxide solution and charging the resulting solution through a drip nozzle into aqueous hydrogen chloride solution to neutralize and cause gelation of the glucan (see U.S. patent.
n [deg.] 3 899 480) and the process of adding a
<EMI ID = 12.1>
drop into water an organic solvent which is not freely miscible with water and neutralize the resulting dispersion with an organic acid.
In the latter method, there can be used as an aqueous alkaline solution which is capable of dissolving -1,3-glucan insoluble in water, aqueous solutions of sodium hydroxide, sodium hydroxide. potassium, barium hydroxide, calcium hydroxide, lithium hydroxide, ammonia, etc.
The pH range of the alkaline aqueous solution is generally between 9 and 14 and preferably between
11 and 13.
<EMI ID = 13.1>
the water thus employed has an influence on the average diameter of the resulting beads. Normally this is chosen between
<EMI ID = 14.1>
The lower the P-1,3-glucan the larger the diameter of the resulting beads.
With regard to the method of dispersing the
<EMI ID = 15.1>
organic solvent which is hardly miscible with water, said solution is preferably added dropwise with stirring. Because there is no particular limit
<EMI ID = 16.1>
drip should be carried out, except that this period should not be too long and cause hydrolysis of the water insoluble P-1,3-glucan, a period of 10 to 90 minutes is generally suitable. In this operation, a surfactant can be added to the organic solvent if necessary. In general, such a surfactant is preferably nonionic, although this is not an exclusive choice. The concentration of a surfactant thus added relative to the organic solvent can vary between 0.1 and 20% and preferably between 0.2 and 10% weight / volume.
Although the organic solvent used can be any solvent which is not easily miscible with water, it is possible to mention, by way of typical example, aromatic hydrocarbons and their derivatives such as for example: benzene, toluene, xylene, etc. ., aliphatic hydrocarbons and their derivatives such as, for example, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, hexane, cyclohexane, etc., ethers such as for example: diethyl ether, isopropyl ether, etc., esters such as, for example: ethyl acetate, butyl acetate. etc .; and alcohols such as for example: n-butanol, isobutanol, etc.
The rotational speed of the stirrer used to disperse the water-insoluble P-1,3-glucan in the aforementioned organic solvent has significant effects on the diameter of the beaded products. Generally, the higher the stirring speed, the smaller the diameter of the pearl-shaped products. A preferred method for gelling the
<EMI ID = 17.1>
adding an acid to the dispersion, said acid soluble in said organic solvent immiscible easily in water. Among the preferred acids, mention may be made of: formic acid, acetic acid, propionic acid, benzoic acid. Although it depends on the manufacturing conditions, the diameters of the non-water soluble P-1,3-glucan gel beads are generally between 5 and 1000 .
In the application of the gel beads according to the present invention as a gel filtration matrix their diameter generally should be desirably smaller in order to obtain a higher separation efficiency but in consideration of the pressure drop and pressure drop. other factors, the pearl diameters are preferably between about 5 and 500 - and for even better results in the range between about 30 and 150 -
To solve the problems resulting from the application of a matrix or of a support for immobilized enzymes or for affinity chromatography, the Applicant has further developed a process for encapsulating a material constituting the core of small diameter. with water insoluble P1,3-glucan. The Applicant has thus succeeded in preparing gel beads hereinafter called microcapsules consisting of a material forming a small core and as an encapsulating means, said water-insoluble P1,3-glucan, which can be prepared in such a way. either to float on water or to settle in water depending on the density of the particular core material chosen. As core material, SIRASU beads, pumice stones, alumina, silica, glass beads, hollow glass beads, etc. can be used.
When the density of the core material is higher than 1, the microcapsules constituting the packing in a column exhibit circulation speed properties always superior to those of the non-water soluble P-1,3-glucan gel beads. When the microcapsules have a density of less than 1 an enzyme or active ingredient can be attached to the nucleus to produce an immobilized enzyme preparation and if this preparation is used in a step reaction system where the reaction product separates by precipitation, the The immobilized enzyme will float on the reaction mixture and therefore greatly facilitate the separation of the reaction product. There is thus a very advantageous process from a commercial point of view.
The known gel filtration techniques are compatible with the gel beads according to the present invention. According to an exemplary technique, a column is packed
<EMI ID = 18.1>
and then an appropriate buffer solution is passed through the column at an appropriate circulation rate to wash the bed. Then apply a predetermined amount
<EMI ID = 19.1>
column. Elution is carried out using a similar buffer solution at a predetermined circulation rate and the eluate is collected in fractions. This process can be applied
for the separation of mixtures and for the determination of the molecular weight of proteins, polysaccharides or other substances.
