<Desc/Clms Page number 1>
In verschillende octrooischriften is reeds een bereidingswijze van oxytetracycline langs biochemische weg beschreven, o.a. in het Amerikaan- se octrooischrift N 2.516.080 en in het Britse octrooischrift N 684.417.
Hierbij wordt gebruik gemaakt van de actinomyceet Streptomyces rimosus. Het is bekend. dat dit micro-organisme tevens een fungicied werkende stof vormt (Antibiotics & Chemotherapy (1951) 289-90).
Tijdens een uitvoerig onderzoek op het gebied der antibiotica is nu uit een grondmonster afkomstig uit Zuid-Frankrijk een nieuwe acti- nomyceet gekweekt, die in zijn morphologische en biochemische eigenschappen belangrijke verschillen vertoont met de bekende Streptomyces rimosus. De nieuwe actinomyceet werd Streptomyces vendargus genoemd. In tabel I zijn de eigenschappen van de Streptomyces vendargus. gekweekt op verschillende cultuurmedia, vergeleken met die van de Streptomyces rimosus.
In deze tabel is het vegetatief mycelium de kolonie genoemd, terwijl het sporogeen mycelium is aangeduid met luchtmycelium.
Cultuurmedium-Streptomyces rimosus -- Streptomyces vendargus N .R .R .L. 2234 havermout agar donker-bruine kolonie bleek-gele kolonie der-bruine kolonie $bleek-gele kg donkere verkleuring v. geen verkleuring van d. voedingsbodem de voedingsbodem weinig wit lucht- geen luchtmycelium mycelium grondlucht geen geur Emerson agar donker-bruine kolonie licht-bruine kolonie (15/A12:
Burnt Amber) (14/D5) donkere verkleuring van geen verkleuring van de voedingsbodem de voedingsbodem weinig wit luchtmycelium overvloedig wit luchtmycelium geen geur geen geur Sabouraud agar zwart-bruine kolonie gelige kolonie (16/C3 Rodent) donkere verkleuring van geen verkleuring van de voedingsbodem de voedingsbodem vrij veel geel-wit lucht- weinig wit lucht- mycelium mycelium sterke grondlucht geen geur Aardappel agar slecht ontwikkelde,
slecht ontwikkelde bruin tot violette bruinige kolonie kolonie geen verkleuring van de geen verkleuring van de voedingsbodem voedingsbodem weinig wit luchtmycelium geen luchtmycelium
Zwakke grondlucht geen geur
<Desc/Clms Page number 2>
Cultuurmedium Streptomyces rimosus Streptomyces vendargus N.R.R.L. 2234 Natriumcitraat grijs-groene kolonie witte kolonie (2/Al) agar (3/A - 13/J5) geen verkleuring van de geen verkleuring van de voedingsbodem voedingsbodem geen luchtmycelium geen luchtmycelium rottingsgeur geen geur GluoQsenitraat bruin tot paarse kolonie bleek-gele kolonie (13/K) (10/B1 Oyster White) géle verkleuring van de geen verkleuring van de voedingsbodem voedingsbodem geen luchtmycelium geen luchtmycelium sterke grondlucht geen geur Aardappelschijfjes goed ontwikkelde,gele zeer goed ontwikkelde,
kolonie (12/E5) geel tot bruine kolonie (12/D5 -13/L7) weinig wit luchtmycelium veel wit luchtmycelium Zetmeel agar bruine kolonie bleke, bijna kleurloze kolonie geel-bruine verkleuring geen verkleuring van de van de voedingsbodem voedingsbodem weinig wit luchtmycelium wit luchtmycelium grondlucht geen geur (De tussen haakjes geplaatse gegevens zijn de kleuren volgens A Dictionary of Color van A. Maerz en M. Rea Paul, 2e ed. 1950).
Uit de tabel blijkt, dat de kolonies van de Streptomyces rimosus op de meeste voedingsbodems donkerder gekleurd zijn dan die van de Streptomy- ces vendargus. Een kenmerkend verschil is de geur. Terwijl de Streptomyces rimosus op de meeste voedingsbodems een meer of minder sterke grondlucht heeft, verspreidt de Streptomyces vendargus geen of vrijwel geen geur.
Vergelijkt men de luchtmycelia van de beide Actinomyces-soorten, dan blijkt dat de Stryptomyces rimosus practisch altijd voorkomen in gesloten spiraal- vormige windingen, terwijl dat van de Streptomyces vendargus op geen voe- dingsbodem spiralen vormt. De Streptomyces vendargus vormt kolonies van het z.g. "tuft-type" (vgl.S.A. Waksman, The Actinomycetes 1950).
Er is nu gevonden, dat Actinomyces vendargus novo spec. bij het kweken onder passende voorwaarden op verschillende vloeibare voedingsbodems niet alleen het reeds bekende antibioticum oxytetracychine, doch bovendien andere antibiotica vormt.
<Desc/Clms Page number 3>
Een van deze andere antibiotisch werkende producten is een sterk fungicied werkende stof, die vengicide is genoemd. Het vengicide ver- schilt zowel wat betreft zijn chemische als bio-chemische eigenschappen van de fungicied werkende stof, welke door de Streptomyces rimosus wordt gevormd. Het vengicide is een witte kristallijne stof, met een amphoteer karakter. De oplosbaarheid in water is gering, n.l. ca 0.4 mg/cm3. De pH van de verzadigde oplossing in water! bedraagt ca 6.3 . Het smeltpunt bedraagt
EMI3.1
240.5 -242 C, de specifieke draaiingof. 20 = -I$ in 0.1 n zoutzuur. Het moleculair gewicht van de stof is ca 600.
Be vermoedelijke empirische for- mule is C H30O10N10 De elementair analyse gaf: C 46,75%, H 4,95%, N 22,86% en 0 25,44% -(berekend).
EMI3.2
In het ultraviolette absorptiespectrtm werden maxima gevonden bij 233,5 m g1 en 273.5 m u, wanneer de stof was opgelost in 0.05 n zoutzuur. Aan een oplossing in paraffine-olie (bekend als "Nujol") en hexachloorbutadieen werden de volgende absorptiebanden gemeten: 2920, 2240,1650, 1580, 1485, 1450, 1365, 1320, 1250, 1200, 1040, 985, 910, 885 cm -1. Een grafische voorstel- ling van deze absorptie is op de bladen Ia en Ib weergegeven. Hierin is op de abscis de golflengte van het licht in u, op de ordinaat het percentage doorgelaten licht getekend.
EMI3.3
Men kan de biologisch actieve stoffen uit het cultuurfiltraat van dp Streptomyces vendargus scheiden door middel van papierchromatografie.
Wer deze chromatografie gedaan bij 26 c op Eaton-Dikeman papier ? H. 613 met Behulp van een elutie-middel van de volgende samenstelling: 600 cm3 met
EMI3.4
water verzadigde butanol, 12 g para-tolueensulfonzuur en 4.8. cm3 piperidi- ne, dan is de R f waarde van vengicid. 0a45, terwijl onder dezelfde omstan- digheden de fungicied werkende stof uit de Streptomyces rimoslis een R f waar- de bezit van 0.70.
Bij papierchro-matografis he scheidingen bij een te%peratuur"van 20 C op hetzelfde papier, echter met een ander elutiemiddel, werden respec-
EMI3.5
tievelijk de R#-waarden 0.45 en 0.31 gevonden. Hierbij was als elutie-middel de bovenlaag gekozen van een mengsel van 4 Solen butanol, 1 deel aethanol en 5 delen water.
Bij deze papiereliromatoglafie bleek tevens, dat de Streptomyces vendargus nog een aantal andere antibiotisch werkzame stoffen maakt en wel een complex van 2 à 3 stoffen met een Rf waarde van 0.04 - 0.08 (26 C, op-
EMI3.6
losmiddel : met water verzadigde butanol, p-tolueensulfonzuur en p.pex.d3ne) welke o.a. een grote activiteit bezitten op Bacillus subtilis (Stam Marburg).
