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EMI1.1
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La présente invention concerne les substances ayant la propriété d'empêcher le développement des tumeurs chez les,animaux et elle concerné, suivant l'un de ses aspects, les substances que l'on trouve dans le champignon Calvatia maxima ayant une activité anti-tumeur. Elle concerne en outre les procédés de fabrication de ces substances.
Au cours des années, des milliers de substances ont été essayées quant à leur activité anti-tumeur. Parmi les matières essayées, beaucoup étaient des produits chimiques réactifs syn- thétiques, tels que moutardes azotées, éthylénimines, époxydes, hormones stéroïdes, carbamates et esters d'acides sulfoniques.
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De nombreux anti-métabolites chimiques synthétiques, tels que les anàlogues de l'acide folique, purines, pyrimidines, formamides, analogues de pyridoxine, analogues de riboflavine, analogues diacides aminés et divers antagonistes de vitamine ont aussi été essayés. A côté des produits chimiques synthétiques, un grand nombre de matières tirées de sources animales ont été essayées quant à leur activité anti-tumeurs. Des exemples de matières de ce genre sont les préparations biliaires, comprenant le sérum cytoxique antiréticulaire (SCA), diverses enzymes d'origine ani- male, par exemple l'erginase, le désoxyribonucléase et le ribo- nucléase, ainsi que;les préparations d'urine. On a aussi essayé diverses matières dérivées de la vie des plantes et de micro- organismes.
Une telle matière comprend la colchicine et la podo- phylline, qui sont dérivées de végétaux supérieurs, ainsi que de nombreux polysaccharides bactériels et antibiotiques produits par le microorganisme, On peut trouver dans la littérature d'autres matières, trop nombreuses pour être mentionnées, qui ont trait à. la chimiothérapie du développement des tumeurs. Parmi ces ma- tières, on a trouvé que certaines ont une application particulière, tandis que de nombreuses autres sont considérées de moindre im- portance en raison de leurs peu d'effets désirables ou de leurs effets latéraux indésirables excessifs.
L'importance et l'urgence de découvrir une matière ayant la propriété d'empêcher les tumeurs sont évidentes à la suite de l'étude très poussée des matières sus-rappelées. L'invention a en conséquence pour but de créer une matière ayant une activité anti-tumeur importante et le minimum d'effets latéraux indé- sirables.
Plusieurs méthodes d'essais ont été utilisées pour évaluer l'activité des substances chimiothérapeutiques sus- mentionnées. Plusieurs modes opératoires d'essai,, appliqués à un grand nombre des substances sus-rappelées, sont étudiés dans un article 'de C. Chester Stock paru dans la revue "Advances in Cancer Hesearch", volume 2 (1954), p- 425 à 492. Parmi ces essai.
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ceux utilisant des tumeurs solides à vif (in vivo) sont ceux qui ont été les plus étendus.
Les agents anti-tumeurs ou chimio- thérapeutiques soumis à ces essais sont appréciés quant à la mesure dont ils empêchent le développement des tumeurs, à leur faculté de faire échouer les amorces de tumeurs dans leur déve- loppement, la mesure de régression des tumeurs mesurées, l'effet sur la durée de survivance de l'animal porteur ou divers critères cytologiques.:
Des essais utilisant la souris sarcome 180 sont extrê- mement utiles pour évaluer l'activité anti-tumeur. Le sarcome 180 a une croissance rapide, presque 100 % de transplantabilité, et une faible mesure de régression. Les méthodes et l'importance de l'essai au sarcome 180 et des essais connexes sont décrites avec beaucoup de détail dans le rapport No. 3-55 d'Août 1955, intitulé "Studies in Experimental Cancer Chemothérapy", de C.
Chester 'stock, paru dans la revue "Current Research in Lancer Chemotherapy".
L'essai est également décrit dans un article de C.C. Stock et C.p. Rhoads "Evaluation of Chemotherapeutic Agents", pages 18 à 190 (1949), Columbia University rress, New York. Au cours de cet essai, des souris pesant environ 20 g. sont pesées au commencement et à la fin de l'essai. Une tumeur est amorcée par l'injection sous-cutanée de fragments ou cubes de tumeur d'environ 1 à 2 mm de diamètre dans la région axillaire. L'agent chimiothèrapeutique soumis à 1'essai est injecté par voie intrapéritonale deux fois par jour pendant sept jours en commençant 24 heures après la trans- plantation de.la tumeur.
Après les injections, le huitième jour, les tumeurs sont de nouveau mesurées et comparées à leur grandeur d'origine- Une matière qui ne réussit pas à maintenir le déve- loppement de la tumeur à moins des trois quarts du diamètre moyen des tumeurs de comparaison est considérée donner un résultat d'essai négatif (-). Le taux maximum (=) signifie que le déve- loppement de la tumeur au cours de l'essai a été réduit à moins d'un quart de la croissance des tumeurs de comparaison. D'autres taux intermédiaires sont indiqués ci-après dans le compte-rendu des résultats d'essais.
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On a trouvé qu'une activité anti-tumeur existe dans le loup Calvatia maxima, le lycoperdon géant ou vesse de, un champignon de la famille Lycoperdacae. Le principe actif ayant cette ac- tivité anti-tumeur peut être extrait du Calvatia maxima. il est de préférence extrait avec de l'eau à partir de la masse frui- gifère fraiche. Le principe actif peut aussi être extrait avec des alcools, tels qu'éthanol, et avec de l'acétone et d'autres solvants miscibles à l'eau.
