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La présente invention est @elative a et a pour
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objet (1) un procédé mi,crob±,olozi<jue pour préparer des stéroïde5 1?-oxyIlds et (2) certains nouveaux stéroïdes o,12-oxye;énés de le série de le ;(11)-dnrdropro;estérone.
Antérieurement à le présente invention, on ne conne. i:3.3étÍ t pas de procédé microbiolo6i(ue pour introduire de l'oxygène dans la position 12 d'un stéroïde de la série du prégnane (par exemple, progestérone et progestérones hydroxylées). On a cependant découvert que si un 9(ll)-dé-
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hydro-stérolae est employé comme substrat, la position al- lylique 12 devient vulnérable à l'attaque oxydante de cer-
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tains microorticnisrtms, ce qui permet de forcer un stéroide 1?-hydroxyle. Les microorganisn'es utilisables pour cette conversion sont ceux capables d'effectuer une 11-hydroxy- lation d'un stéroide saturé dans le noyau C et non substi- tué dans la position 11 (par exemple, progestérone).
Comme
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exemples de tels microorsanismes, on peut citer les suivants Colletotrichum phomoides, Thamnidium elegans, Aspergillus nidulans, Tricothecium roseum, Colletotrichum pisi, Conio- thyrium helleborine, Cunninghamella blakesleeana, Curvula-
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ria lunata, ks2ergillus niger, Suncephalastrum racemosum, Neurospora sitophila, Thicopus nigricans.
Des substrats utilisables dans le procédé sui- vant la présente invention sont constitués par des stéroïde
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de la série de la , !.,(11) -présnadiène-3,?C-dione, tels que la 9(11)-déhydroprogestérone 1: (11)-préônadiène-.
3 ,.20-dioner%; la ' ( 11 ) -nrénadiëne-17 c( -0l-3 ,?C-dione; la -Lprégnadiène-21-ol-3,20-dione (et les 21-es- ters de celle-ci, tels que son 21-acétate); la 1\ IL39(11)- prégnadiène-17 c( ,21-diol-3,?0-d.ione (et ses 21-esters); la "'''a9(11)--prénatriène-3,20-dione; la 1,4,9(11)-pré-
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gnatriéne-17 -{ l 3 '"Jo '. 1 1,4.)";1 ( 11 ).. , gnatrena-- -0 - , -(n0; -prégnriè ne-17 o(21-diol-3,20-d-.0ï- (':1(; ses 2-.ers); la L1,4,9 11-prégnatriène-21-ol-3 s%--dsone \et ses 21-esters); et .,9(11) ,l6prégnatri.:.e-3 s?-dione; de -nie que les stéra roides de la série de 1 L4S(1:!")-ndrçstadiène<3-one, tels que la )9(11)-anéfost9diène-)il(-diOne; la 49(llLandrostadiène-.17/3-ol-3-one; et/17 -'.éthyl- A9(ll)¯arostpdièn.e-17 -ol-3-one.
Les composés sui rant la présents invention sont constitués par la 6 j3 12 d -dihyài=oxj;-9(11)-dàhydropro- gestérone, les diesters de celle-ci et 6,12-dicao-9(11)- déhydroprogestérone ; ces composés pe@vent être représentés par la formule générale :
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dans laquelle R est de l'hydrogène, R' désigne un groupe hydroxy ou acyloxy (en particulier le radical acyloxy d'un acide carboxylique d'hydrocarbure comportant moins de 10 atomes de carbone), ou bien R et R' désignent ensemble un groupe céto.
Pour préparer la 6, 12 d -dihydroxy-9(ll)-dé- hydroprogestérone suivent la présente invention, on soumet
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de la 9(ll)-déhydroprogestérone L- ,4'(11),pr 4nadiéne- 3,20-dione à l'action d'enzymes d'un des microorganismes énumérés plus haut dans des conditions aérobies. L'hyelro-
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xylation peut s'effectuer le'mieux soit en incorporant le stéroide dans une culture aérobie du microorganisme, soit en mettant en présence, dans un milieu aqueux, le stéroïde, de l'air ou des enzymes de cellules non proliférantes du micro organisme.
En général, les conditions de culture des micro- organismes pour les besoins de la présente invention sont (sauf en ce qui concerne l'inclusion du stéroide à trans- formera les mêmes que les conditions de culture de divers autres mycètes aérobies pour la production d'antibiotiques. d'acides organiques ou de vitamines, c'est-à-dire que le microorganisme est cultivé, de manière aérobie, au contact (dans ou sur) un milieu de fermentation appropriée. Un milieu approprié comprend essentiellement une source de facteurs azotés et une source de carbone et d'énergie. Cet- te dernière peut être un hydrate de carbone (tel que su- crose, mélasses, gluco.se, maltose, amidon ou dextrine), un acide gras supérieur, une graisse et/ou le stéroide lui- même.
Toutefois, le milieu contient, de préférence, une source assimilable de carbone et d'énergie en plus du sté- roide. Les sources de facteurs azotés peuvent être organi- ques (par exemple, la farine de graines de soja, la li- queur de macération de mais, les extraits de viande et/ou les solubles de distillateur) ou synthétiques (par exemple, composées des composés organiques et inorganiques synthé- tisables simples, tels que sels d'ammonium, nitrates de métaux alcalins, ainino-acides ou urée).