Verder werd in het cultuurfiltraat ván de Streptomyces vendargus een twee- tal in zuur milieu weinig bestendige antibiotische stoffen gevonden met een R waarde van 0.05 - 0.13 ( bij 20 C oplosmiddel: bovenlaag van butanol, athanol en water in de verhouding 4:1:5), die een remmende werking verto-
EMI3.7
nen op de groei van 0.11. Saccharomyces. Deze stoffen worden niet aangetrof- fen in de cultuurfiltraten van de Streptomyces rimosus.
In tabel II is een overzicht gegeven van de antibiotische werking van het vengicide op verschillende micro-organismen. Tevens is de werking
EMI3.8
van het fungicide van de Streptomyces rimosus ter vergelijking weergegeven.
<Desc/Clms Page number 4>
Tabel II medium Peptonagar + 1% glucose.
4 dgn bij 30 C bebroed. Concentratie 5 /cm3.
EMI4.1
<tb>
- <SEP> inactief <SEP> + <SEP> actief
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vengicide <SEP> Rimocidine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Blastomyces <SEP> sulfureum <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitidis <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> menthagrophytes <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> N <SEP> 34- <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cladosporium <SEP> cucumerinum <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fusarium <SEP> spec.
<SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> Verticillium <SEP> dahliae
<tb>
De nieuw ontdekte actinomyceet blijkt uitstekend geschikt te zijn zowel voor de productie van oxytetracycline als voor het vengicide.
Gezien de variabiliteit, waaraan levende wezens en de microben in het bijzon- der onderhevig zijn, dient met nadruk te worden verklaard, dat de bereidings- wijze van de antibiotica oxytetracycline en vengicide volgens de uitvinding niet is beperkt tot het gebruik van slechts die micro-organismen, die volko- men en tot in alle finesses door de hier gegeven karakteristiek worden gedekt.
Zo zullen hieronder ook de mutanten van de Streptomyces vendargus vallen, die hieruit kunnen worden verkregen met behulp van middelen of stoffen, die muta- tie veroorzaken, voorzover zij oxytetracycline en vengicide produceren.
De antibiotica oxytetracycline en vengicide worden bereid door de Streptomyces vendargus aeroob te kweken en uit de aldus verkregen cultuur de werkzame stoffen af te scheiden. Bij voorkeur kweekt men de Streptomyces vendargus als submerse cultuur in een vloeibaar voedingsmedium onder sterie- le omstandigheden in gesloten vaten, welke zijn voorzien van roerinrichtingen en waaraan voor de beluchting tijdens de kweek steriele zuurstof of lucht kan worden toegevoerd. De tijd gedurende welke wordt gekweekt, de temperatuur en de andere voorwaarden welke in acht moeten worden genomen om goede opbreng- sten aan antibiotica te verkrijgen, zullen hieronder nader worden gesproken.
- De voedingsbodem dient een koolstofbron en een bron voor organi- sche en anorganische stikstof te bevatten, terwijl tevens de aanwezigheid van minerale z'outen, zoals fosfaten, kalium- en natriumzouten, en sporen van ver- schillende metalen gewenst is. Dikwijls zijn echter de in de praktijk gebezig- de grondstoffen voldoende verontreinigd met deze minerale zouten, zodat extra toevoeging hieraan overbodig is.
Als koolstofbron kunnen zowel oplosbare als onoplosbare koolhy- draten worden gebruikt, zoals glucose, saccharose, lactose of zetmeel. Ook suikeralcoholen, zoals glycerol, zijn bruikbaar.
<Desc/Clms Page number 5>
De hoeveelheid van de koolstofbron in het medium kan sterk varieren, afhan- kelijk van de aard van het gebruikte koolhydraat en van de verdere samen- stelling van het medium; zij ligt in het algemeen ongeveer tussen 0.5 en 5% van het gewicht van het medium.
Als stikstofbron voor de bereiding van de antibiotica volgens de uitvinding komen velerlei stoffen in aanmerking. Genoemd kunnen worden al of niet gehydroliseerde caseïne, maisweekwater, pepton, vleesextract, visextract, vismeel, soyameel, aardnotenmeel, nitraten. Veelal hangt het van de opbrengst en van de verdere samenstelling van het medium af en ook van dikwijls wisselende economische factoren, welke stikstofbron men zal kiezen voor productiedoeleinden.
Ook kunnen geringe hoeveelheden stikstofhoudende grondstoffen, zoals gistextract, distillers solubles, enz., in bepaalde media een aanzien- lijke verhoging van de opbrengst aan antibiotica geven.
De duur van de gisting is sterk afhankelijk van de samenstelling van het voedingsmedium. Zij varieert'gewoonlijk tussen 3 en 4 etmalen, maar de gisting kan desgewenst ook langer worden voortgezet, indien de aldus ver- kregen verhoging van de opbrengst aan antibiotica de grotere kosten van een langere gistingscyclus rendabel maakt.
De temperatuur, waarbij de gisting wordt uitgevoerd, kan in prin- cipe variëren tussen 20 en 35 C. Bij voorkeur worden temperaturen van circa 26-28 C toegepast.
Voor een optimale groei van het organisme en opbrengst aan anti- biotica is het noodzakelijk de pH tijdens de gisting binnen vrij nauwe gren- zen te houden, bijv. tussen 5.0 en 8.0. Na de sterilisatie wordt het voedings- medium op een pH tussen 6 en 7 gebracht. Bij voorkeur wordt de gisting uitge- voerd bij een pH tussen 6.5 en 7.3, daar de ervaring heeft geleerd, dat hier- bij de hoogste opbrengsten worden verkregen. Het constant houden van de pH tijdens de gisting kan geschieden door op steriele wijze op gezette tijden loog toe te voegen. Gewoonlijk gebruikt men echter als een soort bufferstof vast calciumcarbonaat in hoeveelheden variërend van 0.2 - 1. 0 gew. % van het medium.
De hoeveelheid lucht, welke tijdens de gisting op steriele wijze in het medium wordt geleid, is sterk afhankelijk van de vorm van het vat, van de snelheid en van de vorm van de roerder(s). In het algemeen varieert deze hoeveelheid tussen 0.5 en 4 liter per liter voedingsmedium per minuut.
Als entmateriaal gebruikt men in het hoofdgistingsvat bij voor- keur 48-72 uur oude voorculturen van de Streptomyces vendargus. Teneinde goe- de opbrengsten te verkrijgen en schommelende uitkomsten te voorkomen, ent men bij voorkeur met hoeveelheden van een cultuur, die 3-6 vol.% van het voedingsmedium in het hoofdgistingsvat bedragen. Het is duidelijk, dat men bij grote gistingsvaten enige trappen van voorcultures moet gebruiken. Ech- ter kan ook een gedeelte van de cultuur, bijv. 10%, in het hoofdgistings- vat worden bewaard voor het aanzetten van een nieuwe cultuur. Ook kan men de gehele gisting continu uitvoeren.
Voor de isolering van de antibiotica uit een uitgegiste cultuur komen verschillende, voor zulke stoffen gebruikelijke, methoden in aanra- king. Bij voorkeur zuurt men, voordat aan de eigenlijke isolering wordt be- gonnen, de uitgegiste cultuur vloeistof aan tot een pH van 2.0-2.5, bij voor- keur tot pH=2.2. Daarna filtreert of centrifugeert men de vloeistof ter ver- wijdering van het mycelium. Zuurt men niet aan, dan verliest men 20-25% van de hoeveelheid aanwezige oxytetracycline.
Na de verwijdering van het mycelium en eventuele andere vaste bestanddelen uit de gistingsvloeistof kunnen de antibiotica aan geactiveer- de kool worden geadsorbeerd bij een pH van ca. 7.0. Zij worden vervolgens ge#lueerd met behulp van een gedeeltelijk met water mengbare alcohol, zoals
<Desc/Clms Page number 6>
butanol, bij een pH van cao 1.5. Bij voorkeur wordt ge#lueerd met een meng- sel van butanol, water en phenol. Na concentrering van het eluaat door ver- damping van de oplosmiddelen in vacuum wordt de vloeistof geëxtraheerd met een niet of gedeeltelijk met water mengbare alcohol, zoals butanol of amy- lalcohol, bij een pH van ca 9.0.