When the gel beads according to the present invention are used as a carrier for immobilized enzymes or for affinity chromatography it has been found that the smaller the diameter of the beads, the greater the amount of en-
<EMI ID = 20.1>
are used as packing in a column, the pressure drop must be taken into account again. In this regard, the diameter of the beads is preferably between
<EMI ID = 21.1>
states between about 30 and 300 .
To prepare immobilized enzymes or a support-ligand complex which can be used in affinity chromatography, the method described in published German application No. [deg.] 25 51438 can for example be used. So some of the pearls of
<EMI ID = 22.1>
of a cyanogen halide. With stirring at a temperature which can vary between 0 [deg.] And 50 [deg.] C, the pH of the reaction mixture is increased to 11 by the dropwise addition of a 2N aqueous sodium hydroxide solution. taking care of
do not cause the gel beads to dissolve (at a rate of approximately 0.5 pH units / minute). The mixture is kept at
a pH of 11 for an additional quarter of an hour during which the activation reaction is carried out completely. After completion of the reaction, the solids are collected by filtration, rinsed with 10 times their volume in water. The activated gel beads thus obtained are insoluble in water and in aqueous alkali solutions and do not gel on heat, the dimensions and strength of the individual beads are suitable, enough to drive a speed.
and sufficient circulation when used as packing in columns.
Support-ligand complexes can also be made using these activated gel beads. A process for making such complexes consists in reacting said activated gel beads with a substance containing secondary or primary amino groups such as for example
an enzyme, a protein, a peptide, an amino acid, a coenzyme, an enzyme or inhibitor substrate, an antigen, an antibody, a hormone, etc., preferably in a weakly alkaline aqueous solution having a temperature chosen from about 0 [deg.] C and about 50 [deg.] C.
The following reference and implementation examples of the invention are intended to illustrate the latter and in particular the preferred implementations without, however, constituting a limitation on the scope of the present invention Reference Example 1
<EMI ID = 23.1>
(thermal method) was examined using dyes
<EMI ID = 24.1>
qued in Table 1.
Table 1
Color test
<EMI ID = 25.1>
Reference example 2
The applicability of the PS-1 gel beads according to Example 1, indicated below as a support for immobilized enzymes or for affinity chromatography was examined.
a) The above gel beads are loaded into a column having an internal diameter of 21.1 mm to prepare a bed having a height of 50 mm. Water is caused to pass through the. read by means of a positive displacement pump and examine the relationship between flow velocity versus pressure drop.
The results are shown in Table 2.
Table 2
<EMI ID = 26.1>
The results shown in Table 2 clearly demonstrate that the gel beads according to the present invention have excellent flow rate properties which make them very suitable for use as a support in chromatography.
b) In a gel bead activation process,
100 ml of distilled water are added to 133 ml of gel beads corresponding to 5 g of PS-1 powder to obtain a suspension. Furthermore, 5 g of BrCN are dissolved in 100 ml of distilled water. The suspension and the solution are combined and the pH is gradually increased by adding 5N NaOH until a pH of 11. The system is maintained at a pH of 11 for 15 minutes to obtain a < EMI ID = 27.1>
glass and the cake is rinsed with 500 ml of distilled water.
In order to examine the ability of the above product to retain high flow rates under experimental column chromatography conditions, pressure drops were determined as follows. The product is loaded into a chromatographic column having a diameter of 19.5 mm and a height of 229 mm and water has been passed through this column by varying the circulation speeds by means of a positive displacement pump in the purpose of determining the change in bed heights and pressure drops. The results are shown in Table 3.
Table 3
<EMI ID = 28.1>
It will be seen that the beads have high stiffness and non-compressibility and that as shown in Figure 1
(where the pressure drop is expressed considering that the height of the bead bed is equal to 1 meter) the flow velocity properties of the beads are superior to those of the agarose gel which is the most widely used product today, which demonstrates that the beads according to the present invention are better suited to be used as a support in chromatography.
c) The example relates to the production of an immobilized enzyme preparation using PS-1 gel beads, 126 ml of activated PS-1 gel beads mentioned above- <EMI ID = 29.1>
(see Japanese application no. [deg.] 25388/1972 (CMC-treated, lyophilized). After the addition of 50 ml of 0.2M phosphate buffer (pH 8.0) to 24 ml of distilled water on The mixture is stirred at 5 [deg.] C and pH 8 for 20 hours The reaction mixture is filtered and the cake is washed with a solution of 0.2M glycine, 0.5M aqueous sodium chloride and distilled water in this order to prepare a preparation of immobilized enzymes.
