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PROCEDE POUR L'OBTENTION' DE PREPARATIONS'FERMENTATIVES-TRES' ACTIVES.
L'invention a pour objet un procédé pour obtenir des préparations fermentatives très .actives à partir de mycèles de champignons qui produisent , par une culture qui s'étend sur une certaine durée, divers groupes de fer- ments; et elle concerne plus spécialement des procédés pour l'obtention de préparations fermentatives à partir de mycèles des genres de phycomycètes et de eumycètes, par exemple des- genres d'aspergullus ou des rhizopus. Les pré- parations ainsi obtenues conviennent à la clarification des jus de fruits et à la clarification et au traitement des vins.
Des préparations fermentatives, qui servent à la clarification des jus de fruits ou à la clarification ou au traitement des vins, on exige qu'elles possèdent un pouvoir destructeur élevé pour la pectine, l'amidon, l'albumine et, le cas échéant, le tanin car ces substances rendent les jus végétaux, fraichement pressurés, très visqueux et rendent leur filtration et leur clarification plus difficiles. Pour réduire au minimum les infections ou contaminations des jus à clarifier par des générateurs de fermentation, la décomposition de la pectine, de l'amidon et de l'albumine doit se faire aussi rapidement que possible. On doit donc exiger d'une préparation fermen- tative que ses activités par unité de poids soient très élevées et qu'elle se dissolve rapidement pour pouvoir produire immédiatement son effet, sur les jus végétaux.
En cultivant des mycèles de champignons qui fournissent simulta- nément plusieurs groupes de ferments, on a constaté que les activités des, différents groupes subissent de jour en jour des modifications importantes.
Le moment où l'on obtient un optimum pour un groupe peut être très défavora- ble pour un deuxième ou autre groupe de sorte que la récolte 'ne fournit à aucun moment des préparations pour lesquelles tous les groupes de fermenta- tion ont des activités maxima.
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Quand par exemple un mycelium déterminé présente au troisième jour un pouvoir destructeur optimum pour la pectine et au septième jour un pouvoir de décomposition optimum pour l'amidon, il est possible, en mélan- geant les deux récoltes faites au troisième et au septième jour, d'obtenir des-préparations fermentatives dans lesquelles les deux effets sont réunis.
A cause de l'accroissement de la quantité des substances de ballast, qui interviennent par ce procédé, il n'est pas possible d'obtenir des prépara- tions qui ont un effet fermentatif optimum par unité de poids.
Conformément à l'invention on obtient des préparations fermenta- tives très actives à partir de mycèles de champignons qui produisent des grou- pes de ferments différents par une récolte qui s'étend sur une certaine pé- riode de temps, en cultivant des parties différentes de mycélium utilisé pendant des périodes ayant des durées différentes jusqu'à ce que l'on obtien- ne dans chaque cas une activité enzymatique maximum. Quand cette activité est atteinte elle décroit ensuite plus ou moins fortement. Des essais préa- lables doivent donc déterminer quand le pouvoir destructeur de la pectine, celui de l'amidon, celui de l'albumine et, le cas échéant, celui du tanin ont une activité maximum, et le moment où la culture doit être interrompue.
Les cultures sont alors extraites à l'eau et les solutions obtenues, qui contiennent les ferments en question, sont transférées simultanément ou suc- cessivement sur un substratum de la manière ordinaire.
Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention on peut uti- liser, d'une manière particulièrement avantageuse, des mycèles des genres de champignons qui ont été cultivés pour la formation d'acides et qui, dans un domaine du pH d'environ 2 à 4, ont une activité enzymatique maximum. Il est avantageux qu'une formation d'acide ait eu lieu.
Comme les préparations d'enzymes ont parfois une odeur désagréa- ble, il peut être recommandable d'extraire le mycélium après qu'il a été la- vé à l'eau et qu'il a été séché et désagrégé à basse température, par un sol- vant organique qui est soluble dans l'eau et qui n'influence pas les activi- tés des ferments, ce solvant pouvant être mélangé en toute proportion à l'eau.
De cette manière on débarrasse la préparation non seulement de l'odeur mais également des dernières traces d'humidité. Parmi les solvants convenables on peut citer le dioxane, l'éthanol, l'acétone et analogues.
Comme substrata, qui conviennent à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut citer par exemple la bentonite, le kaolin, la fa- rine de bois, l'ester cellulosique connu sous la dénomination "Tylose" et analogues.
Comme on se sert d'un seul substratum pour y transférer plusieurs groupes de ferments et comme on a recours à des solutions de ferments qui sont débarrassées du mycelium, on obtient des préparations qui ont une teneur minimum en matières de ballast. La teneur en cendres de ces préparations est donc extrêmement réduite. Par un choix judicieux de la quantité des parties de mycèles que l'on traite chaque fois, il est possible de faire varier dans les préparations la teneur en groupes déterminés de ferments. Suivant les e- xigences imposées ultérieurement à la préparation fermentative on peut, à volonté, augmenter par exemple l'activité pour la pectine ou celle pour l'a- mylase ou ces deux activités bien au-delà des activités normales des mycèles.