Uit de aldus verkregen oplossing van de antibiotica in bijv. butanol kan nu door extractie met water bij een pH van ca 2.0 een waterige oplossing van de antibiotica worden verkregen.
Uit deze oplossing kan, eventueel na concentrering, het oxyte- tracycline op bekende wijze (zie Belgisch octrooischrift 506.950 worden neergeslagen met behulp van magnesiumchloride en een quaternair ammonium-- zout, zoals hexadecyltrimethylammoniumchloride, bij een pH van ca 9.0. Dit neerslag kan gemakkelijk verder worden verwerkt tot zuiver oxytetracycline of tot het zoutzure zout hiervan. Hoewel vengicide evenals oxytetracycline een stof met amphoteer karakter is, wordt het niet neergeslagen met een quaternaire ammoniumbase. Het vengicide kan dus worden verkregen uit het filtraat van bovengenoemd neerslag van oxytetracycline. Daartoe kan men het filtraat extraheren met bijv. butanol bij een pH van ca. 9.0 en de verkre- gen butanolische oplossing van vengicide weer extraheren met water bij een pH van CA 2. 0.
Na eventuele concentrering wordt het vengicide dan volgens de uitvinding kristallijn verkregen door de waterige oplossing op een pH tussen 4. 0 en 5.0 te brengen.
Ook kan het van mycelium bevrijde cultuurfiltraat, eventueel na concentreren door verdamping, direct met een alcohol uit de greep van butanol en amylalcohol worden geëxtraheerd bij een pH van ca 9000 De aldus verkregen oplossing der antibiotica kan dan weer met water worden geëxtra- heerd bij een pH van ca 2.0.
Nadat de waterige oplossing van de antibiotica op de gewenste sterkte is gebracht, wordt het oxytetracycline op de boven aangeduide wijze neergeslagen met een quaternaire ammoniumbase. Uit het filtraat wordt dan het vengicide gewonnen.
Bij een bij voorkeur gevolgde isoleringsmethode volgens de uit- vinding maakt men gebruik van een in de handel verkrijgbare ionenuitwisse- laar met zwakzuur karakter,' n.l. van "Duolite S 30", een phenolische kunst- hars van de Chemical Process Company. Het was in het geheel niet te verwach- ten, dat een amphotere stof als oxytetracycline geadsorbeerd kon worden aan deze zwakzure ionenuitwisselaar. Immers indien ionenuitwisselaars worden gebruikt voor de adsorptie van amphotere stoffen, dan zijn uitwisselaars met hetzij sterk zure, hetzij met sterk basische eigenschappen aangewezen.
Voor de isolering van de antibiotica met behulp van "Duolite S 30" voert men het van mycelium bevrijde cultuur - filtraat bij een pH van Ca 2.5 door een met die uitwisselaar gevulde kolom. Bij een geschikte keuze van de leng- te van de kolom en de hoeveelheid door te voeren cultuurfiltraat kan men adsorptie zodanig laten verlopen, dat practisch uitsluitend het oxytetra- cycline wordt geadsorbeerd en het vengicide opgelost blijft. Dit laatste kan dan hetzij door adsorptie aan actieve kool, hetzij door directe extrac- tie met bijv. butanol bij een geschikte pH worden gewonnen. Het geadsorbeer- de oxytetracycline wordt met loog geëlueerd en kan verder op bekende wijze worden verwerkt tot zuiver oxytetracycline.
De uitvinding wordt néder toegelicht in de volgende voorbeelden.
Voorbeeld I.
Uit een buis met een Streptomyces vendargus cultuur op bijv.
Emerson's agar, waarop een goede sporulatie heeft plaatsgevonden, brengt men geringe hoeveelheden conidiën op steriele wijze over in schudflesen van ongeveer 2 liter inhoud, waarin 500 cm3 van een vloeibaar voedingsme- dium is gebracht. Dit medium bestaat uit:
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> moutextract <SEP> (Balling <SEP> 12) <SEP> 10%
<tb>
<tb>
<tb> pepton <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> keukenzout <SEP> 0.5%
<tb>
Na 48 uur bebroeden op 26 C, waarbij het medium voortdurend wordt geschud, wordt met de inhoud van 2 schudflessen een gistingsvat geënt waarin zich 15 liter van het volgende voedingsmedium bevindt:
EMI7.2
<tb> soyameel <SEP> 2%
<tb>
<tb> aardappelzetmeel <SEP> 1%.
<tb>
Dit medium is na de sterilisatie met'steriele kaliloog op een pH=7.0 ge- bracht. Men laat nu 3 etmalen groeien bij 27 C, onder voortdurend beluchten en roeren. Na afloop van deze termijn blijkt bij onderzoek, dat het vat 195 microgram oxytetracycline per cm3 bevat.
Voorbeeld II.
Uit een buis met entmateriaal, als beschreven in voorbeeld I, ent men 500 cm3 van een voedingsmedium van de volgende samenstelling:
EMI7.3
<tb> pepton <SEP> 0.5%
<tb>
<tb> ingedikt <SEP> maisweek-
<tb>
<tb> water
<tb>
<tb> (45% <SEP> droge <SEP> stof) <SEP> 0.6%
<tb>
<tb>
<tb> glucose <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> Keukenzout <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
(met kaliloog op i pH=7.0 gebracht)
Na bebroeden onder voortdurend schudden bij 26 C gedurende 48 uur wordt de gehele cultuur steriel overgebracht in een gistingsvat, voor- zien van een roerder en een inrichting voor het inblazen van steriele lucht, dat 15 liter van een cultuurmedium van de volgende samenstelling bevat:
EMI7.4
<tb> aardnotenmeel <SEP> 2 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> aardappelzetmeel <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ingedikt <SEP> maisweekwater
<tb>
<tb> ( <SEP> 45% <SEP> droge <SEP> stof) <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> keukenzout <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4 <SEP> 7H2O <SEP> 0. <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0.05%
<tb>
(met kaliloog op een pH=
7.0 gebracht).
Na 2 etmalen bebroeden bij 28 C onder voortdurend beluchten en roeren, blijkt per cm3 van de kweekvloeistof 180 microgram oxytetracycline te zijn gevormd.
Voorbeeld III.
LOCO cm3 van het entmateriaal, verkregen met behulp van schudcultures vol- gens voorbeeld I, wordt op steriele wijze overgebracht in een afgesloten rat, voorzien van een roerder en een inrichting voor het doorleiden van ste- riele lucht. In dit vat bevindt zich 15 liter van een steriel medium van de volgende Samenstelling:
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> glucose <SEP> 3 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> KCI <SEP> 0.4%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 0.5"%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0.02 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ingedikt <SEP> maisweekwater
<tb>
<tb>
<tb> (45% <SEP> droge <SEP> stof) <SEP> 0.2 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> calciumcarbonaat <SEP> 0.8%
<tb>
Na 4 etmalen bebroeden bij 26 C onder voortdurend roeren en doorleiden van steriele lucht blijken 475 microgram'oxytetracycline en 270 microgram vengi- cide per cm3 te zijn gevormd.
Voorbeeld IV.
500 cm3 van het entmateriaal wordt evenals in voorbeeld III in 15 liter van een kweekvloeistof van de volgende samenstelling gebracht :
EMI8.2
<tb> gedroogde <SEP> gist <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb> keukenzout <SEP> 0.5 <SEP> %
<tb>
<tb> ferrosulfaat <SEP> 0.005%
<tb>
Na 5.dagen bebroeden bij 26 C onder roeren en beluchten blijken bij analyse per cm3 van de cultuurvloeistof 443 microgram oxytetracycline en 210 microgram vengicide te zijn gevormd.
Voorbeeld V.
750 cm3 van het entmateriaal wordt op steriele wijze in een voedingsbodem van de volgende samenstelling gebracht:
EMI8.3
<tb> gedroogde <SEP> gist <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb> keukenzout <SEP> 0.5 <SEP> %
<tb>
<tb> f <SEP> errosulfaat <SEP> 0.005 <SEP> %
<tb>
<tb> glucose <SEP> 1 <SEP> %
<tb> calciumcarbonaat <SEP> 0.5 <SEP> %
<tb>
Na 4 etmalen bebroeden onder aerobe voorwaarden werden bij onderzoek in de cultuurvloeistof 413 microgram oxytetracycline en 211 microgram vengicide aangetroffen.
