" METHODE POUR SEPARER DES SUBSTANCES DE DIFFERENTES
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La présente invention est relative à une méthode pour séparer des substances de différentes dimensions molécu. laires à partir d'une solution dans laquelle la solution
est amenée en contact avec un lit de grains de gel capable d'exercer une action de sorption sélective sur les substances à partir de la solution, d'après leurs dimensions moléculaires, et des fractions des substances séparées sont successivement récupérées ou recueillies à partir du lit par élution au moyen d'un liquide.
Il a été précédemment proposé de séparer des substances de différentes dimensions moléculaires à partir
de solutions aqueuses à l'aide d'un lit de grains d'amipar
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procédé présente plusieurs inconvénients considérables,
dus principalement au fait que l'amidon est soluble dans l'eau à un certain degré, ainsi qu'à l'instabilité de l'amidon et à la résistance élevée à l'écoulement des colonnes d'amidon. En tenant compte de cela, l'amidon est toujours contenu comme une impureté dans les produits préparés qui sont séparés et le lit de grains d'amidon sera rapidement détérioré et deviendra une masse d'aspect
boueux. Pour ces motifs, ladite méthode est de peu d'importance pratique.
La présente invention a pour objet d'éliminer lesdits désavantages ou inconvénients et de prévoir un produit sous forme de gel et une méthode grâce à laquelle il est possible de mettre en oeuvre la séparation de façon efficace et d'une manière satisfaisante.
La méthode-_selon l'invention est caractérisée en
ce que la séparation est mise en oeuvre avec un lit de grains <EMI ID=3.1>
de gel d'un produit de co-polymérisation de substances organiques consistant en un réseau macroscopique tridimentionnel de molécules liées ensemble par des liaisons covalentes sous la forme de ponts éther, de préférence du type
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lesdits grains de gel étant insolubles dans le solvant mais capables de gonfler dedans et non chargés ou exempts et
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Il a été prouvé qu'un gel de ces composition et structure est hautement stable et durable et possède une capacité de séparation élevée et qu'en outre il est également possible de faire varier cette capacité de séparation dans de grandes limites.
En général, la séparation selon l'invention est convenablement mise en oeuvre de la façon suivante : on charge une solution aqueuse des substances de différentes dimensions moléculaires qui doivent être séparées,
sur le dessus d'un lit de grains de gel gonflé de la sorte sus-mentionnée sous la forme d'une colonne, immergée dans un milieu aqueux, on extrait le liquide de la colonne afin d'amener la solution en contact avec le lit de grains de gel, ce par quoi les substances de différentes dimensions moléculaires dans la solution sont distribuées ou réparties de façon différente entre les grains de gel et la solution enrobante par suite de leur capacité différente
à pénétrer à l'intérieur des grains de gel, d'après leurs dimensions moléculaires, ensuite on charge un liquide aqueux-liquide d'élution dans le lit afin de déplacer le liquide dudit lit et l'on récupère les fraction successives du liquide déplacé, l'effluent s'écoulant du lit, ce par quoi l'on obtient une fraction qui contient la majeure partie de la substance de dimension moléculaire plus grande et une fraction ultérieure contenant la majeure partie de la substance de dimension moléculaire plus petite.
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lution aqueuse" , de même que "milieu aqueux" et "liquide aqueux" utilisée dans la présente description, signifie que l'eau est le principal composant solvant mais qu'il peut contenir également une-certaine quantité de solvant organique soluble dans l'eau, tel que alcools et cétones, par exemple des alcools et des cétones aliphatiques inférieurs. Il doit être également entendu que le "milieu aqueux" et le "liquide aqueux", respectivement, peuvent consister non seulement en le solvant contenant de l'eau, mais qu'ils peuvent également contenir une certaine quantité de substances dissoutes, par exemple des sels, afin de produire et de maintenir une force ionique convenable dans le liquide ou des substances-tampon pour donner un pH approprié. Des exemples de la première sorte de substances sont le chlorure de sodium et le sulfate d'ammonium et, des
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l'eau, l'acide acétique, les acides chloracétiques, l'acide chlorhydrique et la pyridine.
La capacité des produits sous forme de gel susmentionnés de gonfler en milieu aqueux est due à la présence des groupes hydroxyliques et à la présence des ponts éther. Cette capacité de gonflement du produit sous forme de gel peut être exprimée par la quantité d'eau en gram-
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selon l'invention peut 8tre compris dans la marge allant d'environ 1 à 50 g/g du produit sous forme de gel sec, mais est généralement compris dans la marge allant d'environ 1,0 à 20 g/g du produit sous forme de gel sec.
Les substances sous forme de gel%de la sorte susmentionnés peuvent être obtenues par polymérisation de substances non chargées organiques contenant des groupes hydroxyliques, avec des substances organiques à fonction double contenant des atomes d'halogène et/ou des groupes époxy. Comme exemples de substances contenant des groupes hydroxyliques appropriées pour cette réaction, on peut cite:
les polysaccharides, par exemple dextrane, amidon, dextrine, cellulose, polyglucose, ou des dérivés contenant des groupes hydroxyliques de ces substances, par exemple l'éthylhydroxyéthyl-cellulose, ou des produits obtenus par une dépolymérisation partielle des mêmes, aussi bien que des fractions desdits, en outre l'alcool polyvinylique, le sucre (alcools) par exemple la sorbite, et les hydrates
de carbone, par exemple le saccharose.
Des exemples appropriés de composés à fonction double pour cette réaction sont l'épichlorhydrine, la dichlorhydrine, le diépoxy-butane, l'éther bis-époxy-propylique, l'éther éthylène-glycol-bis-époxypropylique et l'éther 1,4-butane-diol-bis-époxypropylique.
La co-polymérisation desdites substances organiques contenant des groupes hydroxyliques et desdites substances à fonction double se produit facilement en faisant réagir les composants en solution aqueuse en présence d'une substance à réaction alcaline comme catalyseur.
Par exemple, un produit sous forme de gel excelemment approprié pour l'objet de l'invention peut être obtenu en faisant réagir du dextrane ayant un poids moléculaire moyen compris dans la marge allant de 5.000 à 100.000.
avec de l'épichlorhydrine ce qui donne un produit de co-
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de restes de glucose à liaison alpha-l,6-glycosidique liées
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me de gel sec.
Un autre exemple est un produit sous forme de gel produit en faisant réagir de la dextrine commerciale avec de l'épichlorhydrine d'en résulte un produit de co-polymérisation consistant en un réseau macroscopique tridimentionnel constitué par des liaisons principalement de restes de glucose à liaison alpha-l,4-glycosidique liées ensemble
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gel a une teneur en groupe hydroxylique d'au moins 15% en poids du gel sec et un regain d'eau comparativement faible compris sensiblement dans les limites de 1 à 20 g/g du produit sous forme de gel sec.