Une alimentation adéquate en air stérile doit être maintenue pendant la fermentation, par exemple, par les procédés classiques consistant à exposer une grande surface du milieu à de l'air ou à utiliser une culture aé- rée submergée. Le stéroïde peut être ajouté à la culture pendant la période d'incubation ou être incorporé au milieu
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avant sa stérilisation ou son inoculation.
Le procède fournit, entre autres, de la 6 ss,
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12 o( -dïhydroxy-;' ( 11)-déhydro;ro;estcr ore, qui peut à son tour être estérifiée, de la mpmère usuelle, notamment par traitement avec un 1.:;lo-2':2urE': d'acyle ou un anhydride dia- cidre, de manière à foriller les dérivas diesters.
Bien que l'on puisse utiliser nt3ryorte quel 8=9nt d'acylation, les composés préférés sont les chlorures d'école ou les anhy- drides d'acides carboxyliques d'hydrocarbures comportant moins de 10 atomes de carbone, tels que les anhydrides des acides ±.lcanoÍc.:l1Es inférieurs (tF?, que l'anhydride ccéti- que), les chlorures aryl-cerbonyliques monocycliques (tels que le chlorure de benzoyle), les chlorures d'acides aral- canoïques monocycliques (tels que le chlorure de phénacé- tyle),. les anhydrides d'acides alcénoiques inférieurs et les halogénures de monocycloalcane-carbonyle.
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La 6 3 , 12 o(-dihydroxy-9(ll)-déhydropro57,est6- rone est également utilisable comme intermédiaire dans la préparation de la 6,1?-dicéto-9(11)-déiiyd.r-opr-ogestér-one suivant la présente invention. Cette conversion peut s'ef-
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fectuer par oxydation de 6 /--) 12 q -dihydroxY-9(11)-déhy- droprogestérone avec un composé de chrome hexavalent (par exemple, acide chromique).
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La 6 / , 12 o(-dihydroxy-9(11)-déhydroprogesté- rone et ses diesters peuvent également être réduits par traitement avec du zinc dans de l'acide acétique, de maniè
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re à obtenir de la 12 o(-hydroxy-9(ll)-d6hydroprogestA-rone ou son ester respectivement. La 12 o-hydroxy-9(11)-àéhy- droprogestérone et ses esters sont des stéroides physiolo- giquement actifs, qui possèdent une activité'progestatio- nelle.
Les composés suivant la présente invention sont
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des stéroïdes physiologiquement actifs, qui possedent une activité progestationelle Ainsi, ces nouveaux stéroïdes peuvent être administrés au lieu de et de la même manière que la progestérone dans le traitement des avortements ha- bituels. Les doses pour cette administration dépendent évidemment de l'activité relative du stéroide. Ainsi, lors que le' stéroïde en question a approximativement la même ac- tivité que la progestérone, la dose dudit stéroide doit être sensiblement la même que celle employée pour la pro- gestérone.
Les exemples suivants illustrent l'invention (toutes les températures étant données en degrés centigra, des).
EXEMPLE 1
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6 / , 12 o(-dihydroxy-9(11)-déhydroprogestérone (a) Fermentation
Toutes les températures d'incubation sont de
25 . Une culture en surface sur un milieu incliné de gé- lose vieux d'une semaine de Colletotrichum phomoides ATCC
12521 (American Type Culture Collection, Washington, D. C.) - le milieu incliné de la farine de soja (37,5 g); de l'a- midon (20 g), du CaCO3 (2,5 g) et de l'eau en quantité suffisante pour obtenir un volume de 1 litre-7 est lavée avec une solution aqueuse à 0,01% de Duponal (agent mouil lant). La suspension est répartie en parties aliquotes dans 10 flacons coniques d'une capacité de 250 ml conte- nant chacun 50 ml du milieu stérile suivant (A) : - dextrose 10 g.
- liqueur de macération de mais 6 g.
- NH4H2PO4 3 g.
- extrait de levure 2,5 g.
CaCO3 2,5 g.
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Huile de graine de soja 2,2 g.
- Eau distillée q. s. ad 1 litre pH = 7,0 ; stériliéé à l'autoclave.
Après 69 heures d'agitation mécanique à 280 tours par minute sur un rayon de 2 pouces, un transfert
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de 10 (ol/vol) est effectué dans 75 flacons similaires contenant le même milieu stérile (A). Après 44 heures d'incubation dans le second flacon, 925 mg de 9(ll)-déhy- droprogestérone dans 37,5 ml de solution méthanolique sont agoutés (25 mg. par flacon). Après 5 nouvelles heures d'in- cubation,le contenu des flacons est filtré sur un tampon clarificateur de Seitz; les flacons et tampons sont lavés.
Le volume total de filtrat et de liqueur de lavage est de 4150 ml.
