BE1030348A1 - NANO-FORMULATION OF SAIKOSAPONIN b1, PREPARATION METHOD AND APPLICATION FOR PREPARING DRUGS FOR PREVENTING AND TREATING HEPATIC FIBROSIS - Google Patents
NANO-FORMULATION OF SAIKOSAPONIN b1, PREPARATION METHOD AND APPLICATION FOR PREPARING DRUGS FOR PREVENTING AND TREATING HEPATIC FIBROSIS Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une nano-formulation de saikosaponine b1, son procédé de préparation et son application pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique, appartenant au domaine de la médecine traditionnelle chinoise. Encapsuler ladite nano-formulation de saikosaponine b1 selon la présente invention par un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique approuvé par la FDA, disperser dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique et réduire le permanganate de potassium en dioxyde de manganèse pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1, la nano-formulation ayant une structure noyau-enveloppe sphérique de taille d'environ 150 nm.The present invention relates to a nano-formulation of saikosaponin b1, its preparation method and its application for preparing drugs for preventing and treating liver fibrosis, belonging to the field of traditional Chinese medicine. Encapsulating said nano-formulation of saikosaponin b1 according to the present invention with a copolymer of polylactic acid and glycolic acid approved by the FDA, dispersing in a buffer of 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid and reducing the potassium permanganate in manganese dioxide to obtain the nano-formulation of saikosaponin b1, the nano-formulation having a spherical core-shell structure of size of approximately 150 nm.
Description
NANO-FORMULATION DE SAIKOSAPONINE bl, PROCÉDÉNANO-FORMULATION OF SAIKOSAPONIN bl, METHOD
DE PRÉPARATION ET APPLICATION POUR PRÉPARERPREPARATION AND APPLICATION TO PREPARE
DES MÉDICAMENTS POUR PRÉVENIR ET TRAITER LAMEDICINES TO PREVENT AND TREAT THE
FIBROSE HÉPATIQUEHEPATIC FIBROSIS
DOMAINE TECHNIQUETECHNICAL AREA
[0001] La présente invention concerne une nano-formulation de saikosaponine b1, son procédé de préparation et son application pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique, appartenant au domaine de la médecine traditionnelle chinoise.The present invention relates to a nano-formulation of saikosaponin b1, its preparation method and its application for preparing drugs for preventing and treating hepatic fibrosis, belonging to the field of traditional Chinese medicine.
CONTEXTE TECHNIQUETECHNICAL BACKGROUND
[0002] Avec l'augmentation du taux de l'obésité et de la fréquence d’apparition des syndromes métaboliques dans le monde, surtout dans les pays développés, la fibrose hépatique et la cirrhose du foie sont devenues un problème grave pour la santé publique.[0002] With the increase in the rate of obesity and the frequency of appearance of metabolic syndromes throughout the world, especially in developed countries, hepatic fibrosis and liver cirrhosis have become a serious problem for public health. .
La fibrose hépatique est une réponse cicatrisante à une lésion hépatique chronique, caractérisée par une production et un dépôt excessifs de matrices extracellulaires, ce qui conduira à une perte des fonctions hépatiques et une destruction de la structure hépatique, affectera l'apport en oxygène et de nutriments au foie, et généra un micro-environnement très anoxique dans la région hépatique. Pendant le processus de la fibrose hépatique, le micro-environnement anoxique du foie peut induire la génération de l'oxygène réactive et favoriser davantage l'activation des cellules stellaires hépatiques, accélérant ainsi le processus de la fibrose hépatique. Il est donc très intéressant de soulager l'anoxie du tissu hépatique pour inverser le processus de la fibrose hépatique, méritant ainsi une exploration plus approfondie.Liver fibrosis is a scarring response to chronic liver injury, characterized by excessive production and deposition of extracellular matrices, which will lead to loss of liver functions and destruction of liver structure, affect oxygen supply and nutrients to the liver, and generated a very anoxic microenvironment in the liver region. During the process of hepatic fibrosis, the anoxic microenvironment of the liver can induce the generation of reactive oxygen and further promote the activation of hepatic stellate cells, thereby accelerating the process of hepatic fibrosis. Therefore, it is of great interest to relieve hepatic tissue anoxia to reverse the process of hepatic fibrosis, thus worthy of further exploration.
[0003] La médecine traditionnelle chinoise est utilisée depuis des milliers d'années dans le traitement des hépatopathies. Certaines prescriptions de la médecine traditionnelle BE2029/5705 chinoise contenant Bupleurum, tels que la décoction de Xiao Chaihu et la poudre de[0003] Traditional Chinese medicine has been used for thousands of years in the treatment of liver disease. Certain prescriptions of traditional Chinese medicine BE2029/5705 containing Bupleurum, such as Xiao Chaihu decoction and powder of
Chaihu Shugan sont devenues des méthodes traditionnelles pour traiter les hépatopathies dans les pays asiatiques. La saikosaponine bl est l'un des principes actifs biologiques isolés de Bupleurum, qui présente un bon effet d’inhibition sur les cellules stellaires hépatiques activées et peut être bien utilisée dans le traitement de la fibrose hépatique.Chaihu Shugan have become traditional methods for treating liver disease in Asian countries. Saikosaponin bl is one of the biological active ingredients isolated from Bupleurum, which has good inhibition effect on activated hepatic stellate cells and can be well used in the treatment of liver fibrosis.
Cependant, dans le micro-environnement anoxique du foie, l'effet thérapeutique de laHowever, in the anoxic microenvironment of the liver, the therapeutic effect of
Ssbl (saikosaponine bl) est relativement simple et les voies traditionnelles d'administration (voie orale, voie d’injection, etc.) présentent les inconvénients tels qu’une disponibilité faible de médicament et une haute dose de médicament. Par conséquent, il existe un besoin de développer un nouveau formulation pharmaceutique composite, qui joue un rôle important pour favoriser l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique en améliorant l'anoxie dans la région hépatique, en réduisant la stimulation desSsbl (saikosaponin bl) is relatively simple and traditional routes of administration (oral route, injection route, etc.) have disadvantages such as low drug availability and high drug dose. Therefore, there is a need to develop a new composite pharmaceutical formulation, which plays an important role in promoting the therapeutic effect on hepatic fibrosis by improving anoxia in the liver region, reducing the stimulation of
ROS et en libérant Ssb1 de manière sélective dans la région hépatique.ROS and releasing Ssb1 selectively in the liver region.
[0004] Afin de soulager la fibrose hépatique et de renforcer l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique, la présente invention propose une nano-formulation de saikosaponine b1 qui présente un effet thérapeutique renforcé considérablement sur la fibrose hépatique.[0004] In order to relieve hepatic fibrosis and to reinforce the therapeutic effect on hepatic fibrosis, the present invention proposes a nano-formulation of saikosaponin b1 which has a considerably enhanced therapeutic effect on hepatic fibrosis.