De même, un produit sous forme de gel de la même
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le de pomme de terre et d'pichlorhydrine, mais ce gel a un regain d'eau plus élevé dans les limites de 10-50 g/g
du produit sous forme de gel sec.
En outre, un produit sous forme de gel approprié
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de l'épichlorhydrine. On obtient ainsi un produit de copolymérisation consistant en un réseau macroscopique tridimentionnel de restes de sorbite liés ensemble par
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teneur en groupes hydroxylicues d'environ 15% du poids du gel sec et un regain d'eau compris dans la marge allant
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l'utilisation dans les cas où le gel peut venir en contact avec un liquide d'uhe acidité relativement élevée, par exemple lorsque l'on utilise l'acide chlorhydrique comme substance-tampon.
Les produits sous forme de gel sus-mentionnés utilisés dans la méthode ou procédé selon l'invention pour préparer le lit de gel sont pulvérisés jusqu'à une dimension de particules allant de 0,01 à 2,0 mm, par exemple allant d'environ 0,05 à 0,5 mm, de préférence jusqu'à une dimension de particules de 0,84 à 0,074 mm.
La capacité de séparation des grains de gel dépend, d'une part, des dimensions moléculaires des substances qui doivent Être séparées et, d'autre part, des dimensions des pores ou dimensions particulaires dans le réseau tridimentionnel du produit sous forme de gel. Les substances présentes dans la solution aqueuse, dont les dimensions moléculaires sont trop grandes pour permettre une pénétration à l'intérieur des grains de gel, restent dans la solution et passent à travers le lit de grains de gel et sont récupérées dans la première fraction (ou les premières frac-
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res suffisamment petites pour permettre une pénétration à l'intérieur des grains de gel sont momentanément retenues par les grains, permettant ainsi une séparation des molécules de dimension plus grande, et sont alors récupérées dans une fraction ultérieure.
Comme sus-indiqué, le lit de grains de gel est de préférence disposé sous la forme d'une colonne et la mise
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utilise une colonne va �tre maintenant décrite à titre d'exemple.
L'appareil peut convenablement consister en un tube cylindrique fermé dans le bas par un disque ou une plaque poreuse, c'est-à-dire par une plaque de verre fritté, servant de support pour le lit de gel et comportant au-des-sus des dispositifs d'alimentation pour la solution des substances de différentes dimensions moléculaires qui doivent �tre traitées et en liquide destiné au déplacement de ladite solution au moyen du liquide d'élution de la colonne.
Les particules de gel, dont la dimension et le regain d'eaupont choisis avec considération attentive quant au but de séparation en question, doivent être tassées dans la colonne aussi fortement que possible et en une quantité telle qu'elles retiennent la plus grande partie du volume de tassement total, tandis que le reste du volume de tassement constitue ce que l'on appelle le "volume de vide", c'est-à-dire le volume total des espaces entre les grains
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exemple.
La quantité calculée de gel de distribution parti-
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-nir un équilibre, et elle est alors agitée de façon à former une suspension uniforme. On verse cette suspension dans le tube qui a déjà été partiellement rempli avec de l'eau. Pendant l'opération de tassement, on laisse s'écouler l'eau hors de la colonne à une vitesse uniforme. Pendant ce processus, on peut observer que le lit tassé grandit vers le haut en présentant un niveau supérieur net au-dessus duquel les grains de gel ont constamment des mouvements de convection.
Lorsque le lit est lassé, il faut prendre soin que sa couche supérieure soit aussi égale que possible.
On admet alors l'eau à couler au travers du lit jusqu'à ce que la couche supérieure de celui-ci soit près de disparaître dans le lit. Le courant est alors interrompt;:
et la solution-aqueuse à séparer est soigneusement répandue en une couche sur le haut du lit, après quoi le courant à travers le lit est remis.en marche - à partir de ce moment, le liquide qui s'écoule hors de la colonne est dénommé l'effluent- jusqu'à ce que la solution soit près de disparaître dans le lit.
Après cela, le liquide d'élution, généralement
de l'eau, ou éventuellement de l'eau contenant des substances-tampon, est répandue en une couche sur le haut ou sommet du lit et le courant à travers le lit peut commencer
à couler. La première partie ou portion de l'effluent est constituée par de l'eau jusqu'à ce qu'un volume, correspondant sensiblement au volume de vide, ait été déplacé; alors les plus grandes molécules qui sont incapables de pénétrer à l'intérieur des grains de gel apparaissent dans l'effluent et sont récupérées en une ou plusieurs fractions et ensuite - éventuellement après un intervalle pendant lequel l'effluent est constitué par de l'eau- les plus petites molécules, qui ont été momentanément retenues physiquement dans les grains de gel, apparaissent dans l'ef-
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et finalement l'effluent est constitué d'eau. Le lit se trouve alors dans son état original et la séparation d'une nouvelle quantité de solution peut-être immédiatement mise en route.
Il est possible, de cette façon, d'obtenir des fractions qui contiennent la majeure partie, des - ou consistent uniquement en les - substances ayant les plus grandes dimensions moléculaires, et d'autres fractions qui contiennent la majeure portion des - ou consistent uniquement en les - s ubstances de la plus petite dimension moléculaire.
Cependant, afin d'obtenir une séparation efficace
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substances à séparer ne soit pas charge dans le lit de gel en une quantité dépassant la quantité ( = volume) <EMI ID=22.1>
tité d'eau peut être exprimée par la formule a.RE, dans laquelle � est le poids de grains de gel sec et RE le regain d'eau. En conséquence, ladite ouantité de solution aqueuse contenant les substances à séparer doit être fournie au lit en un volume maximum de a.RE, et de préférence en un volume inférieur .
En outre, il est important que la vitesse d'écoulement de la solution à travers le lit de grains de gel
ne soit pas trop élevée. Il a été prouvé que, d'après
les conditions, la vitesse linéaire d'écoulement peut s'élever jusqu'à 10 cm/minute, mais il est préférable qu'elle ne dépasse pas 7-cm/minute.
Dans la description sus-mentionnée, on a fait seulement état d'une manière intermittente de travailler pour l'appareil, mais le procédé peut être convenablement mis
en oeuvre en opérant de façon continue par cycles, par exemple de la manière suivante. Lorsqu'un volume, égal au volume de vide, de la fraction contenant les plus petites molécules est encore dans la colonne, la solution aqueuse des substances à séparer dans le cycle suivant peut être fournie ou chargée sur le haut du lit.
