"Procédé et moyens pour déceler un état de
grossesse par dosage d'hormones" <EMI ID=1.1>
tant le dosage de différentes hormones, à savoir :'la*gonadotrophine
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ne, plus particulièrement, une méthode et des moyens fondamentalement nouveaux pour déceler un état de grossesse'chez la femme (c'està-dire, selon une expression plus courante, pour établir le diagnostic de la grossesse).
Des essais en vue d'établir le diagnostic de la grossesse sont généralement basés sur le dosage d'hormones qui sont produites par le placenta en cours de développement et telles que des hormones gonadotropes analogues à celles produites par le lobe antérieur de l'hypophyse et des hormones stéroïdes analogues à celles qui sont sécrétées par les ovaires et par les surrénales. Des essais pour le diagnostic de la grossesse qui sont présentement en usage sont à peu
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taire, c'est-à-dire la gonadotrophine chorionique humaine (HCG-). Cette hormone se trouve dans des fluides du corps (sérum sanguin et urine) seulement pendant la grossesse, à l'exception de plusieurs autres états très rares du corps qui s'accompagnent de la production d'hormones. L'unité internationale (U.I.) de ECG a été adoptée en
1938 et est définie comme étant l'activité gonadotropique spécifique de 0,1 mg d'un étalon séché conservé aux National Institutes of Health, London (Grande-Bretagne).
Les essais les plus anciens pour le diagnostic de la grossesse sont basés sur des méthodes biologiques in vivo servant à déceler la présence de HCG. Par exemple, le premier de tous ces essais, le "test" de Aschheim-Zondek, était basé sur l'aptitude de HCG, injectée par voie sous-cutanée à des souris, à produire alors du corps jaune. L'essai Friedman est un autre test biologique selon lequel un échantillon d'urine de la femme supposée enceinte est injecté dans le veine de l'oreille d'un lapin femelle adulte ("mature") qui
a été isolé pendant de 3 à 4 semaines, et,48 heures après l'injection} on examine les ovaires de l'animal pour voir s'ils s'y trouve des follicules hémorragiques rompus, ce qui indique une réaction positive. Un essai moins connu, mis au point par Kupperman en 1943, implique l'injection de l'urine de la patiente à un rat femelle avec examen ultérieur de l'ovaire de l'animal afin d'y déceler des signes d'hyperémie. Bien que les deux heures nécessaires pour la conduite de cet essai soient un laps de temps considérablement plus bref que <EMI ID=4.1>
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tif légèrement rose d'un ovaire positif rougi si l'on veut atteindre un haut degré de précision. Un test mis au point par Galli et
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plique toutefois l'injection de l'urine de la patiente dans le corps de grenouilles avec observation ultérieure afin de déceler l'éjection de sperme, mais ces animaux sont relativement insensibles par comparaison avec les lapins, les souris et les rats.
Tous les tests biologiques passés en revue ci-dessus présentent de sérieux inconvénients, y compris la nécessité d'avoir à sa disposition des animaux dont on doit entretenir des groupes nombreux, les essais étant de durées relativement longues et conduisant fréquemment.
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plus significatif et le plus grave, c'est le fait qu'un test positif
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aprcc une période de 25 à 30 jours après l'ovulation.
Une deuxième génération de tests pour le diagnostic de la grossesse groupe ceux qui ont été mis au point dans les premières années de la décennie débutant en 1960 : il s'agit de modes opératoires
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hormone du type protéine, elle agit à la manière d'un antigène dans une espèce hétérologue. Par conséquent, quand on injecte HCG par mise en oeuvre de techniques adéquates dans le corps d'un animal d' essai approprié, de la manière la plus typique dans le corps d'un
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de l'animal. Dans les premiers tests utilisant ce principe, on tentait d'utiliser la réaction de précipitine directe antigène-anticorps, selon laquelle un précipité visible se formerait par suite de la combinaison de HCG et de son anticorps, pour déceler la présence de cette hormone. Des modes opératoires plus communs impliquaient la mise en oeuvre de méthodes de détermination dites indirectes, telles que l'essai avec des particules de latex sur lamelle selon Brody et Carlstrom, et l'essai d'hémagglutination et inhibition de l'aide et Gemzel. Dans le premier de ces deux derniers tests, on ajoute un antisérum à l'urine d'une patiente, puis un support du type latex qui a été revêtu de HCG. Si l'échantillon d'urine pro- <EMI ID=11.1>
trouvent dans l'antiaérum seront neutralisés et ne réagiront donc pas sur HCG présente sous la forme d'un revêtement sur les particules
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tion. Pour la dernière méthode d'essai, on utilise un principe similaire, à l'exception du fait que l'indicateur comprend HCG conjuguée avec des hématies (globules rouges du sang), qui peuvent éventuelle,.lent être formalinisées. Le premier test peut être effectué en une période de seulement environ deux minutes, tandis que le deuxième exige approximativement deux heures.
Dans une méthode pour l'établissement d'un diagnostic de la grossesse qui a été très récemment mise au point et qui est basée sur une modification du mécanisme immunologique fondamental, on a recours à des moyens radiologiques pour déceler et/ou mesurer la présence de HCG dans l'urine de la patiente (ou de son urine). Voir, par exemple, un article de Goldstein et al. dans Fert. Steril., 23, page 817 (1972). Dans ces tests radioimmunologiques, l'anticorps est placé en contact avec un mélange de fluide du corps de la patiente à essayer et une quantité connue de HCG marquée avec un isotope
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sont mises en compétition en ce qui concerne l'interaction avec l'anticorps de HCG. L'anticorps est ensuite séparé du fluide, et on peut analyser chacune des deux fractions radiologiquement afin de déterminer les proportions respectives de la HCG marquée et non marquée qui sont devenues liées aux anticorps, et la concentration de HCG est calculable à partir de cette information étant donné que la proportion de HCG marquée et non marquée doit être de même valeur
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nologique ont permis de surmonter une limitation significative du test immunochimique de la grossesse, à savoir celle concernant la sensibilité. Les techniques de titrage radioimmunologique sont plusieurs milliers de fois plus sensibles que les tests indirects décrits ci-dessus et, par conséquent, permettent d'établir un diagnostic de grossesse beaucoup plus tôt que dans le délai des 25 à 30 jours à la suite de l'ovulation qui est nécessaire avec le test des particules de latex sur lamelle et avec l'essai d'hémagglutination.
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tests présentent l'inconvénient de nécessiter un laps de temps plus <EMI ID=17.1>
res"
L'inconvénient le plus sérieux, toutefois, avec les techniques antérieurement connues d'établissement du diagnostic précoce de la grossesse, réside dans la fréquence relativement grande de faux résultats, aussi bien positifs que négatifs. Dans le cas du test
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due à une immuno-réponse non spécifique en relation avec des réactions anticorps-antigène non spécifiques. Par exemple, la présence
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hormone stimulant les follicules (FSH), l'hormone lutéinisante (LH), la HCG et l'hormone stimulant la thyroïde (TSH), et des nosologies
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hormones ont soulevé d'autres difficultés lors de la production d'anti-sérums spécifiques utilisables pour la mise en oeuvre de techniques immunochimiques. Ces difficultés se trouvent encore exagérées dans des méthodes radioimmunologiques de titrage en raison du haut degré de sensibilité de ce genre de techniques. Cet inconvénient mentionné en dernier a été partiellement surmonté en produisant des anti-sérums spécifiques à l'égard de la bêta-subunit de HCG ; toutefois, cette manipulation nécessite l'utilisation d'un matériel coûteux ainsi que des opérations d'immunisation, de sélection et de purification délicates pour préparer des anticorps spécifiques, et de tels modes opératoires exigent beaucoup de temps, ils sont coûteux et très incommodes. En dépit de ces précautions, le
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diagnostic de la grossesse par un titrage radioimmunologique l'a pas été atteint.