Le principe actif peut être précipité à partir de l'extrait aqueux par l'addition d'éthanol ou d'acétone ou d'un autre solvant miscible à l'eau. -Lorsqu'il est redissous dans l'eau, le précipité conserve son activité anti-tumeur. La couche surnageante retirée de cette précipitation contient aussi un principe actif.
Un principe actif non dialysable peut être obtenu en précipitant tout d'abord une solution aqueuse par addition . d'acétone ou d'éthanol pour former approximativement une concen- tration de 30 % en volume de ce solvant, par retrait de ce pré- cipité et par élévation de la concentration dtacétone ou d'éthanol jusqu'à 70% environ dans la @@@he surnageante pour produire un second précipité. Ce second précipité présente une activité anti- tumeur et est non dialysable. La couche surnageante tirée du second précipité contient aussi un principe actif. Ce principe actif peut être obtenu en faisant évaporer les solvants et en dissolvant le résidu à nouveau dans de l'eau.
L'espèce Calvatia maxima a été mentionnée sous diverses appellations, telles que Calvatia gigantea Pers., LLoyd, Bovista gigantea Nées, Langermannia gigantea Rostk., Lycoperdon giganteum.
Il est probable que tous ces champignons sont semblables au Lycoperdon bovista L, également appelé L. bovista Fries; on trouve ces deux noms dans la littérature européenne. Dans la présente description, on entend couvrir par l'expression Calvatia maxima toutes ces diverses désignations.
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Expérience
Une préparation fut faite en mélangeant une partie de tissu frais d'un corps fruigifère d'un spécimen fraichement recueilli de Calvatia maxima avec deux parties d'eau froide. Cet extrait fut trouvé actif dans l'essai sarcome 180; dans une dilution de 1 :100, préparation (No. 9429) réduisit la grandeur de la tumeur de 0,87 cm de diamètre dans l'animal.de comparaison à 0,49 cm de diamètre lorsqu'elle fut injectée par voie-intra- péritonale suivant,le mode opératoire d'essai.usuel. La dési- gnation d'activité fut +- suivant le code Sloan-kettering qui est décrit ci-dessous. Cet extrait aqueux fut précipité avec un volume d'éthanol et, après séparation par centrifugation, le pré- cipité fut dissous dans de l'eau et remis au volwne original.
Essayée en une dilution de 1:20, cette préparation (No. 9430) maintint la grandeur de la tumeur à 0,22 cm, tandis que la grandeur de celle de l'animal de comparaison était de 1,45 cm ; l'activité inhibitrice fut désignée comme +. Une quantité aliquante de l'extrait aqueux fut conservée42 jours et fut ensuite chauffée jusqu'à 100 C; pendant le chauffage, le volume original de 80 ml diminua à 68 ml, mais on compensa la différence en ajoutant de l'eau. L'injection de cette préparation (No. 9509) eut pour résultat une grandeur de tumeur de 0,51 cm, compara- tivement à 0,89 cm de la tumeur de comparaison (+ -). Ces résultat sont rassemblés au tableau 1.
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Tableau 1 Lteffet de l'injection, parentérale d'extraits de.Calvatia maxima sur le développement de souris sarcome 180
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<tb> No. <SEP> de <SEP> No. <SEP> de <SEP> toxicité <SEP> doses <SEP> cm3
<tb>
<tb> la <SEP> prépa- <SEP> l'essai <SEP> pour <SEP> 2 <SEP> fois
<tb>
<tb> ration <SEP> S. <SEP> K.I. <SEP> souris <SEP> par <SEP> jour
<tb>
EMI7.2
9429 C 2437 0,5(dit.1:10) 0,6(dii,1;'100) 94.30 c 2458 , o,5(dii,*L:lO) 0,5(dil.l:20) 9509 C 2517 os5 0,6-o3(dil.l:10) diam.dechan.gt. de
EMI7.3
<tb> No. <SEP> de <SEP> Effets <SEP> xx <SEP> tumeur <SEP> en <SEP> poids <SEP> en <SEP> morts
<tb>
EMI7.4
la prépa- c'r./diam. g./changt.
EMI7.5
<tb> ration <SEP> de <SEP> tumeur <SEP> de <SEP> poids
<tb>
<tb> comparât, <SEP> de <SEP> tumeur
<tb>
<tb> comparât.
<tb>
EMI7.6
9429 o4Io,$' -2,0/+1,0 9430 -E 0,./., -3,0/-05 2
EMI7.7
<tb> 9509 <SEP> 0,51/0,89 <SEP> -1,0/-0,5 <SEP> 2
<tb>
x Essais d'évaluation d'activité effectués à la
Division for Expérimental Chemotherapy, Sloan-Kettering institute for cancer Research.New York. xx 4 diamètre de tumeur 25% ou moins de la tumeur comparative ++ diamètre de tumeur 25-50% de la tumeur comparative
T= diamètre de tumeur 50-75 % de la tumeur comparative
D'autres essais furent faits avec des champignons frais recueillis à ce moment. Ils représentent les espèces semblables, mais on croit qu'ils sont de souches différentes. Ils furent recueillis en des endroits très éloignés.
