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u Procédé de stabilisation de matières biologiquament active M L
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La pr43ente invention a pour objet un procédé de stabi- !t lotion de matières biologïquement actives par exemple, les b4C- taries les produits du métabolîsme des bactéries, les viruoi les :3ÓrUWJ et les ensyraes.
Un gri:lnd nombre de matières biologiquoment actives per- dent leur l1Ctivlt6, partiellement ou totalement si on les lyophi- Ilie eu lors du ator:!ta±-3, même ai on les stocke à l'état sec* C'est pourquoi, pour améliorer la stabilité et la stookobilité de ces
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r,4-ti%>irtal on a essayé l'addition de stabilisants. C*Éndant* jusqu'à
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présent on neonnatt pas de stabilisant qui puisse être généra- lement utilisa pour la stabilisation de bactéries de produite du f:t6tub(,l11ame de bactéries, de virus de agrume ot dtenzymes et
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qui, et! outre, pu la, 10 rester dans la solution de la substance bio-
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ioiquyifteaît activât même si colle-ci eat appliquée par voie in" truveinousc.
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Tour 1* évaluation de la valeur des vaccinât en particu-
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lier, il est ncoa!3aire do disposer de préparations standard con- servant une efficacité constante pendant des durées prolongées. iï3. aussi la stabilité des substances biologiquement actives doit Être aussi assurée pendant la préparation du vaccin. Jusqu'à pré-
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sent on a, par exemple, lors de la préparation de vaccina antipo-
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Iioray<5!itique3, congelé les suspensions contenant les virus polio-
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Mimiques et on lea a conservées au réfr1gÓrnteur h trll8 basse tenpuraturc.
Lais, cette méthode de stabilisation entra les dit- férenta atadea de préparation est très codteunes La atllbil1t6 est auaui un facteur importnnt pvur les 8&%rnU contenant des anti-
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corps ainsi que pour les enzymes , surtout quand on les applique, sous forme de solution, par perfusion intraveineuse continue à
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environ 20 0.
La streptokinase, produit du métabolisme de plusieurs
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souches de streptocoques, qui peut, comme biocatalyseur, dissoudre
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les caillots do fibrine par transformation du plasminogône en pltl:3::1inc dtn3 le sans et qui joue, n..ur cette raison un grand rôle dans la traitement es thromboses veineuses et artérielles, des tlirorbol)hl4bites et des embolies pulmonaires perd son activi. tsé lors du stockage, nône si elle est stockée & une température de 4*Cp matis surtout A des te'1pt}rntures élevées, corune par exemple
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quand elle est envoyée dans les régions tropicales, L'envoi de ces
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produits dans cou régions a, jusqu'à présent, toujours dtd aso- cié à de crndes parto3 d'activité.
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Or, la demanderesse a trouvé que l'on peut stabiliser
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des matières biologiqueient actives comme1, par exemple, les bac tir Us, les produite du m6tlbol1.me d b o- ###-# #
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t4.rio3) lea viruae les sérums et les enzymes, en ajoutant & lu subatance bioloe:1ru$l11ont active O5 ,,0 Í: d'un cellogène, de rr66rence in gélatine, obtenu selon le procède décrit dans le brevet allemand li" 1.116.732 ,.'et réticulé avec un diisoeyanote.- .
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jusque un poids moléculaire compris entre environ 15.000 et
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60tUCOj préalablement dorade hydrolytiquement ù un poids mol4eu- làiro compris entre .t)c;t7 et 20.000, de préférence z un poids .;.ultaz:la.ra compris entre $.000 et lû.OCO, ou d'un collagène, Cq pr\:f0rence la gélatine, obtenu selon le procédé décrit dans ,la demande de brevet belge n 575#OC4 puur :
If Succédanés de plasma
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sanguin et leur procédé de préparation" , préalablement réticule
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par un diisocianato et ensuite dégrada par voie hydrolytiquo il un p.iids tuoldculairo compris aussi entre} par exemple, 15.000 et 6U.U00, de préférence en combinaison avec 0,5 5 ,0 ,0 ;: de I<"glut<"
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mate de sodium.
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Le produit réticulé par le diisocyanate 9 l'avantage de ne pas posséder des propriétés sntién3,ques.
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Les exemples suivants, qui ne limitent nullement la portée du présent procédé démontrent que les matières biologique- ment actives stabilisées selon le procédé de la présente inven- tion conservent leur activité biologique en solution et aussi
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après lyophilit;ntion et stockage.
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LO:3 exemples oonoemwnt Ici stabilisation do préparations buatÓ1<il\Unel1 parGu;:"df 1300Ule Oalmstt6 Quérir l3Cc)j doo pfe" '
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duita du métabolisme de bactéries (lea anatoxines diphtérique et
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tutanique, la tuberculine), dea virus (poliovirus des 3 typel,\), ; des sérums (aérumo antiréckottsiens), et des onzyices (plasnincs, stroptokntiae). Comv il ressort des exemples (anatoxines diphté- rique ot tétanique), les substances uti1i::Jes.co;Ir:\o vaccins pouvent contenir, de manière connue, un adjuvant, par exemple, lthy, dn,ycFu d'almdnima, en vue d'augmenter leurs propriétés anti;::6. 1 n1quoa.
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HottorMlus' purtuo.Az Oscille de Iii coqueluche) .
Cn ajoute 5(.,U .1 d'es iù!!ôn''1ttt'f'lP"rrodui.t...... dégradation do la gélatine, réticulé avec ITïi eVa ci 6 thyièneVdiftM&PT J " cyanate) obtenu selon l'exenpie 1 du brevet allemand ut 1.11b.792, à 500 :.il d'une suspension de bacilles de la coqueluche ajustée à un titre de 30 x IL) - cernes par cmet donnant, dans le test de
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protection t.:e le souris (4ve;t de une Moyenn. de 2C unités de protection (UP) per ni, et on lyophilise le produit obtenu.
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Go.1 :..(.: solution de contrôle, on lYOI,j1J 1iJO une fiu.9pari. sion corrcîijom1' nte de tCnncB de la coqueluche.
Ui l'on examine li-,,5 'induits lyophilisés, à ur)rè.9 \11:100.. lution dans des vclunea (Sijnux d'eau diatillée, dans le test de protection de la souris, on obtient avec le produit la préparation
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ne contenant pas de produit de rdticulation de la gélatine dégra- dée avec le diisocyanate, en moyenne 4,5 UP, tandis que la prépa- ration avec l'addition mentionnée donne une moyenne de 18 UP.
