BE1027232B1 - Method for detecting at least one protein variant and / or at least one peptide specific to the alpha and / or beta and / or delta chains of hemoglobin - Google Patents
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Abstract
La présente invention porte sur un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un variant de protéine connu et/ou d'au moins un peptide propre aux chaînes α et/ou β et/ou δ d’hémoglobine. La présente invention concerne également un système et un kit pour la mise en œuvre du procédé.The present invention relates to a method for detecting, in a biological sample, at least one known protein variant and / or at least one peptide specific to the α and / or β and / or δ chains of hemoglobin. The present invention also relates to a system and a kit for implementing the method.
Description
+ BE2019/5561 Procede de detection d’au moins un variant de proteine et/ou d’au moins un peptide propre aux chaines alpha et/ou beta et/ou delta d’hemoglobine La présente invention porte sur un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un variant de protéine connu et/ou d'au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’'hémoglobine. La présente invention concerne également un système et un kit pour la mise en œuvre du procédé.+ BE2019 / 5561 Method for detecting at least one protein variant and / or at least one peptide specific to the alpha and / or beta and / or delta chains of hemoglobin The present invention relates to a method of detection, in a biological sample, of at least one known protein variant and / or of at least one peptide specific to the a and / or B chains and / or 5 of hemoglobin. The present invention also relates to a system and a kit for implementing the method.
La spectrométrie de masse est une technique physico-chimique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt et de caractériser leur structure chimique. En particulier, la spectrométrie de masse permet de déterminer les structures moléculaires de nombreuses espèces en mélange (dont des biomolécules). Le principe général de cette technique d'analyse réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). En pratique, les espèces moléculaires examinées sont vaporisées et ionisées au sein d’une source d'ionisation puis les ions formés sont transférés vers l’analyseur qui va mesurer leur rapport masse/charge avant que le détecteur ne mesure le nombre d'ions d’un rapport masse/charge spécifique l’atteignant. Au cours de l’analyse, une étape de fragmentation peut avoir lieu. Le résultat d’une analyse par spectrométrie de masse est un spectre de masse, qui est une représentation graphique dont l’axe des abscisses correspond aux rapports m/z et [axe des ordonnées à l'intensité du signal. Parmi les techniques d'ionisation, la technique « Electrospray » donne bien lieu à une ionisation mais ne provoque pas principalement une fragmentation des molécules : il s’agit d’une technique d'ionisation dite « douce » et particulièrement utile pour la production de protéines et de peptides à charges multiples. En termes de fragmentation, une fragmentation induite par collision peut être utilisée : il s'agit d’une fragmentation permettant de casser les liaisons moléculaires, en particulier les liaisons peptidiques, et de produire des "ions fils". Les spectres de masse complexes ainsi produits sont classiquement convertis en un spectre déconvolué généré par ordinateur ayant un seul pic de masse pour chaque (poly)peptide.Mass spectrometry is a physicochemical analysis technique allowing to detect and identify molecules of interest and to characterize their chemical structure. In particular, mass spectrometry makes it possible to determine the molecular structures of numerous species in mixture (including biomolecules). The general principle of this analytical technique lies in the gas phase separation of charged molecules (ions) according to their mass / charge ratio (m / z). In practice, the molecular species examined are vaporized and ionized within an ionization source then the ions formed are transferred to the analyzer which will measure their mass / charge ratio before the detector measures the number of ions d. 'a specific mass / charge ratio reaching it. During the analysis, a fragmentation step may take place. The result of a mass spectrometry analysis is a mass spectrum, which is a graphical representation with the x-axis corresponding to the m / z ratios and the y-axis to the signal strength. Among the ionization techniques, the “Electrospray” technique does give rise to ionization but does not mainly cause fragmentation of the molecules: it is a so-called “soft” ionization technique and particularly useful for the production of. multi-charged proteins and peptides. In terms of fragmentation, collision-induced fragmentation can be used: it is a fragmentation that breaks molecular bonds, especially peptide bonds, and produces "daughter ions". The complex mass spectra thus produced are conventionally converted into a computer generated deconvolved spectrum having a single mass peak for each (poly) peptide.
