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Procédé pour augmenter le rendement de tyloine produite par
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fermentation au moyen de microorganismes.
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La présente invention concernre 'oU. j"océd6 Amêl:le-6 pour la production da la tyloaine. Un partlciz"4.er, la pré3en%a Invention se rapporte à un procédé pour \i'bt;l1:i.tw dtw 1"i)ndm'Snç3 améliorés de tylosine en ajoutant au due .'aMt&i<3n dans lequel produit lJ"nt1b1vd'Uù ce:t,tdn aj,>nie ehi%' quel qui at1J1ulent la production d1î l ;!,(ntli ;.'t ',1(\ <iflSJ.:!'4..
On a découvert le 10'1 11 i!!.\I'!Uitl en îcee tii)r-ta,b.3 p duits de dégradation, obtenu3 par coupure hy4-.!.ytiq8 <â9 id tylosine et des antîbiotiquet ioi8inJ¯, t&r;+ augmenter atune manière inattendue le$ due 19nt1b1otiq. jusitutâ
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un degré surprenant quand ils sont ajoutaj au mir lieu de fermentation. Le mécanisme par lequel de telles substances ajoutées conduisent à un acrois sement des rendements en tylosine n'est pas connu
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&présent, et aucune théorie ayant pour objet 1??r=1. cation des résultats obtenus ne sera avancée ici. en a trouvé, cependant, que l'accroissement des rendements résulte apparemment d'une stimulation réelle da la production de tylosine et non simplement de la con-
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version des substances ajoutées en tyrosine.
En '- bzz l'augmentation des quantités de tylosine obtenue ost souvent supérieure de dix fois k celle obtenue par
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simple conversion atoéhîométrîque des produits de ¯dégradation ajoutés à l'antibiotique.
Parmi les produits de dégradation qui peuvent être obtenus par coupure hydrolytique de la
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tylosine figurent la desmyao8.na1 le tylonalide d z0- ¯ micaminosyle, le myoarose, le myoaminose, ot le mycinose. Le tylonolide d o-mycaxn.nosS3s, désigné aiaprès par OMT, et la desmycosine sont tous las deux des substances antibaotériennea ef".c,coa par elles-" memest Le myoinome, la mycarose et le &yaamin<9aa SQ!,'V des dérivée des sucras, la dernier dtant u.n aucre aminé basique.
Tous les produits de dégradation sus nommés de la tylosine, ajoutés au milieu de fermenta)..* @
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tion at1mulent plus ou moins la production de ty3.os.u. mais la desmycosine et ltOMT sont les meilleurs stimu" lanta. Les produits de dégradation peuvent être ajoutés. sous forme purifiée ou, si on le désire, des préparations brutes peuvent être employées avec des résultats
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satisfaisants.
L'hydrolysat brut de tylosine pe$,atp
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préparé en chauffant une solution aqueuse de tylosine
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ou un de ses sels d'addition d'ac1des, pH 2 environ. en lavant le mélange réactionnel à laide d'un solvant organique non miscible comme le chloro forme et les solvants analogues, et en concentrant jusque sicité la phase aqueuse lavée,
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Les produits de dégradation correspcn dants obtenus partir de la di.hydrot5.oa.ne, qui est généralement produite en même temps que la tylosine
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dans la eemetitatïon de la tyloaine sont également efficaces dans la stimulation de la production de la tylosine.
Ces produits renferment la dihydrodes- mycosine et le dihydro-CMT aussi bien que les sucres sus-nommés,
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La concetration des produite de dégra,,. dation employée dans l% d\ ',),U de f't31't!iE...tJ. ;.tOti. l:}u.v augmenter les rendements en :; ..b ..: ';.'I1l':'; v,J.."'1.\!!1" da 25 à 1500 ,g/mj, lnl1'.. 'SS sa fi '98 tom"u."s 8,".i,S.éa i 6 :' -e,x t 500 m3.g l' .t\ugnentatic!... deN ::e!6U?"S CI) ;j.t.,.lcli.tH' se traduit par une augmentatif .ro-a*3:ntc.:i..: t;: rcndenient sn 'j".0.9'.?:' -'M des '1c:ne:1(,'a.i<'n'8 8Up1".iQ,¯t);'r, h 500 Tx t.ependa.1t ôlLUl' L!II;:nn. 'Z>' t d ?.e. :1'An ,"/I;Id ty ,s3.n n'est pas .l',)pol',.1.m.h 'i::-::'t' L di>1:1 cl\1 .1.J'I. fpa\l.t.té de l'addit-i=' or., F:
$ en ef't'I1I"t. .u te tA é8" r'l1"ts te.:su..."'", 1,- .3'#it¯"*'k in ¯, ±"t3à>,è a DM,#. i.â s.,..; w i'i,6 âA..e 'S C04".- .&4'.?' ,\':..:; ;;,u C;)t. 'J6. }Z.!l', m optlmaJ.)13 d'addiat. r$.''='' *, ,m4r' con i'sâ'fl4 tP!I,,':l<"'1 v CO'lCf.r,1trat1onu, 3a quantité d9 t:1)44,r.:$..n.O ppoduita a.s supérieure celle obtenue Sh ':... e,r.:di t1:f'. On obtient une production optimale de tylooine quand on emploie des concentrations de l'additif comprises entre 100 et 200 pg/ml environ, et de telles concentrations
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@ont ainsi pz-6fér o8 dans la. Pi'a.t:1q'w àz LKi"!9 t-.5 moment cà lfjd11t est ànaoiqpô:xà au milieu de fermentation peut varier dans de gd8 limitée.
