BE843092A - Procede de determination de l'attenuation de virus grippaux de type a obtenus par recombinaison - Google Patents

Procede de determination de l'attenuation de virus grippaux de type a obtenus par recombinaison

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BE843092A BE168039A BE168039A BE843092A BE 843092 A BE843092 A BE 843092A BE 168039 A BE168039 A BE 168039A BE 168039 A BE168039 A BE 168039A BE 843092 A BE843092 A BE 843092A
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Description


  "Procédé de détermination de l'atténuation de

  
 <EMI ID=1.1>  L'invention est relative à un procédé de détermination de l'atténuation de souches de virus grippaux de type A obtenues par recombinaison d'une souche atténuée et d'une

  
souche pathogène.

  
La recombinaison génétique entre une souche atténuée

  
et une souche pathogène de virus grippal est une méthode utilisée pour l'obtention de souches de virus entrant dans

  
la composition de vaccins vivants contre la grippe.

  
Lorsque, à Ici suite d'une modification antigénique, apparaît une nouvelle souche sauvage de virus grippal, les producteurs de vaccins vivants s'efforcent d'adapter leur vaccin au sérotype de la nouvelle souche. Une étape critique dans la production de ce nouveau vaccin est la sélection rapide de la ou des souches candidates pour ce nouveau vaccin.

  
L'utilisation de marqueurs phénotypiques pour caractériser les recombinants entre eux et par rapport aux souches parentales est fastidieuse, exige beaucoup de temps et n'est pas applicable à toutes les souches pathogènes, de sorte que, avant

  
 <EMI ID=2.1> 

  
fois générale, sûre et simple pour déterminer si une souche de virus grippal obtenue par recombinaison est suffisamment atténuée pour être utilisée dans la préparation d'un vaccin.

  
On sait que le matériel génétique du virus grippal est constitué d'acide ribonucléique (ARN) monocaténaire et que, dans la fraction microsomique des cellules infectées par le virus grippal, il existe une enzyme ( la ribonucléotidepolymérase ) capable de synthétiser un ARN (ARNC) possédant une séquence de bases complémentaire de celle de l'ARN viral (ARNV).

  
Cette enzyme, active in vitro, permet l'isolement de brins  <EMI ID=3.1> 

  
Drocédé utilisé depuis longtempspour l'analyse d'acides nucléiques à séquences inconnues.

  
Ainsi, le procédé d'hybridation a été appliqué à l'analyse de l'ARN du virus grippal - entre autre par C. SCHOLTISSEK

  
 <EMI ID=4.1> 

  
été utilisé pour la reconnaissance de recombinants de virus grippaux ni pour la détermination de leur atténuation pour usage vaccinal.

  
La présente invention concerne donc un procédé de détermination de l'atténuation de virus grippaux de type A obtenus par recombinaison d'un virus atténué (plus particulièrement le virus A/PR8/34) et d'un virus pathogène, le procédé consistant à hybrider l'ARN du virus recombinant avec l'ARN du virus atténué ( plus particulièrement l'ARN du virus A/PR8/34 ) et à sélectionner les virus dont l'ARN présente avec l'ARM- du virus atténué un degré d'hybridation au moins égal à 55% lorsque les antigènes de surface (neuraminidase

  
et hémagglutinine)du virus recombinant sont uniquement ceux du virus pathogène.

  
Il est entendu que le seuil de 55% vise exclusivement le degré d'hybridation des recombinants ayant les antigènes de surface de la souche pathogène et que, dans le cas d'hybrides antigéniques, cette valeur doit être augmentée respectivement de 10

  
 <EMI ID=5.1> 

  
tinine de la souche atténuée.

  
Des méthodes d'hybridation d'ARN viraux ont été décrite:

  
 <EMI ID=6.1> 

  
BI01 18: 204-14/1966 et par C.SCHOLTISSEK(loc.cit.).Il est évident que n'importe quelle méthode d'hybridation peut être utilisée pour réaliser l'invention sans la modifier. 

  
et l'exemple suivant. illustre l'invention sans en limiter la portée.

EXEMPLE

  
Hybridation

  
 <EMI ID=7.1> 

  
On infecte des cultures de fibroblastes de noulet avec la souche A/PR8/34 à raison de 50 à 100 virus nar cellule. 

  
 <EMI ID=8.1> 

  
2-mercaptoéthanol (O.Û01M), on récolte et on homogénise les cellules.

  
 <EMI ID=9.1> 

  
d'éliminer les débris cellulaires, les noyaux et les mitochondries et on centrifuge ensuite le liquide surnageant pendant 60 minutes à 150.OOOg. Le culot obtenu contient la

  
 <EMI ID=10.1> 

  
2) Préparation de l'ARN

  
A une solution tampon de Tris-HCl (33mM) à pH 8,4 on mélange  MgCl2(4 mM), KC 1 (50mM) créatine phosphate (5/ug/ml), 

  
 <EMI ID=11.1> 
-5'-triphosphate (0,5mM), uridine-5'-triphosphate (0,5mM) et cytidine-5ttriphosphate (0,5mM).