Selon une certaine façon d'opérer, une colonne d'eau est constamment maintenue au sommet du lit et la solution aqueuse avec les substances à séparer est chargée
à la partie inférieure de ladite colonne d'eau immédiatement au-dessus du niveau supérieur du lit de grains de
gel où elle forme une couche déplaçant l'eau vers le haut, par suite de la plus forte densité de ladite solution aqueuse .
Il a été prouvé qu'un lit de grains de gel tel que décrit ci-dessus même après avoir été utilisé pendant des années, n'a montré aucun signe de détérioration.
Lors de la mise en oeuvre du procédé à une échelle industrielle, il peut être avantageux d'effectuer seulement une séparation partielle dans chaque cycle et de retenir seulement les fractions qui contiennent une substance pure, c'est-à-dire seulement une des substances à séparer, tandis que les autres fractions, qui contiennent un mélange desdites substances, sont retournées à la colonne afin d'y être de noùveau introduites avec une quantité de la solution dans un cycle ultérieur.
La méthode selon l'invention peut être appliquée pour séparer des substances ayant des dimensions moléculaires variant fortement, la différence dans les dimensions moléculaires correspondant à une différence en poids moléculaire d'au moins 100. Le gel à utiliser pour la séparation est choisi eu égard au but en question, c'est-à-dire les substances à séparer, la capacité de séparation désirée et la vitesse d'écoulement à travers le lit de grains de gel.
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substances colloïdales de substances cristalloides, par exemple pour séparer des sels, tels que chlorure de sodium ou sulfate d'ammonium, de solutions contenant des colloïdes, également des colloïdes labiles, par exemple des colloïdes d'origine biologique tels que des protéines, par exemple enzymes ou virus. D'autres exemples de substances qui peuvent être purifiées, c'est-à-dire séparées d'impuretés de diverses dimensions moléculaires, de cette façon, sont des
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daux et des dispersions aqueuses de polymères produits par ce que l'on appelle "pplymérisation en émulsion".
La méthode est spécialement de valeur pour séparer des substances de poids moléculaire supérieur à 500, par exemple supérieur à 1000, étant donné que de telles substances sont souvent très difficiles à séparer par d'autres méthodes La méthode peut aussi être appliquée au fractionne-
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séparer des homologues polymères de différents poids moléculaires, par exemple pour fractionner des polymères solubles dans l'eau tels que dextrane, ou dextrane partielle-
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lène-glycols, ou dérivés de tels polymères.
Il peut souvent aussi être avantageux d'appliquer cette méthode de séparation pour traiter des protéines
ou des polypeptides, par exemple des protéines du plasma, des enzymes, telles que pepsine ou une enzyme pancréatique, ou des hormones, par exemple l'insuline, ou des mélanges contenant des polysaccharides, par exemple polysaccharides bâterions, tels que le dextrane, et des polysaccharides animaux , par exemple l'héparine, en outre vitamines, antibiotiques et alcaloïdes .
Lorsque l'on utilise la méthode pour séparer des mélanges très complexes, par exemple des solutions obtenues à partir de matières biologiques, il peut être seulement possible d'obtenir une séparation en groupe, après quoi il faut appliquer d'autres méthodes pour une séparation plus poussée et une purification.
Dans quelques cas, il peut être désirable de changer le milieu ion pour les substances qui ne sont pas capables de pénétrer à l'intérieur des grains de gel, afin de faciliter la purification ultérieure de la substance ou des substances en question. Par exemple, il est possible de changer ou modifier rapidement le pH et la force ionique pour une solution de protéine, ce qui présente une très grande importance pour la purification et la séparation de telles substances. Cela peut être effectué en faisant passer la solution de protéine à travers le lit de gel dans lequel le milieu aqueux contient les substances-tampon requides pour le ghangement du pH.
L'application de la méthode selon l'invention va maintenant être décrite plus en détail dans les exemples suivants, qui ne sont pas limitatifs.
EXEMPLE 1.-
Un tube ayant un diamètre de 3,5 cm et une hauteur
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grains de gel gonflés par l'eau (dimension particulaire à l'état sec de 0,149 à 0,074 mm, regain d'eau 2,6 g/g du gel sec = RE 2,6) produit paf réaction entre du dextrane ayant un poids moléculaire moyen (PM moyen) de 40 000 et de l'épichlorhydrine, Le tube a été rempli partiellement avec de l'eau avant qu'on l'alimente ou charge en grains de gel, de sorte que les grains étaient immergés dans l'eau.
Pendant l'opération de tassement, on a fait s'écouler l'eau hors du tube à une vitesse uniforme jusqutà ce que le niveau supérieur de l'eau soit près de disparaître dans le lit de gel tassé. Le volume total du lit de gel tassé était de 390 ml et le volume de vide était de 130 ml. On a alors chargé le lit avec 5 ml d'un solution aqueuse contenant
10% de dextrane pharmaceutique (PM moyen.= 75 000) et 10% de glucose, après quoi on a procédé à l'élution avec de
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a été récupéré ou collecté au moyen d'un collecteur de
en fractions
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ment. La première portion de 130 ml de l'effluent, correspondant au volume de vide, contenait de l'eau. Dans les limites comprises entre 130 et 170 ml, l'effluent contenait du dextrane, et dans les limites comprises entre
240 et 330, du glucoses Le rendement a été quantitatif.
EXEMPLE 2.-
Dans la même colonne que celle utilisée dans l'exemple 1, on charge 15 ml d'une solution aqueuse contenant 0,18 g d'hémoglobine et 4,5 g de sulfate d'ammonium.
On procède alors à l'élution avec de l'eau à une vitesse de 66 ml à l'heure. Entre 130 et 230 ml on a obtenu de
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a
fate d'ammonium. Le rendemant7été quantitatif.