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(b) Isolement de la 6 12 o -dihydroxy-9(11)-déhydro- progestérone
Le filtrat des cultures (4150 ml) est extrait à l'aide de cinq fractions de 1 litre de chloroforme et les extraits combinés sont évaporés sous vide jusqu'à sic-
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cité. Le résidu semi-cristallin (environ 1,215 g) est tri- , turé avec de l'acétone et les cristaux résultants (environ 552 mg) sont recristallisés dans de l'acétone. La 6 3,
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12 d -dihydroxy-9(ll)-déhydroprogestér'one f 'a(11-pr;- gnadiène- 6 /3 ' 12 c{ -diol-3,20-diongpure obtenue de cette manière a les propriétés suivantes : P.F. environ 231 - 232 ' L- 0( J 3 + 107 (c, 0,49 dans CHC1.3); A ' 23['-'11 ( # Il.000); bzz 401 2,96 - 3,00, 5,92, 6,04, 6,21, Il,44 .
La substance donne une coloration pourpre carac- téristique avec du H2SO4, concentré.
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Analyse : Calculé pour 3H,-, (p.i.i,: w! j 1 C = 73,22); H : 19;. frouvµ ; C ²"o 4,..' =* 7,Le, ,...
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(c) Isolement de la ,'-IorcgOène-9 il oxydo-6 , 12 0( -diol-3,20-dione :
Les liqueurs-mères provenant de la cristallisa- tion susdite (deux essais) sont combinés, dissoutes dans 5 ml. de chloroforme et 45 ml. de benzène et chromatogra- phiées sur 40 g. d'oxyde d'aluminium lavé à l'acide.
Par élution avec du chloroforme à 20 % dans du benzène (1600 ml.) on obtient d'abord une matière amorphe suivie d'une fraction cristalline lorsque l'éluant est remplacé par un mélange chloroforme-benzène 1 : 1. 1600 ml de ce dernier mélange de solvants éluant 1.20 mg. de cristaux bruts, qui après recristallisation dans de l'acétone, fournissent un
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produit pur, à savoir de la '-prégnène-9 f3 , 11 fi -oxydo- 6 l3 , 12 0( -diol-3,20-dione, qui présente les propriétés suivantes : P.F. environ 202 - 204 ; L o( D3 + 1,6 (c, 0,41 dans CHC1.); A- 37 rnf (.E = 15.600) Nujol 295) 3307, 6 6.-> max 95, 3 , ?> ,95, 6,02, 6 >18 /U .
Analyse : Calculé pour CzlH$05 (P.lï.360,.1) : C = 69,97 %; H = 7,83%. Trouvé : C = 69,48 %;H =-7,79 % .
En poursuivant l'élution de la colonne avec du chloroforme (650 ml), on obtient une quantité supplémentai.
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re de 6 /3 , 12.o(-dihydroxy-9(11)-déhydroprogestérone (en- viron 240 mg.). Du chloroforme contenant 5% d'acétone (300 ml. ), 10 % d'acétone (200 ml. ) et 25 % d'acétone (100 ml..), respectivement, élue des fractions mélangées, qui sont suivies par une autre bande cristalline, lorsqu'on utilise un mélange chloroforme-acétone 1 : 1 (800 ml.) com- me éluant, Après cristallisation dans de l'acétone, la ma- tière a les propriétés suivantes : P.F. environ 250 - 252 ;
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é (1 23 + 23 ( c, 0,30 dans CHC13 ) ; À ale 23' C,- 12.000); , - 2,95, 5387) 6,05u .
12.000 , Max 2,95, 5,87, ,o Analyse : Calculé pour ,?ZlH28 l. (pu.: 344,44): C = 73,22%;
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H = $,19 . Trouvé : 0 = 72,77 (09 H = 7,58 v
Le #4-prégnène-9 ss,11ss -oxydo-6 , 12 d- diol-3,20-dione est un nouveau stéroide utilisable comme
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agent progestarionel. Ainsi, ce composé peut être admirais- tré au lieu de et de la même tanière que la progestérone dans le traitement des avortements habituels.
EXEMPLE 2 6ss, 12 o(-dihydroxy-9(ll)-déhydroprogestérone (a) Fermentation
Les conditions de fermentation sont les mêmes que celles appliquées dans l'exemple 1, si ce n'est que la culture est vieille de 3 semaines et est une culture de Thamnidium elegans au lieu de C. phomoides. Cinq flacons sont utilisés dans le premier stade, 39 du Second; le pre- mier stade dure 66 heures ; second stade dure 54 heures avant et 17 heures après l'addition du stéroïde; 488 mg. de stéroïde sont utilisés; le volume de filtrat + liqueurs de lavage est de 2140 ml.
(b) Isolement de la 6 ss,12 c( -dihydroxy-9(ll)-déhydro- progestérone :
Le filtrat de la culture est extrait à l'aide ,:. trois fractions de 700 ml de chloroforme, le solvant est évaporé sous vide et le résidu est recristallisé dans de l'alcool à 95 %. On obtient de la 6 ss,12 o(-dihydro- xy-9(11)-déhydroprogestérone pure, qui a les propriétés suivantes identiques à celles indiquées dans l'exemple 1: P.F. environ 230 - 232 ; # alc 234 m ( #= 11.000).
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Analyse : Calculé pour C 21H2804 (P.1.1.: 344,44): C 7322i'-; H = 8,19%. Trouvé : C = 73,11 %; H = 8,32 5.