EXEMPLE 2 :
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Bacille Calnette Guérin (8CG) (avec stabilisant combiné). a) fin ajoute U,5 ' du stabilisant utilisa dans l'exem- ple 1 et 2 1' de L-glutom1ntJto de fJod1U1a à 5QQ ml d'une euepencion contenant du LOO# on filet en amrçèulofit on lyophiliew Ob on ocelle sous pression réduite Le nombre de ,.-emua V1Varttd déterminé z ce moment est 17,0 x 10 par me de substance obehoo
On stocke à 37 C les ampoules obtenus! de 1a manière décrite ci-haut. Apres deux mois, on détermine encore une fois le
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nombre de germes viables, qui est alors de 2p7 2 10 6 rermes par Ing: donc 15 )'- de la quantité initiale.
Le vaccin BCG sec ainsi obtenu est facilement soluble,
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.IV elle A Manipuler et possède encore après etoclulr.8 .pendant #nuls K />? G un nombre de L;armOD BCG suffisant pour une vaccination ïrvuntivet b) Uii vaccin nec# BCG préparé suivant lea procédé son- nua '{ titra de témoin contenant 15 de lactose et 1#3 / de t- lutowlnte de sodium, ne rojsùde Gprèu un stockage de 2 mois A J7"U uc w 2 x IL 1:0rt:: 3 jo HCO vitibles par ma de'vaccin sec.
U.n "duv'nt1 ut1113l ne atabiliaent le vaccin BCG '1nsutr15am- Ir1.:/lt, le *.porto quo le vaccin ne peut plus Être utilisa aprlJo 2 rjçéur une vaccination préventive. c) J.. deasicotion des germe:} DCa sans aucune addition n'cjt ;.3 -jjz;iblet car après s6cliaCo les germes ne peuvent plus Sire 'iu en auspcnsion.
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Anatoxines diphtérique et tétanique.
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Ln ajoute 100 ml d'une solution à ,5 d'un produit de dégradation do la ;'élat1ne rêticOÔ avec l'hexaMethylene- dU.:.vcY\notc, CO'T.'ao indiqué dans l'exemple 1, à 100 ml d'un vaccin c(.,r.îtl nl contre la diphtérie ot le tétanos, contenant 0,2 de de ..1{{ ). ; pu!::> on dilue encore 1UO ml du même vaooin avèoc 100 ml d'une solution à u,/.;5 > do chlorure de sodium. On lyophiliae dlars loa solutions et on dÓtonh1ne les unifia protectrices (Ul') contre 1'! drtrie et le tétanos aprea diaaolution des produits l '"I,h:!..li3 0$ .
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Les valeurs obtenues dont données dans ,le tableau sui-
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vant, 1:3 valeurs entre parenthèses montrant le largeur de dia- jerdion #
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PU c. la d1pht4. PU e. 1. te. fie tanso 1 voc le prvdul t réticulé # X'iQ lU uv. c dUaueyunato 11u <1G. ri-uiatlon ,io la ..!lat1no (IL'O 1$ (10C 150) :. '/t;(1 :.1Cl 5c:. 26 .
(44 73) (20 . t}
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Il. roB.;ort de ce t\J1QUH que lea voleur ovlio Nfldl dont forUr.,- r.t 1':rlult'H';, Lea valeurs obtenues rvec le stabilisant selon l t im.\.:.t1,n prouvont l'action supérieure do ce stabilisant via-A- vi.. ,H) ,.. tv:-.llC8 dirlri'1uc et tt.nâ.;,ue.
! L<j # Virus poliomyélitique du type i%...tzoriy, à 2û*G '..11 .,.;...tt: 4'Ô d'un soluté physiologique A O t>5 ;' de . =-;À. 11, ,:,d.u du :tbi3.i.;t décrit dan l'exemple 1| A 100' 'il ",'11:1<; ,:n;I,W1:11{ Il contenant du po11ovlrua du type ï/ilehoney ...'J 1:,1" u.. i.itru Je 1(., ,VI 1,I5(.,inl, on atoo'({' 1^ 1101ution tlinoi ult .\uc 'rt,....Ylt ï :t :,i;.;1G';: ft a?.4(Î et on 4i(tEli#>Ij.:ll9 nouveau son titru, .1 était de lUú,lJ'IJ5Jml.
Ut. échantillon \:(.1 la f'.C!.'.e solution, oiois sans ttub111... u i.t, u'joc'.:4 i oncl.'.nt v 3e:.ainej A 2L*C ne poaaède qu'un titre de 1U"'(.; JX5u/nl* ... .;....n.i 5 : Virus poliomyélitique du type 1/, :honoy A *57*C en stocke une suspension de virus !olyolny61it1que cor- r('/'1\1(,l.tlnr.t '. (:o11e do l'exemple prc6t1cntJ pondant 21 jours A i4. Prûzz et; dûifci, lrc;,t4rit.iln contumuit le atobilisant a un titre de lu J J ' tendis que la titre d'un échantillon do contrôle 4tsit çl;:; le l6t:.Je jour tonvbd h une valeur non susceptible de
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Mesure-,
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1:......- lJl 6 : Virus po.i.or^yL11t3. lue :1u type ij.:ahoney lA 4*C.
31 l'on stocke les suspensions de po11o.,..vlrus de 1' O.Í". pie prûctdent à 4*C, on obtient les valeurs suivantes j\o11oviru:.1 ovec stabilisant après n lAi 'Y ,xr, 1t,; 10' .U15V ml ; ., zcv k n,; 3i u: ntaù1l1:nnt rlf'rU . , l , . 10"' , ;,lUI /""
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±..¯.l± 7- Virus poliomyélitique du type III/Leon 12 a1b (Sabin) à 20 C.
Cn ajoute 2,6 % du stabilisant selon l'exemple 1 (1,3 g)
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&5Q ml de polioviru3 3abin du type III/Leon 12 Albi et on stocke le tout pendant 6 semaines à 20 C. Après et délai la détermina tien du titre donne les valeurs suivantes
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Poliovirus Jabin avec 2,6 ;.' de e '?< stabilisant 10' PI,oIml Poliûvirua Jabin aprèa 8 semaines lOS.962DISolml Pcliovirus Sabin sans stabilisant ' ,lO',74DI501ml après 6 semaines lo3,66DI,oIml.
