<Desc/Clms Page number 1>
EMI1.1
tt,jx'1,V; voor het bepalen van chemli;1civ:) ritaffin arJ<,"jj:i:.1'i;:l.r 1'1:; hop"<
EMI1.2
Analytische bepalingen die vd0 p>akts,.;cki '?.ilo#iii >;1,jR 4.n verband met het .gebruik van help zijn de tpaU-nf vanl# .*zur.<=ri in hop, van µ/- en iDO" "7.'\.II'01\ in hopeKty-'a'sn '!r; V,11 i,a#-'B -
EMI1.3
zuren in bier.
EMI1.4
Het is een bekend feit dat de tneestg h4-ttero bestand-. delen van de hop behoren tot de groep van da ?pro ";=:;iJren> Dit zijn mengsels van isomeren en homologe verbindingen beantwoordend aan onderstaande algemene struktuurformulii
EMI1.5
<Desc/Clms Page number 2>
waarin R een humulon, kohumulon, adhumulon, prehumulon of posthumulon, d.w.z. respectievelijk CH2CH(CH3)2,CH(CH3)2, CH2(CH3)CH2CH3, CH2-CH2-CH(CH3)2 of CH2CH3 voorstelt.
Bij voorbeeld, bij het gebruik van hop in bier, zijn de bedoelde [alpha]-zuren onderworpen aan chemische reakties gedu- rende het brouwproces, waarvan de voornaamste leiden tot de vorming van iso--zuren met volgende algemene struktuurformule.-
EMI2.1
Men kent verschillende doeltreffende analytische werkwijzen voor de bepaling van het gehalte der hop aan [alpha]-zuren, waarbij men fotometrisch, polarimetrisch of konduktimetrisch te werk gaat.
Deze bekende werkwijzen zijn echte onbetrouwbaar gebleken bij de ontleding van hopextrakten en bier, zodat men tot nu toe genoodzaakt was daarbij zijn toevlucht te nemen tot de dure en tijdrovende tegenstroomverdelingsmethode ("countercurrent distribution method") voor het verkrijgen van voldoend betrouwbare resultaten. Dit moge blijken uit de zeer uiteenlopende resultaten verkregen bij de analyse van vier verschillende hopextrakten volgens de verschillende bekende werkwijzen (zie onderstaande tabel).
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
Extrakt C,C .D. konduktinietrie p olarimetrie fotometrie -1,-- -r ##n-Tm.- m:t-.r fmm-T.'.-r.LLj.n ''"''*-"'-''"-""'''''"" ---r;-1--i.
EMI3.2
<tb>
<tb> 1 <SEP> 14,8 <SEP> 18,2 <SEP> 5,8 <SEP> 4,5
<tb> 14,1 <SEP> 23,6
<tb> 2 <SEP> 15,5 <SEP> 19,8 <SEP> (positieve <SEP> 8,3
<tb> 15,4 <SEP> 22,1 <SEP> draaiing?)
<tb> 3 <SEP> 36,7 <SEP> 41,3 <SEP> 32,1 <SEP> 37,3
<tb> 36,8 <SEP> 40,1
<tb>
<tb> 12,2 <SEP> 15,0 <SEP> 6,6 <SEP> 9,6
<tb>
De konduktimetrische methode biedt het nadeel vrij tijdrovend te zijn wegens de talrijke bewerkingen vereist voor het verkrijgen van het te onderzoeken monster: extraktie met methanol, filtreren, extraktie met hexaan gevolgd door uitdampen, enz.
Alhoewel de resultaten verkregen langs kondukti- metrische weg niet zo heel slecht lijken, toch schenkt deze werkwijze geen bevrediging daar het titratieproces niet verloopt : naar wens en de grafische bepaling van het eindpunt niet veel meer is dan een vrij ruwe raming. De polarimdrische bepaling en de fotometrische bepaling vergen een tijdrovende zuivering van het te analyseren preparaat door filtreren over aktieve @ kool. Beide werkwijzen zijn echter te onbetrouwbaar.