EXEMPLE 3 . -
Dans une colonne tubulaire ayant un diamètre de 7,2 cm et une hauteur de 50 cm on a tassé, de la même manière que dans l'exemple 1, 300 g (extrait sec) de grains de gel gonflés par l'eau. (dimension particulaire à l'état sec de 0,297 à 0,149 mm; RE 4,9) produits par réaction entre dextrane (PM moyen = 40 000) et épichlorhydrine. Le volume total du lit de gel a été de 2 000 ml. Le volume de vide a été de 650 ml. On a chargé le lit avec 100 ml
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avec PM moyen = 4 000 après quoi on a procédé à l'élution avec de l'eau à une vitesse de 240 ml à l'heure. On a rejeté de lteffluent la première portion de 650 ml correspondant au volume de vide, après quoi au moyen d'un collecteur de fraction, on a récupéré 100 fractions de 17 ml . La quantité d'hydrate de carbone dans chaque fraction a été déterminée par réaction avec de l'anthrone. Les fractions al lant du numéro 8 au numéro 95 inclus contenaient l'hydrate
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de PM moyen inférieur ou au plus égal au PM moyen) a été déterminé toutes.les 5 fractions où la substance était en quantité suffisante et l'on a obtenu les séries de valeurs suivantes:
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Dans une colonne tubulaire d'un diamètre de 2 cm et d'une hauteur de 40 cm on a tassé de la même manière que dans l'exemple 1, 7 g (extrait sec) de grains de gel (RE
<EMI ID=35.1> de pH 7. La substance sous forme de gel a été produite par réaction entre de l'éthylhydroxyéthyl-cellulose et de l'éther éthylène-glycol-bis-époxypropylique. Le volume total du lit
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chargé le lit avec 5 ml d'une solution aqueuse de 60 mg
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de phosphate, après quoi on a procédé à l'élution avec un tampon de phosphate Ni/10 de pH 7. Il apparaît successivement dans l'effluent 40-55 ml de tampon phosphaté contenant de l'hémoglobine, puis 55-105 ml de tampon phosphaté contenant du sulfate d'ammonium.
EXEMPLE 5.-
Dans une colonne ayant un diamètre de 4 cm et une hauteur de 26 cm on a tassé de la même manière que dans l'exemple 1, 15 g (extrait sec) de grains de gel gonflés par l'eau (RE 16,0) produits par réaction entre alcool polyvinylique et épichlorhydrine. Le volume total du lit de grains de gel fut de 330 ml et le volume de vide de 120 ml. Afin de déterminer jusqu'à quel degré il était possible de fractionner le dextrane, c'est-à-dire de séparer les substances dextraniques polydispersées, on a déterminé la distribution de 4 substances dextraniques en 4 expériences séparées.
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stance en question dissous dans l'eau ont été chargés dans la colonne et l'on procéda à l'élution avec de l'eau à une vitesse de 20 ml à l'heure au cours des quatre expériences. Le liquide effluent de la colonne fut récupéré en fractions au moyen d'un collecteur de fraction, Dans les deux premières expériences avec des substances dextranioues d'un poids moléculaire moyen de PM moyen = 1 800 000 et = 300 000, respectivement, le dextrane apparut dans l'effluent après rejet d'un volume d'effluent correspondant au volume de video
Dans la troisième expérience qui fut mise en oeuvre avec une substance dextranique de PM moyen = 40 000, la portion principale du dextrane fut contenue dans l'effluent après rejet d'une quantité correspondant au volume de vide, et une portion plus petite arriva ensuite. Dans la quatrième expérience avec une substance dextranique de PM moyen
- 20 000, une portion inférieure du dextrane apparut dans l'effluent après rejet d'une quantité d'effluent correspondant au volume de vide et la portion principale de dextrane arriva ensuite.
Comme il ressort de cette expérience, il est possible par cette méthode de séparer (fractionner) de telles substances dextraniques en au moins deux groupes, l'un d'un poids moléculaire supérieur à 20 000 - 40 000 et l'autre d'un poids moléculaire inférieur à 20 000 - 40 000.
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Dans une colonne d'un diamètre de 4 cm on a tassé
32 g (extrait sec) de grains de gel (dimension particulaire de 0, 149 à 0,074 ; RE 6) produits par réaction entre amidon et 1,3-dichlorohydrine de la glycérine. Le volume total du lit de gel fut de 314 ml.Dans la colonne on introduisit 5 ml d'une solution aqueuse contenant 200 mg d'albumine de sérum humain et 200 mg de chlorure de sodium. Le lit
fut soumis à l'élution avec de l'eau à une vitesse de 120 ml à l'heure et l'on récupéra des fractions de 5,5 ml. L'albumine apparut dans le produit d'élution entre 95-140 ml et le sel entre 270 et 330.
EXEMPLE 7.-
Dans une colonne d'un diamètre de 3 cm on a tassé jusqu'à une hauteur de 45 cm une poudre de gel gonflé (di- mension particulaire de 0,074 à 0,03 mm; RE 4,9) produite par réaction entre du dextrane (PM moyen = 40 000) et de l'épichlorhydrine. Le lit de la substance sous forme de
gel a été lavé avec un tampon phosphaté ( force ionique 0,03 de PH 7,03) jusqu'à atteindre l'équilibre. Alors on
a introduit dans le lit 25 ml de sérum humain frais puis on introduisit le tampon phosphaté. L'effluent fut récupéré en fractions de 7 ml au moyen d'un collecteur de fraction qui changeait de tube toutes les 15 minutes, donnant une vitesse
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LOWRT), les amino-acides, les peptides et les nuoléotides furent déterminées dans chaque fraction (les peptides au moyen de ninhydrine et les nucléotides par absorption des UV.). La protéine fut obtenue dans les fractions de numéros 5 à 12, les peptides et les amino-acides dans les fractions de numéros 20 à 40, et les nucléotides dans les fractions de numéros 42 à 60.
EXEMPLE 8.-
On a tassé un lit de dimensions 3 x 22 cm avec des grains de gel gonflés (RE 4,5) produit par réaction entre dextrane et épichlorhydrine. On fit deux expériences afin de déterminer l'influence du degré d'association de l'insuline sur sa sorption par les grains de gel et ses déplacement et élution des grains:
a) Le lit fut mis en équilibre avec un tampon d'acétate M.1 de pH 3,95. Alors 1 ml d'insuline à 0,51% dans un tel tampon fut chargé dans le lit et il fut soumis à <EMI ID=41.1>
ent entre 55 et 65 ml.
b) Le lit fut rr.�s en équilibre avec lui d'acide di- <EMI ID=42.1>
d'une solution à 0,42% d'insuline et il fut soumis à l'élution avec la solution d'acide dichloroacétique. Dans ce cas, l'insuline fut contenue dans l'effluent entre 80 et 100 ml.
EXEMPLE 9.-
Un lit de dimensions 4 x 37 cm a été tassé àvec
des grains de.gel (dimension particulaire de 0,149 à 0,074 mm; RE 4,2) produits par réaction entre dextrane (PM moyen = 20 000) et épichlorhydrine. Le lit fut lavé avec un tam- <EMI ID=43.1>
5 ml d'une solution aqueuse contenant 0,11% de polymyxine B (antibiotique) et ensuite un tampon phosphaté M/10 à une vitesse de 101 ml à l'heure. La polymyxine sort du lit entre 350 et 400 ml.