Vaccin antipollomyélitique types Il II et III h 37*0..
Un aboies 100 inl d'un vaccin antipoliomy61i tique conte- nant les trois types do virus pendant 14 jours A 3,/ 0 et on meoure ltl.1ctivltJ antigúnique (DI 50 du sérum) dons l'épreuve sur le j cobaye. A 100 m1 de ce vaccin antipoliomyélitique, on ajoute 2,6 n du stabilisant utilisa dans l'exemple 1 et on truite le vaccin do la môme manière.
On obtient les valeurs suivantes :
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<tb> Type <SEP> I <SEP> Type <SEP> II <SEP> Type <SEP> III
<tb>
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polio-vaccin 16320 49152 44eO
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<tb> polio--vaccin <SEP> avec <SEP> 2,6 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> stabilisant <SEP> après
<tb>
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14 jours 7052<J 164UO lU9?6d polïo-vaccîn sana
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<tb> stabilisant <SEP> après
<tb>
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14 jvUI':J . 0 0
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iiérum antl-JCiôvi'e Q.
Un ajoute 1100 ml d'uno aolution A 1,75 /,do tQbil1!)l\nt aolou l'cxumplo 1, dizooua dans une solution z O,t>5 i de chloruro - do sodium, à 100 ml d'un a4rum anti-fièvre Q ayant un, titre d' unticorpa fixant le cor1plément 6e,,%l à 111tiC. Aprèa dilution, cette solution a un titra d'environ lllLC. Un lyophilise ensuite cotte solution. Après rodienolutlon d.,n:3 de l'eau dititilldes on
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obtient une solution ayant un titre d'anticorps fixant le com-
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picntcnt 1 A. liBO.
Une autre solution de aôrufe anti-fievro Q préparée à l'aide d'une solution t 0,1..5 / do chlorure de sodium) n'à qu'un titre d Anticorps 'ia.rtt le eonj4unient h h 11v apr6a lypphi lisation.
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iXJ 1U fl±.1s::rl.ne. a) Une quantité de plasmine contenue dans 10 ml d'une solution à 0,85 % de chlorure de sodium et ayant, après dissolu-
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tisons 6\"t. unit6s/ml, obtenue par l'octio;. do lu treptokinall8 sur le pl3minor;(.:no, subit pendant un f;.1our n U.C une perte u'nctivitl; cO!:J.I!1e indiqua ci-dessous, une unité inté do plaarine t±1l1t actinie pr lu quantité do plu3:nine apte à dissoudre en 15 minutes un caillot de fibrine standard dnn3 1 ml d'une solution à 0,1 ,. de ìbrinolj0ne bovin.
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's3,:s d'incu- Activité de plosrnine Activité en
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<tb> bation. <SEP> en <SEP> heures <SEP> en. <SEP> unité <SEP> int./ml <SEP> 'il
<tb> à <SEP> 20 C.
<tb>
<tb>
0 <SEP> 9600 <SEP> 100 <SEP>
<tb>
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2 66Co '(±,6 :
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<tb> 5 <SEP> 5500 <SEP> 57,3 <SEP> %
<tb>
Il ressort de ces valeurs, que l'activité de la plasmine est tombée au bout de 5 heures après de la moitié de sa valeur initiale.
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La n:t::1e quantité de pll1omino di330ute dans une solution '1 1)7$ / du stabilisant utilio6 dans l'exemple 1, ne subit qu' une moindro l,orte d'activité si elle est réponde à 2ü C, comme est <}6rsiun#ù pur 10:; valeurs donn6os ci-dessuua. Oeo valeurs prou- vont aunsi, que le stabilisant exerce une activité stabilisante dbe la d1DolutionJ car l'activité de la planniino après dissolu- dans la solution tion/à ut,5 i* dcr chlorura de sodium n'.jst que de 96uno unitde/mi.
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<tb> Activité <SEP> de <SEP> la <SEP> Activité.. <SEP> Activité <SEP> de
<tb>
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plasmino en uni* en on plasmine en t S3 int./50 ml, " solution units ist./ on Dolut1on de do Hf.lCl 50 ml, en oo- f,u01 1\.&1on de .tlJb11hQnt avant distSvlutlon u0 100 95UÛ aproa dinaolution i!>'4$0 ù7 9$CO heurt 3 Ilp2':3 ;...a.ra . 5v ,5, 9OO 5 Í1!JUl'ú:; yr::::
::i.:ulutirat ;54(.J 76, a 9500
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La pï'6petin ubit une porto de son activité des la j di:5.K*lutior. dtuis la solution do 30I}' cct+.e réduction d., l*6ctlvit{ ! ":n,,'ntc, oncore. pendant le séjour A 20'0 A un de#ré plus fort que ! duriu l'ensui de comparaison précèdent, effoctuô avec une concûn- tration plue 'ri mIe. Apl'Qa 5 heureui on no retrouve qu'un tiers do Itnctivit4 initiale.
Cependant, l'activité ne cane;. pne en dit Cti..1Y3eu't' uelott 1* exemple 1, malgré la forte dilution, r en,: '. nt. toute cette durée* trepto1nuse : disroutea
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U< dissout 100*000 unités into de streptc\ë1nae dan? 5UC, ml d'une solution à :5,5 du stabilisant utilisé dans l'oxem-' plu 1. pi-4pare une solution correspondante comme solution te- ,;oin (tvoc une solution à 0 85 Il! de chlorure de sodium. ,Aussitôt aprt-3 dio501ut:.1on, pinsi qu'après 2 et 6,5 heures dé sdjour à iit*0} on prélève des échantillons sur lesquels on détermine flac- tivltl1 atreptokinase.
On obtient les valeurs suivantes
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<tb> Activité
<tb>
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après diso- 2 heures après 6,5 'heures lution dissolution oprèo disso- lvtion strer tokin&3e :.;.vcc' 3tubilicant 98 I 9S ]l 9 3trpalno9o aat.s stabilisant 7tJ :: 70 '1, 1:
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fi iiCG, la solution roite stable pendant au moins 6,5 . heures, ce qui out Io temps nécessaire pour une perfusion goutte A 1i.lI!t.tU. la di.f.N1'onco pur rapport, A la quantité rilhe un jeu, dúJ:\ <;(,IHCjt'.t.o 11}rQ ttisoolutione poste dans le domoirie de pro1.' bicn du In ruîthodo de mesure omployde. jtrcptokln. sa : che.
