"Polypeptides dérivés de la somatostatine" <EMI ID=1.1>
une influence inhibitrice 1) sur la sécrétion de l'homone de croissance par la glande pituitaire, 2) sur la sécrétion de glucagoa et d'insuline par le pancréas et 3) sur la sécrétion de polypeptide intestinal vasoactif, de sécrétine, de gastrine et d'acide gastrique chez l'homme et les animaux. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des peptides qui inhibent efficacement la libération de l'hormone de croissance par la glande pituitaire et la libération de glucagon et d'insuline par le pancré as .
<EMI ID=2.1>
hormone de croissance est décrit dans le brevet des E.U.A. n[deg.]
3 904 595. Ce peptide a été nommé "somatostatine". La somatostatine est un tétradécapeptide et répond à la structure suivante, dans laquelle les fragments aminoacide sont numérotés de gauche à droite selon la nomenclature usuelle :
<EMI ID=3.1>
La somatostatine, la forme linéaire de somatostatine (dihidro- <EMI ID=4.1> te invention porte sur cette découverte que certains aminoacides peuvent remplacer les substituants aminoacides du squelette de la somatostatine et de la dihidrosomatostatine, donnant ainsi des peptides qui sont thérapeutiquement utiles lorsqu'on les introduit directement ou indirectement dans le courant sanguin des mammifères pour inhiber la sécrétion d'hormone de croissance�ar la glande pituitaire et celle d'insuline et de glucagon par le pancréas. On peut introduire indirectement les peptides dans le courant sanguin par voie nasale, par implantation sous-cutanée ou intramusculaire ou par toutes autres méthodes connues, avec ou sans la présence d'un diluant ou véhicule. On peut introduire directement les peptides dans le courant sanguin par injection.
On a trouvé que divers peptides de l'invention ont un pouvoir plusieurs fois supérieur à celui de la somatostatine quand on les utilise pour inhiber l'hormone de croissance, l'insuline et le glucagon.
<EMI ID=5.1>
ayant un effet d'inhibition : 1) sur la sécrétion d'hormone de
<EMI ID=6.1>
glucagon et d'insuline par le pancréas des mammifères, y compris <EMI ID=7.1>
Ces buts de l'invention, ainsi que d'autres, apparaîtront mieux dans la description détaillée ci-après.
Généralement, selon l'invention, on a trouvé que des peptides ayant une activité biologique d'inhibition de la sécrétion d'hormone de croissance sont celles qui répondent à la structure :
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1>
représente Ala, Asn ou dès-R2. On a déterminé que Tyr peut remplacer l'un des Phe en positions 7 et 11 ou tous les deux, sans que cela influence l'efficacité des peptides.On a découvert aussi que Ala peut remplacer tout substituant aminoacide des peptides ci-dessus.
Des groupes acyle préférentiels que l'on a trouvés propres à
<EMI ID=10.1> les peptides pontés, il est préférable que l'aminoacide ne contienne pas de groupe sulfhydryle; (c) un dipeptide tiré de deux aminoacides quelconques dont le deuxième, relié à Cys<3>, ne cause pas d'empêchement stérique ; le deuxième aminoacide est de préférence Gly, Ala ou 5 -Ala ; pour les peptides pontés, il est préférable que les aminoacides des dipeptides ne contiennent pas de groupe sulfhydryle ; (d) un tripeptide dont le troisième amino-
<EMI ID=11.1>
les deux autres aminoacides sont quelconques ; le troisième aminoacide du tripeptide est de préférence Gly, Ala ou D-Ala ; pour les peptides pontés, il est préférable qu'aucun des aminoacides du tripeptide ne contienne de groupe sulfhydryle ; (e) un pentapeptide dont les trois premiers constituants aminoacides sont Gly, le quatrième est Ala ou D-Ala et le cinquième, relié à Cys', ne cause pas d'empêchement stérique et peut être Ala, Gly ou D-Ala ; (f) des acides organiques aliphatiques, aromatiques ou cycliques autres que les aminoacides, contenant 1 à 10 atomes de carbone ; les acides organiques peuvent être saturés et/ou contenir d'autres groupes fonctionnels ; des groupes acyle particulièrement préfé-
<EMI ID=12.1>
Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, acétyle, acroyle, pivaloyle, et <EMI ID=13.1>
Sauf lorsqu'on utilise D-Trp, chacun des aminoacides contenus dans la partie des peptides de l'invention qui est située entre les deux groupes Cys et comprend ceux-ci, donc aux positions 3 à
14, est l'isomère L lorsque l'aminoacide comporte des formes iso-
<EMI ID=14.1>
tides de l'invention peut être l'isomère L ou l'isomère D lorsque l'aminoacide comporte des formes isomères. Un peptide préférentiel
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
on obtient des peptides ayant un pouvoir plusieurs fois supérieur à celuidelasomatostatine quant à l'inhibition de l'hormone de croissance et aussi quant à la libération de glucagon et s'insuline. En remplaçant par Ala divers aminoacides du squelette de la somatôstatine, on obtient aussi des peptides ayant une activité pharmaceutique notable.