By the method indicated above 95% of the proteins were immobilized. The activity of the enzyme of this operation
was determined based on the rate of hydrolysis of D-phenylglycine methyl ether. According to this test, 90% of the activity was found to be immobilized.
Reference example 3
The applicability of PS-1 gel beads to
gel filtration.
<EMI ID = 30.1>
was loaded with PS-1 gel beads according to Example 4 below to a height of 415 mm and washed with Tris- buffer.
<EMI ID = 31.1>
30 ml / hour.
TTn ml of this same buffer solution to which was added 3 mg of any of the samples mentioned in Table 4 was applied to the column and development was then carried out with the same buffer solution at a higher speed. of 30 ml / hour. The effluent is collected in
<EMI ID = 32.1>
Bleau 4 showing that samples emerge from the columns in order of their molecular weight demonstrates the utility of the beads as a molecular sieve. The relationship between molecular weight and distribution coefficient is as shown in Figure 2 for the PS-1 gel, the exclusion limit in the range of molecular weights for globular proteins a <EMI ID = 33.1>
Table 4
<EMI ID = 34.1>
Reference example 4
<EMI ID = 35.1>
according to Example 19 indicated above as a support for immobilized enzymes.
In a process for activating gel beads, 100 ml of distilled water are added to 115 ml of gel beads (corresponding to 5 g of PS-1 powder) to obtain a suspension. Furthermore, 5 g of BrCN are dissolved in 100 ml of distilled water. The suspension and the solution are combined and the pH is gradually increased by addition of 5N NaOH until a pH of 11. The system is maintained at a pH of 11 for 15 minutes, an activated gel is obtained. of PS-1.
The gel is filtered through a glass filter and the cake is rinsed with 500 ml of distilled water. 126 ml activated gel beads
(corresponding to 5 g of PS-1 powder) are combined with a solution in 50 ml of distilled water of 50.9 mg of the hydrolase of the α-amino acid ester of Xanthomonas citri (IFO 3835 )
(Japanese published patent application No. [deg.] 25388/1972) CMC-treated, lyophilized). After adding 50 ml of buffer to
<EMI ID = 36.1>
The mixture is stirred at 5 [deg.] C and at a pH of 8 for 20 hours. The reaction mixture is filtered, the cake is then washed with a solution of 0.2M glycine, 0.5M sodium chloride and distilled water in that order to prepare a preparation of immobilized enzymes.
92.9% of immobilized proteins are obtained by the above process. The enzymatic activity of this preparation is determined based on the rate of hydrolysis of the D-phenyl glycine methyl ester. According to this test 90% of the activity was found to be immobilized.
Reference example 5
The applicability of the PS-1 gel beads obtained in Example 19 below to gel filtration was examined.
A glass column having an internal diameter of 15
<EMI ID = 37.1>
overnight at a flow rate of 21 ml / hour.
One ml of the same buffer solution to which is added 3 mg of one of the samples mentioned in Table 5, was applied to the column and development was carried out with the same buffer solution with a flow rate of 21 ml. / h. The effluent is collected in fractions of
<EMI ID = 38.1>
Ception that the sulfuric acid-phenol method was used for dextran.
The results shown in Table 5 show that the samples exit the columns in order of their molecular weight, demonstrating the utility of the beads as a molecular sieve. The relationship between molecular weight and distribution coefficient is such that the exclusion limit in the range of molecular weights for proteins
<EMI ID = 39.1>
Table 5
<EMI ID = 40.1>
Reference example 6
Is added to 125 ml of PS-1 in the form of beads
(particle diameter 50-200 microns) (equivalent to approx.
<EMI ID = 41.1>
5% (w / v) cyanogen bromide.
Add dropwise using an automatic titrator in such amounts as to gradually increase the pH.
<EMI ID = 42.1> <EMI ID = 43.1>
of 2N sodium, at 25 [deg.] C and with stirring. The system is maintained at this pH equal to 11 for about 15 minutes, during which time the reaction is carried out to completion. Following this reaction, the solid material is collected by filtration and rinsed with 500 ml of distilled water. The above process makes it possible to obtain PS-1 in the form of activated beads (dry weight: 5.1 g).