Voorbeeld VI.
10 liter van de uitgegiste vloeistof verkregen volgens voorbeeld III wordt met sterk zoutzuur onder roeren op pH=2.2. gebracht. Na een half uur roeren wordt gecentrifugeerd met behulp van een Sharpless centrifuge. Op deze wij- ze wordt een opalescente vloeistof verkregen, die na enige tijd staan helder wordt gefiltreerd over een of meer filters, welke zijn voorzien van het in de handel onder de naam Filtrarapid bekende filterhulpmiddel. Het heldere filtraat-wordt nu met behulp van natronloog op pH=7.3 gebracht en gedurende 15 minuten geroerd met 100 g actieve kool. Het adsorbens wordt vervolgens door filtreren afgescheiden, met water gewassen en aan de lucht gedroogd.
De luchtdroge kool, waaraan de antibiotica zijn geadsorbeerd, wordt nu 5 keer met 1 liter met water verzadigde butanol, die 10 g phenol bevat, ge#lueerd bij een pH=1.5. Na iedere elutie wordt de actieve kool opnieuw in het elutie- middel gesuspendeerd en met zoutzuur op de gewenste pH gebracht. Het eluaat wordt nu met natronloog op pH=2.5 gebracht en in een retourverdamper in va- cuum geconcentreerd (bij ca 35 C) tot een volume van ca 1 liter. Deze vloei- stof bevat"nu, zoals door microbiologische bepalingen kan worden vastgesteld, 3.8 g oxytetracycline (80% van de oorspronkelijke hoeveelheid) en 2.56 g ven-
<Desc/Clms Page number 9>
gicide (95% van de oorspronkelijke hoeveelheid).
Het geconcentreerde eluaat wordt met natronloog op pH=9.5 ge- bracht en 4 keer met 0.75 liter butanol geëxtraheerd. Het butanolextract wordt met zoutzuur op pH=2.0 gebracht en 5 keer met 0. 75 liter water ge#x- traheerd. De verkregen waterige oplossing bevat 2.85 g oxytetracycline en
2. 31 g vengicide. Deze oplossing wordt met natronloog op pH=2.5 gebracht en in eenrretourverdamper tot ca 1400 cm3 geconcentreerd, d.w.z. tot een con- centratie van ca 2 mg oxytetracycline per cm3. Aan deze geconcentreerde op- lossing worden achtereenvolgens toegevoegd 112 cm3 van een 0.1 molair op, lossing van magnesiumchloride, 5.6 cm3 van een 50%-ige oplossing van citrcen- zuur en 14 g van een 33%-ige oplossing van hexadecyltrimethylammoniumchlori- de.
Vervolgens wordt met natronloog qp een pH=9.0 gebracht. Het vlokkige neerslag, dat ca 98% van de in de oplossing aanwezige oxytetracycline bevat, wordt gefiltreerd, en bij 40-45 in vacuo gedroogd.
Dit neerslag wordt nu 5 keer met ca 13 cm3 methanol uitgetrok- ken. Aan dit methanolisch extract wordt 3.5 cm3 sterk zoutzuur (s.g. 1. 19) toegevoegd, waarna het chloorhydraat van oxytetracycline spontaan kristal- liseert. Opbrengst 2.2 g. Het filtraat van het neerslag van oxytetracycli- ne met de quaternaire ammoniumbase wordt bij pH=9.5 5 keer met 0.75 liter butanol geëxtraheerd. Het butanolische extract wordt met zoutzuur op pH=2.0 gebracht en 3 keer met 1 liter water ge#xraheerd. De waterige oplossing wordt met natronloog op pH=2.5 gebracht en in een retourverdamper in Vacua tot ca 100 cm3 geconcentreerd. Daarna wordt portiegewijs met natronloog op pH=4.5 gebracht.
Het vengicide kristalliseert hierbij uit als een geel ge, kleqrde kristallijne massa. Opbrengst 1. 9 g. Door oplossen in verdund zout- zuur* ontkleuren met actieve kool en opnieuw neerslaan bij pH=4.5 kan de stof gereinigd worden. De witte kristallen smelten bij 20.5 - 242 C.
.
Voorbeeld VII.
10 liter van de uitgegiste vloeistof, verkregen volgens voorbeeld III, wordt met sterk zoutzuur onder roeren op pH=2.2 gebracht. Na een half uur roeren wordt gecentrifugeerd met behulp van'een Sharpless centrifuge. De opalescen- te vloeistof wordt nog een of meer keren met een filterhulpmiddel gefiltreerd, waardoor tenslotte een helder filtraat wordt verkregen. Dit filtraat wordt nu, nadat het op pH=2.5 is gebracht, met een snelheid van ca 1 liter per uur door een kolom "Duolite S 30" gevoerd. De kolom is 75 cm lang, heeft een middellijn van ca 4.6 cm en is geregenereerd met natronloog en wordt voor elk gebruik gewassen met ongeveer 1250 cm3 van een 0.5 molair acetaat- buffer met een pH=4.5 en vervolgens met 400 cm3 water. Nadat het cultuur- filtraat door de kolom is gevoerd, wordt nagewassen met 400 cm3 water.
Het filtraat bevat nu ongeveer 90% van het vengicide terwijl het oxytetra- cycline quantitatief is geadsorbeerd. De isolering van het vengicide ge- schiedt verder geheel volgens voorbeeld VI, d.w.z. het wordt geadsorbeerd aan actieve kool, geëlueerd met een water-butanol-phenol-mengsel, het eluaat wordt geconcentreerd, met butanol geëxtraheerd, de oplossing in butanol met water uitgetrokken, de waterige oplossing geconcentreerd bij pH=Z.5. Ver- volgens wordt door aan de waterige oplossing natronloog toe te voegen het vengicide bij pH=4.5 neergeslagen; deze stof wordt door kristallisatie ge- reinigd. De opbrengst bedraagt 2.0 g.
Het is duidelijk, dat, afhankelijk van de oorspronkelijk in het cultuurfiltraat.aanwezige hoeveelheid vengi- cide en van de andere in het cultuur filtraat aanwezige bestanddelen, een of meer van deze hier opgesomde bewerkingen achterwege kunnen blijven.
Het oxytetracycline wordt van de Duolite S 30-kolom met behulp van 2000 cm3 van een 0. 25 n waterige natronloogoplossing, die met een snel- heid van ca 1000 cm3 per uur wordt doorgevoerd, geëlueerd. Vervolgens wordt dit eluaat bij pH=2.0 in een retourverdamper in vacuo geconcentreerd tot
<Desc/Clms Page number 10>
1000 cm3. Deze oplossing bevat nu, zoals door microbiologisch onderzoek blijkt, 4.27 g oxytetracycline (d.i. 90% van de oorspronkelijke hoeveelheid).
De oplossing wordt bij pH=9.5 met butanol geëxtraheerd. Het verkregen buta- nolisch extract wordt bij pH=2.0 met water uitgetrokken. De aldus bereide waterige oplossing wordt in vacuo geconcentreerd tot een volume van ca 3000 cm3. De oplossing bevat nu 3. 2 g oxytetracycline. Deze hoeveelheid wordt quantitatief neergeslagen met behulp van de quaternaire ammoniumbase en ver- der gezuiverd, geheel als beschreven in voorbeeld VI. Er wordt 2. 6 g van het kristallijne chloorhydraat van oxytetracycline verkregen.
Voorbeeld VIII.
12 liter van de uitgegiste vloeistof, verkregen volgens voor- beeld III, wordt met sterk zoutzuur onder roeren op pH=2.2 gebracht en na een half uur roeren gecentrifugeerd. De opalescente vloeistof wordt in vacua tot een volume van 1200 cm3 geconcentreerd en vervolgens met behulp van een' filter-hulpmiddel gefiltreerd. Het heldere filtraat wordt met natronloog op pH 9.0 gebracht en 4-maal met 900 cm3 butanol geëxtraheerd. De butanolische oplossing wordt met zoutzuur op pH 2.0 gebracht en 5-maal met 1100 cm3 water geëxtraheerd. De aldus verkregen waterige oplossing van de antibiotica bevat, zoals uit een microbiologische analyse blijkt, 4.50 g oxytetracycline (80% van de oorspronkelijk aanwezige hoeveelheid) en 3.01 g vengicide (93% van de oorspronkelijk aanwezige hoeveelheid).