[0005] La présente invention propose également un procédé de préparation de la nano- formulation de saikosaponine bl.[0005] The present invention also provides a process for preparing the nanoformulation of saikosaponin bl.
[0006] Pour réaliser le but ci-dessus, la présente invention propose une solution technique suivante :[0006] To achieve the above goal, the present invention proposes the following technical solution:
[0007] Une nano-formulation de saikosaponine bl est préparée par le procédé suivant :[0007] A nano-formulation of saikosaponin bl is prepared by the following process:
[0008] S1. dissoudre la saikosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA) pour former des microsphères.[0008] S1. Dissolve saikosaponin b1 (Ssb1) and a copolymer of polylactic acid and glycolic acid (PLGA) in a solvent, add it dropwise to an aqueous solution of polyvinyl alcohol (PVA) to form microspheres.
[0009] S2. disperser les microsphères dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à 0,1-1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivement une solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, bien agiter et centrifuger pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1. BE2029/5705[0009] S2. disperse the microspheres in a buffer of 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) at 0.1-1.0 mol/L, add to this solution dropwise gradually a solution of potassium permanganate at 1-10 mol/L, shake well and centrifuge to obtain the nano-formulation of saikosaponin b1. BE2029/5705
[0010] Encapsuler ladite nano-formulation de saikosaponine bl selon la présente invention par un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique approuvé par la[0010] Encapsulate said nano-formulation of saikosaponin bl according to the present invention with a copolymer of polylactic acid and glycolic acid approved by the
FDA, disperser dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique et réduire le permanganate de potassium en dioxyde de manganèse pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1, la nano-formulation ayant une structure noyau-enveloppe sphérique de taille d'environ 150 nm. La nano-formulation de saikosaponine b1 présente un effet thérapeutique renforcé considérablement sur la fibrose hépatique.FDA, disperse in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer and reduce potassium permanganate to manganese dioxide to obtain the saikosaponin b1 nano-formulation, the nano-formulation having a spherical core-shell structure of size approximately 150 nm. The nano-formulation of saikosaponin b1 exhibits significantly enhanced therapeutic effect on liver fibrosis.
[0011] Les effets pharmacologiques du médicament selon la présente invention consiste à ce que : le syndrome de stagnation du foie et d'insuffisance splénique est l’un des principaux syndromes de la fibrose hépatique, Bupleurum a été enregistré pour la première fois sous la dynastie Qing, avec un goût amer et âcre, et une nature légèrement froid, qui retourne au méridien du foie et de la vésicule biliaire, et présente des effets de soulager des syndromes externes et de réduire la fièvre, de dégager l'énergie hépatique, et de monter le clair QI, avec une activité pharmacologique évidente. Il a été constaté que la décoction de Bupleurum seul présentait un bon effet anti-fibrose hépatique. Les résultats des études pharmacologiques modernes ont montré que l’ingrédient le plus actif de Bupleurum était la saikosaponine. L'effet anti-fibrose hépatique de la Ssbl est une pratique efficace basée sur les théories de la médecine traditionnelle chinoise, qui peut efficacement induire l’apoptose des cellules stellaires hépatiques activées. Cependant, l'effet thérapeutique clinique de la Ssb1 seul sur la fibrose hépatique n'est pas idéal, dans le micro-environnement anoxique du foie, l'effet thérapeutique de la Ssb1 est relativement simple et les voies traditionnelles d'administration de médicaments (voie orale, voie d’injection, etc.) présentent les inconvénients tels qu’une disponibilité faible de médicament et une haute dose de médicament.[0011] The pharmacological effects of the drug according to the present invention consist in the following: the syndrome of liver stagnation and splenic insufficiency is one of the main syndromes of hepatic fibrosis, Bupleurum was recorded for the first time under the Qing dynasty, with bitter and acrid taste, and slightly cold nature, which returns to the liver and gallbladder meridian, and exhibits effects of relieving external syndromes and reducing fever, clearing liver energy, and to raise the clear IQ, with obvious pharmacological activity. It was found that Bupleurum decoction alone had a good anti-liver fibrosis effect. The results of modern pharmacological studies have shown that the most active ingredient in Bupleurum is saikosaponin. The anti-liver fibrosis effect of Ssbl is an effective practice based on traditional Chinese medicine theories, which can effectively induce apoptosis of activated hepatic stellate cells. However, the clinical therapeutic effect of Ssb1 alone on liver fibrosis is not ideal. In the anoxic microenvironment of the liver, the therapeutic effect of Ssb1 is relatively simple and traditional drug delivery routes ( oral route, injection route, etc.) have the disadvantages such as low drug availability and high drug dose.
[0012] La base pharmacologique de la nano-formulation de saikosaponine b1 selon la présente invention est que l'apparition de la fibrose favorise l'anoxie du tissu et aggrave le processus de la maladie. L'inversion de l'état anoxique dans la région du foie permet de soulager considérablement la stimulation sur les cellules stellaires hépatiques, ce qui est très nécessaire pour le traitement de la fibrose hépatique. En visant la caractéristique d'anoxie dans le micro-environnement hépatique, l'invention consiste à décomposer le BE2029/5705 peroxyde d'hydrogène (H202) pour générer l'oxygène sous catalyse de MnO: réduire la pression de stress oxydatif tout en soulageant l'anoxie du tissu, réduisant ainsi à la source la stimulation sur les cellules stellaires hépatiques, et renforçant de manière synergique l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique. La nano-formulation de saikosaponine b1 fournie par la présente invention peut libérer de manière sélective la Ssb1 et MnO: dans la région du foie, améliorant ainsi efficacement la disponibilité du médicament. De plus,The pharmacological basis of the nano-formulation of saikosaponin b1 according to the present invention is that the appearance of fibrosis promotes anoxia of the tissue and aggravates the disease process. Reversing the anoxic state in the liver region can significantly relieve the stimulation on hepatic stellate cells, which is very necessary for the treatment of liver fibrosis. Aiming at the characteristic of anoxia in the hepatic microenvironment, the invention consists of decomposing BE2029/5705 hydrogen peroxide (H202) to generate oxygen under MnO catalysis: reducing the pressure of oxidative stress while relieving anoxia of the tissue, thus reducing the stimulation on hepatic stellate cells at the source, and synergistically reinforcing the therapeutic effect on hepatic fibrosis. The nano-formulation of saikosaponin b1 provided by the present invention can selectively release Ssb1 and MnO: in the liver region, thereby effectively improving drug availability. Moreover,
MnOz catalyse la décomposition de H,O, dans la région du foie pour générer l'oxygène, ce qui permet de réduire la pression de stress oxydatif tout en soulageant l’état d'anoxie dutissu et renforçant l'effet thérapeutique de la Ssb1 sur la fibrose hépatique.MnOz catalyzes the decomposition of H,O, in the liver region to generate oxygen, thereby reducing the pressure of oxidative stress while relieving the state of anoxia of the tissue and enhancing the therapeutic effect of Ssb1 on hepatic fibrosis.
