<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne les vaccins pour animaux domésti- ques et les méthodes pour leur préparation.
Il est bien connu de préparer les vaccins donnant un certain degré d'immunité aux maladies produites par certains micro-organismes en atté- nuant ou réduisant la virulence des organismes d'infèction. Par exemple, le bacille Calmette-Guerin (B.C.G.), qui est employé pour produire une ré- sistance à la tuberculose, est préparé de cultures de bacilles vivantes qui ont été atténués, et le vaccin de la fièvre jaune est un exemple de vaccin préparé d'un virus atténué. Jusqu'à présent cependant, il n'a pas été pos- sible de produire des vaccine qui donnent un certain degré d'immunité aux maladies produites par les parasites métazoaires.
Les maladies produites par ces parasites sont difficiles à guérir chez les animaux domestiques et présentent une importance économique considérable, non seulement à cause de la perte des animaux infectés mais également à cause de la nécessité de désinfestation des terres sur lesquelles ces animaux vivent,
L'un des objets de la présente invention est de former des vac- cins convenant pour l'administration orale qui donnent un certain degré d'immunité aux maladies produites par les endoparasites métazoaires qui sont pathogènes pour les animaux domestiques et ont une ou plusieurs formes larvaires migratoires.
Les nouveaux vaccins selon la présente invention conviennent pour l'administration orale aux animaux domestiques et comprennent un véhicule aqueux contenant un endoparasite métazoaire vivant mais atténué qui est pathogène pour les animaux domestiques et est un nématode, trématode ou cestode sous forme d'oeufs ou bien sous une forme pré-migratoire ou migra- toire insuffisamment mûre.
La présente invention fournit également une méthode pour la pro- duction de vaccins convenant pour l'administration orale aux animaux do- mestiques, dans laquelle un endoparasite métazoaire qui est pathogène peur les animaux domestiques et est un nématode, trématode ou cestode, sous for- me d'oeufs ou sous une forme pré-migratoire, ou migratoire insuffisamment mûre, est soumis à un rayonnement ionisant dans des conditions tèlles qu'il soit atténué.
Les organismes irradiés peuvent alors être mis en suspension dans un véhicule aqueux tel qu'une solution saline physiologique, devant servir de vaccin.
De préférence, on emploie des rayons X comme source du rayonne- ment ionisant. Cependant, d'autres sources de rayonnement ionisant peuvent être employées, telle que le cobalt 60. De préférence, le parasite est le Dictyocaulus viviparus.
Dans certains cas il peut être désirable de recueillir les para- sites dans une phase de leur cycle de vie qui n'est pas la phase désirée pour l'irradiation, et dans ce cas ils peuvent être conservés dans des con- ditions appropriées jusqu'à ce que la maturation en la phase 'désirée se soit produite.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention.
Exemple 1.
On a recueilli des matières fécales contenant des larves de pre- mière phase de veaux infectés avec le Dictyocaulus viviparus et mis en culture pendant 8 jours en couches minces à la température ambiante en at- mosphère humide. Les larves ont alors atteint la troisième phase ou phase
<Desc/Clms Page number 2>
infectieuse et ont été lavées de la surface avec de l'eau. La suspension ainsi obtenue fut filtrer à travers un tamis ayant 20 mailles au cm. et fut alors centrifugée à 1550 révolutions par minute pendant trois minutes. Le liquide surnageant fut enlevé par décantation et le.résidu fut dilué pour donner une suspension contenant environ 10.000 larves par ml.
Cette suspen- sion fut transférée dans une capsule Petri sur une épaisseur- de 1 cm. et soumise à l'irradiation dans le faisceau d'une machine à rayons X, en em- ployant des filtres externes consistant en 0,25 mm. de cuivre et 1,0 mm. d'aluminium (couche de mi-valeur- de 8 mm. en aluminium: environ 200 roent- gens par minute). L'irradiation fut continuée jusqu'à une dose de 40.000 roentgens mesurés à la surface de la suspension ait été rendue. La suspen- sion fut ensuite diluée avec de l'eau jusqu'à ce que chaque ml. renferme environ 250 larves par ml.
Il a été trouvé qu'un veau auquel une suspension de 1000 à 4000 larves atténuées préparée comme décrit ci-dessus a été administrée oralement montrait un dégré élevé de résistance à une dose jusque 4000 larves infec- tieuses de Dictyocaulus 50 à 60 jours après administration du vaccin.
Exemple 2a
L'exemple 1, fut répété, mais en supprimant les filtres de cuivre et aluminium. Des résultats similaires à ceux de l'exemple 1 furent obtenus.