La spectrométrie de masse est notamment utilisée pour la détection de variants de protéines et de (poly)peptides impliqués dans différentes maladies dont diverses formes d'anémie et diverses formes de troubles métaboliques héréditaires. Chez l’'Humain, les hémoglobinopathies désignent l'ensemble des maladies provoquées par une anomalie génétique de l'hémoglobine, protéine sanguine assurant le transport de l'oxygène dans l'organisme, via les globules rouges. Les variants d'hémoglobine sont généralement détectés à la suite d'un dépistage pré-anesthésique ou de programmes de dépistage néonatal et prénatal, ces programmes ayant notamment pour objectif de détecter la présence d’au moins un des variants de l'hémoglobine, par exemple Hb S, Hb C, Hb DPnieb, Hb OA, Hb Lepore et/ou Hb E. Ces variants correspondent à des mutations d’acides aminés sur la chaîne B de Phémoglobine : on parle alors d’anomalies qualitatives. Les programmes de dépistage néonatal et prénatal portent aussi sur la mise en évidence d’anomalies dites quantitatives comme l’a-thalassémie et la B-thalassémie.Mass spectrometry is used in particular for the detection of variants of proteins and (poly) peptides involved in various diseases including various forms of anemia and various forms of hereditary metabolic disorders. In humans, hemoglobinopathies refer to all the diseases caused by a genetic abnormality in hemoglobin, a blood protein ensuring the transport of oxygen in the body, via red blood cells. Hemoglobin variants are generally detected following pre-anesthetic screening or neonatal and prenatal screening programs, these programs having the particular objective of detecting the presence of at least one of the hemoglobin variants, for example example Hb S, Hb C, Hb DPnieb, Hb OA, Hb Lepore and / or Hb E. These variants correspond to amino acid mutations on the B chain of hemoglobin: we then speak of qualitative abnormalities. Neonatal and prenatal screening programs also focus on identifying so-called quantitative abnormalities such as α-thalassemia and B-thalassemia.
Par définition, un variant de protéine correspond à l’expression (transcription et traduction) d’un gène présentant une ou plusieurs mutations par rapport au gène natif. Le variant protéique dispose donc d’une séquence primaire en acides aminés différente de celle de la protéine native, pouvant aller d’un seul acide aminé différent (comme c'est le cas pour la chaine B de l’'hémoglobine) à plusieurs dizaines d’acides aminés modifiés. Du point de vue fonctionnel, un variant peut tout à fait conserver l’activité de la protéine native ou, par exemple, perdre sa structure tridimensionnelle (tertiaire), ce qui peut conduire à une perte partielle ou totale de la fonction protéique initiale.By definition, a protein variant corresponds to the expression (transcription and translation) of a gene having one or more mutations compared to the native gene. The protein variant therefore has a primary amino acid sequence different from that of the native protein, which can range from a single different amino acid (as is the case for the B chain of hemoglobin) to several dozen of modified amino acids. Functionally, a variant may well retain the activity of the native protein or, for example, lose its three-dimensional (tertiary) structure, which may lead to partial or total loss of the initial protein function.
Les thalassémies, encore appelées dans leur forme majeure anémie ou maladie de Cooley, sont des formes d'anémies héréditaires, faisant partie des hémoglobinopathies (déficiences dans la synthèse de l'hémoglobine). Il existe deux formes majeures de thalassémie : l’a-thalassémie et la B- thalassémie comme indiqué ci-dessus. La forme 5 est plus rare. Classiquement, la «détection des thalassémies s’effectue par diverses techniques d’électrophorèse (sur gel, sur acétate de cellulose ou capillaire), par la focalisation isoélectrique (une autre forme d'électrophorèse) ou par chromatographie liquide.Thalassemias, also called in their major form anemia or Cooley's disease, are hereditary forms of anemia, forming part of hemoglobinopathies (deficiencies in the synthesis of hemoglobin). There are two major forms of thalassemia: α-thalassemia and β-thalassemia as indicated above. Form 5 is rarer. Conventionally, the "detection of thalassemias is carried out by various electrophoresis techniques (on gel, on cellulose acetate or capillary), by isoelectric focusing (another form of electrophoresis) or by liquid chromatography.