[0013] De préférence, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 6 à 15 mg/ml.Preferably, the mass percentage of PVA in the aqueous PVA solution is 6 to 15 mg/ml.
[0014] De préférence, le rapport en poids de Ssb1 à PLGA est (2-8) :(5-20).Preferably, the weight ratio of Ssb1 to PLGA is (2-8): (5-20).
[0015] De préférence, la nano-formulation de saikosaponine bl a une structure noyau- enveloppe sphérique de taille de 150 nm+5 nm.Preferably, the nano-formulation of saikosaponin bl has a spherical core-shell structure of size 150 nm+5 nm.
[0016] Un procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine blm comprend les étapes suivantes :[0016] A process for preparing the nano-formulation of saikosaponin blm comprises the following steps:
[0017] S1. dissoudre la satkosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution — aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA), agiter pendant 2-3 heures, centrifuger à une vitesse de 5 000 à 10 000 tr/min une fois que l’acétone s'est évaporée, et laver avec l'eau pour obtenir des microsphères PLGA/Ssb1 stabilisées au PVA ;[0017] S1. dissolve satkosaponin b1 (Ssb1) and a copolymer of polylactic acid and glycolic acid (PLGA) in a solvent, add it dropwise to an aqueous solution of polyvinyl alcohol (PVA), shake for 2-3 hours, centrifuge at a speed of 5,000 to 10,000 rpm once the acetone has evaporated, and wash with water to obtain PVA-stabilized PLGA/Ssb1 microspheres;
[0018] S2. disperser les microsphères PLGA/Ssb1 préparées dans un tampon MES à 0,1-1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivement une solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, de sorte de générer le dioxyde de manganèse (MnO2) progressivement sur la surface des microsphères par la réduction du groupe hydroxyle sur le segment PLGA, bien agiter, puis centrifuger, et laver avec l'eau pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1.[0018] S2. disperse the PLGA/Ssb1 microspheres prepared in a MES buffer at 0.1-1.0 mol/L, add to this solution dropwise gradually a solution of potassium permanganate at 1-10 mol/L, so as to generate the manganese dioxide (MnO2) gradually onto the surface of the microspheres by the reduction of the hydroxyl group on the PLGA segment, shake well, then centrifuge, and wash with water to obtain the nano-formulation of saikosaponin b1.
[0019] De préférence, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 6 à 15 mg/mL. De préférence, le pourcentage en masse de PVA dans la solution aqueuse de PVA est de 10 mg/mL. BE2029/5705Preferably, the mass percentage of PVA in the aqueous PVA solution is 6 to 15 mg/mL. Preferably, the mass percentage of PVA in the aqueous PVA solution is 10 mg/mL. BE2029/5705
[0020] De préférence, le rapport en poids de Ssbl à PLGA est (2-8) :(5-20). Le plus préférentiel, le rapport en poids de Ssb1 à PLGA est 1 :10.Preferably, the weight ratio of Ssbl to PLGA is (2-8): (5-20). Most preferentially, the weight ratio of Ssb1 to PLGA is 1:10.
[0021] Une composition pharmaceutique traditionnelle chinoise comprend la nano- 5 formulation de saikosaponine bl selon 1. La nano-formulation de saikosaponine b1 selon la présente invention peut être compatible avec d'autres ingrédients pharmaceutiques ou des excipients couramment utilisés dans les médicaments pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique.[0021] A traditional Chinese pharmaceutical composition comprises the nano-formulation of saikosaponin b1 according to 1. The nano-formulation of saikosaponin b1 according to the present invention may be compatible with other pharmaceutical ingredients or excipients commonly used in medicines to prepare medicines to prevent and treat liver fibrosis.
[0022] Une application de la nano-formulation de saikosaponine b1 pour préparer des médicaments pour prévenir et traiter la fibrose hépatique est proposée.[0022] An application of the nano-formulation of saikosaponin b1 to prepare drugs to prevent and treat hepatic fibrosis is proposed.
[0023] Des tests chez animaux ont montré que, par rapport à l'administration de la monomère de saikosaponine b1l, la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention réduit considérablement l'infiltration cellulaire inflammatoire et le dépôt de collagène dans le tissu, ce qui montre son effet thérapeutique renforcé sur la fibrose hépatique. Par conséquent, la nano-formulation de saikosaponine bl fournie par la présente invention a une compatibilité raisonnable, et présente une sécurité d’utilisation montrée par des validations pharmacologiques, elle peut soulager efficacement les symptômes de la fibrose hépatique, inverser le processus de la fibrose hépatique sans effets indésirables rapportés.[0023] Tests in animals have shown that, compared to the administration of saikosaponin b1l monomer, the nano-formulation of saikosaponin b1 of the present invention considerably reduces inflammatory cell infiltration and collagen deposition in the tissue. , which shows its enhanced therapeutic effect on liver fibrosis. Therefore, the nano-formulation of saikosaponin bl provided by the present invention has reasonable compatibility, and has safety in use shown by pharmacological validations, it can effectively relieve the symptoms of liver fibrosis, reverse the process of fibrosis hepatic without adverse effects reported.
[0024] La figure 1 montre une caractérisation morphologique de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention, où barre d'échelle = 100 nm ;Figure 1 shows a morphological characterization of the nano-formulation of saikosaponin b1 of the present invention, where scale bar = 100 nm;
[0025] la figure 2 montre des courbes de libération simulée in vitro de la nano- formulation de saikosaponine b1 de la présente invention ;[0025] Figure 2 shows simulated in vitro release curves of the saikosaponin b1 nanoformulation of the present invention;
[0026] la figure 3 montre une courbe de l'effet de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention pour générer l'oxygène en catalysant HO; ;[0026] Figure 3 shows a curve of the effect of the nano-formulation of saikosaponin b1 of the present invention to generate oxygen by catalyzing HO; ;
[0027] la figure 4 montre l'effet de la saikosaponine bl de la présente invention sur l'expression des protéines Collagène I, a-SMA et Caspase 3 dans les cellules HSC-T6, où BE2029/5705[0027] Figure 4 shows the effect of saikosaponin bl of the present invention on the expression of the Collagen I, α-SMA and Caspase 3 proteins in HSC-T6 cells, where BE2029/5705
Barre d'échelle = 100 nm ;Scale bar = 100 nm;
[0028] la figure 5 montre l'effet de la nano-formulation de saikosaponine bl de la présente invention pour soulager l'anoxie du tissu de souris atteinte la fibrose hépatique induite par le tétrachlorure de carbone ;[0028] Figure 5 shows the effect of the nano-formulation of saikosaponin bl of the present invention to relieve the anoxia of the tissue of mice affected by hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride;
[0029] la figure 6 montre l'effet thérapeutique de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention sur la fibrose hépatique induite par le tétrachlorure de carbone, où Barre d'échelle = 100 nm ; et[0029] Figure 6 shows the therapeutic effect of the nano-formulation of saikosaponin b1 of the present invention on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride, where Scale bar = 100 nm; And
[0030] la figure 7 montre une évaluation sur la toxicité aiguë de la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention sur les souris normales, où barre d'échelle = 100 nm;[0030] Figure 7 shows an evaluation of the acute toxicity of the nano-formulation of saikosaponin b1 of the present invention on normal mice, where scale bar = 100 nm;
[0031] Sur les figures, A - Groupe témoin blanc ; B - Groupe modèle de tétrachlorure de carbone ; C - Groupe de monomère de saikosaponine bl ; D - Groupe MnO; ; E - groupe de microsphères PLGA/Ssb1 ; F - Groupe de nano-formulation de saikosaponine bl.[0031] In the figures, A - White control group; B - Carbon tetrachloride model group; C - Saikosaponin bl monomer group; D - MnO group; ; E - group of PLGA/Ssb1 microspheres; F - Saikosaponin bl nano-formulation group.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODE DE RÉALISATIONDETAILED STATEMENT OF MODE OF ACHIEVEMENT
[0032] La solution technique de la présente invention sera décrite en plus détaillé ci- dessous via les exemples de réalisation spécifiques. On comprendra que, la mise en œuvre de la présente invention n’est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessous, et touts les variations et/ou changements sous toute forme effectués sur la présente invention doivent être inclus dans le cadre de protection de la présente invention.[0032] The technical solution of the present invention will be described in more detail below via the specific embodiment examples. It will be understood that the implementation of the present invention is not limited to the exemplary embodiments below, and all variations and/or changes in any form made to the present invention must be included in the protection framework of the present invention.