Ainai, en général loorendementude tylsin6 obtenus quand le produit de dégradation est ajotttau début de la fermentation sont apl:u."oximt1ti'1!er:.'J: égaux à ceux obtenus quand l'addition est faite 20-24
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heures, environ après le commencement de la termentat1n Cependant le rendement maximum de tylosine obtbnu décrcfit si l'additif n'est ajouté q"e 48 heures 1 If inoculation et des additions encore plus tardives gor duisent progressivement une stimulation moindre.
La stimulation de la production de
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tylosine devient d'abord &pp,Are&3 prôû en>"iroià y8 heures de fermentation et deviant plus prononcée a mesure que la fermentation contirue Quand l'additif est
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employé! la concentration préférée d < environ 100 ü 200 g/ml, sa présence dans le milieu da fermentation peut être décelée pendant à peu Près les 48 premières heures de la fermentation, mais il ne reste plus de quantités décelables après une fermentation de 72 heures! environ ou plus. A des concentrations supérieures à 1'in
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tervalle optimal et sueout à des concentrations supérieure à environ 500 pg/ml une certaine quantité d'additif inaltéré reste dans le milieu de fermentation pendant toute la période de fermentation.
La stimulation observée dans la synthèse de la tylosine se produit dans de nombreux milieux de fermentation. En général, les milieux donnant des rendements supérieurs en tylosine sans stimulation,
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répondant davantage" la présence de l'additif* Ainsi selon le milieu de fermentation employé, des accrois sements du rendement en tylosine compris entre 10 pour cent et 40 pour cent environ par rapport au milieu. non stimulé ont été observés.
L'addition des produits de dégradation est également efficace en ce qui concerne l'augmenta- tion de la production de tylosine, que la fermentation ait lieu dans des flacons secoueur ou dans des
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appareils !t agitation. En outre, les quantités cela- tives des différentes tylosines produites durant la fermentation ne semblent pas très influencées par ad- jonction de ces additifs.
Ainsi par exemple , la rapport
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de la tylosine .a dhyr'.t:tloa:1ne produite dans une f1)r111ontat:L?n est sensiblement cOHet.,.'1t:, que la fermentation soit réalisée per les :r:>"l'±\ t"1asa1q,,'\" ou par le procédé perffeti'mé de la pflélJe!ltu 1n:lf,tH*" ,ion selon lequel lm s+:.:fJ1lu..'t.;r;.::: da ,:'}ducI;1on OS employé, La 0111&8 .ai. oeavilu d?' la. pear:e invention nt exige pratj,Q.'..'.6J'1mt !,H\!!\ '¯ l 'J!.d:tfi'.?/. t.J1l du procédé habituel de t$l"1Ii.ef't6.t1}:1 ,pou..' >, !d;1.z-e sant le secours dem a.d itis I1UPIitant ?,fJ r 5:¯ .
M,r!1.d. par exomp.3, 1-::1 =1?:'-n.oe ,.'.3gi."r;r32 a'1 ç1ul.q:ue étape de la méthbde de fermentation peuvent 01,rm id .,, iClU3±1 è ceux employé; euparavante ss.uf l J d..-1it.:L,H: du produit de dégradation au milieu de production final. Des suspensions de spores d'organisme. porudic
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tueurs de tylosilles les Streptmyoea fradiae NRRL 2702 ou NRRL 2703 sont produites à partir des cultures inclinées sur gélose de manière habituelle. Les sus- pensions de spores sont ensuite employées pour prq- duire une culture végétative intermédiaire, et la
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culture végétative ainsi obtenue eat c:; 1dio pour inoculer le milieu de fermentation utilisé pour la pro
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duction de l'antibiotique.
Si le produit de db8r adf.t= est employé à des concentrations inréiee8 environ .
500 g/ml , aucune trace de l'additif ne reste dans le bouillon de fermentation à la fin de la période de fer mentation et, par conséquent, l'isolement et la purfics tion de la tylosine sont réalisés suivant les méthodes antérieures décrites,
Afin de déterminer l'effet d'un addiinif
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particulier sur la production de t.3rs SI n Va!>', habituellement pas nécessaire d'isoler l'antibiotique cris
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balia6 d l'état pur, La marche de la fermentation et l'effet de l'additif aur les rendsmente an hyàoai#>1 peuvent être facilement déterninés par axtrs,t.oas du bouillon de fermentation, ajusté à pH 5.
Le taux de tym losine présente dans l'extrait peut être déterminé par Spectrophotométrio en mesurant l'absorption de l'extrait ohloroòrmique â 283 myt et en comparant les valeurs avec celles obtenues avec des solutions standard.
Les résultats ainsi obtenus ont montré une excellente corrélation avec ceux obtenue par isolement effectif de l'antibiotique.
