BE1024355B1 - Determination des communautes microbiennes et des biofilms - Google Patents

Abstract

Les techniques d’entretien et de soins standards actuels tendent à éliminer toute forme de vie microbiologique. Il est clair que cette approche n’est pas durable et pose déjà d’énormes problèmes sanitaires (inefficacité, résistances, biofilms, coût environnemental, etc.). Les méthodes probiotiques de première génération essaient quant à elles de modifier l’environnement par l’adjonction massive d’une association de quelques microorganismes mal caractérisés (inefficace, mauvaise caractérisation, QC incertains, monitoring quasi impossible, etc.). De manière générale, la principale innovation de la présente demande de brevet consiste en la mise au point de produits sophistiqués destinés à réaliser l’homéostasie des communautés microbiennes existantes sur les surfaces visées par ces produits ainsi que des méthodes destinées au monitoring de leur utilisation ( sécurité, QC d’efficacité, etc.).

Description

DETERMINATION DES COMMUNAUTES MICROBIENNES ET DES BIOFILMS

DOMAINE DE L'INVENTION

Les techniques d’entretien et de soins standards actuels tendent à éliminer toute forme de vie microbiologique. Il est clair que cette approche n’est pas durable et pose déjà d’énormes problèmes sanitaires (inefficacité, résistances, biofilms, coût environnemental, etc.). Les méthodes probiotiques de première génération essaient quant à elles de modifier l’environnement par l’adjonction massive d’une association de quelques microorganismes mal caractérisé (inefficace, mauvaise caractérisation, QC incertains, monitoring quasi impossible, etc.).

De manière générale, la principale innovation de la présente demande de brevet consiste en la mise au point de produits sophistiqués destinés à réaliser l’homéostasie des communautés microbiennes existantes sur les surfaces visées par ces produits ainsi que des méthodes destinées au monitoring de leur utilisation (sécurité, QC d’efficacité, etc. ).

CONTEXTE DE L'INVENTION

Le récent rapport Européen [Pedicini P. Rapport sur des soins de santé plus sûrs en Europe: améliorer la sécurité des patients et lutter contre la résistance aux antimicrobiens, 4 mai 2015] sur la manière d’améliorer la sécurité des patients dans les hôpitaux, présenté par l’eurodéputé italien Piernicola Pedicini et voté à Strasbourg ce 18 mai 2015, souligne que pas moins de 8 à 12 % des patients hospitalisés dans l’Union Européenne, c’est-à-dire plus de 3 millions de personnes sont « victimes d’événements indésirables, notamment des infections associées aux soins (IAS), nosocomiales ou non, dont une grande partie pourraient être évitées ». Les coûts en dépenses de santé de ces « événements indésirables » sont estimés, toujours pour l’ensemble de l’Union Européenne, à près de 2,7 milliards d’euros par an et ces évènements indésirables représentent 1,1 % de toutes les hospitalisations. Autre constat du rapport Pedicini, parmi ces IAS, celles causées par les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques entraînent le décès d’au moins 25.000 personnes en Europe chaque année.

La surveillance microbiologique de l’environnement dans les établissements de santé est un sujet qui s’intègre dans l’actualité de la prévention des infections nosocomiales, évoquée dans le rapport Pedicini. Habituellement le monitoring de l’environnement des hôpitaux - comme des industries pharmaceutiques - est réalisé par des techniques classiques de microbiologie dépendantes de la culture. Ces techniques ne permettent de suivre que les microorganismes cultivables qui sont estimés à seulement 1% des microorganismes présents dans l’environnement. En plus ces techniques sont en effet réputées être tout à fait inefficaces pour prélever et étudier quantitativement et qualitativement les communautés microbiennes et les biofilms.