[0033] Dans la présente invention, sauf indication contraire, toutes les parts et tous les pourcentages sont unités de poids, et les matériels et les matières premières utilisés peuvent être achetés sur le marché ou couramment utilisés dans l'art. Les procédés dans les exemples de réalisations ci-dessous, sauf indication contraire, sont des procédés classiques dans l'art.[0033] In the present invention, unless otherwise indicated, all parts and percentages are units of weight, and the materials and raw materials used can be purchased on the market or commonly used in the art. The methods in the exemplary embodiments below, unless otherwise indicated, are methods conventional in the art.
[0034] Afin de mieux illustrer l'essence de la présente invention, les effets de la présente invention seront davantage illustrés ci-après par les résultats de tests des effets BE2029/5705 pharmacologiques de la combinaison pharmaceutique de la présente invention.[0034] In order to better illustrate the essence of the present invention, the effects of the present invention will be further illustrated below by the results of tests of the pharmacological BE2029/5705 effects of the pharmaceutical combination of the present invention.
[0035] Il est important que la présente invention fournisse une nano-formulation de saikosaponine bl, qui est préparée par le procédé suivant :It is important that the present invention provides a nano-formulation of saikosaponin bl, which is prepared by the following process:
[0036] S1. dissoudre la saikosaponine b1 (Ssb1) et un copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) dans un solvant, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA) pour former des microsphères.[0036] S1. Dissolve saikosaponin b1 (Ssb1) and a copolymer of polylactic acid and glycolic acid (PLGA) in a solvent, add it dropwise to an aqueous solution of polyvinyl alcohol (PVA) to form microspheres.
[0037] S2. disperser les microsphères dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à 0,1-1,0 mol/L, ajouter à cette solution goutte à goutte progressivementune solution de permanganate de potassium à 1-10 mol/L, bien agiter et centrifuger pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1.[0037] S2. disperse the microspheres in a buffer of 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) at 0.1-1.0 mol/L, add to this solution dropwise gradually a solution of potassium permanganate at 1-10 mol /L, shake well and centrifuge to obtain the nano-formulation of saikosaponin b1.
[0038] Exemple de réalisation 1[0038] Example of embodiment 1
[0039] Un procédé de préparation de la nano-formulation de saikosaponine blm comprend les étapes suivantes :[0039] A process for preparing the nano-formulation of saikosaponin blm comprises the following steps:
[0040] S1. dissoudre 20 mg de copolymère d'acide polylactique et d'acide glycolique (PLGA) et 2 mg de Ssb1 dans 500 uL de solution d’acétone, l'ajouter goutte à goutte à une solution aqueuse d'alcool polyvinylique (PVA) à 10 mg/mL sous agitation, agiter pendant 3 heures, obtenir des microsphères de saikosaponine b1 une fois que l’acétone s' est évaporée, centrifuger à une vitesse de 5000 tr/min pendant 10 mins, et laver avec l'eau secondaire pour trois fois pour obtenir des microsphères PLGA/Ssb1 stabilisées au PVA ;[0040] S1. dissolve 20 mg of polylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA) and 2 mg of Ssb1 in 500 uL of acetone solution, add it dropwise to an aqueous solution of polyvinyl alcohol (PVA) at 10 mg/mL with stirring, shake for 3 hours, obtain saikosaponin b1 microspheres after the acetone has evaporated, centrifuge at a speed of 5000 rpm for 10 mins, and wash with secondary water for three times to obtain PLGA/Ssb1 microspheres stabilized with PVA;
[0041] S2. disperser les microsphères PLGA/Ssb1 préparées à S1 dans un tampon d'acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique (MES) 0.1 mol/L (pH=5.9), disperser aux ultrasons puis agiter, ajouter goutte à goutte progressivement à cette solution 200 uL de solution de permanganate de potassium à 5 mmol/L, de sorte de générer le dioxyde de manganèse (MnO») progressivement sur la surface des microsphères par la réduction du groupe hydroxyle sur le segment PLGA, agiter à température ambiante pendant 24 heures, laisser réagir sous agitation jusqu'à ce que la solution devient jaune brunâtre, centrifuger à une vitesse de 8000 tr/min, laver avec l'eau secondaire pour trois fois, et disperser aux ultrasons pour obtenir la nano-formulation de saikosaponine b1.[0041] S2. disperse the PLGA/Ssb1 microspheres prepared at S1 in a buffer of 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) 0.1 mol/L (pH=5.9), disperse with ultrasound then shake, add drop by drop gradually to this solution 200 uL of 5 mmol/L potassium permanganate solution, so as to generate manganese dioxide (MnO) gradually on the surface of the microspheres by the reduction of the hydroxyl group on the PLGA segment, stir at room temperature for 24 hours , allow to react with stirring until the solution becomes brownish yellow, centrifuge at a speed of 8000 rpm, wash with secondary water for three times, and disperse with ultrasound to obtain the nano-formulation of saikosaponin b1.
[0042] Exemples d'application[0042] Application examples
[0043] Procédés de tests : BE2029/5705[0043] Test methods: BE2029/5705
[0044] 1. Caractérisation de la nano-formulation de saikosaponine b1[0044] 1. Characterization of the nano-formulation of saikosaponin b1
[0045] Prelever les microsphères PLGA/Ssb1 et la nano-formulations de saikosaponine b1 synthétisées dans l'exemple de réalisation 1 et caractériser les paramètres tels que la morphologie, la vitesse de libération du médicament et l’efficacité de génération d'oxygène sous catalyse.[0045] Take the PLGA/Ssb1 microspheres and the nano-formulations of saikosaponin b1 synthesized in embodiment 1 and characterize the parameters such as the morphology, the drug release speed and the efficiency of oxygen generation under catalysis.