D'autre part, il existe une demanda pressante concernant des moyens permettant de déceler d'une manière aussi précoce que possible des grossesses ectopiques. De telles grossesses donnent des résultats négatifs aux tests d'hémagglutination ou sur des lamelles
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patientes, même après la période des 25 à 30 jours qui suivent l'ovulation et qui est nécessaire pour exécuter ces essais. La raison de ce fait est en relation avec l'hypothèse selon laquelle les techniques d'essais immunochimiques pour l'établissement d'un diagnostic de la grossesse ne permettent de déceler une grossesse qu'après l'implantation, dans la paroi de l'utérus, de l'ovule fécondé.
Ainsi qu'on l'a déjà indiqué ci-dessus, toutes les méthodes d'essai <EMI ID=23.1>
ner l'existence d'une grossesse pendant la période s'écoulant entra la fécondation de l'ovule et l'implantation (nidation) de l'ovule fécondé serait d'un intérêt incalculable en vue du traitement, par exemple, de menaces d'avortement chez des femmes qui avortent habituellement, de cas impliquant une insémination artificielle et en liaison avec de nouvelles méthodes anticonceptionnelles qui mettent fin effectivement à une grossesse avant l'implantation de l'ovule fécondé.
la présence de récepteurs spécifiques pour les diverses hormones a été longtemps suspectée dans des cas plus spécialement étudiés à fond aussi bien sur des êtres humains que sur des animaux, et des chercheurs sont enfin parvenus, au cours des cinq dernières années, à identifier et à étudier directement certains de ces récepteurs et leur interaction avec de nombreuses hormones respectives. Des études préliminaires, entreprises par l'auteur de la découverte qui se trouve à la base de la présente invention,ont suggéré la présence
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des ou pseudo-gravides. (Voir 1? ouvrage "Gonadotropins", Chapitre
21, 1972, John Wiley & Sons). Ces études préliminaires, toutefois, n'ont pas donné d'indication en ce qui concerne les points de savoir si un récepteur similaire est présent chez des femelles de l'espèce humaine ou d'autres animaux, si le récepteur trouvé chez le rat est
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s'il constituerait un indicateur sûr de la présence de HCG dans des échantillons de fluides du corps, ou s'il est stable pendant un temps quelconque d'une assez longue durée.
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de nombreuses années on a cru absente dans l'espèce humaine. Sa présences dans l'espèce humaine a été confirmée au cours des premières années de la décennie commençant en 1970. La présence de récep-
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établissement d'une documentation, et on pense que cette hormone
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meurs de l'hypophyse, dans des désordres de la lactation, dans l'hy-
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interaction complexe avec d'autres hormones provenant de l'hypophy- <EMI ID=31.1>
et il a effectivement été apporté quelques preuves et rapporta de nombreux faits au cours de ces dernières années à la suite d'études poursuivies sur le rat. La liaison spécifique de la PRL à l'ovaire chez le rat a été suggérée très récemment dans la littérature, mais aucun récepteur spécifique n'a été identifié. (Voir Turkington et al., Rec. Prog. Horm. Res., 29:417 (1973)). Des études poursuivies
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fonction d'un caractère peu prononcé dans l'entretien du corps jaune
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68:1902 (1971) ; Midgley et al., Proc. IV Int. Cong. Endocrinol., Int. Cong. Séries n[deg.] 273, Excerpta Medica, Amsterdam, 1972.
En vue des troubles pathologiques dont il a été question ci-
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pliquée, il est quelquefois souhaité de pouvoir déterminer et/ou surveiller la teneur en PRL dans un échantillon d'essai obtenu à partir d'un sujet, par exemple un échantillon de fluide du corps.
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exemple, dans des cas de pédiatrie et, par conséquent, il est désirable d'avoir à sa disposition un test très spécifique ne nécessitant qu'un petit échantillon et seulement un bref laps de temps pour le mettre en oeuvre. Une bonne spécificité est désirable afin de différencier la PRL d'autres hormones qui peuvent être présentes dans l'échantillon, et ceci est plus particulièrement vrai dans des cas où il peut être souhaitable de déceler la présence ou de mesurer la teneur d'au moins deux hormones différentes.11 n'existe jusqu'à présent aucun moyen vraiment spécifique permettant de procéder à de telles déterminations.
En résumé, la présente invention a notamment pour but : <EMI ID=36.1> chorionique humaine (HCG), l'hormone lutéinisante (LE), la prolactine (PRL) et des substances analogues à la HCG dans un échantillon aqueux ;
- d'établir une méthode de diagnostic de la grossesse ayant un degré de sûreté proche de 100 % ;
- d'établir une méthode permettant de déceler une grossesse ectopique et des menaces d'avortement, l'état de grossesse pouvant <EMI ID=37.1>
ception (début de la grossesse) ;
- d'établir une méthode pour la diagnostic de la grossesse permettant de déceler un état de grossesse aussi précocement que du sixième au huitième jour après l'ovulation avec un degré de sûreté <EMI ID=38.1> <EMI ID=39.1>
hormone HCG dans un échantillon aqueux, plus particulièrement afin de déceler la grossesse chez une femme par étude d'un échantillon de fluide du corps ; <EMI ID=40.1> chantillon aqueux, plus spécialement dans un échantillon de fluide du corps ;
- de fournir une méthode et des moyens permettant de déterminer simultanément et de doser HCG, ou LH et PRL, dans un échantillon aqueux, et plus particulièrement dans un très petit échantillon de fluide du corps ;
- de fournir le récepteur particulier utilisé lors de la mise en oeuvre de la méthode de titrage par radiorécepteur à laquelle il a <EMI ID=41.1>
- de fournir une méthode de production du récepteur spécifique utilisé dans la susdite méthode de dosage par radiorécepteur.
