" Vaccin vivant antigrippal" La présente invention est relative à un nouveau vaccin vivant antigrippal administrable par voie
nasale.
Jusqu'à présent, on a atténué le virus grippal par différents procédés: soit par recombinaison d'une souche pathogène avec une souche atténuée et antigéniquement différente soit par passages en série du virus à basse température de façon à obtenir des souches "froides" et transfert par recombinaison de la caractéristique "froid" à des souches pathogènes, soit par induction de souches thermosensibles
à l'aide d'agents mutagènes et transfert par recombinaison
de la caractéristique "thermosensibilité" à des souches pathogènes, soit par sélection de souches résistantes aux inhibiteurs sériques(J.Infect. Dis. 129 (6): 750-71, 1974).
_Des vaccins vivants contre la grippe obtenus suivant l'un ou l'autre des procédés ont déjà été décrits, entre autres en Union Soviétique (ZYKOV M.P. et coll.: Am. Rev. Resp.Dis. 110: 537-41, 1974), aux Etats-Unis (Maasab H.F. et coll.: Bull. OMS 41 : 589-94, 1969) et en Europe (Peetermans J. et coll.: Symp.Series Immunobiol.Standard 20: 208-13,1973; Brevet belge N[deg.] 822.736).
On constate que, presque chaque année, le sérotype des souches de virus grippal de type A circulant dans le monde diffère légèrement du sérotype des souches observées jusque là. Cette modification antigénique crée des problèmes particuliers pour l'immunisation contre le virus grippal de type A. En effet pour obtenir une efficacité maximale, l'antigène vaccinal doit être le plus proche possible de celui du virus dominant et,
de ce fait, les vaccins contre la grippe doivent être périodiquement adaptés, de façon à protéger contre ces nouvelles souches.
<EMI ID=1.1>
pal de type A obtenus par multiplication de la souche atténuée A/PR8/34 en présence de la souche pathogène A/Scotland/840/74 mais ces reccmbinants sont encore faiblement pathogènes et donc inutilisables pour l'usage vaccinal (Beare.A.S. et coll.:
Lancet 729-32, 18 oct 1975).
En recombinant la souche atténuée de virus grippal
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
A/Scotland/840/74 (sérotype H3N2), nous avons maintenant obtenu une nouvelle souche atténuée de virus grippal
dénommée RIT 4025 qui possède une capacité de croissance intermédiaire entre celles des souches A/PR8/34 et A/Scotland/
840/74, est pratiquement non-pathogène et de valeur pour la production d'un vaccin contre la souche de virus grippal A/Scotland 840/74.
La souche de virus grippal recombinant RIT 4025
a été déposée dans la collection de virus du WHO Collaborating Centre for Collection and Evaluattion of Data on Comparative Virology at the Institut für Medizinische Mikrobiologie
<EMI ID=4.1>
La présente invention est donc relative à un vaccin vivant contre la grippe comprenant une dose efficace d'une souche de virus grippal de tyne A obtenue par recombinaison de la souche atténuée A/PR8/34 et de la souche pathogène A/Scotland/840/74- à savoir la souche de virus grippal de type A P/76/ 6 - et un diluant pharmaceutique pour inoculation nasale.
La souche de virus recombinant P/76/6 a été
obtenue par mélange et incubation d'aliquotes (par exemple
des aliquotes de 0,2ml) des souches A/PR8/34 et A/Scotland/
840/74, inoculation du mélange incubé dans la cavité allantoidienne d'oeufs embryonr.és de poule, incubation des oeufs inoculés, récolte du matériel viral obtenu et clonage
du matériel viral par passages en dilution limite.
Pour préparer le vaccin suivant l'invention,on cultive la souche de virus grippal recombinant dans des oeufs embryonnés et plus particulièrement dans la cavité allantoîdienne d'oeufs embryonnés de poule, suivant l'une
ou l'autre des techniques connues pour la production de vaccins de façon à obtenir une quantité importante dudit
virus et, si on le désire, on ajoute éventuellement un stabilisateur (par exemple de la pentone ou du saccharose).