Dans une autre expérience on charge dans le lit
5 ml d'une solution contenant 0,15% de polymyxine et 1% de dextrane-sulfate de sodium (PM moyen = 1 000 000) et
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à l'heure. Le complexe de polymyxine et de sulfate de dextrane sort du lit ensemble avec le sulfate de dextrane ou sulfate dextranique entre 200 et 250 ml.
EXEMPLE 10.-
Dans-une colonne ayant un diamètre de 1,5 cm et
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par l'eau (dimension particulaire de 0,149 à 0,074; RE 2,7) produits par co-polymérisation de dextrane (PM moyen =
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du lit de gel fut de 36 ml. A l'intérieur du lit on introduisit 1 ml d'une solution aqueuse contenant 10 mg d'albumine de sérum humain et 100 mg de chlorure de sodium. Le lit fut soumis à l'élution par l'eau à une vitesse de
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furent récupérées au moyen d'un collecteur de fraction. ]L'albumine apparut dans les fractions 5 et 6 et le sel dans les fractions 8 à 10 .
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Dans la même colonne que dans l'exemple 10 on a tassé des grains de gel (dimension particulaire de 0,149
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et épichlorhydrine. Le volume total du lit fut de 35 ml.
A l'intérieur de la colonne on introduisit 1 ml d'une solution aqueuse contenant 10 mg d'albumine de sérum humain et
<EMI ID=50.1> tion avec de l'eau à une vitesse de 36 ml à l'heure et des fractions contenant chacune 3 ml furent recuprées. L'albu-
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EXEMPLE 12 . -
Dans une colonne ayant un diamètre de 1,5 cm et une hauteur de 22 cm on a tassé des grains de gel (dimen-
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réaction entre amidon et éther bis-époxypropylique. Le volume total du lit fut de 36 ml. A l'intérieur du lit, on introduisit 1 ml d'une solution aqueuse contenant 10 mg d'albumine de sérum humain et 100 mg de chlorure de sodium. Le lit fut soumis à l'élution avec de l'eau à une vitesse de 120 ml à l'heure et des fractions de 3 ml furent récupérées. L'albumine apparut dans les fractions 4 à 6 et
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EXEMPLE 13.-
Dans la même colonne que dans l'exemple 12, on a tassé des grains de gel (dimension particulaire de 0,297 à 0,052 mm; RE 1,6) produits par réaction de dextrane sur le 1,2,3,4-diépoxybutane. Le volume total du lit de gel fut de 35 ml . A l'intérieur du lit fut introduit 1 ml d'une solution aqueuse contenant 10 mg d'albumine de sérum humain et 100 mg de chlorure de sodium. Le lit fut soumis à l'élution avec de l'eau à une vitesse de 7 ml à l'heure et des fractions contenant 3,5 ml chacune furent récupérées ou recueillies. L'albumine apparut dans les fractions 4 et 5 et le sel dans les fractions 8 à 10.
EXEMPLE 14.-
Dans une colonne ayant un diamètre de 3 cm on a tassé des grains de gel (dimension particulaire de 0,149
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et éther 1,4-butane-diol-diépoxypropylique. Le volume to-
"METHOD FOR SEPARATING SUBSTANCES FROM DIFFERENT
<EMI ID = 1.1>
The present invention relates to a method for separating substances of different molecular dimensions. lares from a solution in which the solution
is brought into contact with a bed of gel grains capable of exerting a selective sorption action on the substances from the solution, according to their molecular dimensions, and fractions of the separated substances are successively recovered or collected from the reads by liquid elution.
It has previously been proposed to separate substances of different molecular dimensions from
aqueous solutions using a bed of amipar grains
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process has several considerable drawbacks,
mainly due to the fact that starch is soluble in water to a certain degree, as well as the instability of starch and the high resistance to flow of starch columns. Taking this into account, the starch is still contained as an impurity in the prepared products which are separated and the starch grain bed will quickly deteriorate and become a bulk in appearance.
muddy. For these reasons, said method is of little practical importance.
The object of the present invention is to eliminate said disadvantages or disadvantages and to provide a product in the form of a gel and a method by which it is possible to carry out the separation in an efficient and satisfactory manner.
The method-_according to the invention is characterized by
that the separation is implemented with a grain bed <EMI ID = 3.1>
gel of a product of the co-polymerization of organic substances consisting of a three-dimensional macroscopic network of molecules linked together by covalent bonds in the form of ether bridges, preferably of the type
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said gel grains being insoluble in the solvent but capable of swelling therein and uncharged or free and
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It has been proved that a gel of these composition and structure is highly stable and durable and has a high separation capacity, and furthermore it is also possible to vary this separation capacity within wide limits.
In general, the separation according to the invention is suitably carried out as follows: an aqueous solution is charged with substances of different molecular dimensions which must be separated,
on top of a bed of gel grains swelled of the above-mentioned kind in the form of a column, immersed in an aqueous medium, the liquid is extracted from the column in order to bring the solution into contact with the bed gel grains, whereby substances of different molecular sizes in the solution are distributed or distributed differently between the gel grains and the coating solution due to their different capacity
to penetrate inside the gel grains, according to their molecular dimensions, then an aqueous liquid-eluting liquid is loaded into the bed in order to displace the liquid from said bed and the successive fractions of the displaced liquid are recovered , the effluent flowing out of the bed, whereby a fraction is obtained which contains the major part of the substance of larger molecular size and a subsequent fraction containing the major part of the substance of smaller molecular size.
<EMI ID = 6.1>
Aqueous solution ", as well as" aqueous medium "and" aqueous liquid "used in the present description, mean that water is the major solvent component but that it may also contain some amount of organic solvent soluble in the water. water, such as alcohols and ketones, for example alcohols and lower aliphatic ketones. It should also be understood that the "aqueous medium" and "aqueous liquid", respectively, may consist not only of the solvent containing water , but they may also contain a certain amount of dissolved substances, for example salts, in order to produce and maintain a suitable ionic strength in the liquid or buffer substances to give an appropriate pH. Examples of the first kind substances are sodium chloride and ammonium sulphate and,
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water, acetic acid, chloroacetic acids, hydrochloric acid and pyridine.
The ability of the above gel products to swell in an aqueous medium is due to the presence of hydroxyl groups and the presence of ether bridges. This swelling capacity of the product in gel form can be expressed by the amount of water in grams.