On prépare synthétiquement les peptides de l'invention par des techniques en phase solide, généralement par le procédé décrit dans le brevet des E.U.A. n[deg.] 3 904 595 déjà cité. On conduit la synthèse de façon discontinue sur une résine chlorométhylée. La résine est composés de perles fines (20 à 70 microns de diamètre) d'une résine synthétique que l'on prépare en copolymérisant le styrène avec 1 à 2 % de divinylbenzène. Les noyaux benzène de la résine sont chloromcthylés dans une réaction Friedel-Crafts sur l'éther chlorométhyl-méthylique et le chlorure stannique. Le chlore ainsi introduit est en liaison réactive du type chlorure de benzyle. On poursuit la réaction Friedel-Crafts jusqu'il ce que la résine contienne 0,5 à 2 millimoles de chlore par gramme de résine.
Dans la suite de la'description de la synthèse des peptides, les réactifs utilisés sont d'abord définis par leur nom chimique, leur abréviation usuelle étant entre parenthèses ; par la suite, on désigne le réactif par l'abréviation usuelle.
On prépare un peptide répondant à la structure :
<EMI ID=17.1>
par la technique on phase solide ci-après. On prépare par une technique similaire d'autres peptides définis ci-après.
<EMI ID=18.1> <EMI ID=19.1>
le sel de potassium de l'aminoacide protégé par Boc. On n'utilise qu'un milliéquivalent de Cys protégé par milliéquivalent de Cl de la résine. Le procédé 3 est décrit plus en détail ci-après : à une bouillie de la résine et du Cys protégé dissous dans DMSO, on ajoute 0,9 milliéquivalent (méq) de tertbutylate de potassium
(KOtBut) par méq d'aminoacide. On expose le mélange le moins possible à l'air de façon qu'on n'observe pas de coloration ambrée.
La réaction à 80[deg.]C pendant 2 heures donne une résine substituée
<EMI ID=20.1>
d'aminoacide par gramme de résine). Après élimination du groupe protecteur et neutralisation, on forme la chaîne peptide sur la
résine. L'élimination du groupe protecteur, la neutralisation et l'addition de chaque aminoacide s'effectuent selon le programme I.
<EMI ID=21.1>
aminoacide, si ce n'est que l'on peut utiliser n'importe quel � groupe protecteur de groupe " -amine pour le résidu alanine
(benzyloxycarbonyle ; Z; Boc etc.). Après élimination du groupe protecteur du premier résidu (c'est-à-dire SpOMe Bzl Cys) selon
<EMI ID=22.1>
de Ser en même temps qu'un agent d'enchaînement qui est le dicyclo- <EMI ID=23.1> thréonine. On utilise l'ester p-nitrophénylique (ONp) pour activer l'extrémité carboxyle de Asn. On peut aussi utiliser à cet effet l'ester o-nitrophénylique. On peut utiliser des groupes formyle
<EMI ID=24.1>
peptide est un acide organique, on rattache celui-ci au peptide avant de le détacher de la résine. Pour rattacher l'acide organique au peptide fixé sur la résine) on introduit l'acide organique en présence de DCC ou de l'anhydride organique ou de l'ester actif organique. On peut aussi ajouter l'acide organique en l'utili- <EMI ID=25.1>
ajouté.