Mieux comprendre la formation des communautés microbiennes et des biofilms pathogènes dans l’environnement clinique ainsi que la manière dont les bactéries y entretiennent des interactions synergiques utiles ou pathogènes, facilitant l'apparition d'antibio-résistance, est donc un enjeu de santé publique. Permettre aux hôpitaux de disposer de solutions et de moyens techniques pour lutter efficacement contre ces configurations microbiologiques est d’une importance capitale pour rompre le cercle vicieux qui consiste à utiliser de manière excessive des agents antimicrobiens (antibiotiques, biocides, ...) dont le principal effet est souvent finalement de renforcer l’émergence de bactéries multi-résistantes. Cette résistance aux antimicrobiens pour les bactéries pathogènes formant un biofilm entraine une hausse de la prévalence des infections nosocomiales et des échecs thérapeutiques face aux maladies infectieuses chez l’homme. Ce phénomène déjà bien réel aujourd’hui, impactera encore les générations futures qui, en outre, devront faire face à un épuisement des ressources thérapeutiques pour combattre les microorganismes multi-résistants. Bien entendu, ces problèmes de résistance bactérienne ne sont pas seulement présents dans les soins de la santé humaine, mais ils sont aussi présentés dans les soins de santé animale, même au niveau de l'agriculture industrielle. C’était donc l’objective de la présente demande de brevet de développer des protocoles pour identifier et quantifier tous les microorganismes et les gènes ciblés dans ces biofilms, par rapport aux techniques classiques d’écouvillonnage et/ou de boîtes de contact (Rodac) utilisés traditionnellement dans le monitoring des environnements hospitaliers (et pharmaceutiques).

RESUME DE L'INVENTION

La présente demande de brevet concerne un procédé pour caractériser le microbiome dans un environnement, ce procédé étant basé sur la combinaison d’une analyse génétique / génomique avec une analyse métabolique et / ou une analyse physico-chimique des échantillons d'un environnement donné. Eventuellement complétée par une analyse choisie parmi epigénétique, metagénomique, proteomique, transcriptomique, et metabolomique,

En particulier ce procédé est basé sur la combinaison d’une analyse génétique / génomique avec une analyse métabolique et une analyse physico-chimique des échantillons d'un environnement donné. séquençage ciblé d’amplicons pour l’identification d’espèces, et séquençage complet de génomes pour la détection de nouveaux gènes d’intérêt. De préférence les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs de virulence présents dans cet environnement sont détectés et quantifiés par PCR quantitative en temps réel (qPCR), utilisant l’un quelconque des séquenceur capillaires, d’une plateforme de génotypage comme Taqman SNP Genotyping Assay sur 7900 HT (Applied Biosystem) et d’une plateforme Haut débit (NGS) comme GS-FLX (Roche Diagnostics), HiSeq 2500 (Illumina) ou MiSeq (Illumina) ; ou des combinaisons de ceux-ci. L’analyse métabolique utilise la spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire pour caractériser l'ensemble des métabolites (sucres, acides aminés, acides gras, protéines, peptides, etc.) présents dans les échantillons d'un environnement donné.

Pour l’analyse physico-chimique des protocoles complémentaires seront utilisés : l’XPS (spectroscopie électronique induite par rayons X) et l’IRRAS (Infra Rouge de Surface par réflexion) pour obtenir des informations sur la structure et la composition d’une couche adsorbée ou des bactéries ; la MATS (Adhésion microbienne aux solvants) pour connaître les propriétés acido-basiques au sens de Lewis de la bactérie comme élaboré dans la thèse de doctorat de C. Rubio [Céline Rubio, thèse de doctorat de l’université paris 6, Juillet 5, 2002] ; et le nanoSIMS pour obtenir des informations sur la localisation et l'analyse quantitative des complexes d'antigène-anticorps se liant sur une surface.

Le procédé se prête pour des environnements et des échantillons sélectionnés : - d’environnements des animaux de compagnie (soins et environnement ) - d’environnements d’élevage industriel (ovin, bovin, pisciculture ) - d’environnements construits humains non-médicaux - d’environnements paramédicaux - du milieu hospitalier - de la peau chez l’homme et l’animal

Ainsi, les échantillons analysés comprennent des surfaces construites ou des environnements biologiques, comme des échantillons de peau, poil, sabot, ongles, boues de culture, etc.