Un ajoute JUG m;; du stabilisant utilisé dans l'exemple i h -i ul u'unc solution de atropto:d.n:'J±lo contenant 2504000 unités int.< 2:' ,4à !l1et la solution ainsi obtenue et une autre solution de 3troptokii1lHla ayant la môme concentration, Mais sans le stabilisant acntiunndt dcna àt-o onpoulos de 1 rul, on lyophilise ot en stocke A 4V C Le tableau suivant donne les résultats de la d4tur.inatiuri de l'activité*
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Activité
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<tb> sans <SEP> stabilisant <SEP> avec <SEP> stabilisant
<tb>
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après dissolution 100 j 100 1- apr;;: lyophilisation 86 97 % ûrr, .3 3eaaines à 3'1 C b3 ,! 88 J? apr':'::; 7 scnaineo à ;3't C 70 :
80 ÇÎ âpres 26 sereines à J7.C <52 ' 0 z
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Lea valeurs obtenues contrent que la atreptokinD34 est stabilises par le stabilisant 4 l'état, lyophilisa ainai' que pon- dant un stockage de plus de 6 sois à 37 C. Sans stabilisant, on ne trouve aprJ.3 26 semaines à ,j'7 C qu'un thr1!S de Itactivité, male avoc le stabilisant, il reste oô / de l'activité du produit ini-
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tial.
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:.,rLE,. lu : JtrFtckina3ç : ùche {avec stabilisant combind).
Un dissout 1 r. de L"Clut.r;1[tfJ de sodium at 1 g du ata- b111:J.cnt utilisa dans 1 exemple 1, dinu 1UO ml d'une solution aqueuse du 3trertoinaDc ayant une activité do 150,OOG wiit43 int. p r 1 Us rpt cette solution C!:la deu 4t:1pt;ule. de 1 mlt on lys
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philise et on stocke les ampoulé à 4*0 et 11 370-, un obtient une préparation de atreptokinase qui est stalle à 4 C pendant au moins un an. *-.8nje z la température de 9l'loi la préparation conserve son activité pendant des mgiso comme le l'activit4 strol)tolcïnoee présenta dans le tableau
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suivant Activité
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atreptoldnase sans stabilisant avec 'stabilisant en solution 100 l 100 après lyophilisation 86 98 iJ pria 15 ..Ie:.1I.tino:
J t .1""0 8 1 98 -' aprîa ii acmaines à 3Î Q 6) 96 0-,
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Ces r'3ultitq prouvent que la atreptokinase avec ata- bilisunt) stockée à ft7"C pendant' 8 soiraines) a Conserva son acti- vité. të.jfri.i Lft.,ii4,i Virus de Hewcastle (IIDV)
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(Virus de la peste aviaire atypique).
Un centrifuge pendant 1 heure à 17*500 tours/minute,
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, lc;U ml d'un liquide d'oeuf contenant du virus de Hewcaatle et on reprend le virui de Newcastle, que l'on obtient sous la forme d'un
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du produit
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sédiment, dans 100 ml d'une solution à 4,5 i/de dégradation de gélutine réticulé au noyen do l'hoxam6thylene-diiaocyanuto est obtenu selon'l'exemple 1 du brevet allenond nl 1,.7..v.7;z.
Un dilue 1 inl de cette suspension de virus avec 255 ml d'un soluté physiologique de chlorure de sodium et en atocke les deux nueponuionn de virue pcndnnt lu se eino3 A 4*0.
D'une mohiùru anolonuo, on otocke pendant 10 se-Lnea 4'U tici fiCÎldixltl.lai'z:i c1u liquide d'oeuf contenant du virua do Uowcuatlo dans un ca4 h l'état non dilu4 l' et( doua loutre oatit dïlu6 , 1 .$6 dans un soluté physiologique de chlorure de go" dlun. '
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. des intervalles d'une serine, oh préleva un échantil- Ion de chacune d 4 suspensions et on d'tstr,.rio les unité! dr h6:no-ar,':latin±jtion selon le t:3t d t ij6:11(J-glut1nation. Le taux d' .rr.aw,^Iutination indique la plus forte dilution 'de virus qui f-r",vo(1.u:: encore une rlutii:r:ttraz des h;,5rat3.a de pouleti La di- luti0 1:,6 correspond le. solution utilisée polir le test d'inhibition de l'h6o-Dlutin.tion, contenant 4 Unités hrn..
8i::±:hltinL.ntcs; ce test est Zn4raleir-nt utilisa corariie mdthode dé d.terra3.rmt,ur, Cra.o.t:s pour lu diagnostic de 1<? maladie de .,srrcawt.s. Il, U1' ebttu raison, cette solution devrait pouvoir être stocke pendant dct tcr.po 1;1"olvo(:,10, pcrticuliài'emont pour les
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test,-* comparatifs.
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Lo tableau suivant donne les r<' ultato de ces toistgo les valeurs des suspensions ::;tocl5e:; à l'état dilud étant rnulti.. plî4c.s par Z56.
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Durc de sans stabilisant avec etabilisunt 9toc;a;e" non diluA. dl1u<1 l,: 56 ro1'\ d1lu. d:lur:,;t" 259 .
1 1024 ls1v 1J1U24 . 1 s 1a4 2 1:1024 1:1024 1:1024 l!lù24 J 1:1024 1:51 1:1U24 1:1024 4 11U24 1:512 ltl024 1:'1024 5 1:512 1:51 1:1024 .1:1024 6 1:512 1:512 1:1024 !rlO24 7 1 256 1:1024 1:1024 pas d'a,;7.u-. pas 1:1024 1:512 9 tination net- d' ;wr;lu- ltlO24 Z s 5xz toaent visible e t.nL3.on J.îi4 J. lu 1:1024 1:512
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Les résultats montrent, quo lrh,;o-rzp,7.uinr:tiort de la suspension non diluée, contenant du virus de Newcastle et le otub11isnt, reste inchangée pondant 10 semaines, et que/au8 pension dtlu6 r deno un rapport de 1& 5( ruate inchung6e pendant '1 3')'Min<ja< l'tir opuHunf ltkwuu;4;Iu.taion du liquide cxcuu,t' 111./11 dilué oontommt du vtxuo do newoûatlai se réduit aH bout do 5 semaine? à le moitié et apr63 ii Qemairle8 on na peut
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plus nettre an évidence d'agglutination..