1 - Programme pour l'enchaînement d'aminoacides autres que Asn
dans une synthèse en phase solide (5 à 10 g de résine)
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
ninhydrine ; si l'essai est négatif, revenir à l'étape 1 pour l' enchaînement de l'aminoacide suivant ; si l'essai est positif ou légèrement positif, revenir aux étapes 9 à 13. On utilise le pro-
<EMI ID=28.1>
avec Cys, à l'exception de Asn lorsqu'il est présent. Pour Asn, les étapes 1 à 8 sont les mêmes et on utilise le programme II pour le reste de la réaction d'enchaînement :
Programme II page suivante.
<EMI ID=29.1>
actif dans une synthèse en phase solide (5 à 10 g de résine)
<EMI ID=30.1>
Après l'étape 14, on prélève une portion pour un essai à la
<EMI ID=31.1>
enchaînement de l'aminoacide suivant ; si l'essai est positif ou légèrement positif, revenir aux étapes 9 à 14.
La coupure entre les peptides et la résine (5 g) et.l'élimination des groupes protecteurs en chaîne latérale du peptide s' effectuent dans l'acide fluorhydrique (75 ml) en présence d'anisole (8 ml). Après élimination de l'acide fluorhydrique sous vide poussé, on lave ensemble résine-peptide à l'éther.
On extrait immédiatement la résine séchée par l'acide acéti-
<EMI ID=32.1>
(N2). On ajuste le pH de la solution entre 6,6 et 7,0 avec NH40H. On titre la solution goutte à goutte en agitant avec une solution de ferricyanure de potassium (1 g/500 ml de Il 20) jusqu'à ce qu'on observe une couleur jaune permanente. On laisse reposer la solution pendant 10 minutes et on ajuste le pH à 5,0 au moyen d'acide
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
on agite pendant 15 minutes. On filtre la solution sur de la celite et on l'applique successivement sur deux colonnes : a) ré-
<EMI ID=35.1>
Rex-70" (100 ml), forme cationique. On lave soigneusement le touxteau de célite et de résine avec 500 ml d'eau que l'on applique
<EMI ID=36.1>
moyen d'un mélange pyridine-acide acétique-eau (30 : 4 : 66) ou <EMI ID=37.1>
dilue à l'eau seulement celles qui contiennent du peptide (positives à la ninhydrine) et on les lyophilise immédiatement. On obtient 1,2 g de matière brute de couleur crème. On l'applique sur
<EMI ID=38.1>
et on élue par l'acide acétique 2n.
La courbe d'élution observée à 280 nm présente un pic symé-
<EMI ID=39.1>
une colonne de partage 1,8 x 100 cm (butanol normal-acide acétique
-eau 4 : 1 : 5). La courbe d'élution (280 nm) présente un pic principal de V 2,5 à 4,0. On sépare deux fractions qui apparaissent ensuite identiques à la chromatographie en couche mince (165 mg) <EMI ID=40.1>
vées à la chromatographie en couche mince pour les peptides synthétiques. Le produit désiré s'élue sous la forme d'une bande très étroite qui, après 2 lyophilisations, donne une poudre duveteuse blanche (Il; mg). On observe une impureté peu importante
<EMI ID=41.1>
acétique-eau (4:1:5) (BAW). On applique cette matière (100 mg) sur une colonne de partage 1,8 x 100 cm. La courbe d'élution (280
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
utilise pour inhiber la libération d'hormone de croissance par les cellules pituitaires mises en culture ou pour inhiber la libération d'insuline et de glucagon par le pancréas sous l'action de l'arginiue.