[0046] 1.1 Caractérisation morphologique[0046] 1.1 Morphological characterization
[0047] Tout d'abord, disperser les nanoparticules dans l'eau, gouter sur des mailles de cuivre et une lame de verre conductrice, sécher avec l'azote, puis caractériser la microscopie à l’aide d’une microscopie électronique à transmission (TEM) et d’une microscopie électronique à balayage à émission de champ (SEM). Les résultats de la caractérisation sont présentés dans la figure 1.[0047] First of all, disperse the nanoparticles in water, drip on copper mesh and a conductive glass slide, dry with nitrogen, then characterize the microscopy using transmission electron microscopy. (TEM) and field emission scanning electron microscopy (SEM). The results of the characterization are presented in Figure 1.
[0048] Comme montrée la figure 1, la taille des microsphères PLGA/Ssb1 conçues selon la présente invention était d'environ 150 nm, et en forme sphérique régulière, et la nano-formulation de saikosaponine bl formait une fine couche évidente de MnO2 sur la surface des microsphères PLGA/Ssbl. Au microscope SEM, les microsphères molles[0048] As shown in Figure 1, the size of the PLGA/Ssb1 microspheres designed according to the present invention was approximately 150 nm, and in regular spherical shape, and the nano-formulation of saikosaponin bl formed a thin obvious layer of MnO2 on the surface of the PLGA/Ssbl microspheres. Under the SEM microscope, the soft microspheres
PLGA/Ssb1 présentaient une agglomération-fusion, tandis que la nano-formulation de saikosaponine bl recouverte de la fine couche de MnO2 sur la surface était relativement rigide et bine maintenait la forme sphérique.PLGA/Ssb1 exhibited agglomeration-fusion, while the nano-formulation of saikosaponin bl covered with the thin layer of MnO2 on the surface was relatively rigid and maintained the spherical shape.
[0049] 1.2 Vitesse libération du médicament[0049] 1.2 Drug release speed
[0050] Charger respectivement les microsphères PLGA/Ssb1 et la nano-formulation de saikosaponine b1 dans des sacs de dialyse ayant un seuil de retenue moléculaire de 2000, respectivement, et dialyser avec dix volumes de tampon PBS (pH 7,4), prélever aux heures définies puis compléter avec le tampon de volume correspondant pour poursuivre la dialyse. Une fois le prélèvement aux heures définies effectué, déterminer la quantité de libération de saikosaponine bl à l’aide d’un spectrophotomètre ultraviolet pour simuler l'effet de libération du médicament dans le tissu hépatique. Les résultats sont présentés dans la figure 2.Load respectively the PLGA/Ssb1 microspheres and the nano-formulation of saikosaponin b1 into dialysis bags having a molecular retention threshold of 2000, respectively, and dialyze with ten volumes of PBS buffer (pH 7.4), take at the defined times then complete with the corresponding volume buffer to continue dialysis. After sampling at the set times, determine the release amount of saikosaponin bl using an ultraviolet spectrophotometer to simulate the drug release effect in liver tissue. The results are presented in Figure 2.
[0051] La figure 2 montre des courbes de libération du médicament des microsphères[0051] Figure 2 shows drug release curves from the microspheres
PLGA/Ssbl et de la nano-formulation de saikosaponine bl, dans laquelle la nano-PLGA/Ssbl and the nano-formulation of saikosaponin bl, in which the nano-
formulation de saikosaponine bl conçue selon la présente invention libère la Ssbl BE20225705 lentement et uniformément pendant environ 10 heures, prolongeant ainsi la durée d'action effectif du médicament, ce qui est bénéfique pour renforcer l'effet thérapeutique sur la fibrose hépatique.saikosaponin bl formulation designed according to the present invention releases Ssbl BE20225705 slowly and uniformly for about 10 hours, thereby prolonging the effective action duration of the drug, which is beneficial for enhancing the therapeutic effect on liver fibrosis.
[0052] 1.3 Efficacité de génération d'oxygène sous catalyse[0052] 1.3 Efficiency of oxygen generation under catalysis
[0053] L'efficacité de la nano-formulation de saikosaponine b1 pour générer l'oxygène en catalysant la décomposition de H,O, a été mesurée à l’aide d’un compteur d'oxygène dissous. Disperser la nano-formulation de saikosaponine b1 dans une solution aqueuse et introduire l'argon en continu dans la solution aqueuse pendant 30 minutes pour éliminer l'oxygène dissous jusqu'à ce que l'oxygène dissous tombe en dessous de 4 mg/L. Puis ajouter différentes quantités de solution de H,O, à 3 %, soit 0 mM, 11 mM, 33 mM et 44 mM, surveiller en temps réel la génération d'oxygène à l'aide d'un compteur d'oxygène dissous, lire et enregistrer toutes les 10 secondes, 50 enregistrements au total.[0053] The effectiveness of the nano-formulation of saikosaponin b1 in generating oxygen by catalyzing the decomposition of H, O, was measured using a dissolved oxygen meter. Disperse the saikosaponin b1 nano-formulation in an aqueous solution and introduce argon continuously into the aqueous solution for 30 minutes to remove dissolved oxygen until the dissolved oxygen drops below 4 mg/L. Then add different quantities of 3% H,O solution, i.e. 0 mM, 11 mM, 33 mM and 44 mM, monitor the generation of oxygen in real time using a dissolved oxygen meter, read and record every 10 seconds, 50 records in total.
[0054] La figure 3 montre un effet de la nano-formulation de saikosaponine bl de la présente invention pour générer l'oxygène en catalysant la décomposition de peroxyde d'hydrogène. Pour différentes concentrations de solutions de peroxyde d'hydrogène, la nano-formulations de saikosaponine bl pourrait catalyser la génération d'oxygène de manière rapide et efficace, des concentrations élevées de peroxyde d'hydrogène correspondant à des hautes vitesse de génération d'oxygène, ce qui montre que la nano- formulation de saikosaponine b1 de la présente invention pourrait éliminer rapidement le peroxyde d'hydrogène accumulé dans le foie et réduire les dommages dûs à la oxydation des cellules hépatiques, de plus, l'oxygène généré sous catalyse pourrait soulager l’apport insuffisant en oxygène dans la région de la fibrose hépatique et ajuster l'environnement de la région de la fibrose hépatique et le rendre plus propice au maintien des cellules hépatiques à l’état normal.[0054] Figure 3 shows an effect of the nano-formulation of saikosaponin bl of the present invention to generate oxygen by catalyzing the decomposition of hydrogen peroxide. For different concentrations of hydrogen peroxide solutions, the nano-formulations of saikosaponin bl could catalyze the generation of oxygen quickly and efficiently, with high concentrations of hydrogen peroxide corresponding to high speed of oxygen generation, which shows that the nano-formulation of saikosaponin b1 of the present invention could quickly eliminate the hydrogen peroxide accumulated in the liver and reduce the oxidative damage of liver cells, in addition, the oxygen generated under catalysis could relieve insufficient oxygen supply in the liver fibrosis region and adjust the environment of the liver fibrosis region and make it more conducive to maintaining the liver cells in the normal state.