La mise en oeuvre de l'invention est en outre illustrée par les préparations et les exemples suivants /
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!E!!2-S¯2! A. Préparation de OMT brut. Une solution aqueuse de tylosine, sous forme de base libre ou d'un sle d'addition d'acide, est ajustée à pH d par addition d'acide
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minéral. La solution acide résultante est chauffée au bain-vapeur pendant 100 heures environ, refroidie et lavée avec du chloroforme pour éliminer les subs-
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tances colorées, La phase aqueuse est concentrée & sec afin d'obtenir une préparation de OMT brut contenant . environ 25 à 30 pour cent en poids de OMT B, Préparation de OMT purifié. Le processus décrit au paragraphe A est suivi Jusqu'au stade de lavage au chloroforme.
La phase aqueuse est ajustée à pH 5 par addition d'une base aqueuse et est lavée de nouveau
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avec du chloroforme pour éliminer la desmycoaine sur elle est présente, Le pH de la couche aqueuse est alors ajusté à pH 9 par addition de base, et la solution basi-
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que est extraite ,u . x;lor.°'orob La sonohs chlorotoz--nlcu,t contenant l'QMT, est êval.,orée 1 sec t-.>uq ;pi ds Une aa>ì*; purification de ltO)4T est rlisé par 's'ctf;yxph& d'une solution chloroformiqM des eta d,,r,sr 6ur colcaine d'alumine, Exemple 1
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Una L'j9rt*'',a'9Ys d>1 Bri:fi!18 ".3,.r:
iwn':1;."a't!>>. frad.aa 3t J37'C2 aaR prépartus ùo *à;S.±:,* àwi;1%#,uà.J.;. part.,,r d'une culbarw io *et orKai:lJXe maia'A'9 bzz gélose Incliné* avec fèro&, de im Una portion dn z !s3. de la aua,prta a- . . pae st e!s?y4o podi a nov* . leur 890 si d'un db6r"ra.aaie-¯4 1:>x6hatJù dino vi:,-e ,rW7rW ErletaBoyer de 2 libr< à 1.s .i.ad, ''3'f ";s's.''r5 i5 pour cent de r.s 9, u.r cent de solidee provenant de la 1-iqueur de Bia.ox'ation de mata, 0,5 pue-ier cent de levure, et 0,3 pour cent de carbonate de calcium dans de l'eau distillée. Le milieu végétatif inoculé
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est inchb à 28*C pendant. 48 heures pour fournir un milieu d'ensemencement:.
Ce dernier est employé pour milieu de inoculer un/Production renfermant 1,75 Pour cent de farine de poisson, 2,0 pour cent de mélasse, de @
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rave, 3,0 pour cent d'huile de soja brut3 Op2 p?.L cent de carbonate de calcium, 0,04 pour cent de psph&e de diammonique et 0,1 pour cent de chlorure de aodivm dans lteau. Le milieu est réparti dans des flacons' col large de 500 ml chacun recevant 100 ml du milieu et
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chaque flacon est inoculé avec 5 ml. du milieu dÙ<#::si.. mencement précédemment décrit. Les flacons sunt placée sur des nocoueutes rotatives tournant' 250 tours par minute, et on laisse la fermentation ne déroulop à ;;>W4 pendant 138 heures.
Une autre sxérie de flacons contenant
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le même milieu de production et înoeulde de la m8 t9 est incubée dans les mSmes conditions a*;oc des acncsntpetiens différentes d'0Nt ajouté au moment de l'insoisla... tion. L'effet de la concentration on Qtf"2 lue It 'er.d;!lJ1f.mt en tylosine ont indique dans le tableau C18son66
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tableau 1 -
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> MOT <SEP> Production <SEP> de <SEP> tylosine
<tb>
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-=..-à<àil-....-...
-- ...-.-hàaé...----
EMI9.3
<tb>
<tb> 0 <SEP> 4000
<tb> 50 <SEP> 4665
<tb> 100 <SEP> 5340
<tb> 200 <SEP> 5810
<tb> 300 <SEP> ' <SEP> 6025
<tb> 500 <SEP> 5985
<tb> 750 <SEP> 6100a
<tb> 1000 <SEP> 5810
<tb>
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.1500 5580
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(a) liexcès de ITOMT reot* encore présent clans les bouillons de culture après six jo,#e de formentati,7)r,
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Exemple 2
Le taux de synthèse de tylosine en présn ou en absence dé 1'OMT et les effets de la variation du moment de l'addition de l'OMT sur.la quantité totale de tylosine produite sont déterminés dans l'expérience suivante t des flacons seooueurs contenantle milieu de production sont préparés comme décrit dans l'exemple 1.
Deux séries de milieux de fermentation sont réalisées; la première contenant seulement le milieu de production inoculé, la deuxième renfermant le milieu de production inocula auquel on a ajouté 500 g/ml de MOT sauf indication contraire,
1'OMT est ajouté immédiatement après @ Les @ sont faites à des intervalles d'un Jour pendant t six jours de façon à suivre la progression Je la mentation Les rendements en tylosine sont montrés dans le tableau 11
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TABLEAU II
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<tb>
<tb> emps <SEP> de <SEP> Milieu <SEP> de <SEP> Milieu <SEP> de
<tb>
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ermentatio# Produotivn inoau14 Production Inoculé seul plus OMT ######- us/nitl# Ub 1
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<tb>
<tb> 24 <SEP> 45 <SEP> 50
<tb>
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48 530 655
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<tb>
<tb> 1500 <SEP> 2155
<tb> 2575 <SEP> 30
<tb> 120 <SEP> 3345 <SEP> 4869
<tb>
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i14 4325 309 3 = 570
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<tb>
<tb> 144 <SEP> 4375
<tb> 144 <SEP> @
<tb>
<tb>
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(a)
OMT ajouta 24 beurres après 1nooult1cr.# (b) OMT ajouta 48 heures après in<?8u3.a%J.sa< (c) OMT ajouté 72 h"!,1r(tlf. après 1nocul1i ';lt.J:Â.