Le matériel viral ainsi obtenu est alors réparti dans des flacons contenant des doses unitaires ou multiples
de vaccin . Une dose unitaire contient de préférence au
<EMI ID=5.1>
La préparation est de préférence lyophilisée pour assurer
sa .conservation.
Le vaccin de l'invention est administré par voie nasale, le cas échéant après avoir été rehydraté extemporanément. Pour assurer une réponse vaccinale optimale, l'administration du vaccin peut se faire par inoculation de deux doses unitaires successives; la seconde dose étant inoculée une semaine environ après la première.
Les exemples qui suivent illustrent la présente invention et ne sont pas destinés à en limiter l'étendue.
EXEMPLE 1
A 0,2ml de liquide allantoïdien d'oeufs embryonnés de poule
<EMI ID=6.1>
grippal A/Scotland/840/74 par millilitre et on conserve le mélange à 4[deg.]C pendant une nuit.
Le mélange est ensuite inoculé dans la cavité allantoïdienne d'oeufs embryonnés de poule qui sont incubés à 35[deg.]C pendant 20 heures.
On récolte la progéniture de cette infection mixte et on la clone par passages en dilution limite dans des oeufs
embryonnés de poule en présence de sérum de poule anti.
A/PR8/34.
On récolte le virus ainsi obtenu et, pour chacun d'eux, on effectue successivement un passage dans des oeufs embryonnés de poule en présence de sérum normal de cobaye et de sérum de poule anti A/PR8/34 et deux passages en dilution limite dans des oeufs embryonnés de poule en présence de sérum normal de cobaye.
Une des souches ainsi isolées, a été sélectionnée et caractérisée. Elle a reçu l'appellation RIT 4025 et a
<EMI ID=7.1>
Centre for Collection and Evaluation of Data on Comparative
<EMI ID=8.1>
Infektions -und Seuchenmedizin der Ludwig-MaximilliansUniversitât à Munich (République Fédérale d'Allemagne) sous le numéro P/76/6.
EXEMPLE 2
!
<EMI ID=9.1>
La souche RIT 4025 (P/76/6) a été étudiée au point de vue ! sérotype, production d'hémagglutinine dans des oeufs embryonnés'
<EMI ID=10.1>
sensibilité au chlorhydrate d'amantadine et multiplication à
39[deg.]C et à 35[deg.]C, comparativement aux souches parentales A/PR8/34 et A/Scotland/840/74.
Les caractéristiques des souches parentales et de la
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
la moyenne géométrique du titre hémagglutinant (MGT) sur
<EMI ID=13.1>
au chlorhydrate d'amantadine est exprimée par la différence
<EMI ID=14.1>
croissance à différentes températures est exprimée par la différence entre les titres infectieux en C.C.R.P. à 35[deg.]C et
39[deg.]C.
TABLEAU I
<EMI ID=15.1>
Ainsi que le montre le tableau I, la souche RIT 4025 (P/76/6 ) possède le sérotype de la souche pathogène A/Scotland/840/74 et les autres caractéristiques étudiées de la souche A/PR8/34.
EXEMPLE 3
Production de vaccins
On utilise les virus récoltés au dernier passage obtenu
par la méthode décrite dans l'exemple 1 comme inoculum pour la production des lots d'ensemencement de vaccin.
On inocule un échantillon de la souche P/76/6 obtenue à l'exemple 1 dans la cavité allantoidienne d'oeufs embryonnés de poule qui sont ensuite incubés à 35[deg.]C pendant
3 à 5 jours.
On récolte et on mélange les liquides allantoïdiens contenant la souche P/76/6 , on en teste la stérilité
et l'innocuité et on ajoute de la peptone de façon à
obtenir une concentration finale de 5% en peptone.
On répartit la suspension virale dans des flacons
de 3ml de façon à obtenir des doses unitaires (au moins
<EMI ID=16.1>
les flacons sont ensuite bouchés hermétiquement.
Le vaccin est reconstitué au moment de l'inoculation par addition de 0,5 ml d'un diluant qui peut être par exemple de l'eau distillée, du sérum physiologique ou une solution aqueuse de saccharose à 5% et on administre dans les narines le vaccin ainsi reconstitué.