EXEMPLE 3
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6 , 12 o(-dihydroxy-9(ll)-déhydroprogestérone (a) Fermentation :
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Les conditions de fermentation sont les mêmes que celles utilisées dans l'exemple 1, si ce n'est que la culture est vieille de 3 semaines et est une culture
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dtAsper,-4illus nidulans ATCC 11267. Cinq flacons sont utilà,.. sés dans le premier stade, 3# dans le second; le premier stade dure 48 heures; le second stade dure 29 heures avant et 24 heures après l'addition du stéroïde; la quantité de stéroide est de 488 mg. et le volume de filtrat et de li- queur de lavage est de 2000 ml.
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(b) Isolement de 6 3 , 12 o( -dihydroxy.-g ( 11 ) -déhydrop roges térone : De la 6 /3 , 12 c( -dihydro:cy-(11)--déhydroproges- térone pure est isolée du filtrat de la culture par le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, .section ,±, et est iden- tique à tous égards à la matière obtenue dans l'exemple 1.
EXEMPLE 4
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6 f3 , 12 o -dia.cétate de 6 fi , 12 o( -dihydroxy-9(ll)-dehydroprogestérone 25 mg. d.e 6 j3 , 12 o( -dihydroxy-Ç (11) -déhydro- progestérone sont dissous dans 0,5 ml. de pyridine et 0,5 ml. d'anhydride acétique et le solution est laissée à tem-
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péra:ture ambiante pendant 18 heu'ra.3, Par évaporation des réactifs sous vide, on obtient du diacétate cristallin, qui
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après rec>=isit.1lisJ.tion dans un mélange acétone-hexane, a les propriétés suivantes P.F. environ 171 - 172 ;
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/"#( ,J j 1 2,,0.0 (c, 0,43 dans cu 1) A a C 232 mu S, 1o^r.) 7 ,7 i.Tujol C''rl5y 56, 5e95, 6 17 Analyse : Calculé peur C 5 /., J û (ï,F.-,1 iy.?c,5 : C - 70,o7,r; H = 7,5j µ.;. Trouvé ; C = '7(' ?C %1; H = 7, gel j..1.
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EXEMPLE 5
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6 ,12-dicéto-9(11)-àéhydraprogestér-one A une solution de 70 mj. d.e b , 12 c( -dihydro-.
;cy:-9(11)-déhyàroprogestérone U&fiS 6 ml. diacide acétique glaciale on ajoute une solution de 45 mg. décide chromi- que dans 9 ml. d'acide acétique glacial. Après 30 minutes à température ambiante, on ajoute 0,5 ml. d'alcool et le mélange est concentré sous vide. On ajoute de l'eau et on extrait le mélange avec du chloroforme. L'extrait chloro- formique est lavé avec de l'eau et une solution diluée de bicarbonate, séché sur du sulfate de sodium et évaporé jus- qu'à siccité sous vide.
Le résidu cristallin jaune clair est recristallisé dans de l'acétone et donne de la 6,12-di céto-9(11)-déhydroprogestérone pure, ayant les propriétés suivantes : P.F. environ ?CE - 210 ; [d]23 +27 (c,
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0,38 dans CHC13 j ; i max 235 - 2-0 ( E = 19.3zoo), 313 (2.300); 2;r KOH dans i:ieOH .253 7u (19.000), 3' vu (7.600) (îmm6diateinent); 25: rnrya. (1.600); 432 m,u (9.900) (après 3 heures); # Nujol 5,90, 5,95, 6,25 .
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Analyse : Calculé pour c;i-x2C. (P.i.: 342,42): C = 74,09%; H = 7,11 %. Trouvé : C ="73,77 ; H 7,bu % .
EXEMPLE 6 12 d. -hydroxy-9{11)-déhydroprogestérone Une solution de 52 mg, de 6 f3 ' 12 Q -dih:'droxy- 9(ll)-déhydroprogestérone dans 3 ml. d'acide acétique gla- cial est chauffée au reflux avec 104 mg. de poudre de zinc pendant 2 1/4 heures. Après élimination du zinc par cen- trifugation, la solution ucétique est concentrée sous vide et le résidu est repris dans du chloroforme et de l'eau.
L'extrait chloroformique est lavé avec une solution diluée de bicarbonate de sodium,séché sur du sulfate de sodium et évaporé jusqu'à siccité sous vide. Le résidu amorphe est
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dissous dans 1,5 ml. de benzène et 2 ml.d'hexane et est chromatographié sur 1 g. d'alumine lavée à l'acide.
Par élution evec un mélange benzène-hexane 1 : 1 et avec du ben- zène, on obtient une matière amorphe, qui est suivie d'une fraction cristalline (benzène-chloroforme 1 : 1). Par recristallisation dans un mélange acétone-hexane on obtient de la 12 # -hydroxy-9(11)-déhydroprogestérone pure ayant les propriétés suivantes : P.F.: environ 166 - 168 ;
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LO( J E3 +19 ( c, 0,27 dans CHC13 ) ; o max 23 mu ( = 16.000) À Max z,96., 5)oo; 6,00, 6,0 11,59.
D'une manière similaire, du 6 ss, 12 c( -diacéta-
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te de ô f3 12 0( -dihydroxy-9{11)-déhydroprogestérone peut être réduit en 12 ci -acétate de 12 ci -hydroxy-9(ll)-déhydro- progestérone.