Le document EP1844338 B1 décrit un procédé de détection, dans un échantillon, d'au moins un variant de protéine connu, le procédé comprenant les étapes suivantes : ( digestion de la protéine pour produire une série définie de peptides ; (ii) ionisation des peptides produits à l’étape (i) et sélection par spectrométrie de masse d’un peptide ionisé de rapport masse/charge connu et indicatif dudit au moins un variant de protéine ; (it) fragmentation induite par collision du peptide ionisé et sélectionné à l'étape (ii) ; (iv) détection d’un ou de plusieurs fragments de rapport masse/charge connu obtenu(s) à l’étape (iii) pour confirmer la présence dudit au moins un variant de protéine dans l'échantillon.Document EP1844338 B1 describes a method for the detection, in a sample, of at least one known protein variant, the method comprising the following steps: (digestion of the protein to produce a defined series of peptides; (ii) ionization of the peptides produced in step (i) and selection by mass spectrometry of an ionized peptide of known mass / charge ratio and indicative of said at least one protein variant; (it) fragmentation induced by collision of the ionized peptide and selected at the step (ii); (iv) detection of one or more fragments of known mass / charge ratio obtained in step (iii) to confirm the presence of said at least one protein variant in the sample.
Malheureusement, avec un tel procédé selon le document EP1844338 B1, il subsiste une incertitude considérable qui est de savoir si à issue d’un test ou d’une batterie de tests, ledit au moins un variant de protéine n’est pas détecté dans l'échantillon non pas parce qu’il n’y est pas présent mais tout simplement parce que le procédé lui-même n’est pas à même de détecter ledit au moins un variant de protéine pourtant bien présent dans l'échantillon. Un tel cas peut se présenter dès le moment où l’une des étapes du procédé échoue.Unfortunately, with such a method according to document EP1844338 B1, there remains a considerable uncertainty which is whether at the end of a test or a battery of tests, said at least one protein variant is not detected in the test. 'sample not because it is not present there but quite simply because the method itself is not able to detect said at least one protein variant which is nevertheless present in the sample. Such a case can arise as soon as one of the process steps fails.
Par exemple, si l’étape de digestion ne donne pas lieu à une obtention correcte des peptides attendus, les résultats obtenus au terme de l’ensemble des étapes du procédé peuvent être totalement erronés, avec le risque considérable de ne pas détecter une maladie/pathologie alors que le patient en souffre bel et bien. Il se pourrait également que l’une ou plusieurs des étapes (ii) à (iv) ne se déroule pas de la façon attendue, par exemple parce que l’appareillage utilisé n’est pas calibré et/ou paramétré correctement.For example, if the digestion step does not give rise to a correct obtaining of the expected peptides, the results obtained at the end of all the steps of the process may be totally erroneous, with the considerable risk of not detecting a disease. pathology while the patient is indeed suffering from it. It could also be that one or more of steps (ii) to (iv) does not proceed as expected, for example because the equipment used is not calibrated and / or configured correctly.
Pour résoudre au moins en partie ces problèmes de l’état de la technique, il est prévu suivant l'invention, un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un variant de protéine connu et/ou d'au moins un peptide connu propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’hémoglobine, le procédé comprenant les étapes suivantes : ( digestion de la protéine et/ou de l'hémoglobine pour produire une série définie de peptides ;To at least partially resolve these problems of the state of the art, there is provided according to the invention a method for detecting, in a biological sample, at least one known protein variant and / or at least a known peptide specific to α and / or B and / or hemoglobin chains, the method comprising the following steps: (digestion of the protein and / or hemoglobin to produce a defined series of peptides;
(ii) ionisation des peptides produits à l’étape (i) et sélection par spectrométrie de masse d’au moins un peptide ionisé de rapport masse/charge connu et indicatif dudit au moins un variant de protéine et/ou dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine ; (ii) fragmentation induite par collision dudit au moins un peptide ionisé et sélectionné à l’étape (ii) ; (iv) détection d’un ou de plusieurs fragments de rapport masse/charge connu obtenu(s) à l’étape (iii) pour confirmer la présence dudit au moins un variant de protéine dans l'échantillon et/ou dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’hémoglobine dans l’échantillon ; ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comprend au moins une des étapes suivantes : a) une étape de validation de la détection dudit au moins un variant et/ou dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’'hémoglobine par mise en œuvre des étapes (ii) à (iv) au départ d’un échantillon comprenant au moins un peptide connu caractéristique dudit au moins un variant et/ou comprenant au moins un peptide connu caractéristique des chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine; ou b) une étape de validation de ladite étape (i) de digestion et de validation de la détection dudit au moins un variant et/ou dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’'hémoglobine par mise en œuvre des étapes (i) à (iv) au départ d’un échantillon comprenant au moins une protéine-contrôle porteuse dudit au moins un variant et dont la série de peptides à obtenir par digestion est préalablement connue et/ou comprenant au moins une protéine-contrôle porteuse dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine et dont la série de peptides à obtenir par digestion est préalablement connue.(ii) ionization of the peptides produced in step (i) and selection by mass spectrometry of at least one ionized peptide of known mass / charge ratio and indicative of said at least one protein variant and / or of said at least one peptide specific to a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin; (ii) collision-induced fragmentation of said at least one ionized peptide selected in step (ii); (iv) detection of one or more fragments of known mass / charge ratio obtained in step (iii) to confirm the presence of said at least one protein variant in the sample and / or of said at least one peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin in the sample; said method being characterized in that it comprises at least one of the following steps: a) a step of validating the detection of said at least one variant and / or of said at least one peptide specific to the a and / or B chains and / or 5 of hemoglobin by carrying out steps (ii) to (iv) starting from a sample comprising at least one known peptide characteristic of said at least one variant and / or comprising at least one known peptide characteristic of α chains and / or B and / or 5 hemoglobin; or b) a step of validating said step (i) of digestion and validation of the detection of said at least one variant and / or of said at least one peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin by carrying out steps (i) to (iv) starting from a sample comprising at least one control protein carrying said at least one variant and of which the series of peptides to be obtained by digestion is known beforehand and / or comprising at least one at least one control protein carrying said at least one peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin and of which the series of peptides to be obtained by digestion is known beforehand.