EXEMPLE
Essais cliniques. EXEMPLE
Des doses unitaires du vaccin obtenu par la méthode décrite dans l'exemple 3 ont été reconstituées par addition
<EMI ID=17.1>
inoculées à 9 volontaires sains à raison de 5 gouttes par
narine.
A titre de contrôle, on a inoculé la solution aqueuse stérile de saccharose seule à 2 volontaires.
Tous les volontaires ont été examinés quotidiennement durant six jours après l'inoculation pour détecter d'éventuels symptômes grippaux.
Au. troisième et quatrième jours après l'inoculation, on
a effectué des lavages du nez et de la gorge de chaque
volontaire pour déterminer la présence de virus.
On a prélevé des échantillons de sang avant et
2 à 3 semaines après l'inoculation afin de déterminer le
<EMI ID=18.1>
Les résultats des essais cliniques sont repris dans le tableau II ci-après:
TABLEAU II
<EMI ID=19.1>
(x) La détermination de l'échelle des réactions cliniques utilisée dans le tableau II est basée sur les descriptions
<EMI ID=20.1>
Edw; Arnold Publ., London 1965).
Ainsi que le montre le tableau II, la souche P/76/6 est atténuée et induit la séroconversion chez près de 90% des vaccinés.
EXEMPLE 5
Des doses unitaires du vaccin obtenu par la méthode décrite dans l'exemple 3 ont été reconstituées par addition de 0,5ml d'une solution aqueuse stérile de saccharose à
5% et inoculées à 17 volontaires sains à raison de 5 gouttes par narine.
A titre de..contrôle, on a inoculé la solution aqueuse stérile de saccharose seule à 15 volontaires.
Environ 7 semaines après la vaccination,on a inoculé
<EMI ID=21.1>
A/Scotland /840/74 dans les narines de chaque volontaire.
Après l'inoculation, chaque volontaire a été isolé
<EMI ID=22.1>
pour détecter d'éventuels symptômes grippaux.
<EMI ID=23.1>
déterminer la présence de virus.
On a également prélevé des échantillons de sang au moment
de l'épreuve et environ 3 semaines après l'inoculation. Les résultats de l'épreuve sont repris dans le tableau III ci-après: <EMI ID=24.1>
TABLEAU III
<EMI ID=25.1>
(x) Déterminé soit par isolement de virus A/Scotland/840/74
soit par un symptôme de type grippal avec multiplication par 4 du taux d'anticorps contre la souche de virus A/Scotland/840/74.
Comme il résulte de la différence entre le taux de réisolement du virus d'épreuve chez les vaccinés et le taux de réisolement du virus d'épreuve chez les témoins, la souche vaccinale P/76/6 présente un taux de protection significatif contre
la souche homologue A/Scotland/840/74.
<EMI ID=26.1>
REVENDICATIONS S
1) Vaccin antigrippal vivant administrable par voie nasale
comprenant une dose efficace de la souche de virus grippal . de type A P/76/6 et un diluant pharmaceutique pour administration par voie nasale.
"Live influenza vaccine" The present invention relates to a new live influenza vaccine that can be administered by the
nasal.
Up to now, the influenza virus has been attenuated by various methods: either by recombination of a pathogenic strain with an attenuated and antigenically different strain or by serial passages of the virus at low temperature so as to obtain "cold" strains and transfer by recombination of the "cold" characteristic to pathogenic strains, or by induction of heat-sensitive strains
using mutagens and recombinant transfer
of the characteristic "thermosensitivity" to pathogenic strains, or by selection of strains resistant to serum inhibitors (J. Infect. Dis. 129 (6): 750-71, 1974).
_Live influenza vaccines obtained by one or the other of the methods have already been described, among others in the Soviet Union (ZYKOV MP et al .: Am. Rev. Resp.Dis. 110: 537-41, 1974) , in the United States (Maasab HF et al .: Bull. OMS 41: 589-94, 1969) and in Europe (Peetermans J. et al .: Symp.Series Immunobiol.Standard 20: 208-13,1973; Belgian patent N [deg.] 822.736).