On peut utiliser des esters actifs dans une synthèse en phase solide et on peut aussi utiliser le procédé classique de synthèse pour préparer les peptides de l'invention.
On a mis au point un titrage in vitro de l'efficacité des
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
glandes pituitaires prélevées sur des rats pour en séparer des cellules. On place les adules dans des boîtes de culture sur un milieu Eagle modifié (Dulbecco et al., Virology, volume 8, page
396, 1949). On amène de l'anhydride carbonique et de l'oxygène
<EMI ID=46.1>
de milieu., on ajoute des cultures de cellules qui ont incubé pendant 4 heures et des peptides somatostatines particuliers. On uti-
<EMI ID=47.1>
sécrétion d'hormone de croissance, exprimé en nanogrammes par heure.
Les peptides de l'invention inhibent la stimulation basale et stimulée d'insuline et de glucagon chez les mammifères, y com-
<EMI ID=48.1>
la libération d'insuline et de glucagon par le pancréas de rat perfusé, les cellules insulaires isolées et les cultures primaires in vitro de cellules pancréatiques dispersées par voie enzymatique. Il semole que les :peptides ont un effet direct sur les cel-
<EMI ID=49.1>
de glucagon.
On étudie comme suit l'effet de la somatostatine, de la di-
-hydrosomatostatine (comme témoin) et des peptides de l'invention, quant à l'inhibition de la libération de glucagon et d'insuline :
On utilise dans toutes les expériences des rats mâles SpragusDawley pesant 180 à 220 g, séjournant dans des logements à température et à humidité réglée, avec 14 heures de lumière et 10 heures d'obscurité (lumière de 7 à 21 h). On donne aux animaux de la
<EMI ID=50.1>
moins 5 jours après l'arrivée des rats venant du fournisseur, entre 14 et 16 heures. Après anesthésie par l'éther, on administre des peptides ou du sérum physiologique en un volume de 0,2 ml par la veine jugulaire externe et immédiatement après, un bol de 1 ml d'arginine. Cinq minutes plus tard, on recueille, du sang tronculaire par décapitation rapide.. On effectue la détermination de l'insuline et du glucagon dans le plasma par,des titrages radioimmunologiques spécifiques. On détermine des valeurs d'efficacité rela-
<EMI ID=51.1>
� quatre et six points.
L'arginine,lorsqu'elle est administrée à une dose de 100 mg/ <EMI ID=52.1>
insuline aussi bien que de glucagon. La somatostatine et la dihydrosomatostatine inhibent la libération d'insuline et de glucagon sous l'action de l'arginine, de façon également puissante en fonction de la dose (indiquée dans les deux cas à 100 ug/100 g de poids du sujet).
On prépare divers peptides selon l'invention, conformément
à la technique en phase solide décrite ,plus haut. La composition
<EMI ID=53.1>
<EMI ID=54.1>
Peptide
Témoin (somatostatine)
<EMI ID=55.1>
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 13 14
Peptides de l'invention
Les peptides suivants sont pontés et répondent à la structure;
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
On détermine, par l'essai in vitro décrit plus haut l'efficacité de la somatostatine (témoin) et des peptides de l'invention quant à l'inhibition de la sécrétion d'hormone de croissance. Cha-
<EMI ID=58.1> <EMI ID=59.1>
la sécrétion d'hormone de croissance. On détermine aussi l'éfficacité relative des peptides de l'invention., mentionnés au tableau I, pour l'inhibition de la sécrétion de glucagon et d'insuline sous l'action de l'arginine. Chacun des peptides de l'invention est 8 à 10 fois plus efficace que la somatostatine quant à l'inhibition de la sécrétion de glucagon et d'insuline sous l'action de l'arginine.