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according to the invention can be included in the margin ranging from approximately 1 to 50 g / g of the product in the form of a dry gel, but is generally included in the margin ranging from approximately 1.0 to 20 g / g of the product under dry gel form.
The above-mentioned gel substances% of the kind can be obtained by polymerization of uncharged organic substances containing hydroxyl groups, with double-functional organic substances containing halogen atoms and / or epoxy groups. As examples of substances containing hydroxyl groups suitable for this reaction, we can cite:
polysaccharides, for example dextran, starch, dextrin, cellulose, polyglucose, or derivatives containing hydroxyl groups of these substances, for example ethylhydroxyethyl cellulose, or products obtained by partial depolymerization of the same, as well as of fractions said, in addition polyvinyl alcohol, sugar (alcohols) for example sorbite, and hydrates
carbon, for example sucrose.
Suitable examples of double-functional compounds for this reaction are epichlorohydrin, dichlorohydrin, diepoxy-butane, bis-epoxy-propyl ether, ethylene-glycol-bis-epoxypropyl ether and 1,4-ether. -butane-diol-bis-epoxypropyl.
The co-polymerization of said organic substances containing hydroxyl groups and said dual-functional substances easily occurs by reacting the components in aqueous solution in the presence of an alkaline reacting substance as a catalyst.
For example, a product in the form of a gel excellently suitable for the subject of the invention can be obtained by reacting dextran having an average molecular weight within the range of 5,000 to 100,000.
with epichlorohydrin which gives a product of co-
<EMI ID = 9.1> dimensional consisting mainly of connections
alpha-1,6-glycosidic linked glucose remnants
<EMI ID = 10.1>
me of dry gel.
Another example is a gel product produced by reacting commercial dextrin with epichlorohydrin results in a co-polymerization product consisting of a three-dimensional macroscopic network consisting of bonds mainly of bonded glucose residues. alpha-l, 4-glycosidic linked together
<EMI ID = 11.1>
The gel has a hydroxyl group content of at least 15% by weight of the dry gel and a comparatively low water regain of substantially within the range of 1 to 20 g / g of the product as a dry gel.
Likewise, a product in gel form of the same
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the potato and pichlorohydrin, but this gel has a higher water recovery within the limits of 10-50 g / g
of the product as a dry gel.
In addition, a product in the form of a suitable gel
<EMI ID = 13.1>
epichlorohydrin. A copolymerization product is thus obtained consisting of a three-dimensional macroscopic network of sorbit residues linked together by
<EMI ID = 14.1>
hydroxylic group content of about 15% of the weight of the dry gel and a regain of water within the range from
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use in cases where the gel may come into contact with a liquid of relatively high acidity, for example when hydrochloric acid is used as a buffer substance.
The above-mentioned gel products used in the method or process according to the invention for preparing the gel bed are sprayed down to a particle size ranging from 0.01 to 2.0 mm, for example ranging from about 0.05 to 0.5 mm, preferably up to a particle size of 0.84 to 0.074 mm.
The separation capacity of the gel grains depends, on the one hand, on the molecular dimensions of the substances which are to be separated and, on the other hand, on the dimensions of the pores or particle dimensions in the three-dimensional network of the product in gel form. The substances present in the aqueous solution, the molecular dimensions of which are too large to allow penetration into the interior of the gel grains, remain in the solution and pass through the bed of gel grains and are recovered in the first fraction ( or the first frac-
<EMI ID = 16.1>
Res small enough to allow penetration into the interior of the gel grains are momentarily retained by the grains, thus allowing a separation of molecules of larger dimension, and are then recovered in a subsequent fraction.
As indicated above, the bed of gel grains is preferably arranged in the form of a column and the setting
<EMI ID = 17.1>
uses a column will now be described as an example.
The apparatus may suitably consist of a cylindrical tube closed at the bottom by a disc or a porous plate, that is to say by a plate of sintered glass, serving as a support for the bed of gel and comprising above addition to supply devices for the solution of substances of different molecular dimensions which must be treated and in liquid intended for the displacement of said solution by means of the elution liquid from the column.
The gel particles, the size and water regain of which are chosen with careful consideration as to the separation purpose in question, should be packed into the column as tightly as possible and in such an amount as to retain most of the material. total packing volume, while the remainder of the packing volume is called the "void volume", i.e. the total volume of the spaces between the grains
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example.
The calculated amount of partial distribution gel
<EMI ID = 19.1>
- to achieve equilibrium, and it is then stirred so as to form a uniform suspension. This suspension is poured into the tube which has already been partially filled with water. During the tamping operation, water is allowed to flow out of the column at a uniform rate. During this process, it can be observed that the packed bed grows upward presenting a net upper level above which the gel grains constantly convect.
When the bed is tired, care should be taken that its top layer is as even as possible.
Water is then allowed to flow through the bed until the top layer of the bed is close to disappearing into the bed. The current is then interrupted ;:
and the aqueous-solution to be separated is carefully spread in a layer over the top of the bed, after which the flow through the bed is turned back on - from this point on, the liquid which flows out of the column is referred to as the effluent - until the solution is close to disappearing into the bed.
After that, the elution liquid, usually
water, or possibly water containing buffer substances, is spread in a layer on the top or top of the bed and the flow through the bed can begin
to flow. The first part or portion of the effluent is constituted by water until a volume, corresponding substantially to the void volume, has been displaced; then the larger molecules which are unable to penetrate inside the gel grains appear in the effluent and are collected in one or more fractions and then - possibly after an interval during which the effluent consists of water - the smallest molecules, which have been momentarily physically retained in the gel grains, appear in the ef-
<EMI ID = 20.1>
and finally the effluent consists of water. The bed is then in its original state and the separation of a new quantity of solution can be immediately started.
It is possible, in this way, to obtain fractions which contain the major part, of - or consist only of - substances having the largest molecular dimensions, and other fractions which contain the major part of - or consist only of in the - substances of the smallest molecular dimension.
However, in order to achieve effective separation
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substances to be separated is not loaded into the gel bed in an amount exceeding the amount (= volume) <EMI ID = 22.1>
tity of water can be expressed by the formula a.RE, in which � is the weight of dry frost grains and RE is the water regain. Accordingly, said quantity of aqueous solution containing the substances to be separated should be supplied to the bed in a maximum volume of a.RE, and preferably in a lower volume.
In addition, it is important that the flow rate of the solution through the bed of gel grains
not too high. It has been proven that according to
under the conditions, the linear flow velocity can be up to 10 cm / minute, but it is preferable that it does not exceed 7-cm / minute.