  
 <EMI ID=12.1>  on purifie l'ARNc du surnageant par traitement avec 1/2 volume de diéthylpyrocarbonate et on précipite l'ARNc avec 2 volumes d'éthanol à 95%.

  
 <EMI ID=13.1> 

  
RIT 4050 ) sont propagés séparément dans la cavité allantoïdienne d'oeufs embryonnés de poule pendant 48heures à 37[deg.]C. Les différents liquides allantoïdiens sont récoltés et centrifugés à 100.000g pour concentrer le virus.

  
Les suspensions sont traitées à la pronase (2mg/ml) pendant
30 minutes à 37[deg.]C, additionnées de dodécylsulfate de sodium
(concentration finale 1%), traitées par un volume de phénol et l'ARN de chaque virus est précipité par addition de deux

  
volumes d'éthanol à 95%.

  
 <EMI ID=14.1> 
2.500 coups par minute).

  
On ajoute du tampon SSC au mélange jusqu'à atteindre un volume de 200 microlitres, on place les mélanges dans un

  
bain à 95[deg.]C pendant 5 minutes, on les refroidit lentement jus-

  
 <EMI ID=15.1> 

  
2 heures. On les refroidit ensuite à 45[deg.]C. température à laquelle on les maintient pendant deux heures.

  
 <EMI ID=16.1>  37[deg.]C pendant 30 minutes, on précipite avec un volume d'une  solution aqueuse d'acide trichloroacétique (ATC) à 10%, on récolte le précipité sur filtre en fibre de verre, on lave 

  
les Filtres à l'aide d'une solution aqueuse d'ATC à 5%  contenant 0,04 M de Na2P407 et ensuite avec de l'éthanol 
95%, on sèche les filtres et on les place dans le mélange  scintillant constitué par une solution de diphényloxazole 
(4gr), 1,4-bis-(4-méthyl -5'-phényloxazolyl -2) benzène
(lOOgr), naphtalène (50gr) par litre de xylène.

  
Les filtres immergés dans la solution sont placés dans un compteur à scintillations.

  
Le degré d'hybridation de ces différents virus est indiqué

  
au tableau I, la déviation par rapport à la valeur moyenne

  
des comptages étant de 3%, d'un test à l'autre.

  
 <EMI ID=17.1> 

  
La corrélation degré d'hybridation/atténuation est reprise au Tableau I.

  
Parmi les souches reprises au Tableau I, celles portant les dénominations MRC 2, MRC3, MRC7, MRC8 et MRC11 ont été préparées et leur degré d'atténuation a été déterminé

  
par le Médical Research Council Common Cold Unit, Harvard Hospital à Salisbury (Grande-Bretagne) et décrite dans

  
 <EMI ID=18.1> 

  
a,de plus,été déposée dans la collection de l'American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, Etats Unis d'Amérique;

  
sous le numéro VR 777.

  
Les autres souches appartiennent à la Collection de la Demanderesse qui a également déterminé leur degré d'atténuation.

  
Les souches RIT 4025 et RIT 4050 ont été déposées dans la  <EMI ID=19.1> 

  
 <EMI ID=20.1> 

  
Medizinische Mikrobiologie, Infektions -und Seuchenmedizin der Ludwig-Maximillians - Universitat à Munich (République Fédérale

  
 <EMI ID=21.1> 

  
P/76/ 7.

  
 <EMI ID=22.1> 

  

 <EMI ID=23.1> 


  
(1) Degré d'hybridation entre l'ARNv du virus recombinant code

  
tous les polypeptides à l'exclusion de l'hémagglutinine et de la neuraminidaseet l'ARN, du virus A/PR8/34.

  
(2) '+' indique que la souche est atténuée pour l'homme

  
'-' indique que la ::ouche est pathogène pour l'homme

  
Ce tableau montre que les virus recombinants dont le degré d'hybridation, est au moins égal à 55% sont tous atténués pour l'homme tandis que les virus recombinants dont le degré d'hybridation est inférieur à 55%, peuvent être pathogènes pour l'homme. 

REVENDICATIONS

  
1) Procédé de sélection au point de vue de l'atténuaticn pour

  
l'homme de virus grippaux de type A obtenus par recombinaison d'un virus atténué de type A avec un virus grippal pathogène de type A en vue de la production de vaccins vivants, caractérisé en ce qu'on hybride l'acide ribonucléique du virus recombinant avec l'acide ribonucléique complémentaire du virus atténué et qu'on sélectionne les virus recombinants dont l'acide ribonucléique présente un degré d'hybridation avec l'acide ribonucléique complémentaire du virus atténué au moins égal à 55% lorsque les antigènes de surface du virus recombinant sont uniquement ceux du virus pathogène.

Claims (1)

  1. 2) Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce que le
    virus atténué est le virus A/PR8/34.
    3) Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce que <EMI ID=24.1>
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4278662A (en) 1979-10-16 1981-07-14 Smith Kline - Rit Attenuated influenza type A virus vaccine

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US4278662A (en) 1979-10-16 1981-07-14 Smith Kline - Rit Attenuated influenza type A virus vaccine

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