BE1023586B1

BE1023586B1 - IMPROVED BAKERY PRODUCTS

Info

Publication number: BE1023586B1
Application number: BE2016/5308A
Authority: BE
Inventors: Jacques Georis; Valérie Dorgeo; Oksana SHEGAY; Thierry Dauvrin; Filip Arnaut; Fanny Nguyen; Winckel Bruno Van; Fabienne Verte
Original assignee: Puratos Naamloze Vennootschap
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2017-05-09

Abstract

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op composities en werkwijzen voor de verbetering van bakkerijproducten, in het bijzonder voor de verbetering van de textuur van cakes en de tolerantie van bakkerijdegen.The present invention relates to compositions and methods for the improvement of bakery products, in particular for the improvement of the texture of cakes and the tolerance of bakery dough.

Description

VERBETERDE BAKKERIJPRODUCTEN VAKGEBIED VAN DE UITVINDINGIMPROVED BAKERY PRODUCTS FIELD OF THE INVENTION

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe composities en werkwijzen voor de verbetering van bakkerijproducten, in het bijzonder voor de verbetering van de textuur van cakes en de tolerantie van bakkerijdegen.The present invention relates to new compositions and methods for improving bakery products, in particular for improving the texture of cakes and the tolerance of bakery doughs.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDINGBACKGROUND OF THE INVENTION

Hoewel ze maar 2% van de massa van bloem vertegenwoordigen, spelen de lipiden in bloem bij het bakken een belangrijke technische rol omdat ze een interactie aangaan met eiwitten en zetmeel in een deeg of beslag, hierbij worden de Theologische eigenschappen van het deeg of beslag, evenals de kwaliteit van het gebakken product, beïnvloed. De lipiden kunnen worden onderverdeeld in vrije lipiden en gebonden lipiden, waarbij beide fracties polaire of niet-polaire lipiden bevatten. Ongeveer de helft van de lipiden is polair, en de verhouding van polaire tot niet-polaire lipiden is van groot belang bij het maken van brood vanwege de sterke correlatie met het volume van brood. De polaire lipidenfractie bestaat voornamelijk uit lysofosfolipiden, fosfolipiden en galactolipiden.Although they represent only 2% of the mass of flour, the lipids in flour play an important technical role in baking because they interact with proteins and starch in a dough or batter, thereby the theological properties of the dough or batter, as well as the quality of the baked product. The lipids can be subdivided into free lipids and bound lipids, both fractions containing polar or non-polar lipids. About half of the lipids are polar, and the ratio of polar to non-polar lipids is of great importance in making bread because of the strong correlation with the volume of bread. The polar lipid fraction mainly consists of lysophospholipids, phospholipids and galactolipids.

Het is belangrijk om op te merken dat de lipiden zich op verschillende locaties in een deeg of een beslag bevinden. De meeste polaire lipiden bevinden zich in de zetmeelkorrels. Sommige vrije lipiden verplaatsen zich spontaan naar grensvlakken tussen gas en water, sommige bevinden zich aan het oppervlak of in zetmeelkorrels, of zijn gekoppeld aan glutenmoleculen en sommige zijn pas na gelatinisering van het zetmeel beschikbaar.It is important to note that the lipids are in different locations in a dough or batter. Most polar lipids are found in the starch grains. Some free lipids spontaneously move to interfaces between gas and water, some are on the surface or in starch granules, or are linked to gluten molecules and some are only available after gelatinization of the starch.