1 g of the above activated PS-1 gel beads (as
<EMI ID = 44.1>
0.05 M phosphate buffer (pH 8.0) to prepare a suspension.
To this suspension is added 20 ml of said phosphate buffer solution in which 200 mg of � -amino-, caproyl-D-tryptophan methyl ester as a binder have been dissolved. The mixture is reacted at 5 [deg.] C with gentle stirring for 20 hours.
The solid material is then collected by means of a glass filter and washed with 500 ml of a phosphate buffer.
<EMI ID = 45.1>
washing, the percentage of immobilization of the binder is calculated to be equal to 22%.
A glass column having a diameter of 20 mm was packed with an affinity matrix obtained by the above method to a height of 100 mm and equilibrated with a buffer.
<EMI ID = 46.1>
<EMI ID = 47.1>
α-chymotrypsin (manufactured by Worthington Biochemical, Co. U.S.A.) were dissolved, applied to the column and
washing is carried out with 100 ml of the same buffer solution.
8% of the original products emerge by the above method (quantitatively determined by absorbance 280 m �) α-chymotrypsin activity - determined as esterase using ethyl benzoyl-L-tyrosine ester as a substrate was not encountered.
Elution was carried out with 100 ml of acetic acid
<EMI ID = 48.1> and 96% of the activity is recovered.
Example 1
<EMI ID = 49.1>
of powder is added 270 ml of purified water, stirred to prepare a slurry. To this porridge we add
<EMI ID = 50.1>
an aqueous solution of PS-1 and sodium hydroxide. A beaker with a capacity of 2. liters was filled with 1200 ml of
<EMI ID = 51.1>
Nihon Emulsion CO Japan; which is a surfactant derived from hydrogenated polyoxyethylene castor oil) and with stirring
<EMI ID = 52.1>
Aqueous ration of the above-named PS-1 and sodium hydroxide are added dropwise at room temperature. The resulting PS-1 dispersion is added to a mixture of 2000 ml of toluene and 100 ml of acetic acid with stirring at 800 revolutions / minute followed by stirring for a further additional hour. The mixture is then kept at rest for 3 hours, at the end of which the gel-shaped product has settled. The solvent is removed by decantation and the residual sediments are rinsed 5 times with 2 liter portions of purified water to bring the pH to neutral, the organic solvent is in this way completely removed. 240 ml of PS-1 gel are obtained by this process.
<EMI ID = 53.1>
<EMI ID = 54.1>
Each particle was found to have a shape similar to a pearl. A photomicrograph of these beads
<EMI ID = 55.1>
are equal to 100 �).
Example 2
By a process similar to that described in Example 1, an aqueous solution containing sodium hydroxide and PS-1 prepared from 10 g of powdered PS-1 is dispersed,
<EMI ID = 56.1> <EMI ID = 57.1>
acetic acid. By the above process 206 ml of gel beads having a diameter of 50 to 150 are obtained. . This product is suitable for use as a matrix.
Example 3
The process described in Example 1 is repeated except that 6 g of Emalex ™ HC-40 (sold under this trademark by Nihon Emulsion Co. Ltd. are used as surfactants). Japan) to obtain 265 - ml of gel beads with a diameter between 50 and 250 � . These beads are suitable for use as a matrix.
Example 4
<EMI ID = 58.1>
Ltd. Japan) the process described in Example 1 is repeated for
<EMI ID = 59.1>
Example
Using 6 g of Emale C-40 (a trademark of a product sold by Nihon Emulsion Co. Ltd. Japan) which is a derivative of polyoxyethylenated castor oil) the process of Example 1 is repeated to obtain 312 ml of gel beads having a diameter of 15 to 100 µl. These beads again are suitable for use as a matrix.
Example 6
Using 6 g of Tween 60 as a surfactant the process of example 1 is repeated to obtain gel beads.
<EMI ID = 60.1>
to be used as a matrix.
Example 7
Using benzene instead of toluene as a
of dispersion vehicle, the process described in example 1 is repeated to obtain 240 ml of gel beads having a diameter between 100 and 300 & . These beads are suitable for use as a matrix.
Example 8
With stirring at 1200 revolutions / minute, the process described in Example 1 is repeated to obtain 223 ml of gel beads a-
<EMI ID = 61.1>
useful as a matrix
Example 9
The process of Example 1 is repeated except that formic acid is used instead of acetic acid as neutralization agents and 250 ml of gel beads having 40 to 200. As diameter which are suitable to be used as a die.