En vue d'atteindre les buts susspécifiés, la présente invention a pour objet un procédé pour le dosage de la gonadotrophine chorionique humaine ( HCG), de l'hormone lutéinisante (LH) et de substances du genre de la HCG et/ou de la prolactine (PRL) dans un échantil-
lon aqueux, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il implique la mise en oeuvre des opérations élémentaires consistant essentiellement : à mettre un tel échantillon en contact avec un agent capable de lier sélectivement l'hormone ; de prévoir des moyens propres à indiquer si une telle liaison est bien intervenue, et à observer les moyens indicateurs afin de déterminer la présence de l'hormone dans l'échantillon ; dans lequel procédé un aspect plus particulièrement perfectionné concerne l'agent de liaison qui est un extrait de membranesde plasma provenant du corps jaune d'un animal qui possède le
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d'un tel procédé peut être l'un quelconque de ceux classiquement utilisés lors de la mise en oeuvre d'une méthode immunochimique similaire pour le dosage des protéines et/ou des polypeptides. Par exemple, l'indicateur peut être une substance qui a été traitée par <EMI ID=43.1>
l'indicateur se décolore, se colore, s'agglutine, précipite ou donne quelque autre indication visible (par exemple, une fluorescence) de
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essai ; on peut aussi, de préférence, avoir recours aux techniques de mesures radiologiques plus précises. En vue de l'application du procédé en question pour établir le diagnostic de la grossesse chez une femme, on met un échantillon de sang ou d'urine en contact avec le récepteur spécifique susspécifié, et l'on détermine la présence ou l'absence de HCG dans ledit échantillon en se basant sur le degré des preuves de liaison mises en évidence par le système indicateur.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention,
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dans un échantillon aqueux, de préférence le sérum sanguin ou l'urine d'une patiente présumée enceinte, cette méthode consistant à mettre un récepteur hautement spécifique à l'égard de l'hormone HCG, lequel récepteur est un extrait de membranes de plasma provenant du corps jaune d'un animal possédant le récepteur pour cette hormone, en contact avec l'échantillon aqueux auquel on a ajouté une certaine quantité de HCG qui a été marquée avec un isotope radioactif. Lors
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lement présente dans l'échantillon et la partie de HCG radioactivement marquée se trouvent liées au récepteur. Le récepteur avec son HCG liée est ensuite séparé de l'échantillon aqueux et l'on mesure la radioactivité d'au noins une des deux fractions séparées afin de
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concentration étant une fonction de la radioactivité mesurée. Il est considéré comme préférable d'obtenir le récepteur à partir du corps jaune d'une vache, d'une brebis, d'une jument ou d'une truie, et plus particulièrement du corps jaune provenant d'une femelle gravide, la période la plus avantageuse de la gravidité étant au cours de son premier trimestre.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne une méthode pour la détermination et le dosage de l'hormone prolactine (PRL) dans un échantillon aqueux, ici encore de préférence dans un fluide du corps, la méthode en question comprenant les opérations élémentaires consistant essentiellement à mettre ledit échantillon en con-
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récepteur étant aussi un extrait de membra nes plasmatiques , provenant du corps jaune d'un animal possédant ce récepteur, et à intro- <EMI ID=49.1>
avec un isotope radioactif. Les autres opérations élémentaires sont
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Cette méthode est utilisable pour établir un diagnostic de la grossesse sur une femme présumée enceinte, ou pour indiquer d'autres désordres s'accompagnant de la présence de prolactine.
La portée de l'invention s'étend aussi à une méthode permettant de doser simultanément au moins deux hormones différentes contenues dans un seul et unique échantillon aqueux. Dans ce mode de réalisation, les opérations élémentaires sont analogues à celles mises en oeuvre pour mesurer des hormones présentes isolément ou à doser une par une, à l'exception du fait que l'échantillon aqueux est mis en contact avec au moins un agent capable de lier sélectivement chacune des hormones à doser, en prévoyant des moyens séparés et discernables pour indiquer si une liaison est intervenue pour chaque hormone et en observant chacun des indicateurs afin de déterminer la présence de chaque hormone.
L'agent de liaison est un extrait de membranes plasmatiques , provenant d'un organe du corps d'une espèce animale connue comme possédant dans ledit organe un récepteur spécifique pour chacune des hormones à doser et mesurer. De préférence, le récepteur est extrait de membranes plasmatiques du corps jaune d' un mammifère, possédant des sites récepteurs à la fois pour HCG et
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de sorte qu'une partie des hormones marquées et non marquées se trouve dans chaque cas liée au récepteur, en séparant l'hormone liée et non liée à partir de l'échantillon, et en comptant la radioactivité de chaque espèce isotopique afin de déterminer la présence des hormones respectives proportionnellement à la radioactivité mesurée.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, il est prévu
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lequel réactif comprend sous une forme pratiquement pure la fraction spécifique de l'extrait de membranes plasmatiques , provenant du
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fraction spécifique étant une fraction capable de lier sélectivement de la gonadotrophine chorionique humaine biologiquement active.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, il <EMI ID=56.1>
ge, chimiquement à l'aide d'un récepteur, de l'hormone HCG, cette méthode comprenant les opérations élémentaires consistant essentiellement à préparer un homogénéisat de tissu finement broyé provenant du tissu du corps jaune d'un animal qui possède le récepteur pour HCG, à séparer les membranes de plasma à partir dudit homogénéisât et à sélectionner la fraction de membranesde plasma capable de lier
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active.
Le mode opératoire pour effectuer l'essai du sujet se prête non seulement au diagnostic de la grossesse dans l'espèce humaine,.mais aussi au diagnostic de la gravidité sur des femelles des espèces animales dans lesquelles le récepteur spécifique selon l'invention se trouve, c'est-à-dire des mammifères mais éventuellement aussi des non mammifères convenablement choisis.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne des moyens
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hormone lutéinisante (LH) ou d'une substance analogue à la HCG dans un échantillon aqueux, lesquels moyens comprennent essentiellement : <EMI ID=59.1> réactif comprenant, sous une forme pratiquement pure, la fraction spécifique de l'extrait de membranesplasmatiquesprovenant du corps jaune d'une espèce animale possédant le récepteur pour HCG capable
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xième réactif comprenant de la HCG marquée capable d'émettre un rayonnement, le susdit premier réactif étant destiné à être mis en contact avec l'échantillon contenant l'hormone à mesurer ou doser et avec le deuxième réactif afin de lier une partie de l'hormone marquée et non marquée audit récepteur ; (d) des moyens pour mesurer la quantité d'hormone marquée liée audit récepteur, le rayonnement émis à partir de ladite quantité d'hormone marquée étant fonction de la concentration de l'hormone dans l'échantillon aqueux. Ce mode de réalisation affecte de préférence la forme d'une trousse-nécessaire pour l'établissement d'un diagnostic de la grossesse (ou de la gravidité).
Il est aussi prévu, conformément à l'invention, des moyens pour le dosage de la prolactine (PRL) dans un échantillon aqueux, lesquels moyens comprenant essentiellement : (a) un premier réactif et un deuxième réactif ; (b) ledit premier réactif comprenant, sous une forme pratiquement pure, la fraction spécifique d'un extrait de mem- <EMI ID=61.1>
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réactif étant destiné à être mis en contact avec l'échantillon contenant l'hormone à doser et avec le deuxième réactif pour lier une partie de l'hormone marquée et non marquée audit récepteur ; (d) des moyens pour mesurer la quantité d'hormone marquée liée audit récepteur, le rayonnement émis à partir de ladite quantité d'hormone marquée étant fonction de la concentration de l'hormone dans l'échantillon aqueux.
Enfin, selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, il est prévu des moyens pour la détermination et le dosage de plusieurs hormones dans un échantillon aqueux, lesquels moyens comprennent essentiellement : (a) un premier réactif et un certain nombre de deuxièmes réactifs égal au nombre d'hormones à doser ; (b) ledit premier réactif comprenant, sous une forme pratiquement pure, la fraction spécifique d'un extrait de membranes plasmatiques provenant d'un organe du corps d'une espèce animale possédant ledit récepteur
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xièmes réactifs comprenant chacune desdites hormones à doser sous une forme marquée capable d'émettre un rayonnement, ledit rayonnement émis étant différent pour chaque hormone marquée, le susdit premier réactif étant destiné à être mis en contact avec l'échantillon contenant l'hormone à doser et avec les deuxièmes réactifs afin de lier une partie des hormones marquées et non marquées audit récepteur ;
(d) des moyens pour mesurer la quantité d'hormones marquées liées audit récepteur, le rayonnement émis à partir de chaque hormone marquée étant fonction de la concentration de l'hormone respective dans l'échantillon aqueux.