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EXEMPLE 3
L'aptitude de 1'MOT à stimuler la gradue; or Il* tylosine dans des milieux de compositions différentes est démontrée comme suit le procède géraldécrit dans l'exemple a est suivi sauf la composition du milieu de production qui @
Le milieu 1 est le même que celui employé @ l'exemple 1.
Le milieu II contient 2 pour cent de mélase de betterave,2 pour cent d'extrait de levure, 0,5 pour cent de liqueur de macération de maïs, et 3 pour cent d'huile de soja brute dans l'eau.
Le milieu III a la composition suivante
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<tb>
<tb> Phosphate <SEP> dipotassique <SEP> 2,3 <SEP> % <SEP>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 2/glitte
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 5g/litre
<tb> Citrate <SEP> d'ammonium <SEP> ferrique <SEP> 1g/litre
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> zinc <SEP> heptahydraté <SEP> 0,01%
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 3%
<tb> Glycine
<tb> L-Alanine <SEP> 2%
<tb> L-Valine
<tb> Bétaine <SEP> 5
<tb> Dextrose <SEP> 3,5%
<tb> Oléate <SEP> de <SEP> méthyle <SEP> 2,5 <SEP> %
<tb>
Le pH du milieu III est ajusté à 7,5 environ avant stérili sation à l'autoclave.
L'effet de 1'OMT à différentes concetnrations sur les rendements en tylosine dans chacun des milieux de fermentation décrits ci-dessus est montré dans le tableau III
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' 1 , r à 8 L e A t 1
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Milieu I Milieu Il Milieu III Augmentation Augmentation Augmentation RIJ.ide>=i.it par rapport Rendement par rapport Rendement par rapport Omit ajouté e'- er, au témoin en Tylosine au Témoin en Tylosine au Témoin ug/mi /s/'mi yUS/ELL % /ug/mi %
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<tb> C <SEP> 4360 <SEP> 3395 <SEP> -- <SEP> 1870
<tb> 50 <SEP> 5580 <SEP> 28 <SEP> 3745 <SEP> 9 <SEP> 1895
<tb> 100 <SEP> 5745 <SEP> 30 <SEP> 330 <SEP> 13 <SEP> 2125 <SEP> 14
<tb> 200 <SEP> 6030 <SEP> 36 <SEP> 3770 <SEP> 2095 <SEP> 12,
<tb>
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(a) cû..!*rl'gc ïMtT cux;% ce*.. " ;n r'= 0? cn wl oi:h;
=
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x,pïea La etimalatico. do la Réduction de t7ilon-v-,e / eau* d'autre* n é tô exa.3.be de 3.1t, :a ' os démontrée par une méthode aembl&ale celle décrites à l'exemple 1 L'effet sur le rendement en tylosine produit par addition du produit de dégradation @ eat montré dans le tableau IV
Tableau IV
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<tb>
<tb> Produit <SEP> de <SEP> dégradation <SEP> Quantité <SEP> Rendement <SEP> en
<tb>
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¯¯¯¯¯¯ajout鯯¯¯¯¯ ajoutde jg/m1 tylogine (d -
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<tb>
<tb> aucun <SEP> -- <SEP> 5990
<tb> OMT <SEP> 50 <SEP> 6525
<tb>
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desmyooe1ne 50 C-,630
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<tb>
<tb> mycinose <SEP> 200b <SEP> 6365
<tb>
EMI14.7
(a) corrigé pour conversion de 09, en ty3.asi.sw (b) ajouté in8 heures apro 3,
naaulat.n Exemple 5
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L'aptitude de l'CM' à etr3r la production en tylosine dans des apparoïls k agitation est démontrée dans des récipients b réacbion en a.ei< inoxydable de 15 litres# équipée d'agiatauaa *&?pap<i3. est stérilisé à 120'C pendant 30 minute av.-4nt le chargement. Une fermenbation k trois *tapas omt otaployée.
Un milieu d'eneemenaement végétatif incubé ayant la môme composition que celui employé à l'exempta 1 est employé pour inoculer un'milieu aqueux renfermant 0,5 pour cent de levure, 0,5 pour cent de farine de poisaon, 1 pour cent de liqueur de macération de maïa, 0,5 pour cent d' huile de soja brute et 0,3 pour cent de carbonate de calcium. Ce milieu à son tour, est employé pour inoculer le milieu de fermentation finale employé à l'exemple 1,
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L'effet sur le rendement en tylosine après une période
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de fermentation de 136 heures à 28-0 est montré dane le tableauV.