Par les termes « un échantillon comprenant une protéine-contrôle porteuse dudit au moins un variant », il est entendu au sens de la présente invention, que l’échantillon comprend une protéine dont on sait qu’elle porte leditBy the terms "a sample comprising a control protein carrying said at least one variant", it is understood within the meaning of the present invention that the sample comprises a protein which is known to carry said
> BE2019/5561 au moins un variant. Il s’agit donc d’une protéine connue portant ledit au moins un variant, lequel est également connu.> BE2019 / 5561 at least one variant. It is therefore a known protein carrying said at least one variant, which is also known.
Par les termes « un échantillon comprenant au moins une protéine- contrôle porteuse dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou © d'hémoglobine », il est entendu au sens de la présente invention, que l'échantillon comprend une protéine dont on sait qu’elle porte ledit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’hémoglobine. Il s’agit donc d’une protéine connue portant ledit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine, lequel est également connu.By the terms “a sample comprising at least one control protein carrying said at least one peptide specific to the a and / or B and / or chains of hemoglobin”, it is understood within the meaning of the present invention that the sample comprises a protein which is known to carry said at least one peptide specific to the a and / or B chains and / or 5 of hemoglobin. It is therefore a known protein carrying said at least one peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin, which is also known.
De préférence, selon l'invention, lesdites étapes a) et b) sont des étapes préalables aux étapes i) et/ou ii) et/ou iii) et/ou iv).Preferably, according to the invention, said steps a) and b) are steps prior to steps i) and / or ii) and / or iii) and / or iv).
Un tel procédé selon l'invention permet avantageusement de s'affranchir de l'incertitude mentionnée ci-dessus tant pour la détection d’un variant de protéine que pour la détection d’un peptide propre aux chaînes a et/ou Bet/ou 5 d’'hémoglobine. En effet, lorsque l’étape a) de validation de la détection dudit au moins un variant, par mise en œuvre des étapes (ii) à (iv) au départ d’un échantillon comprenant au moins un peptide connu caractéristique dudit au moins un variant, est positive, elle constitue un contrôle positif garantissant que les étapes (ii) à (iv) du procédé donnent inévitablement lieu à une détection dudit au moins un variant si ce dernier est présent dans l’échantillon biologique. Lorsque l’étape b) de validation de la détection dudit au moins un variant, par mise en œuvre des étapes (i) à (iv) au départ d’un échantillon comprenant une protéine-contrôle porteuse dudit au moins un variant, est positive, elle constitue un contrôle positif garantissant que les étapes (i) à (iv) donnent inévitablement lieu à une détection dudit au moins un variant si ce dernier est présent dans l'échantillon biologique. A la différence de l’étape a) permettant de valider les étapes (ii) à (iv), l'étape b) permet également de valider l’étape (i) de digestion puisque c’est une protéine qui est mise en œuvre et non pas directement au moins un peptide.Such a method according to the invention advantageously makes it possible to overcome the uncertainty mentioned above both for the detection of a protein variant and for the detection of a peptide specific to the α and / or Bet / or 5 chains. hemoglobin. Indeed, when step a) of validating the detection of said at least one variant, by carrying out steps (ii) to (iv) starting from a sample comprising at least one known peptide characteristic of said at least one variant, is positive, it constitutes a positive control guaranteeing that steps (ii) to (iv) of the method inevitably give rise to detection of said at least one variant if the latter is present in the biological sample. When step b) of validating the detection of said at least one variant, by carrying out steps (i) to (iv) starting from a sample comprising a control protein carrying said at least one variant, is positive , it constitutes a positive control guaranteeing that steps (i) to (iv) inevitably give rise to detection of said at least one variant if the latter is present in the biological sample. Unlike step a) enabling steps (ii) to (iv) to be validated, step b) also enables digestion step (i) to be validated since it is a protein that is used and not directly at least one peptide.