On prépare divers autres peptides selon l'invention, ayant des structures identiques à celles qui sont indiquées au tableau I, si ce n'est que Tyr remplace Phe à l'une des positions 7 et 11 ou à toutes les deux. Ces peptides .substitués par Tyr ont aussi un
<EMI ID=60.1>
quant à l'inhibition de l'hormone de croissance, du glucagon et de l' insuline .
On prépare aussi par synthèse des contre-parties linéaires des peptides selon l'invention, indiqués au tableau I. Ces peptides linéaires ont aussi un pouvoir au moins 8 fois supérieur à
<EMI ID=61.1>
croissance, du glucagon et de l'insuline.
Le tableau II indique les pouvoirs relatifs (somatostatine =
100 %) d'une série de peptides de l'invention, quant à l'inhibition de la sécrétion d'hormone de croissance et à l'inhibition de
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
Pouvoirs relatifs de la somatostatine (SRIF) et de la somatostatine substituée, quant à l'inhibition de la libération d' hormone de croissance (GH) par les cellules pituitaires antérieures in vitro et à l'inhibition de la libération d'insuii-line et de glucagon sous l'action de l'arginine in vivo. Pour les déterminations in vivo, on administre les peptides par injection dans la veine jugulaire immédiatement avant l'injection d'arginine (100 mg/100 g de poids du sujet)
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
1. Composé à action inhibitrice de la sécrétion d'hormone de croissance par la glande pituitaire ou de la libération par le pancréas de glucagon et d'insuline chez l.es mammifères, caractéri-
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
tique aromatique ou cyclique avec jusqu'à 10 atomes de carbone, un hydrogène ou un dérivé dès des groupes précités, et où R2 est Ala, dès-Ala, Asn ou dès-Asn.
"Somatostatin-derived polypeptides" <EMI ID = 1.1>
an inhibitory influence 1) on the secretion of growth homone by the pituitary gland, 2) on the secretion of glucagoa and insulin by the pancreas and 3) on the secretion of vasoactive intestinal polypeptide, secretin, gastrin and gastric acid in humans and animals. More particularly, the invention relates to peptides which effectively inhibit the release of growth hormone by the pituitary gland and the release of glucagon and insulin by the pancreas.
<EMI ID = 2.1>
growth hormone is described in the U.S. Patent. n [deg.]
3,904,595. This peptide was named "somatostatin". Somatostatin is a tetradecapeptide and has the following structure, in which the amino acid fragments are numbered from left to right according to the usual nomenclature:
<EMI ID = 3.1>
Somatostatin, the linear form of somatostatin (dihidro- <EMI ID = 4.1> The invention relates to the discovery that certain amino acids can replace the amino acid substituents in the backbone of somatostatin and dihidrosomatostatin, thereby yielding peptides which are therapeutically useful when They are introduced directly or indirectly into the blood stream of mammals to inhibit the secretion of growth hormone la by the pituitary gland and that of insulin and glucagon by the pancreas. Peptides can be introduced indirectly into the stream. blood by the nasal route, by subcutaneous or intramuscular implantation or by any other known methods, with or without the presence of a diluent or vehicle The peptides can be introduced directly into the blood stream by injection.
Various peptides of the invention have been found to have several times the potency of somatostatin when used to inhibit growth hormone, insulin and glucagon.
<EMI ID = 5.1>
having an inhibitory effect: 1) on the secretion of hormone
<EMI ID = 6.1>
glucagon and insulin from the mammalian pancreas, including <EMI ID = 7.1>
These objects of the invention, as well as others, will appear more clearly in the detailed description below.
Generally, according to the invention, it has been found that peptides having a biological activity of inhibiting the secretion of growth hormone are those which respond to the structure:
<EMI ID = 8.1>
<EMI ID = 9.1>
represents Ala, Asn or de-R2. It has been determined that Tyr can replace one or both of the Phe at positions 7 and 11, or both, without influencing the efficiency of the peptides. It has also been found that Ala can replace any amino acid substituent of the above peptides.