Welnu het eerste oogmerk van onderhavige uitvinding @ heeft betrekking op een snelle en betrouwbare werkwijze voor de bepaling van de bovengenoemde chemische verbindingen, die ten minste volgende stadia omvat : hetaanbrengen van één of meer bufferoplossingen op een poreuze drager; het aanbrengen van een monster van het te analyseren produkt op ce aldus behandelde drager;
het ontwikkelen en ten slotte het fotometrisch onder- zoek (fotometrische bepaling van de koncentratie) van deze laatste
De bedoelde drager bestaat overeenkomstig de uitvinding bij voorkeur uit een strook gewoon chromatografisch papier, terwijl de daarbij gebruikte bufferoplossingen bij voorkeur een
<Desc/Clms Page number 4>
reeks met getrapte opeenvolgende pH-waarden vormen. Men verkrijgt aldus goede resultaten met een reeks van vijf bufferoplossingen, die respektievelijk een pH-waarde van 3,0- 5,0- 6,8- 10 en 11 hebben.
Uitstekende resultaten worden bij voorbeeld met onderstaande samenstellingen voor de betrokken bufferoplossingen verkregen: pH=3,0; 2,5'ml 0,25 M prim.fosfaat + 10 ml 0,125 M citroenzuur pH=5,0: 10 ml 0,25 M sec. fosfaat + 10 ml 0,125 M citroenzuur pH=6,8: 10 ml 0,5 M sec. fosfaat + 2,3 ml 0,125 M citroenzuur pH=10 :
10 ml 0,5 M prim.fosfaat + 10 ml 0,5 M tart.fosfaat pH=ll; 10 ml 0,5 M sec. fosfaat + 10 ml 0,5 M tert.fosfaat
Deze verschillende bufferoplossingen worden aangebracht op de betrokken papierstrook, bij voorbeeld met behulp van een zacht penseel, zo dat iedere strook van onderen tot boven voorzien, is van een aantal opeenvolgende zones gedrenkt met bufferoplossingen waarvan de pH's een stijgende reeks vormen.
De papierstroken zijn na het aanbrengen van de bufferoplossingen zeer lang houdbaar zonder enige verslechtering van hun kwaliteit op voorwaarde dat ze grondig gedroogd zijn en bovendien luchtdicht verpakt zijn in plastic. Daar een volkomen droge chromatografische papierstrook met de verschillende pHzones (bufferoplossingen)zich slecht leent tot het scheiden van de betrokken bitterzuren, is het noodzakelijk haar opnieuw min of meer te bevochtigen voor het gebruik. Het verdient aanbevelingtedieneinde een bevochtigingsapparaat met thermostaatregeling te gebruiken waardoor het mogelijk is steeds onder dezelfde genormaliseerde omstandigheden te werken.
Een dergelijk bevochtigingsapparaat bestaat bij voorbeeld uit een geïsoleerd recipiënt, gedeeltelijk gevuld met gedestilleerd water en verwarmd bij een temperatuur van ongeveer 40 C door middel van een plunjerthermostaat.
Het te analyseren monster kan worden klaargemaakt volgens
<Desc/Clms Page number 5>
de ene of andere geschikte bekende werkwijze. Een geschikte werkwijze voor het klaarmaken van hopextrakten is de volgende.
Een representatief monster van het extrakt ,dat ongeveer 60 mg bitterzuur (100 a 500 mg extrakt) overeenkomstig zijn benaderd gehalte bevat, wordt afgewogen in een proefbuis.
Men voegt vervolgens 1 ml methanol toe. Er kunnen zich verschillende gevallen voordoen : het monster lost op of blijft gedeeltelijk of geheel onopgelost. Men voegt 5 ml iso-oktaan en vervolgens 2 ml water toe, waarna men het mengsel aanzuurt eerst met 5 druppels 0,3 N zwavelzuur en vervolgens met enkele druppels 10 N zwavelzuur. Het is van belang het mengsel na elke toevoeging eventjes goed te schudden. Men verkrijgt aldus gewoonlijk een emulsie. Er blijft echter meestal een voldoende hoeveelheid iso-oktaan bovendrijven om zonder moeite een monster met een pipet te kunnen opzuigen, dat groot genoeg is voor het onderzoek. Alle [alpha]-zuren of iso-C-zuren zijn thans aanwezig in de iso-oktaanlaag.
Een lastig probleem is de keus van het gewicht van het monster. Dit hangt immers af van het gehalte van het extrakt, dat nog moet worden bepaald. Er is echter in de meeste gevallen wel een en ander bekend over de samenstelling van het monster,
EMI5.1
. ,¯ wat een ruwe raming van zijn gehalte mogelijk maakt.