[0055] 2. Tests cellulaires[0055] 2. Cellular tests
[0056] 2.1 Modélisation cellulaire[0056] 2.1 Cellular modeling
[0057] Le modèle de fibrose hépatique cellulaire a été construit en stimulant l'activation des cellules stellaires hépatiques HSC-T6 des rats par la protéine recombinante induite par le facteur de croissance transformant-B (TGF-B). Inoculer les cellules HSC-T6 sur une plaque à 6 puits à 1 x 10°, laisser adhérent sur la paroi pendant BE2029/5705 la nuit, remplacer par un milieu sans sérum et cultiver pendant 12 heures, laisser deux puits vierges, ajouter TGF-B à 10 ng/mL dans les autres puits pour activer pendant 24 heures, gratter les cellules, extraire la protéine puis la bouillir pour dénaturer, détecter les expressions de l'actine musculaire lisse a (a-SMA) et du collagène de type I (Collagène 1) par test Western blot (WB) pour vérifier le succès ou l'échec de la modélisation de fibrose hépatique activé par les cellules HSC-T6.The model of cellular hepatic fibrosis was constructed by stimulating the activation of HSC-T6 hepatic stellate cells of rats by the recombinant protein induced by transforming growth factor-B (TGF-B). Inoculate HSC-T6 cells onto a 6-well plate at 1 x 10°, leave adherent to the wall for BE2029/5705 overnight, replace with serum-free medium and culture for 12 hours, leave two wells blank, add TGF- B at 10 ng/mL in the other wells to activate for 24 hours, scrape the cells, extract the protein then boil it to denature, detect the expressions of a-smooth muscle actin (a-SMA) and type I collagen (Collagen 1) by Western blot (WB) test to verify the success or failure of modeling hepatic fibrosis activated by HSC-T6 cells.
[0058] 2.2 Effet anti-fibrose hépatique[0058] 2.2 Anti-hepatic fibrosis effect
[0059] Une fois le succès de la modélisation de cellules vérifié, préparer une suspension cellulaire à partir des cellules HSC-T6 en phase logarithmique de croissance, puis inoculer les cellules HSC-T6 sur une plaque à 6 puits à 1 x 10°, laisser adhérent sur la paroi pendant la nuit, remplacer par un milieu sans sérum, cultiver pendant 12 heures, laisser un puits vierge, et ajouter TGF-B à 10 ng/mL dans les autres puits pour activer.[0059] Once the success of the cell modeling has been verified, prepare a cell suspension from the HSC-T6 cells in the logarithmic phase of growth, then inoculate the HSC-T6 cells onto a 6-well plate at 1 x 10°, leave adherent to the wall overnight, replace with serum-free medium, culture for 12 hours, leave one well blank, and add TGF-B at 10 ng/mL to the other wells to activate.
Observer l'efficacité anti-fibrose hépatique du médicament de monomère de saikosaponine bl dans les puits de cellules HSC-T6 activés. Co-cultiver pendant 24 heures, gratter les cellules, extraire la protéine, détecter les expressions de l’a-SMA et duObserve the anti-liver fibrosis efficacy of saikosaponin bl monomer drug in activated HSC-T6 cell wells. Co-culture for 24 hours, scrape the cells, extract the protein, detect the expressions of a-SMA and
Collagen 1, et répéter pour trois fois. Les cellules HSC-T6 sécrètent la protéine a-SMA après avoir été stimulées et activées par le TGF-B pour indiquer l'état d'activation des cellules HSC-T6. De plus, HSC-T6 se différencie en fibroblastes, sécréte le collagène et autres substances pour former des fibres de collagène, entraînant ainsi une fibrose dans le foie. La figure 4 montre l'effet de la saikosaponine bl de la présente invention sur l'expression des protéines Collagène 1, a-SMA et Caspase 3 dans les cellules HSC-T6, oùCollagen 1, and repeat for three times. HSC-T6 cells secrete a-SMA protein after being stimulated and activated by TGF-B to indicate the activation state of HSC-T6 cells. In addition, HSC-T6 differentiates into fibroblasts, secretes collagen and other substances to form collagen fibers, thereby leading to fibrosis in the liver. Figure 4 shows the effect of saikosaponin bl of the present invention on the expression of Collagen 1, α-SMA and Caspase 3 proteins in HSC-T6 cells, where
Barre d'échelle = 100 nm. La figure 4 montre que la monomère de saikosaponine b1 pourrait réduire efficacement l'expression de l'u-SMA et du collagène 1, ce qui montre que la saikosaponine b1 présentait un bon effet d’inhibition sur l’activation des cellulesScale bar = 100 nm. Figure 4 shows that saikosaponin b1 monomer could effectively reduce the expression of u-SMA and collagen 1, which shows that saikosaponin b1 exhibited a good inhibition effect on cell activation.
HSC-T6 et présentait donc un effet anti-fibrose hépatique.HSC-T6 and therefore presented an anti-liver fibrosis effect.
[0060] Après cela, déterminer le changement d'expression de la protéine de l’enzyme d’apoptose 3 (Caspase 3) des cellules HSC-T6 par test WB, et répéter pour trois fois. La[0060] After that, determine the protein expression change of apoptosis enzyme 3 (Caspase 3) of HSC-T6 cells by WB test, and repeat for three times. There
Caspase 3 (poids moléculaire de 32KD à l'état normal) est une protéine exécutive clé dans le processus d’apoptose celullaire, qui est activée à la phase d’apoptose précoce et se décompose en sous-unités de Cleaved-Caspase 3 ayant un poids moléculaire de 12KD, BE2029/5705 qui médie finalement 1’ apoptose celullaire. La saikosaponine b1 induit l'expression de la sous-unité clivée-caspase 3 dans HSC-T6 à une haute concentration (15 uM), ce qui montre que la saikosaponine bl pourrait induire l'apoptose dans les cellules HSC-T6 activées, inhibant ainsi la fibrose hépatique.Caspase 3 (molecular weight 32KD in normal state) is a key executive protein in the cell apoptosis process, which is activated at the early apoptosis phase and breaks down into Cleaved-Caspase 3 subunits having a molecular weight of 12KD, BE2029/5705 which ultimately mediates cellular apoptosis. Saikosaponin b1 induced the expression of cleaved-caspase 3 subunit in HSC-T6 at a high concentration (15 uM), showing that saikosaponin b1 could induce apoptosis in activated HSC-T6 cells, inhibiting thus liver fibrosis.