Tableau V
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<tb>
<tb> OMT <SEP> ajouté <SEP> - <SEP> Rendement <SEP> en <SEP> tylosine
<tb> g/mo
<tb> néant <SEP> 3670
<tb> 500 <SEP> 4310
<tb> 100 <SEP> 3930
<tb> 100a <SEP> 4635
<tb>
(a) OMT ajouté 22 heures après inoculation Exemple 6
EMI15.3
t t eftet du dîhydro-O4T ur le n , .¯. en tylasina est dt.:rmin6 pu an 3).,01;: ') "flH calui dl:Scl':1.t à ltexemple 1 . f.;C!;j'1 .t:,::;" do d:1hyd:t".::,.,? n'est dêcelable dans la ;o131.1?n em feaaet,t;n 1i. fin de la feoen8ntab16n. e''e 1W.I' le jl;iendc..(1nt à tylosintl est montré dans la tableau 'i:'< Tableau VI
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9on.c.t!.:.:.Mhrdr...91i! yloï'itt ?;'.ti
EMI15.5
<tb>
<tb> g/ml
<tb> 25 <SEP> 5100
<tb> 100 <SEP> . <SEP> 5410
<tb> 150 <SEP> 5660
<tb> 200 <SEP> 5450
<tb>
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Process for increasing the yield of tyloine produced by
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fermentation by means of microorganisms.
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The present invention relates to 'oU. j "océd6 Amêl: le-6 for the production of tyloaine. A partlciz" 4.er, the pre3en% a Invention relates to a process for \ i'bt; l1: i.tw dtw 1 "i) ndm ' Improved Snç3 of tylosin by adding to the due .'aMt & i <3n in which produces lJ "nt1b1vd'U where this: t, tdn aj,> nie ehi% 'which at1J1ulate the production of1î l;!, (Ntli;.' T ' , 1 (\ <iflSJ.:! '4 ..
We discovered the 10'1 11 i !!. \ I '! Uitl en îcee tii) r-ta, b.3 degradation products, obtained3 by cleavage hy4 -.!. Ytiq8 <â9 id tylosin and ioi8inJ antibiotiquet ¯, t &r; + unexpectedly increase the $ due 19nt1b1otiq. jusitutâ
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a surprising degree when they are added to the place of fermentation. The mechanism by which such added substances lead to increased tylosin yields is not known.
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& present, and no theory having for object 1 ?? r = 1. cation of the results obtained will not be advanced here. has found, however, that the increased yields apparently result from actual stimulation of tylosin production and not simply from production.
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version of substances added in tyrosine.
In '- bzz the increase in the quantities of tylosin obtained is often ten times greater than that obtained by
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simple atoheiometric conversion of the degradation products added to the antibiotic.
Among the degradation products which can be obtained by hydrolytic cleavage of
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tylosin include desmyao8.na1, micaminosyl tylonalide, myoarosis, myoaminosis, ot mycinosis. Tylonolide o-mycaxn.nosS3s, hereafter referred to as OMT, and desmycosin are both antibaoteric substancesa ef ".c, coa by them-" memest Myoinoma, mycarosis and & yaamin <9aa SQ!, 'V derivatives of sucras, the latter being another basic amino.
All the aforementioned degradation products of tylosin, added to the fermentation mediuma) .. * @
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tion more or less stimulates the production of ty3.os.u. but desmycosin and OMT are the best stimulants. The degradation products can be added. in purified form or, if desired, crude preparations can be used with results.
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satisfactory.
The crude hydrolyzate of tylosin pe $, atp
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prepared by heating an aqueous solution of tylosin
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or one of its acid addition salts, pH 2 approximately. washing the reaction mixture with an immiscible organic solvent such as chloroform and analogous solvents, and concentrating the washed aqueous phase to dryness,
EMI3.2
The corresponding degradation products obtained from di.hydrot5.oa.ne, which is usually produced at the same time as tylosin
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in the eemetitation of tyloain are also effective in stimulating the production of tylosin.
These products contain dihydrodes-mycosine and dihydro-CMT as well as the above-named sugars,
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The concetration of degradation products. dation used in l% d \ ',), U of f't31't! iE ... tJ. ; .tOti. l:} u.v increase the yields in:; ..b ..: ';.' I1l ':'; v, J .. "'1. \ !! 1" da 25 to 1500, g / mj, lnl1' .. 'SS sa fi '98 tom "u." s 8, ". i, S.éa i 6 : '-e, xt 500 m3.gl' .t \ ugnentatic! ... deN :: e! 6U? "S CI); jt, .lcli.tH 'translates to an augmentative .ro-a * 3: ntc.:i ..: t ;: rcndenient sn 'j ".0.9'.?: '-'M des' 1c: ne: 1 (, 'ai <' n'8 8Up1" .iQ, ¯t); 'r, h 500 Tx t.ependa.1t ôlLUl' L! II;: nn. 'Z>' t d? .E. : 1'An, "/ I; Id ty, s3.n is not .l ',) pol',. 1.mh 'i :: - ::' t 'L di> 1: 1 cl \ 1 .1.I. Fpa \ ltté de add-i = 'or., F:
$ en ef't'I1I "t .u te tA é8" r'l1 "ts te.:su ..." '", 1, - .3' # it¯" * 'k in ¯, ± " t3à>, è a DM, #. i.â s., ..; w i'i, 6 âA..e 'S C04 ".-. & 4'.? ' , \ ': ..:; ;;, u C;) t. 'J6. } Z.! L ', m optlmaJ.) 13 addiat. r $. '' = '' *,, m4r 'con i'sâ'fl4 tP! I ,,': l <"'1 v CO'lCf.r, 1trat1onu, 3a quantity d9 t: 1) 44, r .: $ .. nO ppoduita is greater than that obtained Sh ': ... e, r.: di t1: f' Optimal tylooine production is obtained when concentrations of the additive between 100 and 200 pg are used. / ml approximately, and such concentrations
<Desc / Clms Page number 4>
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@ have thus pz-6fer o8 in the. Pi'a.t: 1q'w àz LKi "! 9 t-.5 time this lfjd11t is atnaoiqpô: xà in the middle of fermentation can vary within limited gd8.