Exemple 3.
Des matières fécales obtenues de vaches ou moutons infectés avec l'espèce Nematodirus et contenant les oeufs de telles espèces furent humi- difiées et mélangées avec du charbon de bois. Cette culture fut maintenue en atmosphère humide jusqu'à développement de larves infectieuses ét celles- ci furent ensuite séparées et irradiées avec des rayons X comme dans l'exemple 1 pour produire le degré d'atténuation requis. Les larves irradiées furent mises en suspension dans une solution saline physiologique.
Exemple 4
Des oeufs de Fasciola hepatica furent obtenus de la bile de vaches ou moutons et les miraoidia qui en furent obtenus furent utilisés pour infec- ter les escargots de l'espèce Limnaea truncatula. Les cercariae qui furent ensuite libérées des escargots furent recueillies et soumises à l'irradia- tion avec des rayons X comme dans l'exemple 1 pour produire le degré d'atté- nuation requis. Les cercariae atténuées furent mises en suspension dans une solution saline physiologique.
Exemple 5.
Des uterus d'Ascaris lumbricoides femelles furent macérés et le produit fut mélangé avec une solution saturée de sucrose. Les oeufs qui flottaient à la surface furent enlevés et mis en suspension dans une solu- tion aqueuse à 2% de formaline et incubés pendant 45 jours à une température de 30 Co Les oeufs furent exposés aux rayons X comme dans l'exemple 1 et furent ensuite mis en suspension dans l'eau pour l'administration orale.
Exemple 6.
Des matières fécales contenant des larves de première phase furent recueillies de veaux infectés avec le Dictyocaulus viviparus et mis en cul- ture pendant huit jours en couches minces à la température ambiante en at- mosphère humide. Les larves avaient alors atteint la troisième phase ou pha- se infectieuse et furent lavées de la surface avec de l'eau. La suspension ainsi obtenue fut filtrée à travers un tamis à 20 mailles par cm. et fut ensuite centrifugée à 1500 r.p.m. pendant trois minutes.
Le liquide surna-
<Desc/Clms Page number 3>
geant fut enlevé par décantation et le résidu fut dilué,pour donner une sus- pension contenant environ 10.000 larves par ml Cette suspension fut soumi- se à l'irradiation dans un faisceau de cobalt 60 radic-actif et l'irradia- tion fut continuée jusqu'à obtention d'une dose de 40000 roentgens. La suspension fut ensuite diluée avec de l'eau jusqu'à ce que chaque ml. ren- fermât environ 20 larves.
Exemple 7.
Des escargots infectés avec Fasciola gigantica furent placés dans l'eau dans un récipient qui était revêtu de papier transparent cellulosique connu dans le commerce sous la marque de fabrique "cellophane" et une feuil- le de Cellophane fut placée sur la surface de l'eau. Des cercariae furent enlevées des escargots et enkystées sur la Cellophane. La Cellophane fut ensuite enlevée et conservée en atmosphère humide, dans l'obscurité, pendant quelques jours jusqu'à ce que les cercariae aient atteint la phase infec- tieuse. Ils furent ensuite soumis à l'irradiation dans le faisceau d'une machine à rayons X jusqu'à obtention d'une dose de 5000 roentgens. Les cer- cariae irradiées furent ensuite mises en suspension dans l'eau de telle manière que chaque ml. renfermât 10 cercariae.
Exemple 8.
De petits morceaux de segments gravides de Taenia saginata furent mis en solution saline physiologique afin de libérer les oeufs. Les oeufs. furent recueillis en faisant passer la suspension à travers un fin tamis qui permettait aux oeufs de passer à travers, mais retenait d'autres ma- tières solides. La suspension d'oeufs ainsi obtenue fut concentrée par cen- trifugation. La suspension concentrée fut soumis à l'irradiation dans le faisceau d'une machine à rayons X jusqu'à obtention d'une dose de 60.000 roentgens. La solution fut diluée avec de l'eau jusqu'à ce que chaque ml. renfermât environ 20.000 oeufs irradiés. Le produit était un vaccin conve- nant pour L'immunisation du bétail à l'égard de la cysticercose.
Exemple 9.