Preferred acyl groups which have been found to be specific to
<EMI ID = 10.1> bridged peptides, it is preferable that the amino acid does not contain a sulfhydryl group; (c) a dipeptide derived from any two amino acids of which the second, linked to Cys <3>, does not cause steric hindrance; the second amino acid is preferably Gly, Ala or 5 -Ala; for the bridged peptides, it is preferable that the amino acids of the dipeptides do not contain a sulfhydryl group; (d) a tripeptide of which the third amino-
<EMI ID = 11.1>
the other two amino acids are any; the third amino acid of the tripeptide is preferably Gly, Ala or D-Ala; for bridged peptides, it is preferable that none of the amino acids of the tripeptide contain a sulfhydryl group; (e) a pentapeptide of which the first three amino acid constituents are Gly, the fourth is Ala or D-Ala and the fifth, linked to Cys', does not cause steric hindrance and may be Ala, Gly or D-Ala; (f) aliphatic, aromatic or cyclic organic acids other than amino acids, containing 1 to 10 carbon atoms; organic acids can be saturated and / or contain other functional groups; particularly preferred acyl groups
<EMI ID = 12.1>
Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, acetyl, acroyl, pivaloyl, and <EMI ID = 13.1>
Except when D-Trp is used, each of the amino acids contained in the part of the peptides of the invention which is located between the two Cys groups and comprises them, therefore at positions 3 to
14, is the L-isomer when the amino acid has iso-
<EMI ID = 14.1>
Theides of the invention may be the L isomer or the D isomer when the amino acid has isomeric forms. A preferential peptide
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
peptides are obtained having a power several times greater than celuidelasomatostatin with regard to the inhibition of growth hormone and also with regard to the release of glucagon and insulin. By replacing various amino acids of the somatostatin backbone with Ala, peptides having significant pharmaceutical activity are also obtained.
The peptides of the invention are synthetically prepared by solid phase techniques, generally by the method described in the U.S. Patent. n [deg.] 3,904,595 already cited. The synthesis is carried out batchwise on a chloromethylated resin. The resin is composed of fine beads (20 to 70 microns in diameter) of a synthetic resin that is prepared by copolymerizing styrene with 1 to 2% of divinylbenzene. The benzene rings of the resin are chloromethylated in a Friedel-Crafts reaction on chloromethyl-methyl ether and stannic chloride. The chlorine thus introduced is in a reactive bond of the benzyl chloride type. The Friedel-Crafts reaction is continued until the resin contains 0.5 to 2 millimoles of chlorine per gram of resin.
In the rest of the description of the synthesis of peptides, the reagents used are firstly defined by their chemical name, their usual abbreviation being in parentheses; hereinafter, the reagent is designated by the usual abbreviation.
A peptide is prepared corresponding to the structure:
<EMI ID = 17.1>
by the solid phase technique below. Other peptides defined below are prepared by a similar technique.
<EMI ID = 18.1> <EMI ID = 19.1>
the potassium salt of the amino acid protected by Boc. Only one milliequivalent of protected Cys per milliequivalent of Cl of the resin is used. Process 3 is described in more detail below: to a slurry of the resin and the protected Cys dissolved in DMSO, 0.9 milliequivalent (meq) of potassium tertbutoxide is added.
(KOtBut) per meq of amino acid. The mixture is exposed to the air as little as possible so that no amber color is observed.
Reaction at 80 [deg.] C for 2 hours gives a substituted resin.
<EMI ID = 20.1>
of amino acid per gram of resin). After removal of the protecting group and neutralization, the peptide chain is formed on the
resin. The elimination of the protecting group, the neutralization and the addition of each amino acid are carried out according to program I.