Thus, in general, the yield of tylsin6 obtained when the degradation product is added at the start of the fermentation are added: u. "Oximt1ti'1! Er:. 'J: equal to those obtained when the addition is made 20-24
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hours, approximately after the start of the term. However, the maximum yield of tylosin obtained is reduced if the additive is not added until 48 hours. Inoculation and even later additions gradually result in less stimulation.
Stimulation of the production of
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tylosin first becomes & pp, Are & 3 prôû in> "I 8 hours of fermentation and becomes more pronounced as the fermentation continues When the additive is
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employee! the preferred concentration of <about 100-200 g / ml, its presence in the fermentation medium can be detected for approximately the first 48 hours of fermentation, but no detectable amounts remain after a 72 hour fermentation! approximately or more. At concentrations greater than 1'in
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At optimum time and so far at concentrations greater than about 500 pg / ml a certain amount of unaltered additive remains in the fermentation medium throughout the fermentation period.
The stimulation observed in the synthesis of tylosin occurs in many fermentation media. In general, media giving higher yields of tylosin without stimulation,
<Desc / Clms Page number 5>
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further responding to the presence of the additive. Thus, depending on the fermentation medium employed, increases in tylosin yield of between about 10 percent and 40 percent over the unstimulated medium have been observed.
The addition of the degradation products is also effective in increasing the production of tylosin, whether the fermentation takes place in shaker flasks or in bottles.
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devices! t agitation. In addition, the amounts of the different tylosins produced during fermentation do not seem to be greatly influenced by the addition of these additives.
So for example, the report
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tylosin .a dhyr'.t: tloa: 1ne produced in a f1) r111ontat: L? n is appreciably cOHet.,. '1t :, that the fermentation is carried out per les: r:> "l' ± \ t "1asa1q ,, '\" or by the perffeti'mé process of the pflélJe! Ltu 1n: lf, tH * ", ion according to which lm s +:.: FJ1lu ..' t.; R;. ::: da, : '} ducI; 1on OS employee, La 0111 & 8 .ai. oeavilu? ' the. pear: the invention requires pratj, Q. '..'. 6J'1mt!, H \ !! \ '¯ l' J! .d: tfi '.? /. t.J1l of the usual procedure of t $ l "1Ii.ef't6.t1}: 1, pou .. '>,! d; 1.z-e the help request a.d itis I1UPIitant?, fJ r 5: ¯.
M, r! 1.d. exomp. 3, 1 - :: 1 = 1?: '- n.oe,.'. 3gi. "r; r32 a'1 ç1ul.q: a stage of the fermentation method can 01, rm id., , iClU3 ± 1 è those employed; euparavante ss.uf l J d ..- 1it.:L,H: from the degradation product to the final production medium Suspensions of organism spores.
EMI5.4
Tylosil killers Streptmyoea fradiae NRRL 2702 or NRRL 2703 are produced from the agar slant cultures in the usual manner. The spore suspensions are then used to produce an intermediate vegetative culture, and the
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vegetative culture thus obtained eat c :; 1dio to inoculate the fermentation medium used for the pro
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duction of the antibiotic.
If the db8r adf.t = product is used at approximately unrealized concentrations.
500 g / ml, no trace of the additive remains in the fermentation broth at the end of the fermentation period and, consequently, the isolation and purification of the tylosin is carried out according to the previous methods described,
In order to determine the effect of an additive
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especially on the production of t.3rs IF n Va!> ', usually not necessary to isolate the antibiotic cris
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balia6 in the pure state, The progress of the fermentation and the effect of the additive on the rendsmente an hyàoai #> 1 can be easily determined by axtrs, t.oas of the fermentation broth, adjusted to pH 5.
The level of tym losine present in the extract can be determined by spectrophotometry by measuring the absorption of the ohloroòrmic extract at 283 mt and comparing the values with those obtained with standard solutions.
The results thus obtained showed an excellent correlation with those obtained by effective isolation of the antibiotic.
The implementation of the invention is further illustrated by the following preparations and examples /
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! E !! 2-S¯2! A. Preparation of crude OMT. An aqueous solution of tylosin, in the form of the free base or of an acid addition layer, is adjusted to pH d by the addition of acid
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mineral. The resulting acidic solution is heated in a steam bath for about 100 hours, cooled and washed with chloroform to remove the substances.