En plus, la présente demande de brevet concerne l’utilisation des procédures ci-dessus : - pour surveiller la présence de pathogènes dans les échantillons d'un environnement donné. En particulier à surveiller la présence des germes pathogènes ou opportunistes dans l’hôpital (« vecteurs biotiques des infections nosocomiales ») ; - pour monitorer l’efficacité des traitements de nettoyage, en particulier des traitements à obtenir ou à garder une flore saine « anti-pathogène ».

Finalement, la présente demande de brevet concerne un procédé de traitement d’un environnement pour obtenir ou garder une flore saine de micro-organismes, ledit procédé utilisant une combinaison de facteurs identifiés au moyen d'une analyse génétique avec une analyse métabolique et / ou une analyse physico-chimique des échantillons dudit environnement. En particulier pour l’entretien et la désinfection des surfaces des locaux (sols, murs, plafonds), des surfaces ouvertes (Open Plant Cleaning ou OPC), des équipements, machines et instruments médicaux et autres ; et des surfaces non accessibles (Cleaning In Place ou CIP) des équipements, machines et instruments.

Dans ce procédé de traitement les facteurs identifiés incluent : - des coatings spécifiques anti-adhésion bactérienne sur les surfaces considérées comme les plus à risque dans le cadre de la transmission de pathogènes ; - des cocktails enzymatiques pour décrocher les biofilms ; - des cocktails complexes, constitués de microorganismes favorisant l’installation durable d’un écosystème luttant par des propriétés intrinsèques sélectionnées contre la contamination par d’autres microorganismes environnementaux dégradant la santé ou le bien-être ; - des biomarqueurs de résistance aux agents antimicrobiens ; - ou toute combinaison de ceux-ci

DESCRIPTION DE L’INVENTION

Pour atteindre l'objectif mentionné ci-dessus, la présente invention est basée sur la combinaison de technologies récentes et disruptives dans le secteur de la microbiologie. Les procédés de l’invention implique la combinaison de la technologie en trois catégories ; - génétique et génomique : typage par séquençage ciblés d’amplicons pour l’identification d’espèces, séquençage complet de génomes pour la détection de nouveaux gènes d’intérêt, mise au point de méthodes pour la détection rapide de gènes, ... - métabolique : identification de molécules clé par exemple pour le contrôle de la croissance compétitive inter-espèces ou pour le contrôle de la production de toxines ou de résistances aux antibiotiques ou encore aux procédés de nettoyage traditionnels, par exemple par la formation de biofilms protecteurs. Egalement, la mise au point de méthodes pour la détection rapide de molécules,... - physico-chimique : caractérisation des propriétés des surfaces et des écosystèmes (ex : nature moléculaire, charge électrique, T°, concentration en oxygène, etc. ) et de leurs importance dans le contrôle du développement de communautés microbiennes et de leurs bénéfices ou inconvénients.

Ainsi, contrairement aux méthodes existantes, il n’est fait pas usage des techniques dépendantes de la culture des microorganismes. Par ce projet, en utilisant des protocoles génétique, métabolique et physico-chimique on peut non seulement identifier tous les microorganismes (également les microorganismes non cultivables) dans les échantillons environnementaux, mais aussi les quantifier. En même temps les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs de virulence présents dans cet environnement sont détectés et quantifiés par PCR quantitative en temps réel (qPCR). Ces deux types de données pourront être corrélées, notamment pour mettre en évidence les phénomènes de « transfert horizontal de gènes » de résistance et tous les hôtes impliqués. Ces phénomènes sont la principale cause de transmission de gènes permettant à différentes espèces bactériennes d’acquérir une (multi) résistance aux antibiotiques ou d’être vecteurs de maladies et les biofilms sont le lieu par excellence où se réalise ce transfert horizontal des gènes.