Toutes les souches, essayées sous la forme d'extraits aqueux de corps fruigifères frais, montrèrent une activité contre le sarcome 180 comparable à celle enregistrée auparavant. L'extraction, de sporophore frais à l'eau bouillante pendant 10 minutes donna des préparations inactives. Une précipitation avec un volume d'éthanol produisit
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une matière qui, dissoute dams 1 'eau et essayée, produisis un ralentissement de La tumeur anac que, bie que non identique.
Il apparut que certaines souches donnèrent davantage d'activité anti-tumeur que les autres.
Afin de rechercher la nature de l'activité, on effectua Inexpérience suivante en utilisant de la matière congelée du sporophore de Calvatia maxima. Une partie de champignon fut mélangée avec deux parties d'eau froide. Une quantité aliquante de cet extrait fut précipitée avec 1 1/2 partie d'éthanol; le précipité fut dissous dans l'eau et amené au volume original.
On fit évaporer l'éthanol du liquide surnageant et la solution résultant fut ramenée au même volume. La solution aqueuse faite à partir du précipité et celle faite à partir de la matière contenue dans le filtrat montrèrent toutes deux une nette activité anti-tumeur.
Etant donné que ce fractionnement indiqua que plus d'un inhibiteur de tumeur est présent dans la matière végétale, les préparations suivantes furent faites. La matière du sporophore fut soumise à l'extraction avec de l'eau comme décrit auparavant et suffisamment d'éthanol fut additionné pour représenter 30 % du volume total. Le précipité mat séparé par centrifugeage et dissous dans l'eau (préparation No, 9896). Le liquide surnageant fut soumis à une nouvelle précipitation à l'éthanol en portant l'éthanol à 70% du volume total.
Le précipité, dissous dans L'eau, donna la préparation No. 9897'. On fit évaporer l'éthanol surnageant et le volume fut réglé à la moitié de l'extrait aqueux original (préparation No. 9898), comme cela a été fait dans le cas des préparations No. 9896 et No. 9897. Un essai d'une préparation qui fut faite par extraction du sporophore à l'éthanol absolu, évporation de l'alcool et réglage au volume original avec de l'eau ion No. 9894) fut aussi effectué. L'activité de l'extrait aqueux du résidu à partir de 1''extraction à l'éthanol est indiquée dans l'essai de la préparation No. 9895.
Il y eut davantage d'ac- tivité anti-tumeur dans l'extrait aqueux que dans l'extrait à
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l'éthanol absolu antérieur. Les résultats de ces essais sont rassemblés au tableau 2.
Tableau 2 Activités anti-tumeur de Calvatia-maxima révélées par un nouveau fractionnement dtextraits de sporophore et essayé contre le
Sarcome 180
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<tb> No- <SEP> de <SEP> No. <SEP> de <SEP> toxicité <SEP> doses <SEP> cm3
<tb>
<tb> la <SEP> prépara- <SEP> ltessai <SEP> pour <SEP> 2 <SEP> fois
<tb>
<tb> tion <SEP> S. <SEP> K.I. <SEP> souris <SEP> par <SEP> jour
<tb>
EMI9.2
98 C 2904 0,5 ot5(dil.l:lo) l'1395 0 2905 1,0 O,é(àil,1:50) 3ôg6 C2906 3,0 0,5(rail,1:10) 9897 1 ,ir 3,0 5....W .twU 9898 ##-. 3,0 0,5Cà.i1.1:100 arn. lie changt . de
EMI9.3
<tb> tumeurs <SEP> en <SEP> poids <SEP> en
<tb> No. <SEP> de <SEP> Effets <SEP> xx <SEP> cm/diarn. <SEP> g./ohangt.
<tb> la <SEP> prépa- <SEP> de <SEP> tumeur <SEP> de <SEP> poids
<tb> ration <SEP> comparat. <SEP> de <SEP> tumeur
<tb> comparat.
<tb>
<tb>
<tb>
9894 <SEP> ++ <SEP> 0,50/1,15 <SEP> -4,0/-1,5
<tb>
EMI9.4
9895 + + 0,22/op5' of--Os5
EMI9.5
<tb> 9896 <SEP> + <SEP> 0,17/0,72 <SEP> -3,0/-1,5
<tb>
<tb> 9897 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0,44/0,93 <SEP> -2,0/-1,5
<tb>
EMI9.6
9898 + 0*43/0*95 -Oe5/-290
X Essais effectués à la Division for Expérimental Chemotherapy Sloan-Kettering.Institute for Cancer Research, Nwe york ss + Diamètre de tumeur 25 % ou moins de la tumeur comparative + + Diamètre de tumeur 25-50% de la tumeur comparative +- Diamètre de tumeur 50-75% de la tumeur comparative
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Des ess '-ce supplément: ' tes furent faits pour déterminer si ou non le principe actif, et un partie de ce principe, était dialysable.
La préparation No. 9906 était une solution aqueuse du précipité résultant d'une précipitation à l'acétone dans la- quelle on ne considéra que la matière qui fut réduite en augmentant la concentration d'acétone de 30% à 70% du volume final. Cet extrait ne contenait pas de principe dialysable. La préparation No. 9907 était le liquide surnageant de la préparation ci-dessus, à partir de laquelle l'acétone était chassée. Elle contenait un principe dialysable ayant des propriétés inhibitrices de tumeur- ' La dialyse fut exécutée à la température ambiante avec de l'eau distillée qui fut remplacée à intervalles*. Le volume d'eau était le même que celui du liquide à l'intérieur de la membrane. Les résultats sont donnés au tableau 3.