Dans le présent mode de réalisation de l'invention, le premier réactif est de préférence l'extrait de membranes plasmatiques provenant d'un mammifère, tandis que les deuxièmes réactifs comprennent HCG et PRL marquées avec des isotopes différents.
D'autres buts, particularités et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture du complément de description détaillée de l' invention qui suit.
La présente invention a été mise au point à la suite de la découverte d'une méthode nouvelle et très spécifique pour la détermination et le dosage de la gonadotrophine chorionique humaine (HCG) <EMI ID=64.1>
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cipe d'une liaison du type antigène-anticorps mais qui ne sont pas suffisamment sûrs, le procédé faisant l'objet de la présente invention est basé sur l'utilisation d'un récepteur hautement sélectif à l'égard de HCG. Ledit récepteur est isolé à partir du tissu-cible
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chimiques, on produit un antisérum à partir du sang d'un animal convenable auquel on a injecté l'hormone afin de produire une réponse du type antigène-anticorps.
Antérieurement à la présente invention, il n'a pas été reconnu de raison pour réaliser la détermination et le dosage de PRL sur des êtres humains, et, par conséquent, les spécialistes ne se sont pas efforcés de mettre au point des modes opératoires adéquats. La présente invention est basée sur la découverte d'un récepteur spécifique à l'égard de cette hormone. L'utilisation d'un récepteur spécifique isolé à partir du tissu-cible d'un animal qui possède ce récepteur spécifique apporte un remède, d'une façon apparemment entièrement efficace, à l'inconvénient des réponses non spécifiques qui interviennent souvent lors de la mise en oeuvre de méthodes immunochimiques. Dans la plupart des cas, la liaison du récepteur spécifique nécessite la configuration d'une hormone sous sa forme biologiquement active.
Par conséquent, lorsque le mode opératoire d'essai chimique par récepteur est combiné à des techniques indicatrices basées sur un radio-titrage, il en résulte l'obtention d'une méthode de titrage par radiorécepteur qui possède le degré de sensibilité des techniques de titrage radioimmunologique et, en même temps, le degré de spécificité du titrage biologique, et, par conséquent, la mise en oeuvre de cette méthode s'accompagne de l'obtention d'une précision régulièrement plus grande que celle de tous les tests immunologiques et biologiques présentement existants pour la détection et le dosage d'hormones, et plus particulièrement des tests pour le diagnostic de la grossesse ou de la gravidité.
De plus, en raison du fait que le récepteur nécessite le recours à la forme biologiquement active de l'hormone pour assurer la liai-
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normalement donnerait une réaction positive avec les modes opératoi-
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mise en oeuvre de la méthode d'essai selon la présente invention.
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fonction dans le cycle de l'oestrus chez le rat, mais en même temps n'a pas été identifiée comme jouant un rôle quelconque dans les pro-
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invention est basée sur la découverte du fait qu'il se produit une
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tissu ovarien provenant de plusieurs espèces animales , y compris des vaches et des femmes. contient des sites récepteurs spécifiques à l'égard de l'hormone PRL, en plus de sites récepteurs à l'égard de ECG.
Par conséquent, en plus d'un mode opératoire généralement applicable pour la détermination et le dosage de PRL à l'occasion des divers états et troubles pathologiques susmentionnés, il est possible aussi d'utiliser la méthode selon l'invention pour établir le diagnostic, ou de préférence pour aider à établir le diagnostic, de la grossesse (ou de la gravidité). Une augmentation décelée dans le
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conjointement avec le dosage de HCG conformément à l'invention, qu' un état de grossesse existe bien effectivement. Ce degré supplémentaire de confirmation est d'une grande valeur et d'un grand intérêt,
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le ou des menaces d'avortement. On pense que la PRL joue un rôle important dans le développement foetal et, par conséquent. le dosage de cette hormone fournit des informations précieuses en plus de celles acquises à la suite d'un dosage de HCG.
Selon un aspect préféré de la présente invention, il est possi-
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on a découvert que le même récepteur possède des sites récepteurs pour l'une et l'autre de ces deux hormones. Il s'agit là d'une découverte particulièrement inattendue en raison du fait que l'existence de sites récepteurs à l'égard de la PRL n'avait jusqu'à présent pas été confirmée dans le corps jaune d'un animal quelconque et que
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que chez la rat. Un dosage simultané s'accompagne d'avantages évidents pour l'établissement d'un diagnostic de la grossesse étant <EMI ID=80.1>
se actuellement.
Cette technique de dosage simultané n'est pas limitée aux hor-
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technique selon l'invention est également applicable à des dosagss simultanés de ces hormones en utilisant un récepteur préparé à partir d'un tissu prélevé dans le sein.
Il a été aussi-découvert, conformément à la présente invention, que la technique du dosage par radiorécepteur permet un diagnostic très précoce de la grossesse (une semaine après l'ovulation). Ceci représente évidemment un progrès très significatif dans le domaine des diagnostics de la grossesse, étant donné que jusqu'à présent un état de grossesse ne pouvait pas être décelé plus tôt que le dixième ou le douziène jour après l'ovulation.
Ce résultat est plus significatif encore si l'on considère que la très grande majorité des diagnostics de la grossesse sont établ_s aujourd'hui non pas au moyen du dosage radicinmunologiaue qui permet une détermination aussi précoce que dix à douze jours après l'ovulation, mais seulement en ayant recours aux tests d'hémagglutination ou sur lamelle supportant un latex, tests qui permettent de diagnostiquer une grossesse seulement 25 ou 30 jours après l'ovulation. Des tests par dosage radioimmunologique exigent une durée de dosage en laboratoire d'au moins
24 heures et qui atteint couramment typiquement 48 heures et, en
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qués et coûteux. D'autre part, la durée du temps nécessaire pour procéder à l'essai conformément à l'invention n'atteint pas plus d' environ une heure et est typiquement de seulement environ une demiheure. Les avantages pratiques découlant de l'utilisation d'une telle méthode d'établissement d'un diagnostic de grossesse, qui permet de déceler l'existence de l'état de grossesse avant l'implantation de l'ovule fécondé dans le tissu de l'endomètre. ont été brièvement passés en revue ci-dessus, et ces avantages, aussi bien que les bienfaits significatifs en matière de recherche fondamentale sur
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questions.
-En raison des similitudes fondamentales dans le mécanisme de liaison au cours de la mise en oeuvre du test chimique par récepteur selon l'invention et dans le mécanisme bien connu de conduite du test immunochimique, il est possible d'utiliser les mécanismes d'indication,antérieurement mis au point, lors de la mise en oeuvre de la présente invention. Par conséquent, le système /indicateur peut être constitué par une substance indicatrice qui a été traitée par HCG de façon telle que, en présence du récepteur, la substance indicatrice se décolore, se colore, s'agglutine, précipite ou donne quelque autre indication visible ou chimique de la présence ou de <EMI ID=85.1>
à l'essai. De ce qui précède, toutefois, il ressort clairement que les résultats les plus efficaces sont obtenus lorsqu'on a recours à une technique de dosage radiologique comme système indicateur. Par conséquent, le mode de réalisation par dosage avec un radiorécepteur selon la présente invention représente clairement la modalité de mise en oeuvre considérée comme étant la plus avantageuse. Il faut néanmoins ne pas perdre de vue que la présente invention ne réside
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particulier utilisable au cours de la mise en oeuvre de la méthode en question, mais qu'elle réside dans l'utilisation fondamentale et nouvelle de techniques chimiques par récepteur et d'un récepteur spécifique pour déterminer la présence de HCG et/ou de PRL et pour les doser.