Ces biofilms constituent des réservoirs potentiels pour des pathogènes, qui servent de sources continues d’infections et de contaminations croisées. Les biofilms bactériens et l’émergence de la multi-résistance aux médicaments sont devenus une menace majeure pour le traitement médical courant des infections nosocomiales. On estime qu’environ 65 à 80 % des infections microbiennes dans les pays développés sont associés aux biofilms [Majik MS, Parvatkar PT. Next generation biofilm inhibitors for Pseudomonas aeruginosa: Synthesis and rational design approaches. Curr. Top. Med. Chem. 2014; 14(1): 81-109 (Review)].

Ces biofilms posent de sérieux problèmes aux hygiénistes cliniciens. En effet, la plupart des directives cliniques pour l’usage des biocides ont été développées pour des microorganismes planctoniques [Cerf O., Carpentier B., Sanders P. Tests for determining in-use concentrations of antibiotics and disinfectants are based on entirely different concepts: “resistance” has different meanings. Int. J. Food Microbiol. 2010 ; 136:247-254]. Or les cellules bactériennes vivant au sein de biofilms peuvent être jusqu’à 1000 fois plus résistantes aux produits désinfectants que leurs homologues planctoniques. Par conséquent, les désinfectants commercialisés peuvent avoir une efficacité confirmée sur les cellules planctoniques et souvent ne pas pouvoir éradiquer les cellules des biofilms. Cette tolérance élevée des cellules sessiles aux biocides accroît le risque d’une désinfection ratée conduisant à de graves problèmes de santé et à des pertes économiques [Abdallah M., Benoliel C., Drider D., Dhulster P., Chihib N.E. Biofilm formation and persistence on abiotic surfaces in the context of food and medical environments. Arch. Microbiol. 2014 ; 196 : 453-472].

Par conséquent l'objectif de cette invention est de fournir des méthodes de surveillance des biofilms sur des surfaces différentes ; des surfaces de locaux (sols, murs, plafonds) ; des surfaces ouvertes (Open Plant Cleaning ou OPC) des équipements, machines et instruments médicaux ; des surfaces non accessibles (Cleaning In Place ou CIP) des équipements, machines et instruments médicaux et autres ; et de mise à disposition de procédures standards (SOP) d’entretien et de désinfection des populations microbiennes en fonction : • du type de local hospitalier (zones à risque classées de 1 à 4). • des points critiques à décontaminer et du type de surface. • du type suspecté de flore microbienne formant le biofilm.

Par le monitoring qui permet d’identifier, de caractériser et de quantifier les micro-organismes, les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs qui influencent la matrice protectrice de polymères du biofilm, de la présente demande a également pour objectif d’utiliser ce matériel dans de nouvelles méthodes de traitement et en mettant au point de nouvelles méthodes de référence pour monitorer de manière innovante l’efficacité de ces traitements.

En utilisant les procédés de la présente invention, on obtient une meilleure compréhension des facteurs de régulation de l’équilibre d’une flore saine « anti-pathogène ». On peut utiliser ces données dans des nouvelles méthodes de traitement permettant de mettre en place sur les surfaces traitées une telle flore saine. Par exemple dans l’environnement hospitalier sur les surfaces des locaux et les surfaces des machines et des instruments médicaux.

Dans la cadre de la présente invention, ces nouveaux traitements incluent : - des coatings spécifiques anti-adhésion bactérienne sur les surfaces considérées comme les plus à risque dans le cadre de la transmission de pathogènes ; - des cocktails enzymatiques pour décrocher les biofilms ; - des cocktails complexes, constitués de microorganismes favorisant l’installation durable d’un écosystème luttant par des propriétés intrinsèques sélectionnées contre la contamination par d’autres microorganismes environnementaux dégradant la santé ou le bien-être ; - des systèmes d’ultra-sonication et de chélates particuliers pour faciliter la désagrégation des biofilms lors des prélèvements ou le traitement des surfaces ; - ou toute combinaison de ceux-ci.