Le liquida d'oeuf dilué dans un rapport de Ii<d56 ne préserve son titre d'agglutination que tjont)inot)t '.J #ft'&WfrîS ' ,',#.##, L'invention cuuprend notamment ,'# -#'' 10) Un proé6d6' do stabilisation de m;:, tiM:'tJ8 biologique- lacrit Lt'CtiV6H J cO:/11V par exemple, les bactéries ia9 produits du m6tu 1?tinr.lO La.: t.1r1 on, lea viiiie, lçd sérums et les enzymes, pro i acian lequel on ajoute 'À la substance biologiquel')1ènt active, *"ti> * 5# tltuit QollucùJl, rljt1Qu6 avue un ,d1U4rQrU1t h un poiJa l.(,l(l\ldlrfl oo(,1pr1a entre environ 1!!<0(.0 et 6Q#OQÔr c1lrdG , 1,,tr hydrolyao A un rc1da Compris outre i et tf.cou, 4o prf''!ï'afice 50U <' 1U,UCC) où d'un oollagtne .l'.:,.1.liJloll!fJnt. r(;ticu16 par un dl1avoyan"te et enouïte dGr:rHd,1 par hyuulyau ,\ Un 1)(,iUj Ino16culr! 11"0 compris entre cuwirÓ'n l5 ûUi uL.t .':<:
I#':rfJronoo ori eombinalaon avec Ut5 &10)C de lutato dû #luUiun* -;") Un procédé <:O;'.'liG f.Jp601tiÓ sous 1"# selon lequel or. utilise do la ;;<51{itine 00::'\1',.8 cÓlla:;ène.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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u Process for stabilizing biologically active materials M L
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The present invention relates to a method of stabilizing a lotion of biologically active materials, for example, the b4C-taries, the products of the metabolism of bacteria, the viruses: 3OrUWJ and the ensyraes.
A big number of biologically active materials lose their l1Ctivlt6, partially or totally if they are freeze-dried during the ator:! Ta ± -3, even if they are stored in the dry state * This is why , to improve the stability and stookobility of these
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r, 4-ti%> irtal the addition of stabilizers was tried. C * Endant * up to
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At present, no stabilizer is known which can be generally used for the stabilization of bacteria produced by the f: t6tub (, the blood of bacteria, citrus virus ot dtenzymes and
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who, and! furthermore, it may remain in the solution of the bio-substance.
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It would activate even if the glue was applied intravenously.
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Round 1 * evaluation of the value of vaccines in particular
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However, it is essential to have standard formulations which maintain constant efficacy for extended periods of time. iï3. also the stability of the biologically active substances must also be ensured during the preparation of the vaccine. Until pre-
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one feels, for example, when preparing an anti-vaccine
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Iioray <5! Itique3, frozen suspensions containing polio viruses
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Mimics and they were stored in the low tenpuraturc refrigerator.
However, this method of stabilization between different preparations is very valuable. The atllbil1t6 is also an important factor in the 8% rnU containing anti-
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body as well as enzymes, especially when applied, as a solution, by continuous intravenous infusion to
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about 20 0.
Streptokinase, a metabolism product of several
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strains of streptococci, which can, as a biocatalyst, dissolve
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fibrin clots by transformation of plasminogone into pltl: 3 :: 1inc dtn3 without and which therefore plays a major role in the treatment of venous and arterial thrombosis, tlirorbol) hl4bites and pulmonary embolism loses its activi. when stored, only if it is stored at a temperature of 4 * Cp matis especially At high te'1pt} rntures, for example
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when it is sent to the tropics, sending these
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produced in these regions has so far always been associated with high levels of activity.
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However, the applicant has found that it is possible to stabilize
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biologically active materials such as, for example, US tanks, metabolic products from b o- ### - # #
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t4.rio3) the viruae serums and enzymes, by adding to the biological substance: 1ru $ 11ont active O5 ,, 0 Í: of a cellogen, of reference in gelatin, obtained according to the procedure described in German patent li " 1,116,732,. 'And crosslinked with a diisoeyanote.-.
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up to a molecular weight of between about 15,000 and
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60tUCOj previously hydrolytically ù a mol4eu- lairo weight between .t) c; t7 and 20,000, preferably z a weight.;. Ultaz: la.ra between $ .000 and lû.OCO, or of a collagen, Cq prefers gelatin, obtained according to the process described in, Belgian patent application No. 575 # OC4 for:
If Plasma substitutes
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blood and their preparation process ", previously reticle
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by a diisocianato and then degraded by hydrolytic way it a p.iids tuoldculairo also included between} for example, 15,000 and 6U.U00, preferably in combination with 0.5 5, 0, 0;: de I <"glut <"
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sodium mate.
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The product crosslinked with the diisocyanate 9 has the advantage of not having sntién3, c properties.
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The following examples, which in no way limit the scope of the present process, demonstrate that the biologically active materials stabilized according to the process of the present invention retain their biological activity in solution and also.
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after lyophilization; ntion and storage.
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LO: 3 examples oonoemwnt Here stabilization of preparations buatÓ1 <il \ Unel1 parGu;: "df 1300Ule Oalmstt6 Find l3Cc) j doo pfe" '
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of the metabolism of bacteria (diphtheria toxoids and
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tutanic, tuberculin), viruses (poliovirus of 3 types, \),; serums (aerumo antiréckottsiens), and onzyices (plasnincs, stroptokntiae). As it emerges from the examples (diphtheria and tetanus toxoids), the substances used: Jes.co; Ir: \ o vaccines may contain, in a known manner, an adjuvant, for example, lthy, dn, ycFu from almdnima, in order to increase their anti; :: 6. 1 n1quoa.
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HottorMlus' purtuo.Az Oscillus of whooping cough Iii).
Cn adds 5 (., U .1 of es iù !! ôn''1ttt'f'lP "rrodui.t ...... degradation of gelatin, crosslinked with ITïi eVa ci 6 thyieneVdiftM & PT J" cyanate) obtained according to exenpie 1 of German patent ut 1.11b.792, to 500:. il of a suspension of pertussis bacilli adjusted to a titre of 30 x IL) - rings per cmand giving, in the test of
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protection t.:e the mouse (4ve; t of an average of 2C protection units (PU) per ni, and the product obtained is lyophilized.