Is dit ' 4,.4 kan Act niet mogelijk, dan/men men zich vaak baseren op de kleur en 11. de viskositeit van het extrakt; viskeuze extrakten met donker groene of zelfs bruinachtige kleur hebben het laagste gehalte aan [alpha]-zuren en omgekeerd. Wat betreft de extrakten die de betrokken bitterzuren in isomere vorm bevatten, wijzen een zeer lage viskositeit en een lichtbruine kleur meestal op een hoog gehalte van iso-[alpha]-zuren. Het is vaak noodzakelijk een tweede papierstrook te behandelen met een monstervolume dat groter of kleiner is naar gelang van de resultaten verkregen met de eerste strook.
De reden daarvan is dat een geringe
<Desc/Clms Page number 6>
hoeveelheid [alpha]-zuren en iso-[alpha]-zuren (0,001 a 0,005 mg) vernietigd wordt tijdens de analyse, wat natuurlijk bij kleine monsters niet onaanzienlijke fouten kan veroorzaken.
Bij de analyse van hop wordt het hopmonster fijngemalen en geëxtraheerd met SO2-houdende ether, waarna de aldus verkregen oplossing op de drager wordt aangebracht.
Voor de analyse van bier verdient de volgende werkwijze aanbeveling.
Men voegt 2 ml 10 N zwavelzuur toe aan 400 ml bier en extraheert vervolgens het bier door het gedurende 2 minuten te schudden in een scheitrechter met 1000 ml iso-oktaan. Er vormt zich in de meeste gevallen een emulsie en men probeert een zo groot mogelijke hoeveelheid emulsievrij iso-oktaan af te gieten. Men bepaalt het volume van het heldere iso-oktaanextrakt, dat gewoonlijk 70 à 90% van het oorspronkelijk volume bedraagt, waarna men het oplosmiddel door verdamping sub vacuo verwijderd. De aldus verkregen verdampingsrest wordt opnieuw opgelost in 5 ml iso-oktaan (precies afgemeten!), waarna men 50 a 100 m van de aldus verkregen oplossing op de drager brengt.
Het monster wordt puntsgewijze aangebracht op een rechte lijn op de onderste gedrenkte zone van de papierstrook, bij voorbeeld door middel van een zorgvuldig gekalibreerde in- jectiespuit, waarna de papierstrook wordt ontwikkeld in een gewone recipiënt, die een geschikte hoeveelheid oplosmiddel (b.v. iso-oktaan) bevat. De vereiste tijd voor de ontwikkeling bedraagt gewoonlijk tussen 20 en 40 minuten. Het ontwikkelingsproces is voltooid als het voortschréidende chromatografische front voorbij de zone is gekomen, die gedrenkt is met de bufferoplossing met de hoogste pH-waarde.
Na de ontwikkeling worden de strookjes met de [alpha]-zuren en iso-[alpha]-zuren uit de papierstroken geknipt. De juiste ligging van de bedoelde strookjes kan worden bepaald door de papier-
<Desc/Clms Page number 7>
strook onder UV-licht te bekijken ofwel door ze te besproeien met een ferrichloride-oplossing. De twee papierstroken die voorzien zijn van de bedoelde strookjes, die de betrokken bitterzuren bevatten, worden vervolgens behandeld om de zuren vrij te maken, bij voorbeeld met azijnzuurhoudend iso-oktaan (azijnzuurgehalte: 1%). De koncentratie van de aldus verkregen oplossing wordt fotometrisch bepaald in vergelijking met zuiver azijnzuurhoudend iso-oktaan (azijnzuurgehalte: 1%).
Is de extinktie te hoog, dan moet de oplossing natuurlijk sterker worden verdund.
De berekening van het gehalte aan [alpha]-zuren en iso-C- zuren van het onderzochte monster biedt geen moeilijkheden.