<EMI ID = 21.1>
amino acid, except that you can use any � group protecting group "-amine for the alanine residue
(benzyloxycarbonyl; Z; Boc etc.). After removal of the protective group from the first residue (i.e. SpOMe Bzl Cys) according to
<EMI ID = 22.1>
of Ser together with a linking agent which is dicyclo- <EMI ID = 23.1> threonine. The p-nitrophenyl ester (ONp) is used to activate the carboxyl terminus of Asn. O-nitrophenyl ester can also be used for this purpose. Formyl groups can be used
<EMI ID = 24.1>
peptide is an organic acid, it is attached to the peptide before detaching it from the resin. To attach the organic acid to the peptide fixed on the resin), the organic acid is introduced in the presence of DCC or of the organic anhydride or of the organic active ester. The organic acid can also be added by using <EMI ID = 25.1>
added.
1 - Program for the chain of amino acids other than Asn
in a solid phase synthesis (5 to 10 g of resin)
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
ninhydrin; if the test is negative, return to step 1 for the sequence of the next amino acid; if the test is positive or slightly positive, go back to steps 9 to 13. The pro-
<EMI ID = 28.1>
with Cys, except Asn when present. For Asn, steps 1 to 8 are the same and we use program II for the rest of the chain reaction:
Program II next page.
<EMI ID = 29.1>
active in solid phase synthesis (5 to 10 g of resin)
<EMI ID = 30.1>
After step 14, a portion is taken for a test at the
<EMI ID = 31.1>
sequence of the following amino acid; if the test is positive or slightly positive, go back to steps 9 to 14.
The cleavage between the peptides and the resin (5 g) and the elimination of the protective groups in the side chain of the peptide takes place in hydrofluoric acid (75 ml) in the presence of anisole (8 ml). After removal of the hydrofluoric acid under high vacuum, the resin-peptide is washed together with ether.
The dried resin is immediately extracted with aceti-
<EMI ID = 32.1>
(N2). The pH of the solution is adjusted to between 6.6 and 7.0 with NH4OH. The solution is titrated dropwise with stirring with a solution of potassium ferricyanide (1 g / 500 ml of II 20) until a permanent yellow color is observed. The solution is allowed to stand for 10 minutes and the pH is adjusted to 5.0 with acid.
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
stirred for 15 minutes. The solution is filtered through Celite and applied successively to two columns: a) re-
<EMI ID = 35.1>
Rex-70 "(100 ml), cationic form. The cough of celite and resin is washed thoroughly with 500 ml of water and applied.
<EMI ID = 36.1>
using a pyridine-acetic acid-water mixture (30: 4: 66) or <EMI ID = 37.1>
dilute only those containing peptide (ninhydrin positive) with water and lyophilize immediately. 1.2 g of crude material of cream color are obtained. We apply it on
<EMI ID = 38.1>
and eluting with 2n acetic acid.
The elution curve observed at 280 nm shows a symmetrical peak.
<EMI ID = 39.1>
a 1.8 x 100 cm partition column (normal butanol-acetic acid
-water 4: 1: 5). The elution curve (280 nm) shows a main peak of V 2.5 to 4.0. Two fractions are separated which then appear identical on thin layer chromatography (165 mg) <EMI ID = 40.1>
ves to thin-layer chromatography for synthetic peptides. The desired product elutes as a very narrow band which, after 2 lyophilizations, gives a white fluffy powder (II; mg). We observe a small impurity
<EMI ID = 41.1>
acetic-water (4: 1: 5) (BAW). This material (100 mg) is applied to a 1.8 x 100 cm partition column. The elution curve (280
<EMI ID = 42.1>
<EMI ID = 43.1>
used to inhibit the release of growth hormone from cultured pituitary cells or to inhibit the release of insulin and glucagon from the pancreas under the action of arginiue.
Active esters can be used in solid phase synthesis and the conventional synthetic method can also be used to prepare the peptides of the invention.
An in vitro titration of the efficacy of
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
pituitary glands taken from rats to separate cells. The adults were placed in culture dishes on modified Eagle's medium (Dulbecco et al., Virology, volume 8, page
396, 1949). We bring carbon dioxide and oxygen
<EMI ID = 46.1>
of medium, cultures of cells which have incubated for 4 hours and particular somatostatin peptides are added. We use
<EMI ID = 47.1>
secretion of growth hormone, expressed in nanograms per hour.