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Go.1: .. (.: control solution, we lYOI, j1J 1iJO a corrcîijom1 'nte fiu.9pari. Sion of pertussis tCnncB.
We examine the lyophilized induced l - ,, 5 ', at ur) r. 9 \ 11: 100 .. lution in vclunea (Sijnux of diatilled water, in the mouse protection test, obtained with the produces the preparation
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containing no crosslinker of the gelatin degraded with the diisocyanate, on average 4.5 PU, while the preparation with the mentioned addition gives an average of 18 PU.
EXAMPLE 2:
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Bacille Calnette Guérin (8CG) (with combined stabilizer). a) end add U, 5 'of the stabilizer used in example 1 and 2 1' of L-glutom1ntJto from fJod1U1a to 5QQ ml of a euepencion containing LOO # on a net in initiation of lyophiliew Ob on ocelle under pressure reduced The number of, .- emua V1Varttd determined z this moment is 17.0 x 10 per me of substance obehoo
The resulting bulbs are stored at 37 C! in the manner described above. After two months, the
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number of viable germs, which is then 2p7 2 10 6 rerms per Ing: therefore 15) '- of the initial quantity.
The dry BCG vaccine thus obtained is easily soluble,
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.IV it A Manipulate and still has after etoclulr.8 .during #nuls K />? G a number of L; armOD BCG sufficient for an immediate vaccination b) A nec # BCG vaccine prepared according to the method known as a control containing 15 of lactose and 1 # 3 / of sodium t-lutowlnte, not rojside Gprèu a storage of 2 months A D7 "U uc w 2 x IL 1: 0rt :: 3 days HCO alive by my de'vaccin sec.
A "duv'nt1 ut1113l does not atabiliaent the BCG vaccine '1nsutr15am- Ir1.:/lt, the * .porto that the vaccine can no longer be used after a preventive vaccination. C) J .. deasicotion of the germs:} DCa without any addition does not cjt; .3 -jjz; iblet because after s6cliaCo the germs can no longer Sire 'iu in auspcnsion.
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Diphtheria and tetanus toxoids.
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Add 100 ml of a solution of a degradation product of the elate reticO with hexaMethylene-dU.:vcY\notc, CO'T.'ao indicated in Example 1, to 100 ml of a vaccine c (., R.îtl nl against diphtheria ot tetanus, containing 0.2 of ..1 {{). ; pu! ::> 1UO ml of the same vaooin is further diluted with 100 ml of a solution of sodium chloride. We lyophiliae the solutions and detonate the protective unifia (Ul ') against 1'! tetanus and tetanus after diaaolution of the products the "I, h:! .. li3 0 $.
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The values obtained, given in the following table
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vant, 1: 3 values in parentheses showing the dia- jerdion width #
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PU c. d1pht4. PU e. 1. te. fie tanso 1 voc the reticulated prvdul t # X'iQ lU uv. c dUaueyunato 11u <1G. ri-uiatlon, io la ..! lat1no (IL'O 1 $ (10C 150):. '/ t; (1: .1Cl 5c :. 26.
(44 73) (20. T}
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He. roB.; ort of this t \ J1QUH that the thief ovlio Nfldl whose forUr., - rt 1 ': rlult'H' ;, The values obtained with the stabilizer according to lt im. \.:. t1, n prove the action superior of this stabilizer via-A- vi .., H), .. tv: -. llC8 dirlri'1uc and tt.nâ.;, ue.
! L <j # Polio virus type i% ... tzoriy, at 2û * G '..11.,.; ... tt: 4'Ô of a physiological solution A O t> 5;' of. = -; To. 11,,:, d.u du: tbi3.i.; t described in Example 1 | At 100 '' il ", '11: 1 <;,: n; I, W1: 11 {It containing ï / ilehoney type po11ovlrua ... 'J 1:, 1" u .. i.itru I 1 (.,, VI 1, I5 (., Inl, on atoo '({' 1 ^ 1101ution tlinoi ult. \ Uc 'rt, .... Ylt ï: t:, i;.; 1G' ;: ft a ? .4 (Î and on 4i (tEli #> Ij.:ll9 new sound title, .1 was from lUú, lJ'IJ5Jml.
Ut. sample \ :(. 1 the f'.C!. '. e solution, oiois without ttub111 ... u it, u'joc'.: 4 i oncl. '. nt v 3e: .ainej A 2L * C ne poaède that a titre of 1U "'(.; JX5u / nl * ....; .... ni 5: Poliomyelitis virus type 1 /,: honoy A * 57 * C stores a suspension of olyolny61it1que virus in it cor- r ('/' 1 \ 1 (, l.tlnr.t '. (: o11e do the previous example giving rise to 21 days A i4. Prûzz et ;duifci, lrc;, t4rit.iln contumuit the immobilizing has a title de lu JJ 'extended that the titer of a control sample 4tsit çl;:; le l6t: .I day tonvbd h a value not likely to
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Measured-,
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1: ......- lJl 6: Po.i.or ^ yL11t3 virus. read: 1u type ij.:ahoney lA 4 * C.
31 we store the suspensions of po11o., .. vlrus of 1 'O.Í ". Pie prûctdent at 4 * C, one obtains the following values j \ o11oviru:. 1 ovec stabilizer after n lAi' Y, xr, 1t ,; 10 '.U15V ml;., Zcv kn ,; 3i u: ntaù1l1: nnt rlf'rU., L,. 10 "',;, lUI /" "
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± ..¯.l ± 7- Poliomyelitis virus type III / Leon 12 a1b (Sabin) at 20 C.
Cn adds 2.6% of the stabilizer according to Example 1 (1.3 g)
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& 5Q ml of polioviru3 3abin type III / Leon 12 Albi and the whole is stored for 6 weeks at 20 C. After and after a delay, the determination of the titre gives the following values
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Jabin poliovirus with 2.6;. ' of E '? <stabilizer 10' PI, oIml Poliûvirua Jabin after 8 weeks lOS.962DISolml Pcliovirus Sabin without stabilizer ', 10', 74DI501ml after 6 weeks lo3,66DI, oIml.