En raison du degré extrême de spécificité et de sensibilité de la méthode de dosage par radiorécepteur selon la présente invention, il est possible de réaliser un dosage satisfaisant sur un échantillon extrêmement petit. Par exemple, lors de l'utilisation de la méthode selon l'invention pour l'établissement d'un diagnostic de grossesse, il est possible de conduire le test en n'utilisant que seulement 0,1 ml, et même moins, du sang prélevé sur la patiente. Cette prise de sang sur la patiente est réalisable au moyen d'une simple piqûre d'aiguille sur l'extrémité d'un doigt. En outre, la méthode
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dans un échantillon aqueux, et, par conséquent, il peut être convenable et commode d'utiliser soit du sérum sanguin, soit un échantillon d'urine provenant d'une patiente.
Le récepteur spécifique utilisé lors de la mise en oeuvre du <EMI ID=88.1>
initialement que la configuration de l'hormone corresponde à sa forme biologiquement active pour qu'intervienne la liaison. Il n'y a donc pas de possibilité d'une immuno-réponse non spécifique. Chez
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lement décelable dans le tissu ovarien qui représente le tissu-cible de l'hormone. Bien que le récepteur soit isolable à partir de n'importe quel mammifère et, le cas échéant, à partir de certains non mammifères, il est considéré comme préférable d'obtenir le récepteur à partir des ovaires d'animaux d'une taille relativement grande, tels que vaches, brebis, truies, juments et analogues)car ces animaux possèdent proportionnellement une plus grande quantité de tissu ovarien et, par conséquent, des ressources facilement exploitables d'un tel tissu existent en raison du fait que. ces animaux sont commercialement élevés pour leur viande. On a constaté qu'il est possible d'établir jusqu'à 200 diagnostics de la grossesse à partir d'un seul et unique ovaire de vache.
Les ovaires de rat, par exemple, sont si petits qu'il est à peu près impossible d'envisager l'utilisation de ces animaux comme source pratique de récepteur. Ainsi qu'on le montre'en détail ci-après, la méthode d'essai selon l'invention est applicable aussi à des animaux qui possèdent le récepteur, et, par conséquent, une évaluation positive-de la gravidité dans une espèce donnée fournit aussi une méthode permettant de sélectionner des animaux pour déceler la présence du récepteur.
De préférence, l'animal dont provient le récepteur est en état de gravidité lorsqu'on l'abat, car à ce moment la quantité de tissu ovarien et le nombre de sites récepteurs atteignent leurs valeurs maximales. On a trouvé que le premier trimestre de la gravidité constitue l'époque la plus avantageuse pour obtenir le tissu.
Le récepteur spécifique utilisable selon l'invention est obtenu en séparant les membranes plasmatiques pures à partir du tissu ovarien, puis en évaluant les diverses fractions de membranes plasma-
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hormone. Le récepteur est extrêmement stable et peut être conservé pendant de longs laps de temps, ou bien il peut même être réutilisé au cours d'un deuxième ou autre test. Le récepteur du type membrane <EMI ID=92.1>
se. le mode opératoire exact pour l'obtention du récepteur est décrit plus en détail ci-après.
Etant donné que le mode opératoire d'essai selon l'invention n' est pas spécifique à une espèce animale, il est utilisable aussi pour déceler l'état de gravidité de femelles de n'importe lesquelles des espèces animales qui se sont révélées comme possédant le récepteur spécifique utilisé selon l'invention. Par conséquent, même en
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pèces animales, il est capable aussi de lier sélectivement des pro-
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pondant à celui que joue HCG dans l'espèce humaine, c'est-à-dire qu' elles correspondent à la gonadotrophine chorionique de l'espèce humaine. Cela est également vrai pour la PRL. L'avantage de ce fait est que des animaux d'essai de laboratoire classiques, tels que des singes, des chiens, des lapins, des souris, etc., peuvent être soumis à des tests par cette méthode, alors que des anticorps distincts sont nécessaires pour chaque animal lorsqu'on a recours à des modes opératoires d'essais immunochimiques.
Le marquage de la HCG ou de la PRL avec un isotope radioactif est réalisable de la manière classique, en utilisant à cette fin un
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gues. Un isotope particulièrement adéquat est un isotope radioactif de l'iode tel que 1251 en raison du fait que le marquage avec cet isotope est relativement simple et que beaucoup le laboratoires possèdent l'équipement nécessaire pour mesurer cet isotope.
Dans le cas du titrage simultané de plusieurs hormones par mise en oeuvre de la technique de titrage par récepteur selon l'invention, il est nécessaire de marquer chaque hormone à doser en utilisant un isotope qu'il soit possible de discerner, afin qu'une mesure des fractions d'hormones liées et/ou non liées puisse fournir une indication séparée pour chaque hormone à doser. Par exemple, quand on
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tage qu'il est facile de se procurer pour compter séparément chaque isotope.
Afin de décrire plus complètement la présente invention, on présente ci-après plusieurs méthodes particulières permettant de prépa- <EMI ID=100.1>
le mode d'application du dosage par radiorécepteur ainsi que des exemples de déterminations cliniques utilisant la présente invention ; il convient toutefois de ne pas perdre de vue que les modes opératoires particuliers ne constituent que de simples exemples bien entendu non limitatifs qui servent simplement à illustrer la mise en
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On utilise, pour la conduite du test, une hormone HCG hautement
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en utilisant une lactoperoxydase préparée à partir de lait (RZ = 0,78 ; Sigma Company, Saint-Louis, Missouri, E.U.A.). Deux mCi de
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à réaction. Une partie aliquote de 50 ng de lactoperoxydase dans 20
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ajoutées à cinq minutes d'intervalle. A la fin d'un laps de temps de 20 minutes, on interrompt la réaction par addition de 0,5 ml d'une
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l'iode libre par filtration au travers d'un gel dans une colonne de
1 x 30 cm de résine "Sephadex G-100." mise en équilibre avec une solu-
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cifique de la HCG marquée est déterminée par précipitation avec de
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recueille par centrifugation les protéines précipitées. La radioacvité associée à la substance précipitable est considérée comme étant une caractérisation de la liaison aux protéines et est utilisée pour le calcul de l'activité spécifique de l'hormone marquée. On purifie le mélange réactionnel brut par filtration au travers d'un gel dans une colonne de 1 x 30 cm garnie de résine "Sephadex G-50" mise en
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tivité spécifique de la HCG utilisée dans le titrage par radiorécep-
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utilisée pour le test, telle qu'elle est déterminée par le titrage .........
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entre 5.826 et 12.250 U.I./mg.