Na concentrering in vacuo tot een volume van ca 1900 cm3 wordt het oxytetracycline volgens de in voorbeeld VI beschreven methode met een quaternaire ammoniumbase en een aardalkalizout neergeslagen. Uit het filtraat wordt geheel op de in voorbeeld VI beschreven wijze het vengicide gewonnen . De -opbrengst aan oxytetracycline is 3.2 g en aan-vengicide 2. 2 g.
Voorbeeld IX.
10 liter van de uitgegiste vloeistof, verkregen volgens voor- beeld III, wordt met zwavelzuur onder roeren op pH=2.2 gebracht en na een half uur roeren gecentrifugeerd. De opalescente vloeistof wordt in vacuo tot een volume van 1000 cm3 geconcentreerd en vervolgens met behulp van een fil- terhulpmiddel gefiltreerd.
Het heldere filtraat wordt vervolgens met natronloog op pH=9.0 gebracht en 4 maal met 0. 75 liter butanol geëxtraheerd. De butanolische oplossing wordt bij pH= 2. 0 4 maal met 0.75 liter water uitgetrokken. Op deze wijze wordt ca 3.0 liter van een waterige oplossing van de antibiotica verkregen, die volgens de microbiologische analyse 3.8 g oxytetracycline en 2.4. g vengici- de bevat. Dit extract wordt in vacuo tot een volume van ca 1.0 liter gecon- centreerd. Deze oplossing wordt, in ongeveer 6 uur tijds, door 4 kolommen Duolite S 30 geleid. De eerste 3 kolommen bevatten elk-30 g Duolite, terwijl de vierde kolom 20g Duolite bevat. De kolommen, die 30 g adsorptiemiddel be- vatten, zijn 42 cm lang, de andrer is 28 cm lang.
De verhouding van de mid- dellijn en de lengte is ongeveer 1:15. Het Duolite in de kolommen is met na- tronloog geregenereerd en vervolgens zo lang met 0.1 n zoutzuur gewassen tot de pH van de doorlopende wasvloeistof gelijk aan 2.0 of lager is. Bij de ana- lyse van de kolommen blijken het oxytetracycline en het vengicide als volgt over de kolommen te zijn verdeeld :
EMI10.1
<tb> kolom <SEP> oxytetracycline <SEP> vengicide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 1330 <SEP> mg <SEP> 96 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 1235 <SEP> mg <SEP> 138 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 938 <SEP> mg <SEP> 173 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb> 235 <SEP> mg <SEP> 239 <SEP> mg
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
De doorlopende vloeistof is practisch vrij van oxytetracycline en bevat 1.85 g vengicide.
Deze vloeistof wordt in vacuo tot 100 cm3 gecon- centreerd en vervolgens op pH=4.5 gebracht. Hierbij slaat 1.8 g vengicide neer, dat door oplossen in 0.25 n zoutzuur en opnieuw neutraliseren tot pH= 4. 5 wordt gezuiverd.
De elutie van de kolommen geschiedt met 0. 25 n natronloog.
De vierde kolom wordt niet ge#lueerd maar voor een volgende adsorptie be- waard. Voor elke kolom wordt 300 cm3 natronloog gebruikt.
De verenigde eluaten worden met sterk zoutzuur op pH=2. 0 gebracht en in va- cuo tot 175 cm3 geconcentreerd. Deze oplossing bevat 20 mg oxytetracycline per cm3. Zij wordt geneutraliseerd, waarbij het oxytetracycline neerslaat.
Na filtreren, wassen met water en drogen weegt dit neerslag 3.7 g.
Het bevat 3. 4 g oxytetracycline. Dit neerslag wordt ter verdere zuivering opgeslibd in 27 cm3 methanol.Aan de suspensie wordt 4.5 cm3 geconcentreerd zoutzuur (s. g. 1. 9) toegevoegd. Het oxytetracycline wordt hierbij omgezet in het chloorhydraat, terwijl de verontreinigingen in oplossing gaan. Het zoutzure zout van oxytetracycline wordt gefiltreerd, met zoutzure methanol (0,1 n) en tenslotte met aether gewassen. De opbrengst aan oxytetracycline- chloorhydraat bedraagt 3.2 g.
<Desc / Clms Page number 1>
Several patents have already described a biochemical preparation of oxytetracycline, including US patent N 2,516,080 and British patent N 684,417.
Use is made of the actinomycete Streptomyces rimosus. It is known. that this micro-organism also forms a fungicidal substance (Antibiotics & Chemotherapy (1951) 289-90).
During extensive research in the field of antibiotics, a new actinomycete has now been cultivated from a soil sample from the south of France, which shows important differences in its morphological and biochemical properties from the well-known Streptomyces rimosus. The new actinomycete was named Streptomyces vendargus. Table I shows the properties of the Streptomyces vendargus. grown on different culture media, compared to that of the Streptomyces rimosus.
In this table, the vegetative mycelium is referred to as the colony, while the sporogenic mycelium is referred to as aerial mycelium.
Culture medium-Streptomyces rimosus - Streptomyces vendargus N .R .R .L. 2234 oatmeal agar dark brown colony pale yellow colony of brown colony $ pale yellow kg dark coloring v. No coloring d. breeding ground the breeding ground little white air no aerial mycelium mycelium ground air no odor Emerson agar dark brown colony light brown colony (15 / A12:
Burnt Amber) (14 / D5) dark discolouration of no discoloration of the culture medium the culture medium little white aerial mycelium abundant white aerial mycelium no odor no odor Sabouraud agar black-brown colony yellowish colony (16 / C3 Rodent) dark discoloration of no discoloration of the culture medium the breeding ground quite a lot of yellow-white air- little white air- mycelium mycelium strong soil smell no odor Potato agar poorly developed,
poorly developed brown to violet brownish colony colony no discoloration of the culture medium no discoloration of the culture medium little white aerial mycelium no aerial mycelium
Weak ground air no odor
<Desc / Clms Page number 2>
Culture medium Streptomyces rimosus Streptomyces vendargus N.R.R.L. 2234 Sodium citrate gray-green colony white colony (2 / Al) agar (3 / A - 13 / J5) no discolouration of the culture medium no discoloration of the culture medium no aerial mycelium no aerial mycelium putrefactive odor no odor GluoQsenitrate brown to purple colony pale yellow colony ( 13 / K) (10 / B1 Oyster White) yellow discoloration of the no discolouration of the culture medium no aerial mycelium no aerial mycelium strong soil smell no odor Potato slices well developed, yellow very well developed,
colony (12 / E5) yellow to brown colony (12 / D5 -13 / L7) little white aerial mycelium much white aerial mycelium Starch agar brown colony pale, almost colorless colony yellow-brown discoloration no discolouration of the nutrient medium little white aerial mycelium white aerial mycelium ground air no odor (Data in brackets are colors according to A Dictionary of Color by A. Maerz and M. Rea Paul, 2nd ed. 1950).
The table shows that the colonies of the Streptomyces rimosus are darker in most culture media than those of the Streptomyces vendargus. A characteristic difference is the smell. While the Streptomyces rimosus has a more or less strong ground odor on most nutrient soils, the Streptomyces vendargus has little or no odor.
A comparison of the aerial mycelia of the two Actinomyces species shows that the Stryptomyces rimosus practically always occur in closed spiral turns, while that of the Streptomyces vendargus does not form spirals on any substrate. The Streptomyces vendargus forms colonies of the so-called "tuft-type" (cf. S.A. Waksman, The Actinomycetes 1950).
It has now been found that Actinomyces vendargus novo spec. when cultivated under suitable conditions on various liquid culture media, not only produces the already known antibiotic oxytetracychin, but also other antibiotics.