S'assurer en amont d’un test ou d’une batterie de tests qu’au moins les étapes d'ionisation, de fragmentation et de détection (étapes ii à iv) voire en plus que l'étape de digestion de la protéine (étape i) fonctionnent comme attendu permet d'éviter la réalisation de tests sur des échantillons biologiques issus deBefore a test or a battery of tests, ensure that at least the ionization, fragmentation and detection steps (steps ii to iv) or even more than the protein digestion step ( step i) operate as expected makes it possible to avoid performing tests on biological samples from
© BE2019/5561 patients sans être certains que le procédé donnera bien lieu à une détection dudit au moins un variant recherché si ce dernier est présent dans l’échantillon. Il est évident que ceci permet d’éviter le gaspillage d'échantillons mais aussi d’optimiser le rendement et la fiabilité du procédé selon l'invention, notamment en écartant tout risque de faux négatifs.© BE2019 / 5561 patients without being certain that the method will indeed result in detection of said at least one desired variant if the latter is present in the sample. It is obvious that this makes it possible to avoid the waste of samples but also to optimize the yield and the reliability of the method according to the invention, in particular by eliminating any risk of false negatives.
Il en va bien entendu de même lorsqu'il s’agit de mettre en évidence une thalassémie par détection d’au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B etfou D d'hémoglobine : élimination d’une incertitude similaire à celle mentionnée ci-avant, pas de gaspillage des échantillons, optimisation du rendement et de l’efficacité du procédé, élimination du risque de faux négatifs.The same is of course the case when it comes to demonstrating thalassemia by detection of at least one peptide specific to the a and / or B and f or D chains of hemoglobin: elimination of an uncertainty similar to that mentioned above, no waste of samples, optimization of the yield and efficiency of the process, elimination of the risk of false negatives.
Notons que, selon la présente invention, une détection simultanée d’au moins un variant de protéine et d’au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine peut être réalisée.Note that, according to the present invention, simultaneous detection of at least one protein variant and at least one peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin can be carried out.
Par ailleurs, pouvoir déduire au travers de l’une des étapes de validation a) ou b) qu’une ou plusieurs étapes du procédé a/ont échoué permet de directement prendre les mesures nécessaires pour corriger et adapter le procédé de telle sorte qu’il puisse rapidement assurer à nouveau une détection fiable dudit au moins un variant recherché.Moreover, being able to deduce through one of the validation steps a) or b) that one or more steps of the process a / have failed makes it possible to directly take the necessary measures to correct and adapt the process so that it can quickly ensure again reliable detection of said at least one desired variant.
Avantageusement, selon l'invention, l’étape a) est effectuée au départ d’un échantillon dans lequel ledit au moins un peptide connu caractéristique dudit au moins un variant et/ou ledit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine est un peptide synthétique.Advantageously, according to the invention, step a) is carried out starting from a sample in which said at least one known peptide characteristic of said at least one variant and / or said at least one peptide specific to the a and / or B chains and / or hemoglobin is a synthetic peptide.
De préférence, selon l’invention, l’étape b) est effectuée au départ d’un échantillon dans lequel ladite au moins une protéine-contrôle porteuse dudit au moins un variant et/ou porteuse dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine est une protéine synthétique.Preferably, according to the invention, step b) is carried out starting from a sample in which said at least one control protein carrying said at least one variant and / or carrying said at least one peptide specific to the a and chains. / or B and / or 5 hemoglobin is a synthetic protein.