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de sodium. On ajoute 100 mg de perles "Iobeads" (Hycel Reagents, Houston, Texas, E.U.A.) au mélange ioduré brut afin d'adsorber 1251 qui n'a pas réagi. On réalise aussi une ioduration de hPRL enzyma-
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Louis, Missouri, E.U.A.). On réalise une purification par filtration au travers d'une colonne mesurant 0,7 x 18 cm, garnie de résine "Sephadex G-100". L'activité spécifique et la pureté de la PRL mar-
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de se lier spécifiquement à du tissu mammaire provenant d'un rat femelle en période de lactation est utilisé pour poursuivre des études de liaison avec un homogénéisat ovarien partiellement purifié. II. Préparation du récepteur
Tous les modes opératoires poursuivis au cours de la préparation de membranes plasmatique;s'effectuent dans un bain de glace ou à 4[deg.]C. On obtient des ovaires frais de vache au début de la période de gravidité (premier trimestre : longueur du foetus de la tête à la croupe atteignant jusqu'à 22 cm) en s'adressant aux abattoirs, et on les conserve dans de l'azote liquéfié jusqu'à l'instant où on doit les traiter. Au cours d'une expérience typique, 100 g de tissu provenant d'approximativement 25 gros corps jaunes sont coupés en petits morceaux à l'aide d'une lame en - �r bien aiguisée, puis on
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en saccharose. On filtre l'homogénéisat au travers de deux épaisseurs de mousseline à beurre ou à fromage et on traite à nouveau les plus grosses particules dans 500 ml du susdit tampon. On homogénéise encore le tissu par 10 à 15 passages dans un homogénéiseur en "Teflon" et verre, Type C, avec un espacement de 0,12 à 0,17 mm et à une température de 4[deg.]C. On centrifuge l'homogénéisat à 650 x g pen-
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Rotor GSA) afin de séparer des cellules intactes, des débris de cel- <EMI ID=128.1>
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surnageant et l'on remet le culot en suspension dans 50 à 70 si du
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(Model Beckman Spinco L3-50) tournant à 3.000 tours/minute et contenant 500 ml d'un sirop à gradient linéaire de saccharose (pompe
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portion supplémentaire de 20 ml est injectée après l'échantillon. Après deux heures de centrifugation à 45.000 tours/minute, on ralentit la rotation de la centrifugeuse et l'on déplace le contenu du
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minute. On déplace les membranes plasmatiques à partir du rotor afin d'accroître la grosseur des particules, et on recueille des fractions de 12 ml que l'on congèle immédiatement avant les opérations de titrage pour préserver les qualités liantes et l'activité enzymatiqua. On maintient les membranes congelées pendant trois mois sans perte apparente de l'aptitude à liaison. On prélève une partie aliquote des fractions pour les soumettre à un examen au microscope électronique avant congélation. Le saccharose contenu dans la suspension ne gêne pas le développement d'une liaison avec la HCG marquée.
Des parties aliquotes d'homogénéisat ovarien et des parties aliquotes convenables des diverses fractions obtenues à partir du gradient continu de densité de saccharose sont solubilisées dans
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afin de déterminer la teneur en protéine par la méthode de Lowry
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ne bovine comme étalon. Des parties aliquotes des diverses fractions
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le degré de liaison dans chaque cas. Sur la base de la concentration de protéine, les membranes plasmatiques contenant le récepteur
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dix fois plus grande que celle de 1'homogénéisât ovarien brut.
On analyse aussi chaque fraction pour en apprécier le degré de contamination en étudiant son activité enzymatique. On titre chaque fraction afin d'en déterminer l'activité 5'-Nucléodiase par la mé- <EMI ID=138.1>
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(J. Biol. Chem., 189, page 665, 1951).
A titre de contrôle supplémentaire du degré de pureté des mem-
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men au microscope électronique. Une partie aliquote de chaque fraction protéinique est mélangée pendant 24 heures avec une solution
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un tampon réfrigéré au cacodylate 0,25 M ou au phosphate contenant
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drate tous les échantillons en les faisant passer au travers d'une série progressive d'alcool, et on les noie dans une résine soit
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et que l'on photographie à l'aide d'un microscope électronique Phillips "Em-300".
Une fraction présentant la plus forte liaison avec la HCG mar-
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plasmatiques pures (ce dernier point étant prouvé par l'examen au microscope électronique) est éluée à une densité de saccharose de 1,16 (environ 35 % en poids/volume). Des parties aliquotes de cette fraction sont conservées dans de l'azote liquéfié et sont utilisées comme récepteur.
III. Mode opératoire pour le titrage au radiorécepteur
Le titrage radiologique à l'aide d'un récepteur est effectué dans des tubes en polystyrène (dix tubes de 75 ml) selon le protocole défini dans le Tableau I ci-après.
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Tableau la
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(1) Le doublement de la dilution commençant à 100 ng dans 100 )il
s'effectue dans un tampon d'incubation.
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isolées à partir de corps jaunes de vaches.
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préparés dans un tampon pour incubation.
(4) Plasma provenant de sujets complètement hypophysectomisés pré-
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radioimmunologiques respectivement correspondants.
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50 U.I. de Trasylol.
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que tube, on ajoute ensuite un millilitre de diluant réfrigéré. On mélange le contenu des tubes sur un mélangeur Vordex puis on centrifuge pendant 20 minutes à 3.000 x g dans une centrifugeuse Sorvall réfrigérée (modèle RC2B ; rotor type HS-4). On aspire les surnageants et on soumet les culots à un comptage dans un compteur Packard Autogamma ayant un rendement de 51 le- pour 1251. Les courbes d'étalonnage et la concentration d'hormone dans les échantillons de
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temps en utilisant des transformations en coordonnées logarithmiques.
L'examen d'un diagramme en coordonnées logarithmiques ainsi établi, indiquant la "réponse à l'inhibition compétitive" pour un titrage à radiorécepteur de HCG, prouve que la sensibilité du titrage descend jusqu'à moins de 3,0 ng/ml avec un degré de précision de
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rents titrages, telles qu'on peut les déterminer en titrant un stock de réserve de plasma à diverses dilutions au cours de douze titra-
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totalité du domaine de portée du titrage, ce qui prouve le haut degré de reproductibilité du titrage en question. L'échantillon de plasma d'une femme enceinte manifeste une réponse de dose identique
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Il apparaît une absence complète de réaction croisée avec des préparations hautement purifiées de FSH, PRL et HPL, aussi bien qu'avec du plasma provenant de sujets hypothyroidiens, acromégaliques, et de femmes en période de lactation post-partum, ce qui constitue une bonne indication de la haute spécificité du titrage radiologique sur récepteur selon l'invention. Le titrage radiologique en question n'établit pas de discrimination entre HCG et LH ; toutefois,
un titrage radioimmunologique utilisant FSH, LH et HCG marquées au
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les hormones a prouvé qu'il n'y a pas d'élévation des taux plasmatilues de LH et de FSH pendant le début d'une grossesse. Par conséquent, le manque de discrimination entre HCG et LH n'a pas d'effet sur la détection de la grossesse quand on utilise le titrage radioLogique avec récepteur selon l'invention.
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Un mélange réactionnel contenant 100 ul de tampon pour incubation contenant 10 U.I. de Trasylol (FBA Pharmaceuticals, New York, N.Y., U.S.A.), 50 )il de préparation de récepteur équivalant à 1-300
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à 37[deg.]C pendant deux heures en l'absence et en présence de 1 pg de PRL bovine non marquée. A la fin de l'incubation, on ajoute 1 ml de
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tubes, que l'on centrifuge ensuite à 5.000 tours/minute pendant 20 minutes. On aspire les surnageants. Les culots contenant du récepteur lié aux hormones sont soumis, à un comptage dans un compteur
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Instrument Company, Downers Grove, Illinois, E.U.A.). On calcule le degré de liaison spécifique admis comme étant égal à la différen-
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un tube sans PRL marquée.