EXEMPLE 7
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li-alloprégnène-3 ,6 ,12,2Ù-tétraone.
Une solution de 25 mg. de 6,12-dicéto-9(11)-déhy- droprogestérone dans 2 ml. d'acide acétique glacial et 1 ml. d'eau est chauffée aubain de vapeur avec 120 mg. de poudre de zinc pendant 15 minutes. Pendant cette période de chauffage, la coloration .jaune de la solution disparaît complètement. Le zinc résiduel est éliminé par centrifuga- tion et lavé avec de l'acide acétique. Les solutions acé- tiques combinées sont concentrées sous vide et le résidu ¯est repris dans de l'eau et du chloroforme. L'extrait chlo, roformique est lavé avec de l'eau et du bicarbonate de sodium dilué, séché et évaporé jusqu'à siccité sous vide.
Le résidu cristallin fournit, après recristallisation dans
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un mélange acétone-hexane, de la 9(11)-alloprégnène-3,6, 12,20-tétraone pure ayant les propriétés suivantes : P.F.: environ 242 - 24 ; ZeL7 -2 (ce 0,33 dans CHC13 ) ; . 1\ ale 234 nr = i2.000 j ; " A mâ KOH dans MeOH
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259 m # 13.100) ; 431 m (6.700) (après 4 heures);
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\A 'Ui 1 5,si, 5 3 6 , 598 6 , 3 u.
L'invention peut être mise en oeuvre de diverses autres manières, sans sortir du cadre des revendications suivantes.
REVENDICATIONS 1,, Procédé pour la préparation d'un stéroïde 12- oxygéné, dans lequel on soumet un 9(11)-déhydro-stéroïde à l'action d'enzymes d'un microorganisme effectuant une 11-hydroxylation d'un stéroïde saturé dans le noyeu C et non substitué dans la position 11, dans des conditions aéra bies.
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The present invention is related to and has for
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object (1) a mi, crob ±, olozi <jue process for preparing steroid 5 1? -oxyIlds and (2) certain new steroids o, 12-oxye; enes of the series of; (11) -dnrdropro; estone.
Prior to the present invention, no conne. There is no microbiological process for introducing oxygen into the 12-position of a pregnane-series steroid (for example, progesterone and hydroxylated progesterones). However, it has been found that if a 9 (ll )-of-
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hydro-sterolae is used as a substrate, the alkyl position 12 becomes vulnerable to oxidative attack from cer-
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tains microorticnisrtms, which allows forcing a 1? -hydroxyl steroid. Microorganisms useful for this conversion are those capable of effecting 11-hydroxylation of a steroid saturated in the C ring and unsubstituted in the 11 position (eg, progesterone).
As
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Examples of such microorsanisms include the following Colletotrichum phomoides, Thamnidium elegans, Aspergillus nidulans, Tricothecium roseum, Colletotrichum pisi, Coniothyrium helleborine, Cunninghamella blakesleeana, Curvula-
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ria lunata, ks2ergillus niger, Suncephalastrum racemosum, Neurospora sitophila, Thicopus nigricans.
Substrates which can be used in the process according to the present invention consist of steroids.
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of the series of,!., (11) -presnadiene-3,? C-dione, such as 9 (11) -dehydroprogesterone 1: (11) -preonadiene-.
3, .20-dioner%; '(11) -nrenadiene-17 c (-01-3,? C-dione; -Lpregnadiene-21-ol-3,20-dione (and 21-esters thereof, such as its 21-acetate); IL39 (11) - pregnadiene-17 c (, 21-diol-3,? 0-d.ione (and its 21-esters); "'' 'a9 (11) - prenatriene-3,20-dione; 1,4,9 (11) -pr-
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gnatriéne-17 - {l 3 '"Jo'. 1 1,4.)"; 1 (11) .., gnatrena-- -0 -, - (n0; -pregnriè ne-17 o (21-diol-3 , 20-d-.0i- (': 1 (; its 2-.ers); L1,4,9 11-pregnatriene-21-ol-3 s% - dsone \ and its 21-esters); and ., 9 (11), l6pregnatri.:. E-3 s? -Dione; de -nie that the steroids of the series of 1 L4S (1:! ") - ndrçstadiene <3-one, such as) 9 (11) -anefost9diene-) il (-diOne; 49 (llLandrostadiene-.17 / 3-ol-3-one; and / 17 - '. Ethyl- A9 (ll) ¯arostpdien.e-17 -ol-3 -one.
The compounds according to the present invention consist of 6j3 12 d -dihyài = oxj; -9 (11) -dàhydroprogesterone, the diesters thereof and 6,12-dicao-9 (11) -dehydroprogesterone; these compounds can be represented by the general formula:
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in which R is hydrogen, R 'denotes a hydroxy or acyloxy group (in particular the acyloxy radical of a hydrocarbon carboxylic acid having less than 10 carbon atoms), or else R and R' together denote a group keto.
In order to prepare the 6, 12 d -dihydroxy-9 (II) -dehydroprogesterone according to the present invention, one submits
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9 (II) -dehydroprogesterone L-, 4 '(11), pr 4nadiene-3,20-dione to the action of enzymes of one of the microorganisms listed above under aerobic conditions. The hyelro-
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The xylation can best be carried out either by incorporating the steroid into an aerobic culture of the microorganism, or by bringing together, in an aqueous medium, the steroid, air or enzymes of non-proliferating cells of the microorganism.