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colored tances, The aqueous phase is concentrated & dry in order to obtain a preparation of crude OMT containing. about 25 to 30 weight percent OMT B, Preparation of purified OMT. The process described in paragraph A is followed up to the stage of washing with chloroform.
The aqueous phase is adjusted to pH 5 by adding an aqueous base and is washed again.
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with chloroform to remove desmycoaine on it is present, The pH of the aqueous layer is then adjusted to pH 9 by addition of base, and the solution basi-
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that is extracted, u. x; lor. ° 'orob The sonohs chlorotoz - nlcu, t containing the QMT, is equal., orée 1 sec t -.> uq; pi ds A aa> ì *; purification of ltO) 4T is rized by 's'ctf; yxph & a chloroformiqM solution of eta d ,, r, sr 6ur alumina colcaine, Example 1
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Una L'j9rt * '', a'9Ys d> 1 Bri: fi! 18 ".3, .r:
iwn ': 1;. "a't! >>. frad.aa 3t J37'C2 aaR prepartus ùo * à; S. ±:, * àwi; 1% #, uà.J.;. part. ,, r of a culbarw io * and orKai: lJXe maia'A'9 bzz Tilted agar * with ferro &, of im Una portion dn z! s3. of the aua, prta a-.. pae st e! s? y4o podi a nov *. their 890 if from a db6r "ra.aaie-¯4 1:> x6hatJù dino vi:, - e, rW7rW ErletaBoyer from 2 libr <to 1.s .i.ad, '' 3'f"; s's . '' 5 i5 percent of rs 9, ur cent of solid from the 1-iquor of Bia.oxation of mata, 0.5 pue-ier cent of yeast, and 0.3 percent of calcium carbonate in distilled water. The inoculated vegetative medium
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is inchb at 28 * C for. 48 hours to provide seeding medium :.
The latter is used as a medium to inoculate a / Production containing 1.75 percent fishmeal, 2.0 percent molasses, @
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rave, 3.0 percent crude soybean oil3 Op2 per liter of calcium carbonate, 0.04 percent of diammonia psph and 0.1 percent of sodium chloride in water. The medium is distributed in wide neck bottles of 500 ml each receiving 100 ml of the medium and
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each vial is inoculated with 5 ml. from the middle of <# :: if .. start described above. The flasks are placed on rotary nocoueutes rotating at 250 revolutions per minute, and the fermentation is left unrolled at ;;> W4 for 138 hours.
Another series of vials containing
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the same production medium and the m8 t9 ool is incubated under the same conditions with different acncsntiens of 0Nt added at the time of isolation. The effect of the concentration on Qtf "2 read It 'er.d;! LJ1f.mt in tylosin indicated in the table C18son66
<Desc / Clms Page number 9>
table 1 -
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> in <SEP> MOT <SEP> Production <SEP> of <SEP> tylosin
<tb>
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- = ..- to <ail -....-...
- ...-.- hàaé ...----
EMI9.3
<tb>
<tb> 0 <SEP> 4000
<tb> 50 <SEP> 4665
<tb> 100 <SEP> 5340
<tb> 200 <SEP> 5810
<tb> 300 <SEP> '<SEP> 6025
<tb> 500 <SEP> 5985
<tb> 750 <SEP> 6100a
<tb> 1000 <SEP> 5810
<tb>
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.1500 5580
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(a) the excess of ITOMT reot * still present in the culture broths after six days, # e of formati, 7) r,
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Example 2
The rate of tylosin synthesis in the presence or absence of OMT and the effects of varying the timing of addition of OMT on the total amount of tylosin produced are determined in the following experiment in separate flasks. containing the production medium are prepared as described in Example 1.
Two series of fermentation media are carried out; the first containing only the inoculated production medium, the second containing the inoculated production medium to which 500 g / ml of MOT has been added unless otherwise indicated,
The OMT is added immediately after @ The @ are done at intervals of one day for t six days so as to follow the progress of the statement. The yields of tylosin are shown in Table 11
<Desc / Clms Page number 11>
TABLE II
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<tb>
<tb> emps <SEP> of <SEP> Middle <SEP> of <SEP> Middle <SEP> of
<tb>
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ermentatio # Produotivn inoau14 Production Inoculated alone plus OMT ###### - us / nitl # Ub 1
EMI11.3
<tb>
<tb> 24 <SEP> 45 <SEP> 50
<tb>
EMI11.4
48 530 655
EMI11.5
<tb>
<tb> 1500 <SEP> 2155
<tb> 2575 <SEP> 30
<tb> 120 <SEP> 3345 <SEP> 4869
<tb>
EMI11.6
i14 4325 309 3 = 570
EMI11.7
<tb>
<tb> 144 <SEP> 4375
<tb> 144 <SEP> @
<tb>
<tb>
EMI11.8
(at)
OMT added 24 butters after 1nooult1cr. # (B) OMT added 48 hours after in <? 8u3.a% J.sa <(c) OMT added 72 h "!, 1r (tlf. After 1nocul1i '; lt.J: Â .
<Desc / Clms Page number 12>
EXAMPLE 3
The ability of the MOT to stimulate graduation; or Il * tylosin in media of different compositions is demonstrated as follows the general procedure described in example a is followed except the composition of the production medium which @
Medium 1 is the same as that used @ Example 1.