Claims (10)

1. REVENDICATONS

   1. Un procédé pour caractériser le microbiome dans un environnement sans usage des techniques dépendantes de la culture des microorganismes., ce procédé étant basé sur la combinaison d’une analyse génétique / génomique avec une analyse métabolique et une analyse physico-chimique des échantillons dudit environnement.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle l’analyse génétique / génomique inclut le génotypage et le séquençage, par exemple par séquençage ciblés d’amplicons pour l’identification d’espèces, et séquençage complet de génomes pour la détection de nouveaux gènes d’intérêt.
3. 3. Procédé selon la revendication 2 dans laquelle les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs de virulence présents dans cet environnement sont détectés et quantifiés par PCR quantitative en temps réel (qPCR), utilisant l’un quelconque des séquenceurs capillaires d’une plateforme de génotypage comme Taqman SNP Genotyping Assay sur 7900 HT (Applied Biosystem); et d’une plateforme Haut débit (NGS) comme GS-FLX (Roche Diagnostics), HiSeq 2500 (Illumina) ou MiSeq (Illumina) ; ou des combinaisons de ceux-ci.
4. 4. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle l’analyse métabolique utilise la spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire pour caractériser l'ensemble des métabolites (sucres, acides aminés, acides gras, protéines, peptides, etc.) présents dans les échantillons d'un environnement donné.
5. 5. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle l’analyse physico-chimique utilise l’XPS (spectroscopie électronique induite par rayons X) et l’IRRAS (Infra Rouge de Surface par réflexion) pour obtenir des informations sur la structure et la composition d’une couche adsorbée ou des bactéries ; la MATS (Adhésion microbienne aux solvants) pour connaître les propriétés acido-basiques au sens de Lewis de la bactérie, et le nanoSIMS pour obtenir des informations sur la localisation et l'analyse quantitative des complexes d'antigène-anticorps se liant sur une surface.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les environnements et les échantillons sont sélectionnés ; - d’environnements des animaux de compagnie ( soins et environnement ) - d’environnements d’élevage industriel (ovin, bovin, pisciculture ) - d’environnements humains non-médicaux construits - d’environnements paramédicaux - du milieu hospitalier - de la peau chez l’homme et l’animal
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les échantillons analysés comprennent des surfaces construites ou des environnements biologiques, comme des échantillons de peau, poil, sabot, ongles, boues de culture, etc. . 8. L’utilisation des procédures ci-dessus : - pour surveiller la présence de pathogènes dans les échantillons d'un environnement donné. En particulier à surveiller la présence des germes pathogènes ou opportunistes dans l’hôpital (« vecteurs biotiques des infections nosocomiales ») ; - pour monitorer l’efficacité des traitements de nettoyage, en particulier des traitements à obtenir ou à garder une flore saine « anti-pathogène ».
8. 9. Un procédé de traitement d’un environnement pour obtenir ou garder une flore saine de microorganismes, ledit procédé utilisant une combinaison de facteurs identifiés au moyen d'une analyse génétique avec une analyse métabolique et / ou une analyse physico-chimique des échantillons dudit environnement.
9. 10. Procédé selon la revendication 9 pour l’entretien et la désinfection des surfaces des locaux (sols, murs, plafonds) ; des surfaces ouvertes (Open Plant Cleaning ou OPC) des équipements, machines et instruments médicaux ; et des surfaces non accessibles (Cleaning In Place ou CIP) des équipements, machines et instruments médicaux.
10. 11. Procédé selon la revendication 10 dans laquelle les facteurs identifiés incluent; - des coatings spécifiques anti-adhésion bactérienne sur les surfaces considérées comme les plus à risque dans le cadre de la transmission de pathogènes ; - des cocktails enzymatiques pour décrocher les biofilms ; - des cocktails complexes, constitués de microorganismes favorisant l’installation durable d’un écosystème luttant par des propriétés intrinsèques sélectionnées contre la contamination par d’autres microorganismes environnementaux dégradant la santé ou le bien-être ; - des systèmes d’ultra-sonication et des chélates particuliers pour faciliter la désagrégation des biofilms lors des prélèvements ou le traitement des surfaces - des biomarqueurs de résistance aux agents antimicrobiens ; - ou toute combinaison de ceux-ci.