In general, the conditions for culturing microorganisms for the purposes of the present invention are (except for the inclusion of the steroid to transform the same as the conditions for culturing various other aerobic fungi for the production of Antibiotics, organic acids or vitamins, ie the microorganism is grown, aerobically, in contact with (in or on) a suitable fermentation medium. A suitable medium essentially comprises a source of factors nitrogenous and a source of carbon and energy. The latter can be a carbohydrate (such as sugar, molasses, glucose, maltose, starch or dextrin), a higher fatty acid, a fat and / or the steroid itself.
However, the medium preferably contains an assimilable source of carbon and energy in addition to the steroid. The sources of nitrogenous factors can be organic (eg, soybean meal, maize maceration liquor, meat extracts and / or distiller solubles) or synthetic (eg. simple synthesizable organic and inorganic compounds, such as ammonium salts, alkali metal nitrates, amino acids or urea).
An adequate supply of sterile air should be maintained during fermentation, for example, by the conventional methods of exposing a large area of the medium to air or using submerged aerated culture. The steroid can be added to the culture during the incubation period or be incorporated into the medium
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before sterilization or inoculation.
The process provides, among other things, 6 ss,
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12 o (-dïhydroxy-; '(11) -dehydro; ro; estcr ore, which can in turn be esterified, of the usual mpmère, in particular by treatment with a 1.:;lo-2':2urE': d acyl or a diacidre anhydride, so as to form the diester derivatives.
Although any acylation 8 = 9nt can be used, the preferred compounds are the school chlorides or the carboxylic acid anhydrides of hydrocarbons having less than 10 carbon atoms, such as the anhydrides of the carboxylic acids. ± .lcanoÍc acids: lower l1Es (tF ?, than ccetic anhydride), monocyclic aryl-cerbonyl chlorides (such as benzoyl chloride), chlorides of monocyclic aralkanoic acids (such as chloride of phenacetyl) ,. lower alkenoic acid anhydrides and monocycloalkane carbonyl halides.
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6 3, 12 o (-dihydroxy-9 (II) -dehydropro57, est6- rone is also useful as an intermediate in the preparation of 6,1? -Diketo-9 (11) -déiiyd.r-opr-ogester- one according to the present invention.
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Carry out by oxidation of 6 / -) 12 q -dihydroxY-9 (11) -dehy- droprogesterone with a hexavalent chromium compound (eg chromic acid).
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6 /, 12o (-dihydroxy-9 (11) -dehydroprogesterone and its diesters can also be reduced by treatment with zinc in acetic acid, so
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re to obtain 12 o (-hydroxy-9 (ll) -d6hydroprogestA-rone or its ester respectively. 12 o-hydroxy-9 (11) -ahydroprogesterone and its esters are physiologically active steroids, which possess progestational activity.
The compounds according to the present invention are
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physiologically active steroids, which possess progestational activity. Thus, these new steroids can be administered instead of and in the same way as progesterone in the treatment of habitual abortions. The doses for this administration obviously depend on the relative activity of the steroid. Thus, while the steroid in question has approximately the same activity as progesterone, the dose of said steroid should be substantially the same as that employed for progesterone.
The following examples illustrate the invention (all temperatures being given in degrees centigra, des).
EXAMPLE 1
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6 /, 12 o (-dihydroxy-9 (11) -dehydroprogesterone (a) Fermentation
All incubation temperatures are
25. A surface culture on a slant medium of one week old gelatin of Colletotrichum phomoides ATCC
12521 (American Type Culture Collection, Washington, D. C.) - the slanted middle of soybean meal (37.5 g); starch (20 g), CaCO3 (2.5 g) and water in sufficient quantity to obtain a volume of 1 liter-7 is washed with a 0.01% aqueous solution of Duponal ( wetting agent). The suspension is distributed in aliquots in 10 conical flasks with a capacity of 250 ml each containing 50 ml of the following sterile medium (A): - 10 g dextrose.
- corn maceration liquor 6 g.
- NH4H2PO4 3 g.
- yeast extract 2.5 g.
CaCO3 2.5 g.
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Soybean oil 2.2 g.
- Distilled water q. s. ad 1 liter pH = 7.0; autoclaved.
After 69 hours of mechanical stirring at 280 revolutions per minute on a 2 inch radius, a transfer
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of 10 (ol / vol) is made in 75 similar vials containing the same sterile medium (A). After 44 hours of incubation in the second flask, 925 mg of 9 (II) -dehydroprogesterone in 37.5 ml of methanolic solution are stirred (25 mg. Per flask). After a further 5 hours of incubation, the contents of the flasks are filtered through a Seitz clarifying pad; the vials and swabs are washed.
The total volume of filtrate and wash liquor is 4150 ml.
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(b) Isolation of 6 12 o -dihydroxy-9 (11) -dehydro- progesterone
The filtrate of the cultures (4150 ml) is extracted with five 1 liter fractions of chloroform and the combined extracts are evaporated in vacuo to dryness.