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Tableau 3 Répartition des principes inhibiteurs de tumeurs dans des fractions obtenues en dialysant une préparation de Calvatia maxima (Tumeur d'essai :sarcome 180)
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<tb> No. <SEP> de <SEP> No. <SEP> de <SEP> toxicité <SEP> doses <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> la <SEP> prépa- <SEP> ltessai <SEP> pour <SEP> 2 <SEP> fois <SEP> Effets <SEP> xx
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ration <SEP> S.K.I. <SEP> souris <SEP> par <SEP> jour
<tb>
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9907 C 2917 3,0 Os6(dil-1:4) -- +
EMI11.3
<tb> 910 <SEP> C2920 <SEP> 5,0 <SEP> 0,6
<tb>
<tb> 991 <SEP> C <SEP> 2921 <SEP> 5,0 <SEP> 0,6
<tb>
<tb> 9912 <SEP> C <SEP> 2922 <SEP> 5,0 <SEP> 0,6
<tb>
<tb> 9913 <SEP> C <SEP> 2923 <SEP> 3,0 <SEP> 0,5(dil.l:
5) <SEP> +1
<tb>
EMI11.4
dam. de lldnLj Vstt,e No. a.e tumeurs en. poids morts observations 7.a prëpa- é''.en p 0 /chancpt en morts observations ration cm/diam. 0 C> ra-cion de tumeur de poids
EMI11.5
<tb> comparat. <SEP> de <SEP> tumeur
<tb>
<tb> comparât.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
9907 <SEP> 0,40/0,95 <SEP> -3,0/-2,0 <SEP> 1 <SEP> Prep. <SEP> avant
<tb>
<tb>
<tb> dialyse
<tb>
<tb>
<tb> 9910 <SEP> 0,55/1,13 <SEP> -1,5/-1,0 <SEP> 1 <SEP> dialyse <SEP> 2 <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9911 <SEP> 0,62/1,13 <SEP> -3,0/-1,0 <SEP> 1 <SEP> dialyse <SEP> 4 <SEP> heures <SEP> 1/23
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9912 <SEP> 0,86/1,13 <SEP> -1,0/-1,0 <SEP> dialyse <SEP> 6 <SEP> heures <SEP> 1;
/2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9913 <SEP> 0,45/0,74 <SEP> -4,5/41.0 <SEP> liquide <SEP> à <SEP> l'in-
<tb>
<tb>
<tb> . <SEP> térieur <SEP> de <SEP> la <SEP> mem-
<tb>
<tb>
<tb> brane <SEP> en <SEP> dialyse
<tb>
<tb>
<tb> après <SEP> 18 <SEP> heures <SEP> 1/2
<tb>
x Essais effectués à -La Division for Expérimental Chemothérapy Sloan-Kettering Institute for Cancer Research,New York xx + Diamètre de tumeur 25% ou moins de la tumeur comparative ++Diamètre de tumeur 25-50 7;
de la tumeur comparative
T-= Diamètre de, tumeur 50-75 de la tumeur comparative
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Le tableau montre un inhibiteur de tumeurs facilement dialysable qui traverse la memorane dans les quatre premières heures de la dialyse. Une substance non-dialysable, qui ralentit également le développement des tumeurs est pareillement présente.
Pour caractériser davantage les propriétés biologiques des substances inhibitrices de tumeurs contenues dans le Calvatia maxima, des essais de dilution furent effectués sur plusieurs des préparations précédemment mentionnées au Sloan-Kettering Institute. D'une façon générale, l'activité inhibitrice diminua avec l'augmentation de la dilution. Quelques données représen- tatives sont rassemblées au Tableau 4.
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Tableau. 4 Inhibition de tumeurs de dilutions d'extraits de Calvatia maxima (Tumeur dressai :Sarcome 180)*
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<tb> No. <SEP> de <SEP> Doses <SEP> cm3 <SEP> diam.de <SEP> changt.de
<tb>
<tb>
<tb> la <SEP> prépa- <SEP> 2 <SEP> fois <SEP> Effets <SEP> xx <SEP> tumeur <SEP> en <SEP> poids <SEP> en
<tb>
<tb>
<tb> ration <SEP> par <SEP> jour <SEP> cm/diam. <SEP> g./changt. <SEP> morts
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> tumeur <SEP> de <SEP> poids
<tb>
<tb>
<tb> comparat. <SEP> de <SEP> tumeur
<tb>
<tb>
<tb> comparat.