Medium II contains 2 percent beet melase, 2 percent yeast extract, 0.5 percent corn steep liquor, and 3 percent crude soybean oil in water.
Medium III has the following composition
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<tb>
<tb> Phosphate <SEP> dipotassium <SEP> 2,3 <SEP>% <SEP>
<tb> Chloride <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 2 / glitte
<tb> <SEP> Magnesium <SEP> <SEP> 5g / liter
<tb> Citrate <SEP> of ammonium <SEP> ferric <SEP> 1g / liter
<tb> Sulphate <SEP> of <SEP> zinc <SEP> heptahydrate <SEP> 0.01%
<tb> 3% calcium <SEP> carbonate <SEP> <SEP>
<tb> Wisteria
<tb> L-Alanine <SEP> 2%
<tb> L-Valine
<tb> Betaine <SEP> 5
<tb> Dextrose <SEP> 3.5%
<tb> Oleate <SEP> of <SEP> methyl <SEP> 2.5 <SEP>%
<tb>
The pH of medium III is adjusted to approximately 7.5 before sterilization in the autoclave.
The effect of OMT at different concentrations on the tylosin yields in each of the fermentation media described above is shown in Table III.
<Desc / Clms Page number 13>
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'1, r to 8 L e A t 1
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Medium I Medium II Medium III Increase Increase Increase RIJ.ide> = i.it relative Yield vs. Yield vs. Omit added e'- er, to the Tylosin Control to the Tylosin Control to the Control ug / mi / s / 'mi yUS / ELL% / ug / mi%
EMI13.3
<tb> C <SEP> 4360 <SEP> 3395 <SEP> - <SEP> 1870
<tb> 50 <SEP> 5580 <SEP> 28 <SEP> 3745 <SEP> 9 <SEP> 1895
<tb> 100 <SEP> 5745 <SEP> 30 <SEP> 330 <SEP> 13 <SEP> 2125 <SEP> 14
<tb> 200 <SEP> 6030 <SEP> 36 <SEP> 3770 <SEP> 2095 <SEP> 12,
<tb>
EMI13.4
(a) cû ..! * rl'gc ïMtT cux;% ce * .. "; n r '= 0? cn wl oi: h;
=
<Desc / Clms Page number 14>
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x, pïea La etimalatico. do the Reduction of t7ilon-v-, e / water * other * n é tô exa.3.be of 3.1t,: a 'os demonstrated by a method similar to that described in Example 1 The effect on the yield of tylosin produced by addition of the degradation product @ eat shown in Table IV
Table IV
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<tb>
<tb> Product <SEP> of <SEP> degradation <SEP> Quantity <SEP> Yield <SEP> in
<tb>
EMI14.3
¯¯¯¯¯¯ added ¯¯¯¯¯¯ addition of jg / m1 tylogine (d -
EMI14.4
<tb>
<tb> none <SEP> - <SEP> 5990
<tb> OMT <SEP> 50 <SEP> 6525
<tb>
EMI14.5
desmyooe1ne 50 C-, 630
EMI14.6
<tb>
<tb> mycinosis <SEP> 200b <SEP> 6365
<tb>
EMI14.7
(a) corrected for conversion of 09, in ty3.asi.sw (b) added in8 hours apro 3,
naaulat.n Example 5
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The ability of the CM 'to produce tylosin in shaking devices is demonstrated in 15 liter stainless steel reaction vessels # equipped with agiatauaa * &? Pap <i3. is sterilized at 120 ° C for 30 minutes before loading. A fermenbation k three * omt otaployed tapas.
An incubated vegetative enemenation medium having the same composition as that employed in exemption 1 is employed to inoculate an aqueous medium containing 0.5 percent yeast, 0.5 percent poison flour, 1 percent poison maia maceration liquor, 0.5 percent crude soybean oil and 0.3 percent calcium carbonate. This medium in turn is used to inoculate the final fermentation medium used in Example 1,
<Desc / Clms Page number 15>
The effect on tylosin yield after a period
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136 hour fermentation at 28-0 is shown in Table V.
Table V
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<tb>
<tb> OMT <SEP> added <SEP> - <SEP> Yield <SEP> in <SEP> tylosin
<tb> g / mo
<tb> none <SEP> 3670
<tb> 500 <SEP> 4310
<tb> 100 <SEP> 3930
<tb> 100a <SEP> 4635
<tb>
(a) OMT added 22 hours after inoculation Example 6
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t t eftet of dîhydro-O4T on n, .¯. in tylasina is dt.:rmin6 pu an 3)., 01 ;: ') "flH calui dl: Scl': 1.t in example 1. f.; C!; j'1 .t:, ::;" do d: 1hyd: t ". ::,.,? is not detectable in the; o131.1? n em feaaet, t; n 1i. end of the feoen8ntab16n. e''e 1W.I 'the jl; iendc .. (1nt to tylosintl is shown in table 'i:' <Table VI
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9on.c.t!.:.:. Mhrdr ... 91i! yloï'itt?; '. ti
EMI15.5
<tb>
<tb> g / ml
<tb> 25 <SEP> 5100
<tb> 100 <SEP>. <SEP> 5410
<tb> 150 <SEP> 5660
<tb> 200 <SEP> 5450
<tb>