Des matières fécales obtenues de moutons infeotés avec Haemonchus contortus furent conservées pendant 14 jours à la température ambiante. On ajouta alors de l'eau aux matières fécales et le mélange fut laissé au re- pos pendant trois heures. Les larves présentes dans les matières fécales passèrent dans l'eau qui fut ensuite séparée' et centrifugée à 1500 r.p.m. pendant trois minutes. Le liquide surnageant fut enlevé par décantation et le résidu fut dilué pour donner une suspension renfermant environ 10.000 larves par ml. Les larves furent exposées aux rayons X comme dans l'exemple 1 et la suspension fut ensuite diluée avec de l'eau.
Le vaccin préparé selon l'exemple 1 a été administré à plus de mille veaux sans mauvais résultats. Les essais suivants montrent son emploi et ses avantages.
Essai 1.
Dans cet essai, 45 veaux Ayrshire qui avaient été élevés sans pa- rasites furent employés. Quinze veaux furent employés comme porteurs, 15 furent vaccinés avec le vaccin préparé comme décrit dans l'exemple 1, et 15 furent employés comme contrôles, mais 3 de ce dernier groupe furent éli- minés, par accident. Chaque animal d'un sous-groupe de 5 animaux porteurs reçut une dose de 4000 larves.infectieuses de Dictyocaulus viviparues et on les laissa paître dans un pâturage de 1,2 hectare pendant 35 jours. En dé- terminant les larves présentes dans les matières fécales de ces animaux on a estimé qu'il y avait une population larvaire minimum de pâturage de 140
<Desc/Clms Page number 4>
par dmo carré. Le groupe d'animaux vaccinés reçut une dose du vaccin conte- nant 1000 larves atténuées 50 jours avant d'être mis en pâture.
Les animaux vaccinés, les contrôles et un autre sous-groupe de 10 porteurs, traités de la même manière que le premier sous-groupe, furent mis simultanément en pâture 35 jours après que le premier sous-groupe de porteurs avait été mis en pâtureo Dix des animaux de contrôle sont morts de bronchite parasitique entre le 27e et le 73e jour après exposition au pâturage infecté, mais 3 seulement des 15 animaux vaccinés sont morts. Quatre du groupeporteur sôntmorts également. Les conditions sévères auxquelles ces animaux furent soumis sont considérées comme étant fortement en excès par rapport à tout ce qui pour- rait être rencontré dans les conditions ordinaires d'élevage.
Essai 2.
On a employé 91 veaux répartis sur 5 fermes dont toutes étaient atteintes d'une sévère épidémie de bronchite parasitique. De ces animaux, 48 furent vaccinés et 43 furent laissés non-traités pour servir de contrôles.
Trois seulement des animaux vaccinés montrèrent des symptômes de bronchite parasitique, tandis que 27 des animaux non-traités contractaient la maladie.
L'essai 3 qui suit montre l'utilisation et les avantages du vaccin de l'exemple 8.
Essai 3.
Chaque animal d'un groupe de 8 veaux fut infecté avec 100.000 oeufs non-traités de Taenia saginata et le nombre de kystes de Cysticerous bovis trouvés à l'autopsie fut noté; la moyenne par animal était de 13,8.
Deux veaux furent traités avec le vaccin décrit dans l'exemple 8. Dans 1-'un des veaux on ne trouva à l'autopsie aucun kyste et dans l'autre on n'a trou- vé qu'un petit amas fibreux contenant un kyste dégénéré. Un anti-oorps pré- cipitant contre le cysticercus bovis put être détecté dans les sérùm des veaux auxquels le vaccin avait été administré.
Essai 4
Chaque mouton d'un group de cinq moutons a reçu une suspension contenant 10.000 larves de Haemonchus contortus. Après 35 jours les animaux furent tués et furent examinés quant à la présence des parasites. On trouva une moyenne de 3000 parasites adultes par animal. Chacun des deux animaux dans trois autres groupes reçut des suspensions de 10.000 larves qui avaient été atténuées par irradiation avec 40.000, 60. 000 et 100. 000 roentgens res- pectivement, et après les avoir tués l'examen montrait ce qui suit : 40.000 roentgens 250 parasites
600000 roentgens 250 parasites
1000000 roentgens 50 parasites
Tous les parasites trouvés dans les animaux qui avaient reçu des larves irradiées étaient insuffisamment mûrs.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to vaccines for domestic animals and to methods for their preparation.
It is well known to prepare vaccines which give a certain degree of immunity to diseases produced by certain microorganisms by attenuating or reducing the virulence of infecting organisms. For example, Bacillus Calmette-Guerin (BCG), which is used to produce resistance to tuberculosis, is prepared from cultures of live bacilli which have been attenuated, and yellow fever vaccine is an example of a vaccine prepared of an attenuated virus. Heretofore, however, it has not been possible to produce vaccinia which provide a certain degree of immunity to diseases produced by metazoan parasites.