[0061] 3. Tests chez animaux[0061] 3. Tests in animals
[0062] 3.1 Modélisation des tests chez animaux[0062] 3.1 Modeling of animal tests
[0063] Sélectionner 60 souris mâles Balb/c d'environ 20 g âgées de 5 à 6 semaines, les diviser au hasard en un groupe témoin blanc ; un groupe modèle de tétrachlorure de carbone ; un groupe de monomère de saikosaponine bl ; un groupe de dioxyde de manganèse ; un groupe de microsphères PLGA/Ssb1 ; un groupe de nano-formulation de saikosaponine bl, 10 souris pour chaque groupe. Injecter l’huile d'olive par voie sous- cutanée chez les souris du groupe témoin blanc, et injecter un mélange à 3mL/kg composé de 40 % de tétrachlorure de carbone et de l'huile d'olive chez les souris des autres groupes pour induire la fibrose hépatique chez les souris, deux fois par semaine pendant 5 semaines, tuer les souris et détecter l’état de fibrose hépatique.[0063] Select 60 Balb/c male mice weighing approximately 20 g aged 5 to 6 weeks, divide them randomly into a white control group; a model group of carbon tetrachloride; a group of saikosaponin bl monomer; a manganese dioxide group; a group of PLGA/Ssb1 microspheres; a saikosaponin bl nano-formulation group, 10 mice for each group. Inject olive oil subcutaneously into mice in the white control group, and inject a mixture at 3mL/kg composed of 40% carbon tetrachloride and olive oil into mice from other groups. to induce liver fibrosis in mice, twice a week for 5 weeks, kill the mice and detect the state of liver fibrosis.
[0064] 3.2 Protocole d’administration[0064] 3.2 Administration protocol
[0065] Le modèle de souris atteinte de la fibrose hépatique a été construit avec succès à la fin de cinq semaines de l'injection de tétrachlorure de carbone. À l'exception des souris témoins blanc, d'autres souris atteintes de la fibrose hépatique ont reçu une injection par voie intraveineuse caudale de 100 uL de tampon PBS, de monomère de saikosaponine bl dispersé dans le sodium CMC, d'une solution de microsphères de dioxyde de manganèse, d'une solution de microsphères PLGA/Ssb1 et d'une solution de nano-formulation de saikosaponine bl. Administrer toutes les semaines, et en mêmes temps, injecter un mélange à 3mL/kg composé de 40 % de tétrachlorure de carbone et de l'huile d'olive par voie abdominale pendant 3 semaines pour maintenir l’état de fibrose hépatique.The mouse model suffering from hepatic fibrosis was successfully constructed at the end of five weeks of carbon tetrachloride injection. Except for blank control mice, other mice with liver fibrosis were injected caudally intravenously with 100 μL of PBS buffer, saikosaponin bl monomer dispersed in CMC sodium, microspheres solution of manganese dioxide, a solution of PLGA/Ssb1 microspheres and a solution of saikosaponin bl nano-formulation. Administer every week, and at the same time, inject a mixture at 3mL/kg composed of 40% carbon tetrachloride and olive oil abdominally for 3 weeks to maintain the state of liver fibrosis.
[0066] 3.3 Prélever pour les tests chez animaux[0066] 3.3 Collect for animal tests
[0067] 24 heures après la dernière injection, anesthésier légèrement les souris avec l'hydrate de chloral (à une concentration de 4 % préparée avec le sérum physiologique, 1 ml pour 100 g de souris), puis prélever un échantillon de sang du cœur, tuer par BE2029/5705 décapitation, laisser l’échantillon à température ambiante pendant 3 heures, centrifuger à 1500 tr/min, prélever le plasma surnageant et stocker à 4 °C. Disséquer le foie des souris, prélever un morceau de tissu hépatique de même taille, fixer avec 4 % paraformaldéhyde pendant une semaine, et enrober avec la paraffine. Parallèlement, prélever un morceau de tissu hépatique de 1,0 cm x 1,0 cm x 1,0 cm au même site, homogénéiser avec le sérum physiologique à basse température, et stocker le tissu hépatique restant à -80°C.[0067] 24 hours after the last injection, lightly anesthetize the mice with chloral hydrate (at a concentration of 4% prepared with physiological serum, 1 ml per 100 g of mice), then take a sample of blood from the heart , kill by BE2029/5705 decapitation, leave the sample at room temperature for 3 hours, centrifuge at 1500 rpm, collect the supernatant plasma and store at 4 °C. Dissect the liver of mice, remove a piece of liver tissue of the same size, fix with 4% paraformaldehyde for one week, and embedding with paraffin. At the same time, collect a 1.0 cm x 1.0 cm x 1.0 cm piece of liver tissue from the same site, homogenize with saline at low temperature, and store the remaining liver tissue at -80°C.
[0068] 3.4 Détection des indicateurs pertinents[0068] 3.4 Detection of relevant indicators
[0069] Prélever un petit morceau de tissu hépatique congelé en découpant au site correspondant, l’enrober avec ICG, découper en tranches ayant une épaisseur de 4 um à l'aide d'un cryotrancheuse, effectuer une analyse par immunofluorescence tissulaire (IF) pour détecter l’expression du facteur lo inductible par l'anoxie (HIF-1a) dans le tissu.[0069] Take a small piece of frozen liver tissue by cutting at the corresponding site, coat it with ICG, cut into slices having a thickness of 4 μm using a cryo-slicer, carry out tissue immunofluorescence (IF) analysis. to detect the expression of anoxia-inducible factor lo (HIF-1a) in the tissue.
HIF-1« est surexprimé par les cellules à l’état anoxique et induit les cellules à effectuer un métabolisme glycolytique indépendant de l'oxygène, leur permettant de survivre à l’état anoxique. Cependant, dans le processus de métabolisme anoxique, en raison d'un apport insuffisant en oxygène, une grande quantité de l'oxygène à haute réactivité sera générée dans les mitochondries, stimulant l'activation des cellules HSC-T6. HIF-10, comme protéine indicatrice de l'état anoxique cellulaire, peut bien indiquer l'état de croissance cellulaire.HIF-1" is overexpressed by cells in the anoxic state and induces cells to perform oxygen-independent glycolytic metabolism, allowing them to survive the anoxic state. However, in the process of anoxic metabolism, due to insufficient oxygen supply, a large amount of the high-reactivity oxygen will be generated in the mitochondria, stimulating the activation of HSC-T6 cells. HIF-10, as an indicator protein of cell anoxic state, can well indicate cell growth state.