Example 10
90 ml of purified water are added to 3 g of pachymane powder and then stirred to obtain a slurry. By adding 10 ml of 5N NaOH, the pachymane is dissolved. A beaker with a capacity of 1 liter is filled with 500 ml
<EMI ID = 62.1>
at 800 revolutions / minute, the aforementioned aqueous solution of pachimane and sodium hydroxide are added dropwise at room temperature.
The resulting pachymane dispersion is added to a mixture of 2000 ml of toluene and 100 ml of acetic acid, then stirred for one hour. The solvent is removed by decantation and the sedimented gel is rinsed with water. We ob-
<EMI ID = 63.1>
a diameter of 50 to 300 Il This product is suitable for use as a die.
Example 11
The process is repeated as described in Example 1
except that an agitation of 2100 00 bears / minute is used.
<EMI ID = 64.1>
5 to 50 microns. These beads are suitable for use as a matrix.
Example 12
The process is repeated as described in Example 1
except that stirring is carried out at 400 revolutions / minute
<EMI ID = 65.1>
matrix me.
Example 13
3 g of powdered PS-1 are dissolved by adding
144 ml of purified water and 16 ml of IN NaOH. To this solution are added 9 g of SIRASU beads (40-80 mesh 0.42-0.177 mm sieve) sold by Sanki Engineering Co. Ltd. Japan and then stirred. To this mixture is added dropwise with stirring at 360 revolutions / minute a solution of 600 ml of
<EMI ID = 66.1>
do then 15 ml of acetic acid to cause gelation. The reaction mixture is filtered through a nylon cloth and the cake is rinsed with water. As can be seen from Figure 4 (8 graduations on the scale corresponding to 100%) microscopic examination of the cake shows that spherical 20-40 mesh sieve microcapsules were produced.
(0.84 to 0.42 mm) each comprising a core consisting of a SIRASU bead and a shell of PS-1.
Example 14
The process of Example 13 is repeated with the exception that dichloroethane is used instead of toluene. to obtain the microcapsules.
Example 15
The process of Example 13 was repeated except that molded alumina in spherical form sold by Mizusawa Industrial Chemicals Ltd. was used. Japan called Neo Bead C) of 14-60 sieve (1.41 - 0.25 mm mesh) instead of SIRASU beads to obtain microcapsules.
Example 16
The process described in Example 13 is repeated except that the SIRASU beads are replaced by glass beads (sold by Nippon Electric Glass Co. Ltd. Japan BH-W of sieve 150-200 (mesh 0.104 - 0.074 mm) to obtain microcapsules.
Example 17
The process described in Example 13 was repeated except that the SIRASU beads were replaced by spherically molded silica (sold by Mizusawa Industrial Chemicals Ltd., called Silbead W), sieve 4-6 (mesh size 4.76 - 3.36 mm), this process makes it possible to obtain microcapsules.
Example 18
The process described in Example 13 is repeated with the exception that the SIRASU beads of
pumice stone sold by Ishikawaraito, Co. Ltd. of
28-40 sieve, (0.589-0.42 mesh) to obtain microcapsules.
<EMI ID = 67.1>
distilled, then stirred to obtain a suspension. This suspension is added dropwise to 2 liters of lamb's lettuce oil heated to 80-85 [deg.] C with stirring with a homomixer at 250 revolutions / minute followed by stirring for a further 30 minutes. After the resulting dispersion of PS-1 has been cooled to room temperature, the lamb's lettuce oil is removed by decantation and the gel as a sediment is rinsed with 400 ml of toluene. This rinsing is repeated until the oil is completely removed.
salad.
Toluene is removed from distilled water by decantation. 460 ml of PS-1 gel are obtained by this process. , gel which has the following diameters
<EMI ID = 68.1>
The Sirasu beads used in the matrices according to the invention are a volcanic ash sand consisting of
<EMI ID = 69.1>
ferric oxide (Fe203), 1.3 to 2.0% calcium oxide (CaO), 0.3 to 0.5% magnesium oxide MgO, 3.5 to 4.0% sodium oxide
(Na20) and 2.5 to 3.3% potassium oxide (KgO).
Tween 60 is a registered trademark for polyoxyethylene sorbitan monostearate and sold by Atlas Chemical Industries Inc. Wilmington U.S.A.
CLAIMS
1. Matrix characterized by the fact that it includes
<EMI ID = 70.1>