In the above-mentioned description, it has only been reported intermittently to work for the apparatus, but the method can be suitably carried out.
carried out by operating continuously in cycles, for example as follows. When a volume, equal to the void volume, of the fraction containing the smallest molecules is still in the column, the aqueous solution of the substances to be separated in the next cycle can be supplied or loaded onto the top of the bed.
According to a certain way of operating, a column of water is constantly maintained at the top of the bed and the aqueous solution with the substances to be separated is charged.
at the lower part of said water column immediately above the upper level of the grain bed of
gel where it forms a layer displacing water upwards, due to the higher density of said aqueous solution.
It has been proven that a gel grain bed as described above, even after being used for years, has shown no signs of deterioration.
When carrying out the process on an industrial scale, it may be advantageous to carry out only a partial separation in each cycle and to retain only those fractions which contain a pure substance, i.e. only one of the substances. to be separated, while the other fractions, which contain a mixture of said substances, are returned to the column in order to be introduced there again with a quantity of the solution in a subsequent cycle.
The method according to the invention can be applied to separate substances having widely varying molecular dimensions, the difference in molecular dimensions corresponding to a difference in molecular weight of at least 100. The gel to be used for the separation is chosen with regard to the purpose in question, i.e. the substances to be separated, the desired separation capacity and the flow rate through the bed of gel grains.
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colloidal substances of crystalloid substances, for example for separating salts, such as sodium chloride or ammonium sulfate, from solutions containing colloids, also labile colloids, for example colloids of biological origin such as proteins, for example enzymes or viruses. Other examples of substances which can be purified, i.e. separated from impurities of various molecular sizes, in this way, are
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daux and aqueous dispersions of polymers produced by so-called "emulsion polymerization".
The method is especially valuable for separating substances with a molecular weight greater than 500, for example greater than 1000, since such substances are often very difficult to separate by other methods. The method can also be applied to fractionation.
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separate polymer homologues of different molecular weights, for example to fractionate water-soluble polymers such as dextran, or partial dextran-
<EMI ID = 26.1>
lene glycols, or derivatives of such polymers.
It can often also be advantageous to apply this separation method to process proteins.
or polypeptides, for example plasma proteins, enzymes, such as pepsin or a pancreatic enzyme, or hormones, for example insulin, or mixtures containing polysaccharides, for example polysaccharides, such as dextran, and animal polysaccharides, for example heparin, further vitamins, antibiotics and alkaloids.
When using the method to separate very complex mixtures, for example solutions obtained from biological materials, it may only be possible to achieve group separation, after which other methods must be applied for separation. further and purification.
In some cases it may be desirable to change the ion medium for substances which are not able to penetrate inside the gel grains, in order to facilitate subsequent purification of the substance or substances in question. For example, it is possible to quickly change or modify the pH and ionic strength for a protein solution, which is of great importance for the purification and separation of such substances. This can be done by passing the protein solution through the gel bed in which the aqueous medium contains the buffer substances required for the pH change.
The application of the method according to the invention will now be described in more detail in the following examples, which are not limiting.
EXAMPLE 1.-
A tube having a diameter of 3.5 cm and a height
<EMI ID = 27.1>
water-swollen gel grains (dry particle size 0.149 to 0.074 mm, water regain 2.6 g / g of dry gel = RE 2.6) produced by reaction between dextran having a weight molecular average (average MW) of 40,000 and epichlorohydrin, The tube was partially filled with water before it was fed or loaded with gel grains, so that the grains were submerged in the water.
During the tamping operation, the water was made to flow out of the tube at a uniform speed until the upper level of water was near disappearing into the packed gel bed. The total volume of the packed gel bed was 390 ml and the void volume was 130 ml. The bed was then loaded with 5 ml of an aqueous solution containing
10% pharmaceutical dextran (mean MW = 75,000) and 10% glucose, after which elution was carried out with
<EMI ID = 28.1>
was recovered or collected by means of a collector of
in fractions
<EMI ID = 29.1>
is lying. The first 130 ml portion of the effluent, corresponding to the void volume, contained water. Within the limits between 130 and 170 ml, the effluent contained dextran, and within the limits between
240 and 330, glucose The yield was quantitative.
EXAMPLE 2.-
In the same column as that used in Example 1, 15 ml of an aqueous solution containing 0.18 g of hemoglobin and 4.5 g of ammonium sulfate are charged.
The elution is then carried out with water at a rate of 66 ml per hour. Between 130 and 230 ml we obtained
<EMI ID = 30.1>
at
ammonium fate. The yield was quantitative.
EXAMPLE 3. -
In a tubular column having a diameter of 7.2 cm and a height of 50 cm were packed, in the same manner as in Example 1, 300 g (dry extract) of gel grains swollen with water. (particle size in the dry state 0.297 to 0.149 mm; RE 4.9) produced by reaction between dextran (average MW = 40,000) and epichlorohydrin. The total volume of the gel bed was 2000 ml. The void volume was 650 ml. We loaded the bed with 100 ml
<EMI ID = 31.1>
with mean MW = 4000 after which elution was carried out with water at a rate of 240 ml per hour. The first 650 ml portion corresponding to the void volume was discarded from the effluent, after which by means of a fraction collector 100 fractions of 17 ml were collected. The amount of carbohydrate in each fraction was determined by reaction with anthrone. Fractions ranging from number 8 to number 95 inclusive contained the hydrate
<EMI ID = 32.1>
of average MW less than or at most equal to the average MW) was determined all 5 fractions where the substance was in sufficient quantity and the following series of values were obtained:
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
In a tubular column with a diameter of 2 cm and a height of 40 cm was packed in the same way as in Example 1, 7 g (dry extract) of gel grains (RE
<EMI ID = 35.1> of pH 7. The gel substance was produced by reaction between ethyl hydroxyethyl cellulose and ethylene glycol bis-epoxypropyl ether. The total volume of the bed
<EMI ID = 36.1>
loaded the bed with 5 ml of a 60 mg aqueous solution
<EMI ID = 37.1>
of phosphate, after which the elution was carried out with an Ni / 10 phosphate buffer of pH 7. 40-55 ml of phosphate buffer containing hemoglobin appear successively in the effluent, then 55-105 ml of phosphate buffer containing ammonium sulfate.
EXAMPLE 5.-
In a column having a diameter of 4 cm and a height of 26 cm was packed in the same way as in Example 1, 15 g (dry extract) of gel grains swollen with water (RE 16.0) produced by reaction between polyvinyl alcohol and epichlorohydrin. The total volume of the gel seed bed was 330 ml and the void volume 120 ml. In order to determine to what degree it was possible to fractionate the dextran, i.e. to separate the polydisperse dextranic substances, the distribution of 4 dextranic substances was determined in 4 separate experiments.