Une utilisation d’un peptide synthétique et/ou d’une protéine synthétique, c'est-à-dire d’un peptide et/ou d’une protéine obtenue par voie de synthèse, permet de travailler avec du matériel de qualité toujours égale et contrôlée pour la fabrication de l’échantillons permettant la réalisation des étapes a) et b). La reproductibilité des échantillons contrôle et donc celle des résultats obtenus lors des étapes a) et b) sont de ce fait assurées.The use of a synthetic peptide and / or of a synthetic protein, that is to say of a peptide and / or of a protein obtained by synthesis, makes it possible to work with material of always equal quality. and controlled for the manufacture of the samples allowing the performance of steps a) and b). The reproducibility of the control samples and therefore that of the results obtained during steps a) and b) are thereby ensured.
Préférentiellement, le procédé suivant l'invention comprend en outre une étape additionnelle de validation de ladite étape (i) de digestion de la protéine, ladite étape de validation additionnelle consistant en une digestion d’une protéine de référence dont la série de peptides à obtenir par digestion est préalablement connue, ladite protéine de référence étant une protéine différente de ladite protéine-contrôle porteuse dudit au moins un variant et/ou porteuse dudit au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’hémoglobine lorsque ladite étape b) est mise en œuvre. Cette étape additionnelle permet de valider que l’étape de digestion est efficace, notamment que l’enzyme de type protéase utilisée permet bien d’obtenir la série de peptides attendue, ce qui conditionne évidemment le bon déroulement de l’ensemble des autres étapes subséquentes du procédé selon l'invention.Preferably, the method according to the invention further comprises an additional step of validating said step (i) of digestion of the protein, said additional validation step consisting of a digestion of a reference protein including the series of peptides to be obtained. by digestion is known beforehand, said reference protein being a protein different from said control protein carrying said at least one variant and / or carrying said at least one peptide specific to the a and / or B chains and / or 5 of hemoglobin when said step b) is implemented. This additional step makes it possible to validate that the digestion step is effective, in particular that the protease-type enzyme used does indeed make it possible to obtain the expected series of peptides, which obviously conditions the correct progress of all the other subsequent steps. of the method according to the invention.
Avantageusement, selon l'invention, la protéine de référence est de l'hémoglobine native ou de Phémoglobine synthétique.Advantageously, according to the invention, the reference protein is native hemoglobin or synthetic hemoglobin.
De préférence, selon l'invention, ledit au moins un variant de protéine connu est un variant d’hémoglobine.Preferably, according to the invention, said at least one known protein variant is a hemoglobin variant.
Avantageusement, selon l'invention, ledit variant d’'hémoglobine est Hb S, Hb C, Hb DPyriab, Hb O/rab, Hb Lepore ou Hb E.Advantageously, according to the invention, said variant of hemoglobin is Hb S, Hb C, Hb DPyriab, Hb O / rab, Hb Lepore or Hb E.
Préférentiellement, selon l’invention, l’échantillon biologique est un échantillon de sang, d'urine, de liquide céphalo-rachidien ou de tissu.Preferably, according to the invention, the biological sample is a sample of blood, urine, cerebrospinal fluid or tissue.
De préférence, selon linvention, l’étape de digestion de la protéine est effectuée en utilisant une protéase, en particulier de la trypsine.Preferably, according to the invention, the step of digesting the protein is carried out using a protease, in particular trypsin.
Avantageusement, selon l'invention, l’étape d'ionisation des peptides et de sélection d’au moins un peptide ionisé est effectuée en utilisant un spectromètre de masse de type triple quadripôle équipé d’une source d’ionisation par électro-pulvérisation (électro-spray).Advantageously, according to the invention, the step of ionization of the peptides and of selection of at least one ionized peptide is carried out using a triple quadrupole type mass spectrometer equipped with a source of ionization by electrospray ( electro-spray).
Préférentiellement, selon l'invention, l’étape de fragmentation induite par collision est effectuée en utilisant un spectromètre de masse de type triple quadripôle équipé d’une source d’ionisation par électro-pulvérisation (électro-spray).Preferably, according to the invention, the collision-induced fragmentation step is carried out using a triple quadrupole type mass spectrometer equipped with an ionization source by electro-spray (electro-spray).
De préférence, selon l'invention, l’étape de détection d’un ou de plusieurs fragments de rapport masse/charge connu est effectuée en utilisant un spectromètre de masse de type triple quadripôle équipé d’une source d’ionisation par électro-pulvérisation (électro-spray).Preferably, according to the invention, the step of detecting one or more fragments of known mass / charge ratio is carried out using a triple quadrupole type mass spectrometer equipped with an ionization source by electrospray. (electro-spray).