Ze geschiedt op grond van volgende gegevens : gewicht en verdunningsgraad, en natuurlijk de specifieke extinktiewaarden van
EMI7.1
de 0- zuren en iso-tk-zuren bij de golflengte (m,t ) , waarbij de betrokken oplossing fotometrisch is onderzocht. Als men voor de bedoelde specifieke extinkties respektievelijk de waarden 257 en 280 aanneemt, dan vindt men het gewenste gehalte telkens door berekening met behulp van onderstaande formulen:
gehalte aan [alpha]-zuren in % = B X 1000 X
257 x W x V
EMI7.2
gehalte aan 1SO--Zuren . n- in % ¯ E X 1000 x 5
275 x W x V waarin ± afgelezen extinktiewaarde
W = gewicht van het monster
V = volume van het monster,
Uit bovenstaande beschouwingen blijkt dat de vereiste apparatuur voor de praktijktoepassing van de werkwijze volgens onderhavige uitvinding betrekkelijk eenvoudig is. Ze omvat bij voorbeeld, buiten het gewone laboratoriumglaswerk, een geschikt filtreerpapier, een zacht penseel, een droogstoof, een bevochti- ;
EMI7.3
gingsctparaat met thermostaatregcling, een gekalibreerde pipet,
<Desc/Clms Page number 8>
een ontwikkeltank met dunne vloeistoflaag, een UV-fotometer en een UV-lamp.
Uitgebreide kontroleproeven op de werkwijze volgens onderhavige uitvinding leren dat de reproduceerbaarheid ervan uitstekend is, alsook dat de nauwkeurigheid ervan (naar raming beter dan 5%) waarschijnlijk aanmerkelijk beter is dan die van alle andere bekende werkwijzen. Dat moge blijken uit de vergelijkende resultaten, aangegeven in beide onderstaande tabellen en verkregen met extrakten van zeer uiteenlopende herkomst enerzijds volgens de bekende CCD-werkwijze (CCD- "countercurrent distribution") en anderzijds volgens de werkwijze overeenkomstig onderhavige uitvinding.
[alpha]-zuren
EMI8.1
<tb>
<tb> Extract <SEP> C.C.D.-werkwijze <SEP> werkwijze <SEP> volgens <SEP> de <SEP> uitvinnr. <SEP> ding
<tb> 1 <SEP> 36.7 <SEP> 35.5/35.5/35.5/35.5
<tb> 2 <SEP> 34.3 <SEP> 34.9/34.9/34.9/33.9
<tb> 3 <SEP> 27.3/27.4 <SEP> 27.3/28.1/28.1/27.3
<tb> 28.1
<tb> 4 <SEP> 29.8/29.4 <SEP> 29.3/29.8/29.8/29.6
<tb> 5 <SEP> 13.9 <SEP> 13.0/12.9/13.3/12.9
<tb> 13.0/13.0/12.8/12.8
<tb> 6 <SEP> 14.9/14.8 <SEP> 13.2/13.1/13.3/13.1
<tb> 7 <SEP> 6.5/6.9 <SEP> 6.3/6.3/6.2/6.0
<tb> 6. <SEP> 6/6.9
<tb> 8 <SEP> 12.2 <SEP> 12.2/12.4/12.3
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
iso-[alpha]-zuren.
EMI9.1
<tb>
<tb> Extrakt <SEP> C.
<SEP> C.D.-werkwijze <SEP> werkwijze <SEP> volgens <SEP> de <SEP> uitnr, <SEP> vinding
<tb> 8 <SEP> 10.2 <SEP> 10.3/10.3/9.7
<tb> 9 <SEP> 8.7 <SEP> 8.2/8.2/8.4/8.3
<tb>
EMI9.2
10 50.0 7.2/47.2/46.6/4S.6 11 8.2/7.9 8.218.0/8,4/8.2
EMI9.3
<tb>
<tb> 12 <SEP> 19.9 <SEP> 18. <SEP> 9/19.8/19.2/19.3
<tb> 13 <SEP> 18.4/19.2 <SEP> 17.1/17.4/17.1/17.0
<tb>
<tb>
De bovenbeschreven werkwijze volgens de uitvinding kan eveneens worden toegepast voor het bepalen van humulinezuren en
EMI9.4
zelfs voor het scheiden van A- en B-humulinGSUuur (zie I.Inst. Brew4-ngLXXI,3,23201965), waarbij men bij voorkeur benzeen als extraktiemiddel in plaats van iso-oktaan gebruikt.
EISEN. l.- Werkwijze voor het bepalen van chemische stoffen afkomstig uit hop, met het kenmerk dat ze tenminste volgende stadia omvat; het aanbrengen van een of meer bufferoplossingen op een poreuze drager; het aanbrengen van een monster van het te analyseren produkt op de aldus behandelde drager; het ontwikkelen en ten slotte het fotometrisch onderzoek van deze laat ste. **WAARSCHUWING** Einde van DESC veld kan begin van CLMS veld bevatten **.