<tb>
EMI13.2
9895 0,,5(cLil .1.-50) i- 0,66/1,22 -3tolr2so 0,5 d%.1:100 0,66/1,23 -1,5/-2,0 9895 0,5 dil.1:200 0,76f1,22 -2 2 Ô7/-2 e 0 '0,5 d1.1:400 0,85/1,22 -1,5/-2 ,Q
EMI13.3
<tb> 0,5(dil.1:800) <SEP> - <SEP> 1,21/1,22 <SEP> -0,5/-2,0
<tb>
<tb> 9898 <SEP> 0 <SEP> 5,5 <SEP> dU <SEP> -1. <SEP> 100 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0,43/0,95 <SEP> -3,5/-2,5 <SEP> 1
<tb> 0,5 <SEP> di1.1:200 <SEP> + <SEP> 0,67/0,95 <SEP> -1,0/-2,5
<tb> 0,5 <SEP> DIL.1:400 <SEP> +12 <SEP> 0,56/0,95 <SEP> -1,0/-2,5
<tb> 0,5 <SEP> dil.l:800 <SEP> = <SEP> 0,77/0,95 <SEP> -1,0-2,5
<tb>
EMI13.4
c'906 0,5(dil.l:10 +¯ + z3/1,02 -4,5/-1,0 1 0,51.1:20 1 - 0,58/1,02 -2e5rlso 0,5[L-Ll,1:40 1 - 0,55/1,02 -1,0/-1,0 1 O,5(dil.1:80 - 0,77/1,02 +0,5/-1,0
EMI13.5
<tb> 9907 <SEP> 0,5 <SEP> dil.l:5) <SEP> ++ <SEP> 0,47/1,02 <SEP> -2,5/-1,0
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> dil.1:
10) <SEP> ++ <SEP> 0,50/1,02 <SEP> -2,0/-1,0
<tb>
EMI13.6
0,5 dit 1 - O,i4/1,02 L,0/-1,0
EMI13.7
<tb> 0,5 <SEP> dil.l:40) <SEP> 0,73/1,02 <SEP> -1,5/-1,0
<tb>
x Essais effectués à la Division for Expérimental Chemothérapy
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Sloan-Kettering lnstitute for Cancer Research, iow York xx + Diamètre de tumeur 25 % ou moins de la tumeur comparative + + Diamètre de tumeur 25-50% de la tumeur comparative +1 Diamètre de tumeur 50-75 % de la tumeur comparative
On a trouvé qu'une activité importante anti-tumeur reste dans un extrait aqueux de Calvatia maxima après avoir amené l'ex- trait en contact avec diverses résines synthétiques dtéchange ionique.
Bien que l'on ait décrit en détail des réalisations par- ticulières de l'invention pour l'illustrer, il est évident que de nombreuses variantes peuvent être réalisées sans sortir de son cadre.
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The present invention relates to substances having the property of preventing the development of tumors in animals and it relates, according to one of its aspects, to the substances which are found in the fungus Calvatia maxima having anti-tumor activity. . It also relates to the manufacturing processes of these substances.
Over the years, thousands of substances have been tested for their anti-tumor activity. Among the materials tested, many were synthetic reactive chemicals, such as nitrogen mustards, ethylenimines, epoxies, steroid hormones, carbamates and esters of sulfonic acids.
<Desc / Clms Page number 3>
Many synthetic chemical anti-metabolites, such as folic acid analogs, purines, pyrimidines, formamides, pyridoxine analogs, riboflavin analogs, di-amino acid analogs, and various vitamin antagonists have also been tried. Besides synthetic chemicals, a large number of materials derived from animal sources have been tested for their anti-tumor activity. Examples of such materials are bile preparations, including antireticular cytoxic serum (ACS), various enzymes of animal origin, for example, erginase, deoxyribonuclease and ribonuclease, as well as; 'urine. Various materials derived from plant life and microorganisms have also been tried.
Such a material includes colchicine and podophylline, which are derived from higher plants, as well as many bacterial polysaccharides and antibiotics produced by the microorganism. Other materials, too numerous to mention, can be found in the literature which relate to. chemotherapy of the development of tumors. Among these materials, some have been found to have particular application, while many others are considered of lesser importance due to their few desirable effects or their excessive undesirable side effects.
The importance and the urgency of discovering a material having the property of preventing tumors are evident following the very detailed study of the above-mentioned materials. It is therefore an object of the invention to provide a material having high anti-tumor activity and the minimum of undesirable side effects.
Several test methods have been used to evaluate the activity of the above-mentioned chemotherapeutic substances. Several test procedures applied to a large number of the above-mentioned substances are discussed in an article by C. Chester Stock published in the journal "Advances in Cancer Hesearch", volume 2 (1954), p-425 to 492. Among these test.
<Desc / Clms Page number 4>
those using live solid tumors (in vivo) are the most widespread.
The anti-tumor or chemotherapeutic agents subjected to these tests are appreciated as regards the extent to which they prevent the development of tumors, their faculty of causing tumor primers to fail in their development, the measurement of regression of the tumors measured. , the effect on the survival time of the carrier animal or various cytological criteria:
Assays using the sarcoma 180 mouse are extremely useful in evaluating anti-tumor activity. Sarcoma 180 is rapidly growing, almost 100% transplantable, and has little degree of regression. The methods and importance of the sarcoma 180 test and related tests are described in great detail in Report No. 3-55 of August 1955, entitled "Studies in Experimental Cancer Chemotherapy", by C.
Chester 'stock, appeared in the journal "Current Research in Launch Chemotherapy".
The assay is also described in an article by C.C. Stock and C.p. Rhoads "Evaluation of Chemotherapeutic Agents", pages 18-190 (1949), Columbia University rress, New York. During this test, mice weighing about 20 g. are weighed at the beginning and at the end of the test. A tumor is initiated by the subcutaneous injection of fragments or cubes of tumor about 1 to 2 mm in diameter in the axillary region. The chemotherapeutic agent under test is injected intraperitoneally twice daily for seven days beginning 24 hours after the tumor is transplanted.
After the injections, on the eighth day, the tumors are again measured and compared to their original size - A material that fails to keep tumor growth within three quarters of the mean diameter of the comparison tumors is considered to give a negative test result (-). The maximum rate (=) means that the growth of the tumor during the test was reduced to less than a quarter of the growth of the comparison tumors. Other intermediate rates are indicated below in the report of test results.