La présente invention porte également sur un système pour mettre en œuvre le procédé suivant la présente invention, ledit système comprenant une machine pour effectuer une spectrométrie de masse en tandem, en particulier avec un spectromètre de masse de type triple quadripôle équipé d’une source d'ionisation par électro-pulvérisation (électro-spray).The present invention also relates to a system for implementing the method according to the present invention, said system comprising a machine for performing tandem mass spectrometry, in particular with a triple quadrupole type mass spectrometer equipped with a source of ionization by electro-spray (electro-spray).
La présente invention porte encore sur un kit pour mettre en œuvre le procédé suivant la présente invention, ledit kit comprenant : - des tampons et des réactifs pour la préparation de l'échantillon biologique comprenant au moins un variant de protéine connu et/ou au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d'hémoglobine ; - une protéase pour digérer la protéine et/ou l’'hémoglobine en une série définie de peptides ; - un système pour introduire l'échantillon au sein d’une source d'ionisation d’un instrument permettant d’effectuer des analyses par spectrométrie de masse en tandem, en particulier avec un spectromètre de masse de type triple quadripôle équipé d’une source ionisation par électro-pulvérisation (électro- spray).The present invention also relates to a kit for implementing the method according to the present invention, said kit comprising: buffers and reagents for the preparation of the biological sample comprising at least one known protein variant and / or at least a peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin; - a protease to digest protein and / or hemoglobin into a defined series of peptides; - a system for introducing the sample into an ionization source of an instrument making it possible to carry out analyzes by tandem mass spectrometry, in particular with a triple quadrupole type mass spectrometer equipped with a source electro-spray ionization (electro-spray).
Le kit peut en outre comprendre un logiciel approprié pour configurer la machine afin de mettre en œuvre le procédé de la présente invention.The kit may further include appropriate software for configuring the machine to implement the method of the present invention.
Le procédé de la présente invention permet la détection précise et spécifique d'un variant de protéine et/ou d’au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’'hémoglobine. En particulier, en digérant la protéine pour produire une série définie de peptides et en soumettant les peptides ionisés sélectionnés à une dissociation induite par collision, le risque de détection d’un faux positif est très significativement réduit.The method of the present invention allows the precise and specific detection of a protein variant and / or at least one peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin. In particular, by digesting the protein to produce a defined series of peptides and subjecting the selected ionized peptides to collision-induced dissociation, the risk of detecting a false positive is very significantly reduced.
Le variant de protéine à détecter peut être n'importe quelle protéine, y compris une glycoprotéine. Le variant de protéine à détecter peut être n'importe quelle protéine indiquant un trouble ou une maladie.The protein variant to be detected can be any protein, including a glycoprotein. The protein variant to be detected can be any protein indicative of a disorder or disease.
Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour détecter un variant de protéine connu et/ou un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5The method according to the invention can be used to detect a known protein variant and / or a peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains.
? BE2019/5561 d’hémoglobine. En conséquence, la séquence du variant de protéine à détecter doit être connue. Le procédé selon l'invention nécessite donc la sélection d’au moins un peptide ionisé de rapport masse/charge connu dérivé de la protéine. Si le variant détecté n'est pas connu, il n'est pas possible de déterminer le rapport masse/charge des peptides ionisés dérivés de la protéine. Ceci est également d'application lorsque le procédé selon l'invention porte simultanément ou non sur la détection d’au moins un peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou © d’'hémoglobine.? Hemoglobin BE2019 / 5561. Accordingly, the sequence of the protein variant to be detected must be known. The method according to the invention therefore requires the selection of at least one ionized peptide of known mass / charge ratio derived from the protein. If the variant detected is not known, it is not possible to determine the mass / charge ratio of the ionized peptides derived from the protein. This also applies when the method according to the invention relates simultaneously or not to the detection of at least one peptide specific to the a and / or B and / or chains of hemoglobin.
En sélectionnant au moins un peptide ionisé dont le rapport masse/charge est connu, seule une fenêtre limitée de rapports masse/charge doit être balayée. Ceci permet de réduire significativement la quantité de travail et d'analyse que l'opérateur doit effectuer. En particulier, en sélectionnant un seul peptide ionisé dont le rapport masse/charge est connu, il n’est pas nécessaire de déterminer un large spectre de particules ionisées présentant des rapports masse/charge différents et il n’est pas nécessaire de réaliser l’étape complexe et longue de l’analyse de déconvolution.By selecting at least one ionized peptide whose mass / charge ratio is known, only a limited window of mass / charge ratios needs to be scanned. This can significantly reduce the amount of work and analysis that the operator has to perform. In particular, by selecting a single ionized peptide whose mass / charge ratio is known, it is not necessary to determine a broad spectrum of ionized particles having different mass / charge ratios and it is not necessary to carry out the analysis. complex and long step of the deconvolution analysis.