<EMI ID = 38.1>
Stance in question dissolved in water were loaded into the column and elution was carried out with water at a rate of 20 ml per hour during the four experiments. The effluent liquid from the column was collected in fractions by means of a fraction collector. In the first two experiments with dextranic substances of average molecular weight of MW = 1,800,000 and = 300,000, respectively, dextran appeared in the effluent after rejection of a volume of effluent corresponding to the volume of video
In the third experiment which was carried out with a dextranic substance of mean MW = 40,000, the main portion of the dextran was contained in the effluent after discharge of an amount corresponding to the void volume, and a smaller portion then arrived. . In the fourth experiment with a dextranic substance of average MW
- 20,000, a lower portion of the dextran appeared in the effluent after discharge of a quantity of effluent corresponding to the void volume and the main portion of dextran then arrived.
As can be seen from this experiment, it is possible by this method to separate (fractionate) such dextranic substances into at least two groups, one with a molecular weight greater than 20,000 - 40,000 and the other with a molecular weight greater than 20,000 - 40,000. molecular weight less than 20,000 - 40,000.
<EMI ID = 39.1>
In a column with a diameter of 4 cm we have packed
32 g (dry extract) of gel grains (particle size 0.149 to 0.074; RE 6) produced by reaction between starch and 1,3-dichlorohydrin of glycerin. The total volume of the gel bed was 314 ml. Into the column was introduced 5 ml of an aqueous solution containing 200 mg of human serum albumin and 200 mg of sodium chloride. The bed
was eluted with water at a rate of 120 ml per hour and 5.5 ml fractions were collected. Albumin appeared in the elution product between 95-140 ml and salt between 270 and 330.
EXAMPLE 7.-
In a column with a diameter of 3 cm was packed to a height of 45 cm a swollen gel powder (particle size 0.074 to 0.03 mm; RE 4.9) produced by reaction between dextran (Average MW = 40,000) and epichlorohydrin. The bed of the substance in the form of
gel was washed with a phosphate buffer (ionic strength 0.03 of pH 7.03) until equilibrium was reached. So we
25 ml of fresh human serum was introduced into the bed and then the phosphate buffer was introduced. The effluent was collected in fractions of 7 ml by means of a fraction collector which changed tubes every 15 minutes, giving a speed
<EMI ID = 40.1>
LOWRT), amino acids, peptides and nuoleotides were determined in each fraction (peptides by ninhydrin and nucleotides by UV absorption). The protein was obtained in fractions of numbers 5 to 12, peptides and amino acids in fractions of numbers 20 to 40, and nucleotides in fractions of numbers 42 to 60.
EXAMPLE 8.-
A bed of dimensions 3 x 22 cm was packed with swollen gel grains (RE 4.5) produced by reaction between dextran and epichlorohydrin. Two experiments were carried out in order to determine the influence of the degree of association of insulin on its sorption by the gel grains and its displacement and elution from the grains:
a) The bed was equilibrated with M.1 acetate buffer pH 3.95. Then 1 ml of 0.51% insulin in such a buffer was loaded into the bed and it was subjected to <EMI ID = 41.1>
ent between 55 and 65 ml.
b) The bed was rr. � s in equilibrium with it of di- <EMI ID = 42.1>
0.42% insulin solution and eluted with dichloroacetic acid solution. In this case, the insulin was contained in the effluent between 80 and 100 ml.
EXAMPLE 9.-
A bed of dimensions 4 x 37 cm was packed with
grains of gel (particle size 0.149 to 0.074 mm; RE 4.2) produced by reaction between dextran (average MW = 20,000) and epichlorohydrin. The bed was washed with a tam- <EMI ID = 43.1>
5 ml of an aqueous solution containing 0.11% polymyxin B (antibiotic) and then M / 10 phosphate buffer at a rate of 101 ml per hour. Polymyxin leaves the bed between 350 and 400 ml.
In another experiment we load in the bed
5 ml of a solution containing 0.15% polymyxin and 1% sodium dextran sulfate (average MW = 1,000,000) and
<EMI ID = 44.1>
on time. The polymyxin and dextran sulfate complex exits the bed together with the dextran sulfate or dextran sulfate between 200 and 250 ml.
EXAMPLE 10.-
In-a column having a diameter of 1.5 cm and
<EMI ID = 45.1>
by water (particle size 0.149 to 0.074; RE 2.7) produced by co-polymerization of dextran (average MW =
<EMI ID = 46.1>
of the gel bed was 36 ml. Into the bed was introduced 1 ml of an aqueous solution containing 10 mg of human serum albumin and 100 mg of sodium chloride. The bed was eluted with water at a rate of
<EMI ID = 47.1>
were recovered by means of a fraction collector. ] Albumin appeared in fractions 5 and 6 and salt in fractions 8-10.
<EMI ID = 48.1>
In the same column as in Example 10 were packed gel grains (particle size 0.149
<EMI ID = 49.1>
and epichlorohydrin. The total volume of the bed was 35 ml.
Inside the column is introduced 1 ml of an aqueous solution containing 10 mg of human serum albumin and
<EMI ID = 50.1> was treated with water at a rate of 36 ml per hour and fractions each containing 3 ml were collected. Albu-
<EMI ID = 51.1>
<EMI ID = 52.1>
EXAMPLE 12. -
In a column having a diameter of 1.5 cm and a height of 22 cm were packed gel grains (dimension
<EMI ID = 53.1>
reaction between starch and bis-epoxypropyl ether. The total volume of the bed was 36 ml. Inside the bed, 1 ml of an aqueous solution containing 10 mg of human serum albumin and 100 mg of sodium chloride was introduced. The bed was eluted with water at a rate of 120 ml per hour and 3 ml fractions were collected. Albumin appeared in fractions 4-6 and
<EMI ID = 54.1>
EXAMPLE 13.-
In the same column as in Example 12, gel grains (particle size 0.297-0.052mm; RE 1.6) produced by reaction of dextran with 1,2,3,4-diepoxybutane were packed. The total volume of the gel bed was 35 ml. Into the bed was introduced 1 ml of an aqueous solution containing 10 mg of human serum albumin and 100 mg of sodium chloride. The bed was eluted with water at a rate of 7 ml per hour and fractions containing 3.5 ml each were collected or collected. Albumin appeared in fractions 4 and 5 and salt in fractions 8-10.
EXAMPLE 14.-
In a column having a diameter of 3 cm were packed gel grains (particle size 0.149
<EMI ID = 55.1>
and 1,4-butanediol-diepoxypropyl ether. The volume to-