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It has been found that anti-tumor activity exists in the wolf Calvatia maxima, the giant lycoperdon or puffball, a fungus of the Lycoperdacae family. The active principle having this anti-tumor activity can be extracted from Calvatia maxima. it is preferably extracted with water from the fresh fruit mass. The active ingredient can also be extracted with alcohols, such as ethanol, and with acetone and other water-miscible solvents.
The active principle can be precipitated from the aqueous extract by the addition of ethanol or acetone or another solvent miscible with water. -When it is redissolved in water, the precipitate retains its anti-tumor activity. The supernatant layer removed from this precipitation also contains an active principle.
A non-dialysable active principle can be obtained by first precipitating an aqueous solution by addition. of acetone or ethanol to form approximately a 30% concentration by volume of this solvent, by removing this precipitate and increasing the concentration of acetone or ethanol to about 70% in the water. @@ he supernatant to produce a second precipitate. This second precipitate exhibits anti-tumor activity and is non-dialyzable. The supernatant layer drawn from the second precipitate also contains an active principle. This active principle can be obtained by evaporating the solvents and dissolving the residue again in water.
The species Calvatia maxima has been mentioned under various names, such as Calvatia gigantea Pers., LLoyd, Bovista gigantea Nées, Langermannia gigantea Rostk., Lycoperdon giganteum.
It is likely that all of these fungi are similar to Lycoperdon bovista L, also called L. bovista Fries; these two names are found in European literature. In the present description, the expression Calvatia maxima is intended to cover all these various designations.
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Experience
A preparation was made by mixing one part of fresh tissue from a fruit body of a freshly collected specimen of Calvatia maxima with two parts of cold water. This extract was found to be active in the sarcoma 180 trial; in a dilution of 1: 100, preparation (No. 9429) reduced the size of the tumor by 0.87 cm in diameter in the animal compared to 0.49 cm in diameter when injected intravenously - peritoneal following, the usual test procedure. The activity designation was + - according to the Sloan-kettering code which is described below. This aqueous extract was precipitated with one volume of ethanol and, after separation by centrifugation, the precipitate was dissolved in water and returned to the original volume.
Tested in a 1:20 dilution, this preparation (No. 9430) maintained the size of the tumor at 0.22 cm, while the size of the comparison animal was 1.45 cm; inhibitory activity was designated as +. An aliquante amount of the aqueous extract was stored for 42 days and was then heated to 100 ° C; during heating, the original volume of 80 ml decreased to 68 ml, but the difference was made up by adding water. Injection of this preparation (No. 9509) resulted in a tumor size of 0.51 cm, compared to 0.89 cm of the comparison tumor (+ -). These results are collated in Table 1.
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Table 1 The effect of injection, parenteral of extracts of Calvatia maxima on the development of sarcoma 180 mice
EMI7.1
<tb> No. <SEP> of <SEP> No. <SEP> of <SEP> toxicity <SEP> doses <SEP> cm3
<tb>
<tb> the <SEP> prepa- <SEP> test <SEP> for <SEP> 2 <SEP> times
<tb>
<tb> ration <SEP> S. <SEP> K.I. <SEP> mouse <SEP> by <SEP> day
<tb>
EMI7.2
9429 C 2437 0.5 (dit.1: 10) 0.6 (dii, 1; '100) 94.30 c 2458, o, 5 (dii, * L: lO) 0.5 (dil.l: 20) 9509 C 2517 os5 0.6-o3 (dil.l: 10) diam.dechan.gt. of
EMI7.3
<tb> No. <SEP> of <SEP> Effects <SEP> xx <SEP> tumor <SEP> in <SEP> weight <SEP> in <SEP> dead
<tb>
EMI7.4
the prepa- c'r. / diam. g./changt.
EMI7.5
<tb> ration <SEP> of <SEP> tumor <SEP> of <SEP> weight
<tb>
<tb> comparât, <SEP> of <SEP> tumor
<tb>
<tb> would appear.
<tb>
EMI7.6
9429 o4Io, $ '-2.0 / + 1.0 9430 -E 0,. /., -3.0 / -05 2
EMI7.7
<tb> 9509 <SEP> 0.51 / 0.89 <SEP> -1.0 / -0.5 <SEP> 2
<tb>
x Activity assessment tests carried out at the
Division for Experimental Chemotherapy, Sloan-Kettering institute for cancer Research, New York. xx 4 tumor diameter 25% or less of comparative tumor ++ 25-50% tumor diameter of comparative tumor
T = tumor diameter 50-75% of the comparative tumor
Further tests were made with fresh mushrooms collected at this time. They represent similar species, but are believed to be of different strains. They were collected in very distant places.
All the strains, tested as aqueous extracts of fresh fruit bodies, showed activity against sarcoma 180 comparable to that recorded previously. Extraction of fresh sporophore in boiling water for 10 minutes gave inactive preparations. Precipitation with one volume of ethanol produced
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a material which, dissolved in water and tested, produced a slowing down of the tumor anac that, although not identical.
It appeared that some strains gave more anti-tumor activity than others.
In order to investigate the nature of the activity, the following experiment was performed using frozen material from Calvatia maxima sporophore. One part of the mushroom was mixed with two parts of cold water. An aliquante amount of this extract was precipitated with 1 1/2 part of ethanol; the precipitate was dissolved in water and brought to the original volume.
Ethanol was evaporated from the supernatant liquid and the resulting solution was brought to the same volume. The aqueous solution made from the precipitate and that made from the material contained in the filtrate both showed marked anti-tumor activity.