Pollomyelitis vaccine types II II and III h 37 * 0 ..
A 100 inl of polio vaccine containing all three types of virus for 14 days A 3, / 0 and the antigenic activator (ID 50 of serum) is added to the guinea pig test. To 100 ml of this polio vaccine, 2.6 n of the stabilizer used in Example 1 are added and the vaccine is trouted in the same way.
We obtain the following values:
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<tb> Type <SEP> I <SEP> Type <SEP> II <SEP> Type <SEP> III
<tb>
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polio-vaccine 16320 49152 44eO
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<tb> polio - vaccine <SEP> with <SEP> 2.6 <SEP>%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> stabilizer <SEP> after
<tb>
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14 days 7052 <J 164UO lU9? 6d polïo-vaccîn sana
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<tb> stabilizer <SEP> after
<tb>
EMI7.9
14 jvUI ': J. 0 0
EMI7.10
iérum antl-JCiôvi'e Q.
One adds 1100 ml of uno aolution A 1.75 /, do tQbil1!) L \ nt aolou l'cxumplo 1, dizooua in a solution z O, t> 5 i of chloruro - do sodium, to 100 ml of a a4rum anti-Q fever having a titer of unticorpa fixing the 6th supplement,% 1 at 111tiC. After dilution, this solution has a titration of approximately III LC. Then freeze-dried this solution. After rodienolutlon d., N: 3 dititilldes water on
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obtains a solution having a titer of antibody binding the compound
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picntcnt 1 A. liBO.
Another solution of anti-fievro Q aorufe prepared using a solution of 0.1..5 / d sodium chloride) only as Antibody 'ia.rtt the eonj4unient hh 11v apr6a lypphi lization.
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iXJ 1U fl ± .1s :: rl.ne. a) A quantity of plasmin contained in 10 ml of a 0.85% solution of sodium chloride and having, after dissolving
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burns 6 \ "t. units / ml, obtained by the octio ;. do lu treptokinall8 on the pl3minor; (.: no, undergoes during a f; .1our n UC a loss of activity; cO!: JI! 1e indicated below, an internal unit of platarine t ± 1l1t actinie for a quantity of plu3: nine capable of dissolving in 15 minutes a clot of standard fibrin in 1 ml of a 0.1 solution of bovine ìbrinoljon.
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's3,: s of incu- Plosrin activity Activity in
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<tb> bation. <SEP> in <SEP> hours <SEP> in. <SEP> unit <SEP> int./ml <SEP> 'it
<tb> to <SEP> 20 C.
<tb>
<tb>
0 <SEP> 9600 <SEP> 100 <SEP>
<tb>
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2 66Co '(±, 6:
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<tb> 5 <SEP> 5500 <SEP> 57.3 <SEP>%
<tb>
It emerges from these values that the activity of the plasmin fell after 5 hours after half of its initial value.
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The quantity of pll1omino di330ute in a solution of the stabilizer used in Example 1, undergoes only a least amount of activity if it corresponds to 2 ° C. as is <} 6rsiun # ù pure 10 :; values given above. Oeo values show that the stabilizer exerts a stabilizing activity in the d1DolutionJ because the activity of the planniino after dissolving in the solution tion / at ut, 5 i * dcr sodium chlorura is only 96uno unit. /mid.
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<tb> Activity <SEP> of <SEP> the <SEP> Activity .. <SEP> Activity <SEP> of
<tb>
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plasmino en uni * en on plasmino t S3 int./50 ml, "solution units ist./ on Dolut1on de do Hf.lCl 50 ml, en oo- f, u01 1 \. & 1on .tlJb11hQnt before distSvlutlon u0 100 95UÛ aproa dinaolution i!> '4 $ 0 ù7 9 $ CO collision 3 Ilp2': 3; ... a.ra. 5v, 5, 9OO 5 Í1! JUl'ú :; yr ::::
:: i.: ulutirat; 54 (.J 76, a 9500
EMI9.3
The pï'6petin ubits a port of its activity from the day of: 5.K * lutior. remove the solution do 30I} 'cct + .e reduction d., l * 6ctlvit {! ": n ,, 'ntc, oncore. during the stay A 20'0 Has a de # d stronger than! duriu the preceding comparison, effected with a greater competition. Apl'Qa 5 heureui we only find a third of the initial Itnctivit4.
However, the activity cannot. pne en dit Cti..1Y3eu't 'uelott 1 * example 1, despite the strong dilution, r en ,:'. nt. all this time * trepto1nuse: disroutea
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U <dissolves 100,000 units into streptc \ ë1nae dan? 5UC, ml of a solution at: 5.5 of the stabilizer used in oxem- 'plu 1. pi-4pare a corresponding solution as solution te-,; oin (tvoc a solution at 85 μl of sodium chloride ., Immediately aprt-3 dio501ut: .1on, so that after 2 and 6.5 hours of residence at iit * 0} samples are taken on which flactivltl1 atreptokinase is determined.
We get the following values
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<tb> Activity
<tb>
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after diso- 2 hours after 6.5 'hours lution dissolution oprèo disso- lvtion strer tokin &3e:.;. vcc' 3tubilicant 98 I 9S] l 9 3trpalno9o aat.s stabilizer 7tJ :: 70 '1, 1:
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fi iiCG, the solution remains stable for at least 6.5. hours, which out Io time required for a drip infusion 1i.lI! t.tU. the di.f.N1'onco pure report, A the quantity rilhe a game, dúJ: \ <; (, IHCjt'.to 11} rQ ttisoolutione post in the domoirie of pro1. 'bicn of the In ruîthodo de mesure omployde. jtrcptokln . sa: che.
A adds JUG m ;; of the stabilizer used in the example ih -i ul u'unc atropto: dn: 'J ± lo solution containing 2504000 int. <2:', 4 to! l1and the solution thus obtained and another solution of 3troptokii1lHla having the same concentration, But without the stabilizer acntiunndt dcna àt-o onpoulos of 1 rul, one lyophilizes ot in stores at 4V C The following table gives the results of the d4tur.inatiuri of the activity *
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Activity
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<tb> without <SEP> stabilizer <SEP> with <SEP> stabilizer
<tb>
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after dissolution 100 d 100 1- apr ;;: lyophilization 86 97% ûr, .3 3eaaines at 3'1 C b3,! 88 J? apr ':' ::; 7 scnaineo at; 3't C 70:
80 Çî bitter 26 serene on D7.C <52 '0 z
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The values obtained counter that atreptokinD34 is stabilized by the stabilizer 4 state, lyophilisa so that on storage of more than 6 are at 37 C. Without stabilizer, it is not found after 26 weeks to 3 days. 7 C that a thr1! S of Itactivity, male av the stabilizer, there remains o6 / of the activity of the initial product.