Ces conditions sont indiquées dans le tableau ci-dessous pour le- quel les activités fermentatives ont été déterminées pour une souche Asper- gillus-niger qui a été cultivée, dans des conditions normales, sur un support nutritif liquide. On a obtenu, pour des récoltes séparées, les activités fer- mentatives suivantes pour les mycèles ayant des âges différents.
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<tb> Préparation <SEP> Activité <SEP> Activité <SEP> Activité <SEP> Pouvoir <SEP> destructeur
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<tb> Préparation <SEP> protéase <SEP> amylase <SEP> pectinase <SEP> du <SEP> tanin. <SEP>
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Mycélium <SEP> de
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<tb> Mycélium <SEP> de
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<tb> 7 <SEP> jours <SEP> 0,5 <SEP> 2,21 <SEP> 1,5 <SEP> 0,63
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<tb> Préparation <SEP> se-
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<tb> lon <SEP> l'invention
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<tb> de-mycèles <SEP> de
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La préparation, obtenue en transférant un mycelium de trois jours et un de sept jours sur un substratum unique, montra que pour une même quantité on obtient un accroissement des activités de 30 % pour la pec- tinase et d'environ 50 % pour l'amylase par rapport aux autres mycèles uti- lisées dans les conditions optima.
L'activité pour l'amylase a été déterminée par la méthode Willstâtter-Schudel. Celle pour la protéase par dosage du groupement carbo- xyl libéré à l'aide d'une solution alcoolique de potasse n/20. Les activi- tés pour la pectinase ont été obtenues par la détermination viscosimétrique de la pectine comparée à celle d'une préparation normélisée connue. L'acti- vité par la tannase a été déterminée par la méthode de Armbruster et Dyker- hoff. Comme substratum on se sert d'un ester méthylique de l'acide gallique.
Les groupements carboxyl libérés par la fermentation sont dosés avec du KOH n/40.
L'usage des préparations a montré que la séparation des ferments d'avec les substrata utilisés se fait pour ainsi dire instantanément de sorte que leur activité peut se manifester en plein.
Il est connu de transférer des ferments sur des substrata. Ce procédé a déjà été appliqué, plus spécialement, pour la préparation d'ex- traits de malt diastatiques ou de préparations fermentatives décomposant les albumines. Toutefois dans ce cas on ne transfère qu'un seul groupe de ferment sur un unique substratum pour obtenir une activité aussi élevée que possible.
L'exemple ci-dessous, qui n'est nullement limitatif ou restrictif, sert à expliquer davantage la mise en oeuvre du nouveau procédé.
On désagrège 16 Kg d'un mycelium, vieux de trois jours, du genre Aspergillus-niger et qui a atteint son activité optimum pour la pectinase.
On fait macérer la substance pendant plusieurs heures dans une quantité en- viron trois fois plus grande d'un citrate-tampon ayant un pH de 4 à 5.. Le ré- sidu insoluble est ensuite séparé par filtration et la solution aqueuse est absorbée par la quantité juste nécessaire de farine de bois pour être séchée à 45 dans une étuve à air.
On traite exactement de la même manière un mycelium, vieux de sept jours, qui a atteint son activité optimum pour l'amylase et le jus de macération obtenu est mélangé à la farine de bois déjà chargée ce qui donne une bouillie épaisse que l'on sèche dans l'étuve à air à 45 .
On obtient ainsi une préparation ayant des propriétés pectolyti- ques et amylytiques très prononcées.
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PROCEDURE FOR OBTAINING 'FERMENTATIVE-VERY ACTIVE' PREPARATIONS.
The object of the invention is a process for obtaining highly active fermentative preparations from myceles of fungi which produce, by culturing over a period of time, various groups of ferments; and more particularly it relates to processes for obtaining fermentative preparations from myceles of the genera of phycomycetes and eumycetes, for example of the genera of Aspergullus or rhizopus. The preparations thus obtained are suitable for the clarification of fruit juices and for the clarification and treatment of wines.
Fermentative preparations, which serve for the clarification of fruit juices or for the clarification or treatment of wines, are required to have a high destructive power for pectin, starch, albumin and, where appropriate, tannin because these substances make vegetable juices, freshly squeezed, very viscous and make their filtration and clarification more difficult. To minimize infections or contamination of juices to be clarified by fermentation generators, the decomposition of pectin, starch and albumin must be done as quickly as possible. It is therefore necessary to require of a fermentation preparation that its activities per unit of weight are very high and that it dissolves rapidly in order to be able to produce its immediate effect on vegetable juices.
By cultivating myceles of fungi which simultaneously provide several groups of ferments, it has been found that the activities of different groups undergo significant changes from day to day.
The time when an optimum is obtained for one group may be very unfavorable for a second or other group so that the harvest at no time provides preparations for which all the fermentation groups have maximum activities. .