Since this fractionation indicated that more than one tumor inhibitor is present in the plant material, the following preparations were made. The sporophore material was extracted with water as previously described and sufficient ethanol was added to make up 30% of the total volume. The dull precipitate separated by centrifugation and dissolved in water (Preparation No, 9896). The supernatant liquid was subjected to further precipitation with ethanol, bringing the ethanol to 70% of the total volume.
The precipitate, dissolved in water, gave preparation No. 9897 '. The ethanol supernatant was evaporated and the volume was adjusted to half of the original aqueous extract (preparation No. 9898), as was done in the case of preparations No. 9896 and No. 9897. A test of a preparation which was made by extracting the sporophore with absolute ethanol, evaporating the alcohol and adjusting to the original volume with water ion No. 9894) was also carried out. The activity of the aqueous extract of the residue from the ethanol extraction is shown in Test Preparation No. 9895.
There was more anti-tumor activity in the aqueous extract than in the water extract.
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previous absolute ethanol. The results of these tests are collated in Table 2.
Table 2 Anti-tumor activities of Calvatia-maxima revealed by a new fractionation of sporophore extracts and tested against
Sarcoma 180
EMI9.1
<tb> No- <SEP> of <SEP> No. <SEP> of <SEP> toxicity <SEP> doses <SEP> cm3
<tb>
<tb> the <SEP> prepared <SEP> the <SEP> test for <SEP> 2 <SEP> times
<tb>
<tb> tion <SEP> S. <SEP> K.I. <SEP> mouse <SEP> by <SEP> day
<tb>
EMI9.2
98 C 2904 0.5 ot5 (dil.l: lo) l'1395 0 2905 1.0 O, é (àil, 1: 50) 3ôg6 C2906 3.0 0.5 (rail, 1: 10) 9897 1, ir 3.0 5 .... W .twU 9898 ## -. 3.0 0.5C at i1.1: 100 arn. lie changt. of
EMI9.3
<tb> tumors <SEP> in <SEP> weight <SEP> in
<tb> No. <SEP> of <SEP> Effects <SEP> xx <SEP> cm / diarn. <SEP> g./ohangt.
<tb> the <SEP> prepa- <SEP> of <SEP> tumor <SEP> of <SEP> weight
<tb> ration <SEP> comparat. <SEP> of <SEP> tumor
<tb> comparat.
<tb>
<tb>
<tb>
9894 <SEP> ++ <SEP> 0.50 / 1.15 <SEP> -4.0 / -1.5
<tb>
EMI9.4
9895 + + 0.22 / op5 'of - Os5
EMI9.5
<tb> 9896 <SEP> + <SEP> 0.17 / 0.72 <SEP> -3.0 / -1.5
<tb>
<tb> 9897 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0.44 / 0.93 <SEP> -2.0 / -1.5
<tb>
EMI9.6
9898 + 0 * 43/0 * 95 -Oe5 / -290
X Tests performed at the Division for Experimental Chemotherapy Sloan-Kettering.Institute for Cancer Research, Nwe york ss + Tumor diameter 25% or less of comparative tumor + + Tumor diameter 25-50% of comparative tumor + - Diameter of tumor 50-75% of comparative tumor
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Supplementary essences were made to determine whether or not the active ingredient, and part of it, was dialyzable.
Preparation No. 9906 was an aqueous solution of the precipitate resulting from precipitation with acetone in which only the material was considered which was reduced by increasing the acetone concentration from 30% to 70% of the final volume. This extract did not contain any dialyzable principle. Preparation No. 9907 was the supernatant of the above preparation, from which acetone was driven off. It contained a dialyzable principle having tumor inhibitory properties. The dialysis was performed at room temperature with distilled water which was replaced at intervals *. The volume of water was the same as that of the liquid inside the membrane. The results are given in Table 3.
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Table 3 Distribution of tumor-inhibiting principles in fractions obtained by dialysing a preparation of Calvatia maxima (Test tumor: sarcoma 180)
EMI11.1
<tb> No. <SEP> of <SEP> No. <SEP> of <SEP> toxicity <SEP> doses <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> the <SEP> prepa- <SEP> the <SEP> test for <SEP> 2 <SEP> times <SEP> Effects <SEP> xx
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ration <SEP> S.K.I. <SEP> mouse <SEP> by <SEP> day
<tb>
EMI11.2
9907 C 2917 3.0 Os6 (dil-1: 4) - +
EMI11.3
<tb> 910 <SEP> C2920 <SEP> 5.0 <SEP> 0.6
<tb>
<tb> 991 <SEP> C <SEP> 2921 <SEP> 5.0 <SEP> 0.6
<tb>
<tb> 9912 <SEP> C <SEP> 2922 <SEP> 5.0 <SEP> 0.6
<tb>
<tb> 9913 <SEP> C <SEP> 2923 <SEP> 3.0 <SEP> 0.5 (dil.l:
5) <SEP> +1
<tb>
EMI11.4
dam. de lldnLj Vstt, e No. a.e tumors in. dead weight observations 7.a prepared ''. in p 0 / chancpt in dead observations ration cm / diam. 0 C> weight tumor ra-cion
EMI11.5
<tb> comparat. <SEP> of <SEP> tumor
<tb>
<tb> would appear.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
9907 <SEP> 0.40 / 0.95 <SEP> -3.0 / -2.0 <SEP> 1 <SEP> Prep. <SEP> before
<tb>
<tb>
<tb> dialysis
<tb>
<tb>
<tb> 9910 <SEP> 0.55 / 1.13 <SEP> -1.5 / -1.0 <SEP> 1 <SEP> dialysis <SEP> 2 <SEP> hours
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9911 <SEP> 0.62 / 1.13 <SEP> -3.0 / -1.0 <SEP> 1 <SEP> dialysis <SEP> 4 <SEP> hours <SEP> 1/23
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9912 <SEP> 0.86 / 1.13 <SEP> -1.0 / -1.0 <SEP> dialysis <SEP> 6 <SEP> hours <SEP> 1;
/ 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9913 <SEP> 0.45 / 0.74 <SEP> -4.5 / 41.0 <SEP> liquid <SEP> to <SEP> in-
<tb>
<tb>
<tb>. <SEP> <SEP> of <SEP> the <SEP> mem-
<tb>
<tb>
<tb> brane <SEP> in <SEP> dialysis
<tb>
<tb>
<tb> after <SEP> 18 <SEP> hours <SEP> 1/2
<tb>
x Tests performed at -The Division for Experimental Chemotherapy, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York xx + Tumor diameter 25% or less of the comparative tumor ++ Tumor diameter 25-50 7;
comparative tumor
T- = Diameter of, tumor 50-75 of the comparative tumor
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The table shows an easily dialyzable tumor inhibitor which passes through the memory within the first four hours of dialysis. A non-dialyzable substance, which also slows the development of tumors is also present.