[0070] Sur la figure 5, le tissu hépatique des souris de modèle de fibrose hépatique présente le plus haut niveau de fluorescence HIF-lo, chez les souris injectés avec les microsphères de dioxyde de manganèse et la nano-formulations de saikosaponine b1, l'expression de HIF-1a dans leur tissu hépatique a présenté une diminution significative, ce qui montre que les microsphères de dioxyde de manganèse et la nano-formulations de saikosaponine bl de la présente invention pouvaient catalyser efficacement le peroxyde d'hydrogène pour générer l'oxygène dans le foie, soulager donc efficacement l'apport insuffisant en oxygène au tissu fibrose hépatique, réduire le stress oxydatif du tissu hépatique, et présenter un bon effet protecteur sur le foie.[0070] In Figure 5, the liver tissue of mice model of hepatic fibrosis presents the highest level of HIF-lo fluorescence, in mice injected with manganese dioxide microspheres and the nano-formulations of saikosaponin b1, l The expression of HIF-1a in their liver tissue showed a significant decrease, showing that the manganese dioxide microspheres and saikosaponin bl nano-formulations of the present invention could effectively catalyze hydrogen peroxide to generate the oxygen in the liver, therefore effectively relieve insufficient oxygen supply to liver fibrosis tissue, reduce oxidative stress of liver tissue, and exhibit a good protective effect on the liver.
[0071] Prélever le tissu hépatique enrobé avec la paraffine, couper en tranches ayant une épaisseur de 4 um et effectuer une analyse par coloration à l'hématoxyline-éosine[0071] Take the liver tissue coated with paraffin, cut into slices having a thickness of 4 μm and carry out an analysis by staining with hematoxylin-eosin
(H&E), dans laquelle le noyau était coloré en bleu et le cytoplasme était coloré en rouge. BE2029/5705(H&E), in which the nucleus was stained blue and the cytoplasm was stained red. BE2029/5705
Par rapport au groupe normal, une grande quantité de cellules inflammatoires ont été infiltrées dans le tissu hépatique chez le groupe modèle, ce qui se présente par une accumulation de nombreux noyaux (Figure 6). Chez les souris traitées, par rapport à l'administration de la monomère de saikosaponine bl, la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention réduit considérablement l'infiltration cellulaire inflammatoire. De plus, préparer le tissu en coupes de paraffine et effectuer une analyse de coloration Masson, le collagène dans la région de fibrose hépatique étant coloré en bleu, et comme montrée la figure 6, par rapport à l'administration de la monomère de saikosaponine b1, la nano-formulation de saikosaponine b1 de la présente invention réduit efficacement le dépôt de collagène du tissu, ce qui indique son effet thérapeutique renforcé sur la fibrose hépatique.Compared with the normal group, a large amount of inflammatory cells were infiltrated into the liver tissue in the model group, which presented as accumulation of numerous nuclei (Figure 6). In treated mice, compared to the administration of saikosaponin b1 monomer, the saikosaponin b1 nano-formulation of the present invention significantly reduced inflammatory cell infiltration. Additionally, prepare the tissue in paraffin sections and perform Masson staining analysis, with collagen in the liver fibrosis region stained blue, and as shown in Figure 6, compared to administration of saikosaponin b1 monomer , the nano-formulation of saikosaponin b1 of the present invention effectively reduces tissue collagen deposition, indicating its enhanced therapeutic effect on liver fibrosis.
[0072] 3.5 Évaluation de la sécurité in vivo[0072] 3.5 In vivo safety assessment
[0073] Les souris ont été mises à jeun pendant 12 heures avant les tests et réparties au hasard en 5 groupes en fonction de leur poids corporel : un groupe témoin blanc, un groupe de monomère de saikosaponine bl, un groupe de dioxyde de manganèse, un groupe de microsphères PLGA/Ssb1 et un groupe de nano-formulation saikosaponine b1, 6 souris pour chaque groupe. Injecter le médicament par voie intraveineuse caudale à une dose de 20 mL/kg chez chaque groupe, et injecter un volume égal de PBS par voie 1ntraveineuse caudale chez le groupe témoin de PBS, une fois par jour pendant 3 jours consécutifs, et détecter la sécurité biologique du médicament sur les souris. Après l'injection, prélever sur les animaux comme décrit dans la section "3.3", en particulier les organes suivants : le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins, fixer avec 4 % paraformaldéhyde pendant une semaine, et enrober avec la paraffine, découper en tranches et effectuer une analyse par coloration H&E. La figure 7 montre les résultats de coloration H&E sur les principaux organes de différents groupes, dans une analyse histomorphologique, il n'y avait aucun changement évident chez les souris du groupe d'administration du médicament, ce qui a montré que les médicaments et la nano- formulations de la présente invention ne présentait pas de toxicité évidente et présentait une bonne sécurité biologique.[0073] The mice were fasted for 12 hours before the tests and randomly distributed into 5 groups according to their body weight: a blank control group, a saikosaponin bl monomer group, a manganese dioxide group, a group of PLGA/Ssb1 microspheres and a group of saikosaponin b1 nano-formulation, 6 mice for each group. Inject the drug intravenously caudally at a dose of 20 mL/kg in each group, and inject an equal volume of PBS intravenously caudally in the PBS control group, once a day for 3 consecutive days, and detect the safety biology of the drug on mice. After injection, collect from animals as described in section "3.3", particularly the following organs: heart, liver, spleen, lungs and kidneys, fix with 4% paraformaldehyde for one week, and coat with paraffin, cut into slices and carry out analysis by H&E staining. Figure 7 shows the results of H&E staining on the main organs of different groups, in histomorphological analysis, there were no obvious changes in the mice in the drug administration group, which showed that the drugs and the nano-formulations of the present invention did not exhibit obvious toxicity and exhibited good biological safety.
[0074] En conclusion, la nano-formulation de saikosaponine bl de la présente BE2029/5705 invention peut efficacement inhiber et réduire le niveau de fibrose hépatique, présente une bonne sécurité biologique et un bon effet de protection du foie.[0074] In conclusion, the nano-formulation of saikosaponin bl of the present BE2029/5705 invention can effectively inhibit and reduce the level of liver fibrosis, has good biological safety and a good liver protection effect.
[0075] Enfin, il faut noter que, le cadre de protection de la présente invention n’est pas limité aux exemples de réalisations ci-dessous, les exemples de réalisations ci-dessous ne sont que pour expliquer et illustrer la présente invention, au lieu de limiter le cadre de protection de la présente invention, toutes modifications, remplacements équivalents et améliorations obtenus par l’homme de l’art sans travail créatif et en respectant les esprits et les principes de la présente invention doivent être inclus dans le cadre de protection de la présente invention.[0075] Finally, it should be noted that the protection framework of the present invention is not limited to the examples of embodiments below, the examples of embodiments below are only to explain and illustrate the present invention, at least instead of limiting the framework of protection of the present invention, all modifications, equivalent replacements and improvements obtained by those skilled in the art without creative work and respecting the spirits and principles of the present invention must be included within the framework of protection of the present invention.
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CN202210252175.6A CN114767661B (en) | 2022-03-15 | 2022-03-15 | Saikosaponin b1 nano-preparation, preparation method and application thereof in preparation of medicines for preventing and treating hepatic fibrosis |
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