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cited. The semicrystalline residue (about 1.215 g) is tri- tured with acetone and the resulting crystals (about 552 mg) are recrystallized from acetone. The 6 3,
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12 d -dihydroxy-9 (II) -dehydroprogester'one f 'a (11-pr; - gnadiene- 6/3' 12 c {-diol-3,20-diongpure obtained in this way has the following properties: mp approximately 231 - 232 'L- 0 (J 3 + 107 (c, 0.49 in CHC1.3); A' 23 ['-' 11 (# Il.000); bzz 401 2.96 - 3.00, 5 , 92, 6.04, 6.21, II, 44.
The substance gives a characteristic purple coloration with H2SO4, concentrated.
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Analysis: Calculated for 3H, -, (p.i.i: w! J 1 C = 73.22); H: 19 .; frouvµ; C ² "o 4, .. '= * 7, Le,, ...
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(c) Isolation of 1α -IorcgOene-9-oxido-6,12 0 (-diol-3,20-dione:
The mother liquors from the above crystallization (two runs) are combined, dissolved in 5 ml. of chloroform and 45 ml. of benzene and chromatographed on 40 g. of acid washed aluminum oxide.
By elution with 20% chloroform in benzene (1600 ml.) An amorphous material is first obtained followed by a crystalline fraction when the eluent is replaced by a 1: 1 chloroform-benzene mixture. 1600 ml of this mixture. last mixture of solvents eluting 1.20 mg. of crude crystals, which after recrystallization from acetone, provide a
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pure product, namely ′ -pregnene-9 f3,11 β -oxydo- 6 l3,12 0 (-diol-3,20-dione, which exhibits the following properties: mp about 202 - 204; L o (D3 + 1.6 (c, 0.41 in CHC1.); A- 37 rnf (.E = 15.600) Nujol 295) 3307, 6 6 .-> max 95, 3,?>, 95, 6.02, 6 > 18 / U.
Analysis: Calculated for C11H $ 05 (P. 11.360, .1): C = 69.97%; H, 7.83%. Found: C = 69.48%; H = -7.79%.
Further elution from the column with chloroform (650 mL) gives more.
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re of 6/3, 12.o (-dihydroxy-9 (11) -dehydroprogesterone (approx. 240 mg.). Chloroform containing 5% acetone (300 ml.), 10% acetone (200 ml.) .) and 25% acetone (100 ml.), respectively, elute from the mixed fractions, which are followed by another crystalline band, when a 1: 1 chloroform-acetone mixture (800 ml.) is used. eluting. After crystallization from acetone, the material has the following properties: mp about 250 - 252;
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é (12 23 + 23 (c, 0.30 in CHCl3); at 23 ° C, -12,000); , - 2.95, 5387) 6.05u.
12,000, Max 2.95, 5.87,, o Analysis: Calculated for,? Z1H28 l. (pu .: 344.44): C = 73.22%;
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H = $, 19. Found: 0 = 72.77 (09H = 7.58v
# 4-Pregnene-9 ss, 11ss -oxydo-6, 12 d-diol-3,20-dione is a new steroid which can be used as
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progestin agent. Thus, this compound can be admired instead of and from the same lair as progesterone in the treatment of usual abortions.
EXAMPLE 26ss, 12o (-dihydroxy-9 (II) -dehydroprogesterone (a) Fermentation
The fermentation conditions are the same as those applied in Example 1, except that the culture is 3 weeks old and is a culture of Thamnidium elegans instead of C. phomoides. Five vials are used in the first stage, 39 in the Second; the first stage lasts 66 hours; second stage lasts 54 hours before and 17 hours after the addition of the steroid; 488 mg. steroid are used; the volume of filtrate + washing liquors is 2140 ml.
(b) Isolation of 6 ss, 12 c (-dihydroxy-9 (ll) -dehydro- progesterone:
The culture filtrate is extracted using:. three fractions of 700 ml of chloroform, the solvent is evaporated in vacuo and the residue is recrystallized from 95% alcohol. Pure 6 ss, 12 o (-dihydro- xy-9 (11) -dehydroprogesterone is obtained, which has the following properties identical to those indicated in Example 1: mp about 230 - 232; # alc 234 m (# = 11,000).
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Analysis: Calculated for C 21H2804 (P.1.1: 344.44): C 73221'-; H, 8.19%. Found: C, 73.11%; H = 8.32 5.
EXAMPLE 3
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6, 12 o (-dihydroxy-9 (ll) -dehydroprogesterone (a) Fermentation:
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The fermentation conditions are the same as those used in Example 1, except that the culture is 3 weeks old and is a culture
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dtAsper, -4illus nidulans ATCC 11267. Five vials are used in the first stage, 3 # in the second; the first stage lasts 48 hours; the second stage lasts 29 hours before and 24 hours after the addition of the steroid; the amount of steroid is 488 mg. and the volume of filtrate and wash liquor is 2000 ml.
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(b) Isolation of 6 3, 12 o (-dihydroxy.-g (11) -dehydroprogesterone: From 6/3, 12 c (-dihydro: cy- (11) - pure dehydroprogesterone is isolated from filtrate from the culture by the procedure described in Example 1, section, ±, and is identical in all respects to the material obtained in Example 1.