To further characterize the biological properties of the tumor inhibiting substances contained in Calvatia maxima, dilution tests were performed on several of the previously mentioned preparations at the Sloan-Kettering Institute. Generally, the inhibitory activity decreased with increasing dilution. Some representative data are collated in Table 4.
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Board. 4 Inhibition of tumors from dilutions of extracts of Calvatia maxima (Dressai tumor: Sarcoma 180) *
EMI13.1
<tb> No. <SEP> of <SEP> Doses <SEP> cm3 <SEP> diam.de <SEP> changt.de
<tb>
<tb>
<tb> the <SEP> prepa- <SEP> 2 <SEP> times <SEP> Effects <SEP> xx <SEP> tumor <SEP> in <SEP> weight <SEP> in
<tb>
<tb>
<tb> ration <SEP> per <SEP> day <SEP> cm / diam. <SEP> g./changt. <SEP> dead
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> tumor <SEP> of <SEP> weight
<tb>
<tb>
<tb> comparat. <SEP> of <SEP> tumor
<tb>
<tb>
<tb> comparat.
<tb>
EMI13.2
9895 0,, 5 (cLil .1.-50) i- 0.66 / 1.22 -3tolr2so 0.5 d% .1: 100 0.66 / 1.23 -1.5 / -2.0 9895 0.5 dil. 1: 200 0.76f1.22 -2 2 Ô7 / -2 e 0 '0.5 d1.1: 400 0.85 / 1.22 -1.5 / -2, Q
EMI13.3
<tb> 0.5 (dil. 1: 800) <SEP> - <SEP> 1.21 / 1.22 <SEP> -0.5 / -2.0
<tb>
<tb> 9898 <SEP> 0 <SEP> 5.5 <SEP> dU <SEP> -1. <SEP> 100 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0.43 / 0.95 <SEP> -3.5 / -2.5 <SEP> 1
<tb> 0.5 <SEP> di1.1: 200 <SEP> + <SEP> 0.67 / 0.95 <SEP> -1.0 / -2.5
<tb> 0.5 <SEP> DIL.1: 400 <SEP> +12 <SEP> 0.56 / 0.95 <SEP> -1.0 / -2.5
<tb> 0.5 <SEP> dil.l: 800 <SEP> = <SEP> 0.77 / 0.95 <SEP> -1.0-2.5
<tb>
EMI13.4
c'906 0.5 (dil.l: 10 + ¯ + z3 / 1.02 -4.5 / -1.0 1 0.51.1: 20 1 - 0.58 / 1.02 -2e5rlso 0.5 [ L-Ll, 1: 40 1 - 0.55 / 1.02 -1.0 / -1.0 1 O, 5 (dil. 1: 80 - 0.77 / 1.02 + 0.5 / -1 , 0
EMI13.5
<tb> 9907 <SEP> 0.5 <SEP> dil.l: 5) <SEP> ++ <SEP> 0.47 / 1.02 <SEP> -2.5 / -1.0
<tb>
<tb> 0.5 <SEP> dil.1:
10) <SEP> ++ <SEP> 0.50 / 1.02 <SEP> -2.0 / -1.0
<tb>
EMI13.6
0.5 dit 1 - O, i4 / 1.02 L, 0 / -1.0
EMI13.7
<tb> 0.5 <SEP> dil.l: 40) <SEP> 0.73 / 1.02 <SEP> -1.5 / -1.0
<tb>
x Tests carried out at the Division for Experimental Chemotherapy
EMI13.8
Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, iow York xx + Tumor diameter 25% or less of comparative tumor + + Tumor diameter 25-50% of comparative tumor +1 Tumor diameter 50-75% of comparative tumor
It has been found that significant anti-tumor activity remains in an aqueous extract of Calvatia maxima after contacting the extract with various synthetic ion exchange resins.
Although particular embodiments of the invention have been described in detail to illustrate it, it is obvious that many variants can be produced without departing from its scope.