L'échantillon dans lequel le variant protéique est détecté peut être tout échantillon approprié, tel que des échantillons de sang, d'urine, de liquide céphalo-rachidien et de tissus. Le type d’échantillon dépendra du variant de protéine à détecter et/ou du peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’hémoglobine à détecter. Si le variant de protéine est un variant d'hémoglobine, l'échantillon est de préférence du sang. L'échantillon peut être traité par des méthodes standard pour éliminer tout contaminant indésirable, pour concentrer le variant de protéine à détecter, pour dénaturer la protéine et/ou pour placer l'échantillon sous une forme adaptée à la digestion des protéines.The sample in which the protein variant is detected can be any suitable sample, such as blood, urine, cerebrospinal fluid, and tissue samples. The type of sample will depend on the protein variant to be detected and / or the peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin to be detected. If the protein variant is a hemoglobin variant, the sample is preferably blood. The sample can be processed by standard methods to remove any unwanted contaminants, to concentrate the protein variant to be detected, to denature the protein and / or to place the sample in a form suitable for protein digestion.
La série définie de peptides est ionisée et au moins un peptide ionisé de rapport masse/charge connu caractéristique du variant de protéine et/ou du peptide propre aux chaînes a et/ou B et/ou 5 d’'hémoglobine est sélectionné. Les peptides peuvent être ionisés et les peptides ionisés peuvent être sélectionnés en utilisant n'importe quel procédé de spectrométrie de masse connu. Dans un mode de réalisation préféré, la spectrométrie de masse quadripolaire par ionisation par électro-spray est utilisée pour ioniser les peptidesThe defined series of peptides is ionized and at least one ionized peptide of known mass / charge ratio characteristic of the protein variant and / or peptide specific to the a and / or B and / or 5 chains of hemoglobin is selected. Peptides can be ionized and ionized peptides can be selected using any known mass spectrometry method. In a preferred embodiment, quadrupole electro-spray ionization mass spectrometry is used to ionize the peptides.
LO BE2019/5561 et pour sélectionner les peptides ionisés.LO BE2019 / 5561 and to select ionized peptides.
La méthode d'ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI) peut par exemple être utilisée.The matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) method can for example be used.
La présente invention a été décrite en relation avec des modes de réalisations spécifiques, qui ont une valeur purement illustrative et ne doivent pas être considérés comme limitatifs.The present invention has been described in relation to specific embodiments, which have a purely illustrative value and should not be considered as limiting.
D'une manière générale, il apparaîtra évident pour l’homme du métier que la présente invention n’est pas limitée aux exemples illustrés et/ou décrits ci-dessus.In general, it will be obvious to those skilled in the art that the present invention is not limited to the examples illustrated and / or described above.
L’usage des verbes « comprendre », « inclure », « comporter », ou toute autre variante, ainsi que leurs conjugaisons, ne peut en aucune façon exclure la présence d’éléments autres que ceux mentionnés.The use of the verbs "to understand", "to include", "to include", or any other variant, as well as their conjugations, can in no way exclude the presence of elements other than those mentioned.
L’usage de l’article indéfini « un », «une », ou de l’article défini «le», «la» ou « l’ », pour introduire un élément n’exclut pas la présence d’une pluralité de ces éléments.The use of the indefinite article "a", "a", or of the definite article "the", "the" or "the", to introduce an element does not exclude the presence of a plurality of these elements.
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| BE20195561A BE1027232B1 (en) | 2019-08-28 | 2019-08-28 | Method for detecting at least one protein variant and / or at least one peptide specific to the alpha and / or beta and / or delta chains of hemoglobin |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023089533A1 (en) * | 2021-11-18 | 2023-05-25 | Neuberg Anand Academy Of Laboratory Medicine Private Limited | Tandem triple quadrupole mass spectrometer-based screening and confirmation method for analyzing protein and its variants |
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| EP1844338A1 (en) * | 2005-02-01 | 2007-10-17 | King's College London | Screening method |
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-
2019
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