<Desc / Clms Page number 3>
One of these other antibiotic products is a strong fungicidal substance called vengicide. The vengicide differs in both chemical and biochemical properties from the fungicidal substance produced by the Streptomyces rimosus. The vengicide is a white crystalline substance with an amphoteric character. The solubility in water is low, i.e. about 0.4 mg / cm3. The pH of the saturated aqueous solution! amounts to approximately 6.3. The melting point is
EMI3.1
240.5 -242 C, the specific rotation or. 20 = -I $ in 0.1 N hydrochloric acid. The molecular weight of the substance is approximately 600.
The putative empirical formula is C H30O10N10. Elemental analysis gave: C 46.75%, H 4.95%, N 22.86%, and O 25.44% - (calculated).
EMI3.2
In the ultraviolet absorption spectrum, maxima were found at 233.5 ml and 273.5 ml when the substance was dissolved in 0.05 N hydrochloric acid. The following absorption bands were measured on a solution in paraffin oil (known as "Nujol") and hexachlorobutadiene: 2920, 2240, 1650, 1580, 1485, 1450, 1365, 1320, 1250, 1200, 1040, 985, 910, 885 cm. -1. A graphic representation of this absorbance is shown on sheets Ia and Ib. The abscissa shows the wavelength of the light in u, the ordinate shows the percentage of transmitted light.
EMI3.3
The biologically active substances can be separated from the culture filtrate of Streptomyces vendargus by means of paper chromatography.
Was this chromatography done at 26c on Eaton-Dikeman paper? H. 613 using an eluting agent of the following composition: 600 cc of met
EMI3.4
water saturated butanol, 12 g para-toluenesulfonic acid and 4.8. cm3 piperidine, then the R f value of vengicid. 0a45, while under the same conditions the fungicidal substance from the Streptomyces rimoslis has an R f value of 0.70.
In paper chromatography separations at a% temperature of 20 ° C on the same paper, but with a different eluent, respects were obtained.
EMI3.5
found the R # values 0.45 and 0.31. The top layer of a mixture of 4 Solen of butanol, 1 part of ethyl alcohol and 5 parts of water was chosen as the eluent.
This paper eliromatoglaphy also showed that the Streptomyces vendargus produces a number of other antibiotic active substances, namely a complex of 2 to 3 substances with an Rf value of 0.04 - 0.08 (26 C, op-
EMI3.6
release agent: water-saturated butanol, p-toluenesulphonic acid and p.pex.d3ne) which, inter alia, have a high activity on Bacillus subtilis (Strain Marburg).
In addition, in the culture filtrate of the Streptomyces vendargus, two antibiotic substances with a low resistance in an acidic environment were found with an R value of 0.05 - 0.13 (at 20 ° C solvent: top layer of butanol, ethanol and water in the ratio 4: 1: 5 ), which has an inhibitory effect
EMI3.7
nen on the growth of 0.11. Saccharomyces. These substances are not found in the culture filtrates of the Streptomyces rimosus.
Table II provides an overview of the antibiotic effect of the vengicide on various microorganisms. The effect is also
EMI3.8
of the fungicide of Streptomyces rimosus for comparison.
<Desc / Clms Page number 4>
Table II medium Peptonagar + 1% glucose.
Incubated 4 days at 30 ° C. Concentration 5 / cm3.
EMI4.1
<tb>
- <SEP> inactive <SEP> + <SEP> active
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vengicide <SEP> Rimocidin
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Blastomyces <SEP> sulfurea <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitidis <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> menthagrophytes <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> N <SEP> 34- <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cladosporium <SEP> cucumerinum <SEP> - <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fusarium <SEP> spec.
<SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> Verticillium <SEP> dahliae
<tb>
The newly discovered actinomycete appears to be excellent for both the production of oxytetracycline and the vengicide.
In view of the variability to which living beings and microbes in particular are subject, it should be expressly stated that the method of preparation of the antibiotics oxytetracycline and vengicide according to the invention is not limited to the use of only those microbes. organisms, which are completely and finely covered by the characteristic given here.
Thus, it will also include mutants of the Streptomyces vendargus obtainable therefrom by means or substances which cause mutation, as long as they produce oxytetracycline and vengicide.
The antibiotics oxytetracycline and vengicide are prepared by aerobically culturing the Streptomyces vendargus and separating the active ingredients from the culture thus obtained. Preferably, the Streptomyces vendargus is grown as a submerse culture in a liquid nutrient medium under sterile conditions in closed vessels which are provided with stirrers and to which sterile oxygen or air can be supplied for aeration during the culture. The time of cultivation, the temperature and the other conditions that must be observed to obtain good yields of antibiotics will be discussed in more detail below.
The culture medium should contain a carbon source and a source of organic and inorganic nitrogen, while the presence of mineral salts, such as phosphates, potassium and sodium salts, and traces of various metals is desirable. However, the raw materials used in practice are often sufficiently contaminated with these mineral salts, so that additional addition is unnecessary.
As a carbon source, both soluble and insoluble carbohydrates can be used, such as glucose, saccharose, lactose or starch. Sugar alcohols, such as glycerol, can also be used.
<Desc / Clms Page number 5>
The amount of the carbon source in the medium can vary widely, depending on the nature of the carbohydrate used and the further composition of the medium; it is generally between about 0.5 and 5% of the weight of the medium.
Many substances are suitable as nitrogen source for the preparation of the antibiotics according to the invention. Mention may be made, whether or not hydrolysed, casein, corn steep water, peptone, meat extract, fish extract, fish meal, soybean meal, groundnut flour, nitrates. It often depends on the yield and the further composition of the medium, and also on often varying economic factors, which nitrogen source will be chosen for production purposes.
Also, small amounts of nitrogenous raw materials, such as yeast extract, distillers, solubles, etc., in certain media can significantly increase the yield of antibiotics.
The duration of the fermentation strongly depends on the composition of the nutrient medium. It usually varies between 3 and 4 days, but the fermentation can be continued for longer if desired, if the increase in the yield of antibiotics thus obtained makes the greater cost of a longer fermentation cycle profitable.
The temperature at which the fermentation is carried out can in principle vary between 20 and 35 ° C. Preferably temperatures of approximately 26-28 ° C are used.
For optimal growth of the organism and yield of antibiotics it is necessary to keep the pH during fermentation within fairly narrow limits, eg between 5.0 and 8.0. After sterilization, the nutrient medium is brought to a pH between 6 and 7. Preferably the fermentation is carried out at a pH between 6.5 and 7.3, as experience has shown that the highest yields are obtained here. The pH during fermentation can be kept constant by adding lye at regular intervals in a sterile manner. Usually, however, as a kind of buffering substance, solid calcium carbonate is used in amounts ranging from 0.2 to 1.0 wt. % of the medium.
The amount of air, which is introduced into the medium in a sterile manner during fermentation, is highly dependent on the shape of the vessel, the speed and the shape of the stirrer (s). In general, this amount varies between 0.5 and 4 liters per liter of nutrient medium per minute.
Preferably 48-72 hour old pre-cultures of the Streptomyces vendargus are used as inoculum in the main fermentation vessel. In order to obtain good yields and to avoid fluctuating results, it is preferred to inoculate with amounts of culture amounting to 3-6% by volume of the nutrient medium in the main fermentation vessel. Obviously, some preculture steps should be used with large fermenters. However, a portion of the culture, e.g. 10%, can also be kept in the main fermentation vessel for starting a new culture. The entire fermentation can also be carried out continuously.
For the isolation of the antibiotics from a fermented culture, various methods common for such substances are discussed. Preferably, before the actual isolation is started, the fermented culture liquid is acidified to a pH of 2.0-2.5, preferably to pH = 2.2. The liquid is then filtered or centrifuged to remove the mycelium. If no acidification is made, 20-25% of the amount of oxytetracycline present is lost.
After the removal of the mycelium and any other solids from the fermentation broth, the antibiotics can be adsorbed on activated charcoal at a pH of about 7.0. They are then eluted using a partially water miscible alcohol such as
<Desc / Clms Page number 6>
butanol, at a pH of cao 1.5. Preferably, it is eluted with a mixture of butanol, water and phenol. After concentration of the eluate by evaporation of the solvents in vacuum, the liquid is extracted with an alcohol that is not or partially miscible with water, such as butanol or amyl alcohol, at a pH of about 9.0.