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When, for example, a determined mycelium presents on the third day an optimum destructive power for pectin and on the seventh day an optimum decomposition power for the starch, it is possible, by mixing the two harvests made on the third and seventh day, to obtain fermentative preparations in which the two effects are combined.
Due to the increase in the quantity of ballast substances involved by this process, it is not possible to obtain preparations which have an optimum fermentative effect per unit weight.
In accordance with the invention very active fermentative preparations are obtained from myceles of fungi which produce different groups of ferments by a harvest which extends over a certain period of time, by culturing different parts. of mycelium used for periods having different durations until maximum enzymatic activity is obtained in each case. When this activity is reached it then decreases more or less strongly. Prior tests must therefore determine when the destructive power of pectin, that of starch, that of albumin and, if applicable, that of tannin have maximum activity, and when the cultivation must be interrupted. .
The cultures are then extracted with water and the resulting solutions, which contain the ferments in question, are transferred simultaneously or successively to a substratum in the ordinary manner.
For carrying out the process according to the invention, it is particularly advantageous to use myceles of the genera of fungi which have been cultivated for the formation of acids and which, in a pH range of. about 2 to 4, have maximum enzymatic activity. It is advantageous that acid formation has taken place.
Since enzyme preparations sometimes have an unpleasant odor, it may be advisable to extract the mycelium after it has been washed with water and has been dried and broken up at low temperature, for example. an organic solvent which is soluble in water and which does not influence the activities of the ferments, this solvent being able to be mixed in any proportion with water.
In this way the preparation not only gets rid of the smell but also of the last traces of moisture. Among the suitable solvents are dioxane, ethanol, acetone and the like.
As substrates, which are suitable for carrying out the process according to the invention, there may be mentioned, for example, bentonite, kaolin, wood flour, the cellulose ester known under the name “Tylose” and the like.
Since a single substratum is used to transfer several groups of ferments thereto and since ferment solutions which are free of mycelium are used, preparations are obtained which have a minimum content of ballast material. The ash content of these preparations is therefore extremely low. By judicious choice of the quantity of the parts of myceles which are treated each time, it is possible to vary the content of specific groups of ferments in the preparations. Depending on the requirements subsequently imposed on the fermentative preparation, the activity for pectin or for amylase can be increased at will, for example, or both activities well beyond the normal activities of the myceles.
These conditions are indicated in the table below for which the fermentative activities were determined for an Aspergillus-niger strain which was cultured, under normal conditions, on a liquid nutrient support. The following fermentative activities were obtained for the myceles of different ages for separate harvests.
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EMI3.1
<tb> Preparation <SEP> Activity <SEP> Activity <SEP> Activity <SEP> Destructive power <SEP>
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<tb> Preparation <SEP> protease <SEP> amylase <SEP> pectinase <SEP> from <SEP> tannin. <SEP>
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Mycelium <SEP> of
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<tb> Mycelium <SEP> of
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<tb> Preparation <SEP> se-
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<tb> lon <SEP> the invention
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<tb> de-myceles <SEP> of
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<tb> 3 <SEP> and <SEP> 7 <SEP> days <SEP> 0.55 <SEP> 3.15 <SEP> 4.2 <SEP> 0.70
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The preparation, obtained by transferring a three-day and a seven-day mycelium onto a single substratum, showed that for the same quantity an increase in activities of 30% for pectinase and of about 50% for pectinase was obtained. amylase relative to other myceles used under optimum conditions.
The activity for amylase was determined by the Willstâtter-Schudel method. That for the protease by assaying the carboxyl group released using an alcoholic solution of n / 20 potassium hydroxide. Activities for pectinase were obtained by viscosimetric determination of pectin compared to that of a known standard preparation. Tannase activity was determined by the method of Armbruster and Dykerhoff. As the substratum, a methyl ester of gallic acid is used.
The carboxyl groups released by the fermentation are assayed with KOH n / 40.
The use of the preparations has shown that the separation of the ferments from the substrates used takes place almost instantaneously so that their activity can be fully manifested.
It is known to transfer ferments to substrates. This process has already been applied, more especially, for the preparation of diastatic malt extracts or of fermentative preparations which decompose albumins. However, in this case, only one group of ferment is transferred onto a single substratum in order to obtain as high an activity as possible.
The example below, which is in no way limiting or restrictive, serves to further explain the implementation of the new process.
16 kg of a mycelium, three days old, of the Aspergillus-niger genus, which has reached its optimum activity for pectinase, is broken up.
The substance is macerated for several hours in about three times the amount of a citrate buffer having a pH of 4 to 5. The insoluble residue is then filtered off and the aqueous solution is absorbed by the water. just the right amount of wood flour to be dried at 45 in an air oven.
A seven day old mycelium which has reached its optimum activity for amylase is treated in exactly the same way and the maceration juice obtained is mixed with the wood flour already loaded, which gives a thick porridge which is dries in the air oven at 45.
A preparation is thus obtained having very pronounced pectolytic and amylytic properties.