The diseases produced by these parasites are difficult to cure in domestic animals and are of considerable economic importance, not only because of the loss of infected animals but also because of the need for disinfestation of the land on which these animals live,
One of the objects of the present invention is to form vaccines suitable for oral administration which provide a certain degree of immunity to diseases produced by metazoan endoparasites which are pathogenic to domestic animals and have one or more forms. migratory larvae.
The novel vaccines according to the present invention are suitable for oral administration to domestic animals and comprise an aqueous vehicle containing a live but attenuated metazoan endoparasite which is pathogenic to domestic animals and is a nematode, trematode or cestode in the form of eggs or alternatively. in an insufficiently mature pre-migratory or migratory form.
The present invention also provides a method for the production of vaccines suitable for oral administration to domestic animals, wherein a metazoan endoparasite which is pathogenic to domestic animals and is a nematode, trematode or cestode, in form. m of eggs or in a pre-migratory or insufficiently ripe migratory form, is subjected to ionizing radiation under conditions such that it is attenuated.
The irradiated organisms can then be suspended in an aqueous vehicle such as physiological saline solution, to serve as a vaccine.
Preferably, X-rays are employed as the source of the ionizing radiation. However, other sources of ionizing radiation can be employed, such as cobalt 60. Preferably, the parasite is Dictyocaulus viviparus.
In some cases it may be desirable to collect the parasites in a phase of their life cycle which is not the desired phase for irradiation, and in this case they may be stored under suitable conditions until. maturation to the desired phase has occurred.
The examples which follow illustrate the invention.
Example 1.
Faeces containing first phase larvae of calves infected with Dictyocaulus viviparus were collected and cultured for 8 days in thin layers at room temperature in a humid atmosphere. The larvae have then reached the third phase or phase
<Desc / Clms Page number 2>
infectious and have been washed from the surface with water. The suspension thus obtained was filtered through a sieve having 20 mesh per cm. and was then centrifuged at 1550 revolutions per minute for three minutes. The supernatant liquid was removed by decantation and the residue was diluted to give a suspension containing about 10,000 larvae per ml.
This suspension was transferred to a Petri dish to a thickness of 1 cm. and subjected to irradiation in the beam of an x-ray machine, employing external filters consisting of 0.25 mm. of copper and 1.0 mm. aluminum (mid-value layer of 8 mm. aluminum: about 200 roent-people per minute). Irradiation was continued until a dose of 40,000 roentgens measured at the surface of the suspension had been returned. The suspension was then diluted with water until each ml. contains about 250 larvae per ml.
It was found that a calf to which a suspension of 1000 to 4000 attenuated larvae prepared as described above was administered orally exhibited a high degree of resistance to a dose up to 4000 infective Dictyocaulus larvae 50 to 60 days after administration. vaccine.
Example 2a
Example 1 was repeated, but removing the copper and aluminum filters. Results similar to those of Example 1 were obtained.
Example 3.
Faeces obtained from cows or sheep infected with the Nematodirus species and containing the eggs of such species were moistened and mixed with charcoal. This culture was maintained in a humid atmosphere until the development of infectious larvae, and these were then separated and irradiated with X-rays as in Example 1 to produce the required degree of attenuation. The irradiated larvae were suspended in physiological saline solution.
Example 4
Eggs of Fasciola hepatica were obtained from the bile of cows or sheep and the resulting miraoidia were used to infect snails of the species Limnaea truncatula. The cercariae which were then released from the snails were collected and irradiated with X-rays as in Example 1 to produce the required degree of attenuation. The attenuated cercariae were suspended in physiological saline solution.
Example 5.
Female Ascaris lumbricoides uteri were macerated and the product mixed with saturated sucrose solution. Eggs which floated on the surface were removed and suspended in a 2% aqueous solution of formalin and incubated for 45 days at a temperature of 30 Co. The eggs were exposed to x-rays as in Example 1 and were then suspended in water for oral administration.
Example 6.
Faeces containing first-phase larvae were collected from calves infected with Dictyocaulus viviparus and cultured for eight days in thin layers at room temperature in a humid atmosphere. The larvae had then reached the third or infectious phase and were washed from the surface with water. The suspension thus obtained was filtered through a sieve at 20 mesh per cm. and was then centrifuged at 1500 r.p.m. for three minutes.