It is observed that, almost every year, the serotype of strains of influenza virus type A circulating in the world differs slightly from the serotype of strains observed so far. This antigenic modification creates particular problems for immunization against influenza virus type A. In fact, to obtain maximum effectiveness, the vaccine antigen must be as close as possible to that of the dominant virus and,
therefore, influenza vaccines must be periodically adapted to protect against these new strains.
<EMI ID = 1.1>
pal type A obtained by multiplication of the attenuated strain A / PR8 / 34 in the presence of the pathogenic strain A / Scotland / 840/74 but these recombinants are still weakly pathogenic and therefore unusable for vaccine use (Beare.AS et al. .:
Lancet 729-32, Oct 18, 1975).
By recombining the attenuated strain of influenza virus
<EMI ID = 2.1>
<EMI ID = 3.1>
A / Scotland / 840/74 (serotype H3N2) we have now obtained a new attenuated strain of influenza virus
called RIT 4025 which has an intermediate growth capacity between those of strains A / PR8 / 34 and A / Scotland /
840/74, is practically non-pathogenic and of value for the production of a vaccine against the influenza A / Scotland strain 840/74.
Recombinant influenza virus strain RIT 4025
has been deposited in the virus collection of the WHO Collaborating Center for Collection and Evaluattion of Data on Comparative Virology at the Institut für Medizinische Mikrobiologie
<EMI ID = 4.1>
The present invention therefore relates to a live influenza vaccine comprising an effective dose of a strain of influenza virus of tyne A obtained by recombination of the attenuated strain A / PR8 / 34 and of the pathogenic strain A / Scotland / 840 / 74- namely the influenza virus strain AP / 76/6 - and a pharmaceutical diluent for nasal inoculation.
The recombinant virus strain P / 76/6 was
obtained by mixing and incubating aliquots (for example
0.2ml aliquots) of strains A / PR8 / 34 and A / Scotland /
840/74, inoculation of the mixture incubated in the allantoic cavity of embryonated hen eggs, incubation of the inoculated eggs, harvest of the viral material obtained and cloning
viral material by passages in limit dilution.
To prepare the vaccine according to the invention, the strain of recombinant influenza virus is cultivated in embryonated eggs and more particularly in the allantoic cavity of embryonated hen eggs, according to one
either of the known techniques for the production of vaccines so as to obtain a large amount of said
virus and, if desired, optionally added a stabilizer (eg pentone or sucrose).
The viral material thus obtained is then distributed in vials containing unit or multiple doses
vaccine. A unit dose preferably contains
<EMI ID = 5.1>
The preparation is preferably lyophilized to ensure
its .conservation.
The vaccine of the invention is administered by the nasal route, where appropriate after having been extemporaneously rehydrated. To ensure an optimal vaccine response, administration of the vaccine can be done by inoculation of two successive unit doses; the second dose being inoculated about a week after the first.
The examples which follow illustrate the present invention and are not intended to limit its scope.
EXAMPLE 1
At 0.2ml of allantoic fluid from embryonated chicken eggs
<EMI ID = 6.1>
influenza A / Scotland / 840/74 per milliliter and the mixture is stored at 4 [deg.] C overnight.
The mixture is then inoculated into the allantoic cavity of embryonated hen eggs which are incubated at 35 [deg.] C for 20 hours.
The offspring of this mixed infection are harvested and cloned by limiting dilution passages in eggs.
embryonated hens in the presence of anti hen serum.
A / PR8 / 34.
The virus thus obtained is harvested and, for each of them, one passage is carried out successively in embryonated hen eggs in the presence of normal guinea pig serum and anti A / PR8 / 34 hen serum and two passages in limiting dilution in embryonated chicken eggs in the presence of normal guinea pig serum.
One of the strains thus isolated was selected and characterized. It received the designation RIT 4025 and has
<EMI ID = 7.1>
Center for Collection and Evaluation of Data on Comparative
<EMI ID = 8.1>
Infektions -und Seuchenmedizin der Ludwig-MaximilliansUniversitât in Munich (Federal Republic of Germany) under number P / 76/6.
EXAMPLE 2
!
<EMI ID = 9.1>
Strain RIT 4025 (P / 76/6) has been studied from the point of view! serotype, production of hemagglutinin in embryonated eggs'
<EMI ID = 10.1>
sensitivity to amantadine hydrochloride and multiplication to
39 [deg.] C and 35 [deg.] C, compared to the parental strains A / PR8 / 34 and A / Scotland / 840/74.