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provenant de corps jaunes de vaches est un processus saturable. La saturation est prouvée par incubation de membranes plasmatiques prove-
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calculée par analyse Scatchard de données obtenues à partir de la
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croît en fonction de la quantité d'homogénéisats que l'on ajoute et
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non marquée.
A 37[deg.]C, la liaison est rapide pendant les 30 premières minutes ; ensuite, la liaison croît lentement pour atteindre un état d'équili-
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degré de liaison, même après 18 heures d'incubation.
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homogénéisats ovariens, on incube à diverses concentrations des échantillons des hormones suivantes : hormone de croissance humaine
(hGH) hormone humaine stimulatrice des follicules (hFSH), hormone
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une activité et des capacités essentiellement similaires en ce qui concerne la compétition avec 125I-hPRL. Un manque de compétition manifesté par FSH et LH à l'égard de la liaison au récepteur prouve la spécificité de PRL pour les sites récepteurs de hCS, qui présente des similitudes aussi bien structurales que biologiques avec PRL avec pour conséquence un certain degré de réaction croisée ; toute-
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préparation de hGH est en bon accord avec la contamination signalée de hGH à un degré très similaire.
IV. Essais cliniques
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tendues et étaient des candidates possibles à un miniavortement ont fait l'objet d'une prise de sang en vue du titrage radiologique avec récepteur et on a recueilli leur urines de 24 heures pour le test d'agglutination (test Pregnosticon-Dri-Dot). On procède à un examen physique général et à un examen du bassin. on évalue les modifications de dimensions de l'utérus et de sa consistance, ainsi que d' autres symptômes d'une grossesse possible. Si le titrage radiolcgique avec récepteur est positif, et quel que soit le résultat, positif ou négatif, du test Pregnosticon, on a affaire à un miniavortement. Tous les échantillons sont envoyés au laboratoire de pathologie afin de confirmer un état de grossesse. Trois patientes ont avorté spontanément, et trois autres, qui ont développé une grossesse ectopique, contituent des cas qui seront discutés séparément. Les
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pendant 15 minutes, après quoi on conserve le plasma ou sérum à
-20[deg.]C jusqu'à son utilisation.
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sang est effectué 77 fois pour 72 patientes afin de déterminer la présence d'une grossesse à ses débuts.- On détermine le degré de précision du test en le comparant au test Pregnosticon-Dri-Dot, et le présence d'une grossesse est confirmée par l'examen histologique d'échantillon d'endomètre obtenus à la suite d'un avortement électif <EMI ID=200.1>
sent. d'autres preuves permettant de confirmer la précision du titrage radiologique avec récepteur.
Quarante-et-une patientes présentais un titrage radiologique
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l'absence de toute grossesse par d'autres observations cliniques.
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Il apparaît aussi que le test Pregicsticon n'est pas assez sen-
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radiologique avec récepteur est capable ie déceler la présence d'une
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contenu utérin que l'on avait recueilli révèle la présence de tissu chorionique. Dans les quatre grossesses qui ne sont terminées par
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de 10 à 14 jours et l'utérus n'apparaissait pas suffisamment agrandi pour la durée de la grossesse admise, ce qui suggérait une ano-
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Sur 20 sujets ayant consulté à la clinique de fécondité, des prises de sang ont été pratiquées quotidiennement pendant le cycle menstruel en vue de doser FSH et LH par vitrage radioimmunologique.
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tion urinaire d'oestrogène et de progestérone et de modifications caractéristiques survenues dans le mucus cervical comme preuve d'ovulation, on avisa ces femmes qu'elles étaient devenues enceintes. Les échantillons de sang de quatre de ces femmes qui étaient devenues enceintes ont été analysés afin d'établir les taux de HCG par
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normales au cours de la période englobant l'ovulation et les débuts de la grossesse. Un résumé portant sur tous les sujets traités est présenté dans le Tableau II ci-dessous.
Tableau II
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5 états de non grossesse enregistrés deux fois
Ci-après sont donnés des résumés de l'histoire de cas additionnels qui servent à illustrer encore la valeur de la technique du titrage radiologique avec récepteur.
Une femme âgée de 23 ans (para III, gravida IV) est examinée huit jours après la non apparition des règles. Le test Pregnosticon sur l'urine est négatif, et le dosage sur radiorécepteur est positif. Un miniavortement survenu le jour suivant permet de constater la présence de tissu placentaire.
Une nullipare de 20 ans porte un dispositif anticonceptionnel intra-utérin, et neuf mois après sa mise en place ses règles sont de neuf jours en retard ; le titrage au radiorécepteur est positif. On trouve que ce titrage est de nouveau positif deux jours plus tard, et un miniavortement révèle la présence de tissu chorionique. Deux tests au Pregnosticon effectués les mêmes jours étaient négatifs- <EMI ID=221.1>
négatif. Sept jours plus tard, un avortement spontané intervient. Trois mois plus tard, la femme vient se faire de nouveau examiner cinq jours après la première période de règles manquantes. De nouveau, le titrage au radiorécepteur est positif et le test au Pregnosticcn est négatif. L'utérus ne grossit pas, des pertes noires commencent à apparaître et se poursuivent jusqu'à ce qu'il intervi-
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manquant. Un examen des tissus recueillis après le deuxième avortement révèle la présence d'un sac amniotique dépourvu de foetus.
Dans un autre cas, une femme âgée de 30 ans (gravida I) est examinée douze jours avec la non apparition de règles. A ce moment, le titrage au radiorécepteur est positif et le test au Pregnosticon est négatif. Après deux semaines de pertes irrégulièrement colorées et d'un grossissement douteux de l'utérus, un avortement spontané intervient.
Sur deux patientes suspectées de grossesse ectopique, une présente un titrage au radiorécepteur positif et l'autre un test négatif. Il se confirme que la première fait une grossesse tubaire non rompue. Dans les deux cas, le test au Pregnosticon est négatif. Ciaprès est un bref compte-rendu du déroulement d'une grossesse ectopique : une femme âgée de 40 ans (para I, gravida I) constate une non apparition de ses règles et immédiatement après, une douleur modérée dans la région abdominale inférieure et l'apparition de taches vaginales qui persistent pendant deux semaines. Le test d' inhibition de l'hémagglutination dans un tube est négatif le jour qui suit celui de l'admission. Le deuxième jour, le résultat du titrage au radiorécepteur est positif.
Le troisième jour, un curetage ne révèle aucun signe de grossesse ; une ponction dans les culs-de-sac est négative, et une laparoscopie révèle la présence d'une grossesse ectopique gauche non rompue dont on pratique l'ablation au cours d'une laparotomie ultérieure.
Treize patientes sont admises à l'hôpital à la suite de diagnostics suspectant une grossesse ectopique. La dernière période mentruelle s'étendait de 23 à 76 jours avant l'admission. Une douleur dans la portion inférieure de l'abdomen, une aménorrhée, des pertes vaginales colorées fréquentes, et la présence d'une masse annexe dans les oviductes constituent les constatations habituelles.