The liquid surna-
<Desc / Clms Page number 3>
The giant was removed by decantation and the residue was diluted to give a suspension containing about 10,000 larvae per ml This suspension was irradiated in a beam of radic-active cobalt 60 and the irradiation was continued. until a dose of 40,000 roentgens is obtained. The suspension was then diluted with water until each ml. contained about 20 larvae.
Example 7.
Snails infected with Fasciola gigantica were placed in water in a container which was lined with transparent cellulosic paper known commercially as "cellophane" and a sheet of Cellophane was placed on the surface of the water. . Cercariae were removed from the snails and encysted on the Cellophane. The cellophane was then removed and stored in a humid atmosphere, in the dark, for a few days until the cercariae reached the infective phase. They were then subjected to irradiation in the beam of an X-ray machine until a dose of 5000 roentgens was obtained. The irradiated cerariae were then suspended in water such that each ml. contained 10 cercariae.
Example 8.
Small pieces of gravid segments of Taenia saginata were put in physiological saline solution to release the eggs. Eggs. were collected by passing the slurry through a fine sieve which allowed the eggs to pass through but retained other solids. The egg suspension thus obtained was concentrated by centrifugation. The concentrated suspension was subjected to irradiation in the beam of an X-ray machine until a dose of 60,000 roentgens was obtained. The solution was diluted with water until each ml. contained about 20,000 irradiated eggs. The product was a suitable vaccine for the immunization of cattle against cysticercosis.
Example 9.
Faeces obtained from sheep infested with Haemonchus contortus were stored for 14 days at room temperature. Water was then added to the faeces and the mixture was left to stand for three hours. The larvae present in the faeces passed into the water which was then separated and centrifuged at 1500 r.p.m. for three minutes. The supernatant liquid was removed by decantation and the residue was diluted to give a suspension containing about 10,000 larvae per ml. The larvae were exposed to X-rays as in Example 1 and the suspension was then diluted with water.
The vaccine prepared according to Example 1 was administered to more than a thousand calves without bad results. The following tests show its use and its advantages.
Test 1.
In this trial 45 Ayrshire calves which had been reared without parasites were used. Fifteen calves were used as carriers, 15 were vaccinated with the vaccine prepared as described in Example 1, and 15 were used as controls, but 3 of the latter group were accidentally eliminated. Each animal in a subgroup of 5 carrier animals received a dose of 4000 infectious larvae of Dictyocaulus viviparous and were left to graze on a 1.2 hectare pasture for 35 days. By determining the larvae present in the faeces of these animals it was estimated that there was a minimum grazing larval population of 140
<Desc / Clms Page number 4>
by square dmo. The vaccinated group of animals received a dose of the vaccine containing 1000 attenuated larvae 50 days before being grazed.
Vaccinated animals, controls and another subgroup of 10 carriers, treated in the same manner as the first subgroup, were simultaneously grazed 35 days after the first subgroup of carriers had been grazed. control animals died from parasitic bronchitis between the 27th and 73rd day after exposure to the infected pasture, but only 3 of the 15 vaccinated animals died. Four of the carrier group are also dead. The severe conditions to which these animals were subjected are considered to be greatly in excess of anything that might be encountered under ordinary husbandry conditions.
Test 2.
91 calves were employed on 5 farms, all of which were suffering from a severe epidemic of parasitic bronchitis. Of these animals, 48 were vaccinated and 43 were left untreated to serve as controls.
Only three of the vaccinated animals showed symptoms of parasitic bronchitis, while 27 of the untreated animals contracted the disease.
Test 3 which follows shows the use and advantages of the vaccine of Example 8.
Test 3.
Each animal in a group of 8 calves was infected with 100,000 untreated Taenia saginata eggs and the number of Cysticerous bovis cysts found at autopsy was noted; the average per animal was 13.8.
Two calves were treated with the vaccine described in Example 8. In one of the calves no cysts were found at autopsy and in the other only a small fibrous mass was found containing a. degenerated cyst. A precipitating antibody against cysticercus bovis could be detected in the serum of calves to which the vaccine had been administered.
Trial 4
Each sheep in a group of five sheep received a suspension containing 10,000 Haemonchus contortus larvae. After 35 days the animals were killed and examined for the presence of parasites. An average of 3000 adult parasites was found per animal. Each of the two animals in three other groups received suspensions of 10,000 larvae which had been attenuated by irradiation with 40,000, 60,000 and 100,000 roentgens, respectively, and after killing them the examination showed the following: 40,000 roentgens 250 parasites
600,000 roentgens 250 parasites
1,000,000 roentgens 50 parasites
All parasites found in animals which had received irradiated larvae were insufficiently ripe.