The characteristics of the parental strains and the
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1>
the geometric mean of the hemagglutinating titer (GMT) on
<EMI ID = 13.1>
to amantadine hydrochloride is expressed as the difference
<EMI ID = 14.1>
growth at different temperatures is expressed by the difference between the infectious titers in C.C.R.P. at 35 [deg.] C and
39 [deg.] C.
TABLE I
<EMI ID = 15.1>
As shown in Table I, the strain RIT 4025 (P / 76/6) possesses the serotype of the pathogenic strain A / Scotland / 840/74 and the other characteristics studied of the strain A / PR8 / 34.
EXAMPLE 3
Vaccine production
We use the viruses collected at the last passage obtained
by the method described in Example 1 as an inoculum for the production of the vaccine seed lots.
A sample of the strain P / 76/6 obtained in Example 1 is inoculated into the allantoic cavity of embryonated hen eggs which are then incubated at 35 [deg.] C for
3 to 5 days.
The allantoic fluids containing the P / 76/6 strain are collected and mixed, and tested for sterility.
and safety and peptone is added to
obtain a final concentration of 5% peptone.
The viral suspension is distributed in vials
of 3ml so as to obtain unit doses (at least
<EMI ID = 16.1>
the bottles are then hermetically stoppered.
The vaccine is reconstituted at the time of inoculation by adding 0.5 ml of a diluent which can be for example distilled water, physiological saline or a 5% aqueous solution of sucrose and is administered into the nostrils. the vaccine thus reconstituted.
EXAMPLE
Clinical tests. EXAMPLE
Unit doses of the vaccine obtained by the method described in Example 3 were reconstituted by adding
<EMI ID = 17.1>
inoculated into 9 healthy volunteers at a rate of 5 drops per
nostril.
As a control, the sterile aqueous solution of sucrose alone was inoculated into 2 volunteers.
All volunteers were examined daily for six days after inoculation for any flu-like symptoms.
At. third and fourth days after inoculation, we
performed nose and throat washes of each
volunteer to determine the presence of viruses.
Blood samples were taken before and
2 to 3 weeks after inoculation to determine the
<EMI ID = 18.1>
The results of the clinical trials are shown in Table II below:
TABLE II
<EMI ID = 19.1>
(x) The determination of the scale of clinical reactions used in Table II is based on the descriptions
<EMI ID = 20.1>
Edw; Arnold Publ., London 1965).
As shown in Table II, the P / 76/6 strain is attenuated and induces seroconversion in nearly 90% of the vaccinated.
EXAMPLE 5
Unit doses of the vaccine obtained by the method described in Example 3 were reconstituted by adding 0.5 ml of a sterile aqueous solution of sucrose to
5% and inoculated into 17 healthy volunteers at a rate of 5 drops per nostril.
As a control, 15 volunteers were inoculated with sterile aqueous solution of sucrose alone.
About 7 weeks after vaccination, we inoculated
<EMI ID = 21.1>
A / Scotland / 840/74 in the nostrils of each volunteer.
After inoculation, each volunteer was isolated
<EMI ID = 22.1>
to check for possible flu-like symptoms.
<EMI ID = 23.1>
determine the presence of viruses.
Blood samples were also taken at the time
of the test and approximately 3 weeks after inoculation. The results of the test are shown in Table III below: <EMI ID = 24.1>
TABLE III
<EMI ID = 25.1>
(x) Determined either by isolation of A / Scotland / 840/74 virus
or by a flu-like symptom with a fourfold increase in the level of antibodies against the A / Scotland / 840/74 strain of virus.
As the result of the difference between the rate of re-isolation of challenge virus in vaccines and the rate of re-isolation of challenge virus in controls, the vaccine strain P / 76/6 shows a significant level of protection against
the homologous strain A / Scotland / 840/74.
<EMI ID = 26.1>
CLAIMS S
1) Live influenza vaccine for nasal administration
comprising an effective dose of the influenza virus strain. type A P / 76/6 and a pharmaceutical diluent for nasal administration.