From the solution of the antibiotics thus obtained in, for example, butanol, an aqueous solution of the antibiotics can now be obtained by extraction with water at a pH of about 2.0.
From this solution, optionally after concentration, the oxytetracycline can be precipitated in a known manner (see Belgian Patent Specification 506,950 with the aid of magnesium chloride and a quaternary ammonium salt, such as hexadecyltrimethylammonium chloride, at a pH of about 9.0. be processed into pure oxytetracycline or its hydrochloric acid salt. Although vengicide, like oxytetracycline, is an amphoteric substance, it is not precipitated with a quaternary ammonium base. Thus, the vengicide can be obtained from the filtrate of the above-mentioned oxytetracycline precipitate. extracting the filtrate with e.g. butanol at a pH of about 9.0 and extracting the obtained butanolic solution of vengicide again with water at a pH of CA 2.0.
After optional concentration, the vengicide is then obtained crystalline according to the invention by bringing the aqueous solution to a pH between 4.0 and 5.0.
The culture filtrate freed from mycelium, optionally after concentration by evaporation, can also be extracted directly with an alcohol from the grip of butanol and amyl alcohol at a pH of about 9,000. The solution of the antibiotics thus obtained can then be extracted again with water at a pH of about 2.0.
After the aqueous solution of the antibiotics has been adjusted to the desired strength, the oxytetracycline is precipitated with a quaternary ammonium base in the manner indicated above. The vengicide is then recovered from the filtrate.
In a preferred isolation method according to the invention, use is made of a commercially available ion exchanger of weak acid character, n.l. from "Duolite S 30", a phenolic synthetic resin from the Chemical Process Company. It was not at all to be expected that an amphoteric substance such as oxytetracycline could be adsorbed on this weakly acidic ion exchanger. After all, if ion exchangers are used for the adsorption of amphoteric substances, then exchangers with either strongly acidic or strongly basic properties are recommended.
For the isolation of the antibiotics with the aid of "Duolite S 30", the culture filtrate freed from mycelium is passed through a column filled with this exchanger at a pH of Ca 2.5. With a suitable choice of the length of the column and the amount of culture filtrate to be passed through, adsorption can be effected in such a way that practically only the oxytetracyclin is adsorbed and the vengicide remains dissolved. The latter can then be obtained either by adsorption on activated carbon or by direct extraction with, for example, butanol at a suitable pH. The adsorbed oxytetracycline is eluted with caustic and can be further processed in a known manner to give pure oxytetracycline.
The invention is further illustrated in the following examples.
Example I.
From a tube with a Streptomyces vendargus culture on e.g.
Emerson's agar, on which good sporulation has taken place, small quantities of conidia are sterilely transferred into shake flasks of about 2 liters capacity into which 500 cc of a liquid nutrient medium has been placed. This medium consists of:
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> malt extract <SEP> (Balling <SEP> 12) <SEP> 10%
<tb>
<tb>
<tb> peptone <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> table salt <SEP> 0.5%
<tb>
After incubation for 48 hours at 26 ° C, with continuous agitation of the medium, the contents of 2 shake flasks are inoculated into a fermentation vessel containing 15 liters of the following nutrient medium:
EMI7.2
<tb> soybean meal <SEP> 2%
<tb>
<tb> potato starch <SEP> 1%.
<tb>
After sterilization with sterile caustic potash, this medium was adjusted to a pH = 7.0. It is now allowed to grow for 3 days at 27 ° C, with continuous aeration and stirring. On expiry of this period, an investigation shows that the vessel contains 195 micrograms of oxytetracycline per cm3.
Example II.
500 ml of a nutrient medium of the following composition are inoculated from a tube of inoculum as described in Example 1:
EMI7.3
<tb> peptone <SEP> 0.5%
<tb>
<tb> thickened <SEP> maize week
<tb>
<tb> water
<tb>
<tb> (45% <SEP> dry <SEP> fabric) <SEP> 0.6%
<tb>
<tb>
<tb> glucose <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> Table salt <SEP> 1 <SEP>%
<tb>
(adjusted to pH = 7.0 with caustic potash)
After incubation with continuous shaking at 26 DEG C. for 48 hours, the whole culture is transferred sterile into a fermentation vessel equipped with a stirrer and a sterile air blowing device containing 15 liters of culture medium of the following composition:
EMI7.4
<tb> groundnut flour <SEP> 2 <SEP>% <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> potato starch <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> thickened <SEP> maize steep water
<tb>
<tb> (<SEP> 45% <SEP> dry <SEP> substance) <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> table salt <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4 <SEP> 7H2O <SEP> 0. <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0.05%
<tb>
(with caustic potash at a pH =
7.0).
After incubation for 2 days at 28 DEG C. with continuous aeration and stirring, 180 micrograms of oxytetracycline were found to have been formed per cc of the culture liquid.
Example III.
LOCO cm3 of the inoculum obtained by shaking cultures according to Example I is sterile transferred into a closed rat equipped with a stirrer and a sterile air passage device. This vessel contains 15 liters of a sterile medium of the following composition:
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> glucose <SEP> 3 <SEP>% <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> KCI <SEP> 0.4%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (NH4) 2SO4 <SEP> 0.5 "%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0.02 <SEP>% <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> thickened <SEP> maize steep water
<tb>
<tb>
<tb> (45% <SEP> dry <SEP> fabric) <SEP> 0.2 <SEP>% <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> calcium carbonate <SEP> 0.8%
<tb>
After incubation for 4 days at 26 DEG C. with continuous stirring and passage of sterile air, 475 micrograms of oxytetracycline and 270 micrograms of vengicide per cc were found to have been formed.
Example IV.
500 cm3 of the inoculum is added, as in Example 3, to 15 liters of a culture fluid of the following composition:
EMI8.2
<tb> dried <SEP> yeast <SEP> 3 <SEP>%
<tb>
<tb> table salt <SEP> 0.5 <SEP>%
<tb>
<tb> ferrous sulfate <SEP> 0.005%
<tb>
After 5 days of incubation at 26 DEG C. with stirring and aeration, an analysis showed that 443 micrograms of oxytetracycline and 210 micrograms of vengicide had been formed per cc of the culture liquid.
Example V.
750 cm3 of the inoculum is placed in a sterile manner in a culture medium of the following composition:
EMI8.3
<tb> dried <SEP> yeast <SEP> 3 <SEP>%
<tb>
<tb> table salt <SEP> 0.5 <SEP>%
<tb>
<tb> f <SEP> errosulfate <SEP> 0.005 <SEP>%
<tb>
<tb> glucose <SEP> 1 <SEP>%
<tb> calcium carbonate <SEP> 0.5 <SEP>%
<tb>
After incubation for 4 days under aerobic conditions, an examination revealed 413 micrograms oxytetracycline and 211 micrograms vengicide in the culture fluid.
Example VI.
10 liters of the fermented liquid obtained according to Example III are mixed with strong hydrochloric acid with stirring to pH = 2.2. brought. After stirring for half an hour, it is centrifuged using a Sharpless centrifuge. In this way an opalescent liquid is obtained which, after standing for some time, is filtered clear through one or more filters which are provided with the filter aid known commercially under the name Filtrarapid. The clear filtrate is now brought to pH = 7.3 with sodium hydroxide solution and stirred with 100 g of activated carbon for 15 minutes. The adsorbent is then separated by filtration, washed with water and air dried.
The air-dried coal, on which the antibiotics have been adsorbed, is now eluted 5 times with 1 liter of water-saturated butanol, which contains 10 g phenol, at a pH = 1.5. After each elution, the activated carbon is resuspended in the eluent and adjusted to the desired pH with hydrochloric acid. The eluate is now brought to pH = 2.5 with sodium hydroxide solution and concentrated in a vacuum in a return evaporator (at about 35 ° C) to a volume of about 1 liter. This liquid now contains, as can be determined by microbiological determinations, 3.8 g oxytetracycline (80% of the original amount) and 2.56 g ven-
<Desc / Clms Page number 9>
gicide (95% of the original amount).