EXAMPLE 4
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6 f3, 12 o -dia. 6 fi, 12 o (-dihydroxy-9 (ll) -dehydroprogesterone 25 mg. Of 6 d3, 12 o (-dihydroxy-Ç (11) -dehydro- progesterone are dissolved in 0 , 5 ml. Of pyridine and 0.5 ml. Of acetic anhydride and the solution is left to cool.
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perera: ambient temperature for 18 hours. 3, By evaporation of the reagents under vacuum, crystalline diacetate is obtained, which
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after rec> = isit.1lisJ.tion in acetone-hexane, has the following properties m.p. about 171 - 172;
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/ "# (, J j 1 2,, 0.0 (c, 0.43 in cu 1) A a C 232 mu S, 1o ^ r.) 7, 7 i.Tujol C''rl5y 56, 5e95, 6 17 Analysis: Calculated for C 5 /., J û (ï, F .-, 1 iy.?c.5: C - 70, o7, r; H = 7.5j µ.;. Found; C = '7 ( '? C% 1; H = 7, gel j..1.
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EXAMPLE 5
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6, 12-diketo-9 (11) -ahydraprogester-one In a solution of 70 mj. d.e b, 12 c (-dihydro-.
; cy: -9 (11) -dehydroprogesterone U & fiS 6 ml. Glacial acetic acid a solution of 45 mg is added. decides chromic in 9 ml. glacial acetic acid. After 30 minutes at room temperature, 0.5 ml is added. alcohol and the mixture is concentrated in vacuo. Water is added and the mixture is extracted with chloroform. The chloroform extract is washed with water and dilute bicarbonate solution, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo.
The light yellow crystalline residue is recrystallized from acetone to give pure 6,12-di keto-9 (11) -dehydroprogesterone, having the following properties: m.p. about? EC - 210; [d] 23 +27 (c,
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0.38 in CHCl3 d; i max 235 - 2-0 (E = 19.3zoo), 313 (2,300); 2; r KOH in i: ieOH .253 7u (19,000), 3'v (7,600) (imdiatein); 25: rnrya. (1,600); 432 m, u (9,900) (after 3 hours); # Nujol 5.90, 5.95, 6.25.
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Analysis: Calculated for c; i-x2C. (Mp: 342.42): C = 74.09%; H, 7.11%. Found: C = "73.77; H 7, bu%.
EXAMPLE 6 12 d. -hydroxy-9 (11) -dehydroprogesterone A solution of 52 mg, of 6 f3 '12 Q -dih:' droxy-9 (II) -dehydroprogesterone in 3 ml. of glacial acetic acid is heated to reflux with 104 mg. of zinc powder for 2 1/4 hours. After removal of the zinc by centrifugation, the ucetic solution is concentrated under vacuum and the residue is taken up in chloroform and water.
The chloroform extract is washed with dilute sodium bicarbonate solution, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The amorphous residue is
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dissolved in 1.5 ml. of benzene and 2 ml of hexane and is chromatographed on 1 g. of acid washed alumina.
By eluting with a 1: 1 benzene-hexane mixture and with benzene, an amorphous material is obtained, which is followed by a crystalline fraction (benzene-chloroform 1: 1). By recrystallization from an acetone-hexane mixture, pure 12 # -hydroxy-9 (11) -dehydroprogesterone is obtained having the following properties: m.p .: approximately 166 - 168;
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LO (J E3 +19 (c, 0.27 in CHC13); o max 23 mu (= 16,000) At Max z, 96., 5) oo; 6.00, 6.0 11.59.
In a similar fashion, from 6 ss, 12 c (-diaceta-
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f3 12 0 (-dihydroxy-9 (11) -dehydroprogesterone can be reduced to 12 ci -acetate of 12 ci -hydroxy-9 (ll) -dehydro-progesterone.
EXAMPLE 7
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li-allopregnene-3, 6, 12,2Ù-tetraone.
A solution of 25 mg. of 6,12-diketo-9 (11) -dehydroprogesterone in 2 ml. glacial acetic acid and 1 ml. water is heated steam boil with 120 mg. of zinc powder for 15 minutes. During this heating period, the yellow coloration of the solution completely disappears. Residual zinc is removed by centrifugation and washed with acetic acid. The combined acetic solutions are concentrated in vacuo and the residue is taken up in water and chloroform. The chlo, roformic extract is washed with water and dilute sodium bicarbonate, dried and evaporated to dryness in vacuo.
The crystalline residue gives, after recrystallization from
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an acetone-hexane mixture of pure 9 (11) -allopregnene-3,6,12,20-tetraone having the following properties: m.p .: about 242 - 24; ZeL7 -2 (ce 0.33 in CHCl3); . 1 \ ale 234 nr = i2,000 j; "A mâ KOH in MeOH
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259 m # 13.100); 431 m (6,700) (after 4 hours);
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\ A 'Ui 1 5, si, 5 3 6, 598 6, 3 u.
The invention can be implemented in various other ways, without departing from the scope of the following claims.
CLAIMS 1 ,, Process for the preparation of a 12-oxygenated steroid, in which a 9 (11) -dehydro-steroid is subjected to the action of enzymes of a microorganism effecting an 11-hydroxylation of a saturated steroid. in the nucleus C and unsubstituted in the 11 position, under ventilated conditions.