The peptides of the invention inhibit basal and enhanced stimulation of insulin and glucagon in mammals, including
<EMI ID = 48.1>
release of insulin and glucagon from the perfused rat pancreas, isolated island cells and primary in vitro cultures of enzymatically dispersed pancreatic cells. It appears that the: peptides have a direct effect on the cells
<EMI ID = 49.1>
of glucagon.
The effect of somatostatin, di-
-hydrosomatostatin (as a control) and peptides of the invention, as regards the inhibition of the release of glucagon and insulin:
Male SpragusDawley rats weighing 180-220 g, staying in temperature and humidity controlled housing, 14 hours light and 10 hours dark (7 to 9 p.m. light) were used in all experiments. We give animals
<EMI ID = 50.1>
at least 5 days after the arrival of the rats from the supplier, between 2 and 4 p.m. After anesthesia with ether, peptides or physiological serum are administered in a volume of 0.2 ml through the external jugular vein and immediately afterwards a bolus of 1 ml of arginine. Five minutes later, the truncal blood is collected by rapid decapitation. The determination of insulin and glucagon in the plasma is carried out by specific radioimmunological assays. Relative efficiency values are determined
<EMI ID = 51.1>
� four and six points.
Arginine, when given at a dose of 100 mg / <EMI ID = 52.1>
insulin as well as glucagon. Somatostatin and dihydrosomatostatin inhibit the release of insulin and glucagon under the action of arginine, also potently depending on the dose (indicated in both cases at 100 µg / 100 g of subject body weight).
Various peptides are prepared according to the invention, in accordance with
to the solid phase technique described above. The composition
<EMI ID = 53.1>
<EMI ID = 54.1>
Peptide
Control (somatostatin)
<EMI ID = 55.1>
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 13 14
Peptides of the invention
The following peptides are bridged and respond to structure;
<EMI ID = 56.1>
<EMI ID = 57.1>
The effectiveness of somatostatin (control) and of the peptides of the invention as regards the inhibition of the secretion of growth hormone is determined by the in vitro assay described above. Cha-
<EMI ID = 58.1> <EMI ID = 59.1>
secretion of growth hormone. The relative efficacy of the peptides of the invention, mentioned in Table I, for the inhibition of the secretion of glucagon and insulin under the action of arginine is also determined. Each of the peptides of the invention is 8 to 10 times more effective than somatostatin in inhibiting the secretion of glucagon and insulin under the action of arginine.
Various other peptides are prepared according to the invention, having structures identical to those shown in Table I, except that Tyr replaces Phe at one of the 7 and 11 positions or both. These Tyr-substituted peptides also have a
<EMI ID = 60.1>
with regard to the inhibition of growth hormone, glucagon and insulin.
Linear counterparts of the peptides according to the invention, shown in Table I. These linear peptides also have a power at least 8 times greater than
<EMI ID = 61.1>
growth, glucagon and insulin.
Table II shows the relative potencies (somatostatin =
100%) of a series of peptides of the invention, as regards the inhibition of the secretion of growth hormone and the inhibition of
<EMI ID = 62.1>
<EMI ID = 63.1>
Relative powers of somatostatin (SRIF) and substituted somatostatin in inhibiting growth hormone (GH) release from anterior pituitary cells in vitro and inhibiting insuii-line release and glucagon under the action of arginine in vivo. For in vivo determinations, the peptides are administered by injection into the jugular vein immediately prior to the injection of arginine (100 mg / 100 g of subject body weight).
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
1. Compound with inhibitory action of the secretion of growth hormone by the pituitary gland or of the release by the pancreas of glucagon and insulin in mammals, charac-
<EMI ID = 66.1>
<EMI ID = 67.1>
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
aromatic or cyclic tick with up to 10 carbon atoms, a hydrogen or a derivative of the aforementioned groups, and where R2 is Ala, de-Ala, Asn or de-Asn.