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sur latex à partir d'échantillons d'urine. Les résultats d'essais, d'établissement de diagnostic de la grossesse, et les constatations
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dessous.
Tableau III
Comparaison de tests de diagnostic de grossesse et de constatations pathologiques sur treize patientes
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le Tableau III indique les résultats obtenus par le titrage sur radiorécepteur et par le test d'hémagglutination sur treize cas soupçonnés de grossesse ectopique, avec, en plus, la durée du temps passé depuis les dernières règles et la conclusion d'examens histologiques sur des prélèvementstubaires. Sept sur les dix cas de grossesse ectopique donnent un résultat positif du titrage au radiorécepteur et un résultat négatif du test d'hémagglutination pour établir un diagnostic de grossesse. On obtient un test d'hémagglutination faussement positif, mais pas de titrages faussement positifs au radiorécepteur. Il existe un large intervalle de durée de grossesse, compris entre 23 et 76 jours après les dernières règles.
L'établissement des courbes en coordonnées logarithmiques selon les principes brièvement décrits ci-dessus révèle, à la suite de la
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sensibilité de 0,3 ng ou 3 mUI/HCG/ml. Diverses dilutions de l'échantillon de plasma provenant d'une femme enceinte donnent une pente parallèle à celle de HCG, ce qui prouve la validité du titrage.
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inconnue d'hormone. La variation dans un titrage donné et entre des titrages différents en ce qui concerne les estimations de taux d' hormone dans des stocks de réserve de plasma est respectivement de
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cependant plus ou moins annulé à la suite de certaines observations,
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ni pour FSH au cours des débuts d'une grossesse, tel qu'on peut le déterminer par titrage radioiEmunologique �-subunitaire spécifique
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nent la même quantité de plasma provenant de femmes non enceintes
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tous les échantillons non connus sont comparés à un stock de réserve de plasma provenant de femmes non enceintes et à diverses dilutions d'un stock de plasma de réserve provenant de femmes enceintes et que l'on analyse systématiquement lors de chaque titrage afin de procéder à un contrôle de la précision et de la qualité ; 4[deg.]) enfin, au
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fois plus élevés que chez des femmes non enceintes au cours de la période lutéale.
Les taux de HCG dans dix cas de grossesse ectopique sont comparés avec les taux observés sur deux cas de grossesse intra-utérine normale et sur un cas d'ovulation et de grossesse provoquées avec
10.000 U.I. de HCG, tous ces cas étant surveillés par des titrages sur radio récepteur. Les taux plasmatiques de HCG pendant les débuts d'une grossesse provoquée ou d'une grossesse naturelle sont similaires. Le jour du début de la grossesse est basé sur la dernière période menstruelle signalée par les patientes. Pour une des dix patientes, le titrage sur radiorécepteur a été effectué les
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associés à des tests négatifs au Pregnosticon. Le début de l'élévation du taux de HCG à la suite du maximum de LH est décelé pour la première fois dans les échantillons de sang prélevés en premier lieu de 6 à 8 jours après l'ovulation et éventuellement plus tôt après la fécondation. Pour trois des cas de grossesse ectopique, on dispose
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trages se trouvent compris dans l'intervalle correspondant à une grossesse normale. Les si'!;: autres taux de HCG mesurés sur des cas de grossesse ectopique sont inférieurs à la normale. Ces observations suggèrent que les nidations précoces dans les oviductes, avant rupture et hémorragie, peuvent sécréter des quantités normales de HCG. Plus tard, toutefois, quand l'hémorragie survient, avec séparation accrue et moindre apport de sang, la sécrétion de HCG se stabilise sur un palier.
Pour la susdite série de treize cas de grossesse ectopique
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soit 0,26 et 0,42 U.I., pour deux de ces treize cas. Le fait d'avoir décelé la présence de HCG à d'aussi faibles taux a facilité la mise au point d'un traitement correct de ces femmes à un stade très précoce de leur grossesse pathologique. Pour les autres patientes, les valeurs des taux étaient supérieures à 100 ng/ml. Les valeurs du taux de HCG ont été obtenus les 21ème, 24ème, 30ème et 42ème jours de la grossesse pour la même patiente. Le premier titrage est associé à un test négatif au Pregnosticon, cependant que les deux types de tests sont positifs pour les trois déterminations suivan-
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re par suite d'une grossesse ectopique droite rompue.
En résumé, le titrage, sur radiorécepteur, de HCG avec une sensibilité de 50 pg ou 3 mUI/ml de plasma apparaît comme étant capable de déceler la grossesse avec un degré de certitude proche de
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gles. Ce test, qu'il est possible de conduire en une heure, est idéalement adéquat pour la détection clinique de grossesses ectopiques, plus spécialement chez des patientes pour lesquelles une intervention chirurgicale immédiate s'impose. Treize patientes soupçonnées de développer une grossesse ectopique ont fait l'objet d'un titrage par la technique du radiorécepteur selon l'invention, et le cas de l'une d'entre elle a été suivi à l'aide de quatre déterminations séparées. Les résultats du titrage ont été ultérieurement comparés avec ceux de tests de grossesse par hémagglutination, avec les symptômes cliniques, et avec des constatations de pathologie. Pour toutes ces patientes, le titrage par radiorécepteur a permis d'
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mesurés par le titrage selon l'invention dans des cas de grossesse <EMI ID=244.1>
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l'aide des tests d'hémagglutination est possible. De plus, l'hypothèse d'une grossesse ectopique peut être exclue chez des patientes admises à l'hôpital en urgence pour des manifestations abdominales aiguës.
La figure 1 est un diagramme en coordonnées logit-log. exprimant sous forme d'une courbe la réponse d'inhibition compétitive lors du titrage de HCG par radiorécepteur, servant d'étalon de calcul en vue de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention . La figure 2 illustre les résultats apparaissant à la sortie de la calculatrice IBM concernant la transformation en coordonnées logit-log de l'étalon pour le titrage par radiorécepteur de HCG.
La figure 3 présente sous forme de courbes l'évolution, en fonction du temps (nombre de jours de grossesse portés en abscisses), des taux plasmatiques de HCG pour deux cas de grossesse normale (patientes H.D. et R.S.), pour un cas de grossesse intrautérine provoquée (patiente S.L.), et pour dix cas de grossesse ectopique. <EMI ID=246.1> les courbes étalons établies pour une hormone humaine (HCG) et pour des hormones lutéinisantes de diverses espèces animales
(femelles du cheval, du chien, du rat, du lapin) .
Des allusions à ces figures apparaissent,notamment dans la description précédente, au cours de passages débutant page
30, ligne 35, page 31 ligne 24, page 32 ligne 10 .
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humaine (HCG), de l'hormone lutéinisante (LH) ou d'une substance analogue à la HCG dans un échantillon aqueux, ce procédé comportant les opérations consistant à mettre ledit échantillon en contact avec un agent capable de lier sélectivement ladite hormone, à prévoir des moyens pour indiquer si une telle liaison est intervenue, et à observer lesdits moyens indicateurs afin de déterminer la présence de ladite hormone dans l'échantillon, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comporte le perfectionnement consistant à utiliser, comme susdit agent capable de lier sélectivement ladite hormone, un extrait de membranes plasmatiques provenant du corps jaune d'une espèce animale possédant le récepteur pour la HCG.