The concentrated eluate is brought to pH = 9.5 with sodium hydroxide solution and extracted 4 times with 0.75 liter of butanol. The butanol extract is adjusted to pH = 2.0 with hydrochloric acid and extracted 5 times with 0.75 liters of water. The resulting aqueous solution contains 2.85 g of oxytetracycline and
2.31 g of vengicide. This solution is brought to pH = 2.5 with sodium hydroxide solution and concentrated in a return evaporator to about 1400 cc, i.e. to a concentration of about 2 mg oxytetracycline per cc. To this concentrated solution are successively added 112 ml of a 0.1 molar solution of magnesium chloride, 5.6 ml of a 50% solution of citric acid and 14 g of a 33% solution of hexadecyltrimethylammonium chloride.
Subsequently, a pH = 9.0 is adjusted with sodium hydroxide solution qp. The flaky precipitate, containing about 98% of the oxytetracycline present in the solution, is filtered, and dried in vacuo at 40-45.
This precipitate is now extracted 5 times with about 13 cm3 of methanol. 3.5 ml of strong hydrochloric acid (s.g. 1. 19) are added to this methanolic extract, after which the chlorohydrate of oxytetracycline crystallizes spontaneously. Yield 2.2 g. The filtrate from the oxytetracycline precipitate with the quaternary ammonium base is extracted 5 times with 0.75 liter butanol at pH 9.5. The butanolic extract is adjusted to pH = 2.0 with hydrochloric acid and extracted 3 times with 1 liter of water. The aqueous solution is brought to pH = 2.5 with sodium hydroxide solution and concentrated in a return evaporator in Vacua to about 100 ml. Then the pH is adjusted to 4.5 portionwise with sodium hydroxide solution.
The vengicide crystallizes out as a yellow colored crystalline mass. Yield 1.9 g. The fabric can be cleaned by dissolving in dilute hydrochloric acid * decolorization with activated carbon and reprecipitation at pH = 4.5. The white crystals melt at 20.5 - 242 C.
.
Example VII.
10 liters of the fermented liquid obtained according to Example 3 are brought to pH = 2.2 with strong hydrochloric acid while stirring. After stirring for half an hour, the mixture is centrifuged by means of a Sharpless centrifuge. The opaque liquid is filtered one or more times with a filter aid, finally obtaining a clear filtrate. After it has been brought to pH 2.5, this filtrate is now passed through a column "Duolite S 30" at a rate of about 1 liter per hour. The column is 75 cm long, has a diameter of about 4.6 cm and has been regenerated with caustic soda and is washed before each use with about 1250 cm3 of a 0.5 molar acetate buffer having a pH = 4.5 and then with 400 cm3 of water. After the culture filtrate has passed through the column, it is rinsed with 400 cm3 of water.
The filtrate now contains about 90% of the vengicide and the oxytetracyclin is quantitatively adsorbed. The isolation of the vengicide is further carried out entirely according to Example 6, that is to say it is adsorbed on activated carbon, eluted with a water-butanol-phenol mixture, the eluate is concentrated, extracted with butanol, the butanol solution extracted with water, the aqueous solution concentrated at pH = Z.5. The vengicide is then precipitated at pH 4.5 by adding sodium hydroxide solution to the aqueous solution; this substance is purified by crystallization. The yield is 2.0 g.
It will be understood that, depending on the amount of vengicide originally present in the culture filtrate and on the other ingredients present in the culture filtrate, one or more of these operations listed herein can be omitted.
The oxytetracycline is eluted from the Duolite S 30 column with the aid of 2000 ml of a 0.25 N aqueous caustic soda solution passed at a rate of about 1000 ml per hour. This eluate is then concentrated in a return evaporator in vacuo at pH = 2.0 to
<Desc / Clms Page number 10>
1000 cc. This solution now contains, as shown by microbiological research, 4.27 g of oxytetracycline (i.e. 90% of the original amount).
The solution is extracted with butanol at pH = 9.5. The obtained butanol extract is extracted with water at pH = 2.0. The aqueous solution thus prepared is concentrated in vacuo to a volume of about 3000 ml. The solution now contains 3.2 g of oxytetracycline. This amount is quantitatively precipitated with the aid of the quaternary ammonium base and further purified, entirely as described in Example VI. 2. 6 g of the crystalline hydrochloride of oxytetracycline are obtained.
Example VIII.
12 liters of the fermented liquid obtained according to example III are brought to pH = 2.2 with strong hydrochloric acid while stirring and centrifuged after stirring for half an hour. The opalescent liquid is concentrated in vacuum to a volume of 1200 ml and then filtered with the aid of a filter aid. The clear filtrate is brought to pH 9.0 with sodium hydroxide solution and extracted 4 times with 900 ml of butanol. The butanolic solution is adjusted to pH 2.0 with hydrochloric acid and extracted 5 times with 1100 ml of water. The aqueous solution of the antibiotics thus obtained contains, as appears from a microbiological analysis, 4.50 g of oxytetracycline (80% of the amount originally present) and 3.01 g of vengicide (93% of the amount originally present).
After concentration in vacuo to a volume of about 1900 ml, the oxytetracycline is precipitated by the method described in Example 6 with a quaternary ammonium base and an alkaline earth salt. The vengicide is recovered from the filtrate entirely in the manner described in Example 6. The yield of oxytetracycline is 3.2 g and agicide 2. 2 g.
Example IX.
10 liters of the fermented liquid obtained according to example III are brought to pH = 2.2 with sulfuric acid while stirring and centrifuged after stirring for half an hour. The opalescent liquid is concentrated in vacuo to a volume of 1000 ml and then filtered with the aid of a filter aid.
The clear filtrate is then brought to pH = 9.0 with sodium hydroxide solution and extracted 4 times with 0.75 liters of butanol. The butanolic solution is extracted 4 times with 0.75 liters of water at pH = 2.0. In this way, approximately 3.0 liters of an aqueous solution of the antibiotics are obtained, which, according to microbiological analysis, contains 3.8 g oxytetracycline and 2.4. g of vengicide. This extract is concentrated in vacuo to a volume of about 1.0 liter. This solution is passed through 4 columns of Duolite S 30 in about 6 hours. The first 3 columns each contain -30g of Duolite, while the fourth column contains 20g of Duolite. The columns, containing 30 g of adsorbent, are 42 cm long, the other is 28 cm long.
The ratio of the diameter to the length is approximately 1:15. The Duolite in the columns was regenerated with sodium hydroxide solution and then washed with 0.1 N hydrochloric acid until the pH of the continuous washing liquid is equal to 2.0 or lower. Analysis of the columns showed that the oxytetracycline and vengicide were distributed among the columns as follows:
EMI10.1
<tb> column <SEP> oxytetracycline <SEP> vengicide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 1330 <SEP> mg <SEP> 96 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 1235 <SEP> mg <SEP> 138 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 938 <SEP> mg <SEP> 173 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb> 235 <SEP> mg <SEP> 239 <SEP> mg
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
The continuous liquid is practically free of oxytetracycline and contains 1.85 g of vengicide.
This liquid is concentrated in vacuo to 100 ml and then brought to pH = 4.5. This precipitates 1.8 g of vengicide, which is purified by dissolving in 0.25 N hydrochloric acid and neutralizing again to pH 4.5.
The columns are eluted with 0.25 N sodium hydroxide solution.
The fourth column is not eluted but is saved for subsequent adsorption. 300 ml of sodium hydroxide solution is used for each column.
The combined eluates are treated with strong hydrochloric acid at pH = 2. Brought to 0 and concentrated to 175 ml in vacuo. This solution contains 20 mg oxytetracycline per cm3. It is neutralized, precipitating oxytetracycline.
After filtration, washing with water and drying, this precipitate weighs 3.7 g.
It contains 3.4 g of oxytetracycline. This precipitate is slurried in 27 ml of methanol for further purification. To the suspension, 4.5 ml of concentrated hydrochloric acid (s. G. 1.9) is added. The oxytetracycline is converted into the hydrochloric acid, while the impurities dissolve. The hydrochloric acid salt of oxytetracycline is filtered, washed with hydrochloric acid methanol (0.1 N) and finally with aether. The yield of oxytetracycline chlorohydrate is 3.2 g.