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tial.
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:., rLE ,. lu: JtrFtckina3ç: ùche {with combind stabilizer).
One dissolves 1 r. of L "Clut.r; 1 [sodium tfJ at 1 g of ata-b111: J.cnt used in 1 example 1, dinu 1UO ml of an aqueous solution of 3trertoinaDc having an activity of 150, OOG wiit43 int. pr. 1 We repeat this solution C!: The deu 4t: 1pt; ule. Of 1 ml on lys
<Desc / Clms Page number 11>
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Philise and we store the ampoules at 4 * 0 and 11 370-, one obtains an atreptokinase preparation which is stalled at 4 ° C for at least one year. * -. 8nje z the temperature of 9l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'loi the preparation retains its activity during mgiso as the activity strol) tolcïnoee presented in table
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next Activity
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atreptoldnase without stabilizer with stabilizer in solution 100 l 100 after lyophilization 86 98 iJ pria 15 ..Ie: .1I.tino:
J t. 1 "" 0 8 1 98 - 'aprîa ii acmaines to 3Î Q 6) 96 0-,
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These results prove that atreptokinase with atabilisunt) stored at ft7 "C for 8 evenings) retained its activity. Të.jfri.i Lft., Ii4, i Hewcastle virus (IIDV)
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(Atypical avian plague virus).
A centrifuge for 1 hour at 17 * 500 revolutions / minute,
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, lc; U ml of an egg liquid containing Hewcaatle virus and we take Newcastle virus, which we obtain in the form of a
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of the product
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sediment, in 100 ml of a 4.5 i / solution of gelutin degradation crosslinked with the nucleus of the hoxam6thylene-diiaocyanuto is obtained according to'l'example 1 of the allenond patent nl 1, .7..v.7; z.
Dilute 1 inl of this virus suspension with 255 ml of a physiological saline of sodium chloride and remove the two waves of the virus from this virus suspension at 4 * 0.
From a mohiùru anolonuo, we otock for 10 sec-Lnea 4'U tici fiCÎldixltl.lai'z: i c1u egg liquid containing virua do Uowcuatlo in a ca4 h the undiluted state4 l 'and (doua otter oatit dïlu6.1. $ 6 in physiological saline of go "dlun" chloride.
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. intervals of a serine, oh took a sample of each of 4 suspensions and we tstr, .rio the units! dr h6: no-ar, ': latin ± jtion according to t: 3t dt ij6: 11 (J-glut1nation. The rate of .rr.aw, ^ Iutination indicates the strongest dilution' of virus which fr ", vo (1.u :: another rlutii: r: ttraz des h;, 5rat3.a of chickeni The di- luti0 1:, 6 corresponds to the solution used polish the inhibition test of the h6o-Dlutination, containing 4 hrn units ..
8i :: ±: hltinL.ntcs; this test is Zn4raleir-nt used corariie method d.terra3.rmt, ur, Cra.o.t: s for the diagnosis of 1 <? disease of., srrcawt.s. It is right that this solution should be able to be stored for dct tcr.po 1; 1 "olvo (:, 10, pcrticuliài'emont for
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test, - * comparative.
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The following table gives the r <'ultato of these toistgo the values of the suspensions ::; tocl5e :; in the diludated state being rnulti .. plî4c.s by Z56.
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Cured without stabilizer with etabilisunt 9toc; a; e "undilutedA. Dl1u <1 l,: 56 ro1 '\ d1lu. D: lur:,; t" 259.
1 1024 ls1v 1J1U24. 1 s 1a4 2 1: 1024 1: 1024 1: 1024 l! Lù24 J 1: 1024 1:51 1: 1U24 1: 1024 4 11U24 1: 512 ltl024 1: '1024 5 1: 512 1:51 1: 1024. 1: 1024 6 1: 512 1: 512 1: 1024! RlO24 7 1 256 1: 1024 1: 1024 no a,; 7.u-. step 1: 1024 1: 512 9 tination net- d '; wr; lu- ltlO24 Z s 5xz toaent visible e t.nL3.on J.îi4 J. lu 1: 1024 1: 512
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The results show, that lrh,; o-rzp, 7.uinr: tiort of the undiluted suspension, containing Newcastle virus and otub11isnt, remains unchanged for 10 weeks, and that / au8 pension dtlu6 r deno a ratio of 1 & 5 (ruate inchung6e during '1 3') 'Min <ja <the draw opuHunf ltkwuu; 4; Iu.taion of the liquid cxcuu, t' 111./11 diluted where vtxuo do newoûatlai is reduced after 5 weeks? at half and apr63 ii Qemairle8 we can not
<Desc / Clms Page number 13>
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no more evidence of agglutination.
The egg liquida diluted in a ratio of Ii <d56 only preserves its agglutination title tjont) inot) t '.J # ft' & WfrîS ',', #. ##, The invention cuuprend in particular, '# - # '' 10) A proé6d6 'do stabilization of m;:, tiM:' biological tJ8- lacrit Lt'CtiV6H J cO: / 11V for example, bacteria ia9 products of m6tu 1? Tinr.lO La .: t. 1r1 on, viiiie, lçd sera and enzymes, pro i acian which is added 'To the biological substance') 1 ent active, * "ti> * 5 # tltuit QollucùJl, rljt1Qu6 avue un, d1U4rQrU1t h un poiJa l. (, l (l \ ldlrfl oo (, 1pr1a between about 1 !! <0 (.0 and 6Q # OQÔr c1lrdG, 1,, tr hydrolyao A un rc1da Included in addition to i and tf.cou, 4o prefer ''! ï'afice 50U <'1U, UCC) where from an oollagtne .l'.:,. 1.liJloll! FJnt. R (; ticu16 par un dl1avoyan "te and enouïte dGr: rHd, 1 by hyuulyau, \ Un 1) (, iUj Ino16culr! 11 "0 between cuwirÓ'n l5 ûUi uL.t. ': <:
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