In het algemeen is de belangrijkste functie van lipiden hun effect op de stabiliteit van de gascellen en het versterken van gluten. Ook hebben in het bijzonder de polaire lipiden het vermogen om retrogradatie van zetmeel te verminderen. Het stabiliseren van gasbellen die ontstaan door gistfermentatie leidt tot een groter volume van het gebakken product. Het versterken van het glutennetwerk leidt tot een betere stabiliteit van het deeg en verbetert de zachtheid en de textuur van het kruim en verlengt hierbij de houdbaarheid. Vanwege de kleine hoeveelheid lipiden in bloem is de natieve fosfolipïdenfractie van de bloem echter niet genoeg om van zichzelf een significant effect op de eigenschappen van het deeg of beslag en de kwaliteit van de gebakken producten te produceren. Bovendien hebben sommige van de aanwezige fosfolipidemoleculen geen effect of zelfs een negatief effect op de eigenschappen van deeg. Derhalve worden exogene fosfolipiden en/of emulgatoren gebruikt om gelijkmatige kwaliteit en stabiliteit van de houdbaarheid van gebakken producten te garanderen.In general, the most important function of lipids is their effect on gas cell stability and gluten enhancement. In particular, the polar lipids also have the capacity to reduce starch retrogradation. The stabilization of gas bubbles caused by yeast fermentation leads to a larger volume of the baked product. Strengthening the gluten network leads to a better stability of the dough and improves the softness and texture of the crumb and thereby extends the shelf life. However, due to the small amount of lipids in flour, the native phospholipid fraction of the flour is not enough to produce a significant effect on the properties of the dough or batter and the quality of the baked products. Moreover, some of the phospholipid molecules present have no effect or even a negative effect on the properties of dough. Therefore, exogenous phospholipids and / or emulsifiers are used to ensure uniform quality and stability of the shelf life of baked products.

Een andere manier om dit probleem aan te pakken is om lipolytische enzymen te gebruiken (zoals fosfolipasen en lipasen) en een in-situ modificatie van triglyceriden, fosfolipiden en galactolipiden uit te voeren om de overeenkomstige lysolipiden vrij te geven. Lysolipiden hebben betere emulgerende eigenschappen ten opzichte van de oorspronkelijke moleculen en zijn functioneler als bevochtigingsmiddel in processen voor het maken van brood en cake. Voorts leidt het vrijgeven van meer lysolipiden met betere emulgerende eigenschappen tot verbeterde rheologische eigenschappen van het deeg of het beslag. Een dergelijke vrijgave verbetert in het bijzonder bij het maken van cake de opname van lucht in de waterige fase in een schuim- of sponscake en verbetert de verdeling van het bakkerijvet in het beslag van cakes opgebouwd in lagen.Another way to address this problem is to use lipolytic enzymes (such as phospholipases and lipases) and perform an in-situ modification of triglycerides, phospholipids and galactolipids to release the corresponding lysolipids. Lysolipids have better emulsifying properties compared to the original molecules and are more functional as a wetting agent in bread and cake making processes. Furthermore, releasing more lysolipids with better emulsifying properties leads to improved rheological properties of the dough or batter. Such a release, in particular when making a cake, improves the absorption of air in the aqueous phase in a foam or sponge cake and improves the distribution of the bakery fat in the batter of cakes built up in layers.

Vanwege het feit dat de lipiden niet gelijkmatig zijn verdeeld in deeg- en beslagsystemen, zijn ze niet altijd toegankelijk voor hydrolyse door lipasen en fosfolipasen. Door de pH-omstandigheden, de ionensterkte en/of de suikerconcentratie bij verschillende temperaturen te wijzigen, wordt de beschikbaarheid van deze lipiden gewijzigd. In dergelijke gevallen heeft men enzymen nodig die bij deze verschillende temperaturen en omstandigheden actief zijn en de gewenste specificiteit bezitten. Anderzijds ontstaan er wanneer de substraten te ver worden gehydrolyseerd moleculen die een negatief effect hebben op de kwaliteitskenmerken van gebakken producten.Due to the fact that the lipids are not evenly distributed in dough and batter systems, they are not always accessible for hydrolysis by lipases and phospholipases. By changing the pH conditions, the ionic strength and / or the sugar concentration at different temperatures, the availability of these lipids is changed. In such cases, enzymes are needed that are active at these different temperatures and conditions and have the desired specificity. On the other hand, when the substrates are over-hydrolyzed, molecules are formed that have a negative effect on the quality characteristics of baked products.

Hoewel bepaalde lipasen en/of fosfolipasen al zijn beschreven vanwege hun positieve eigenschappen bij de bereiding van gebakken producten, is het resultaat van het gebruik daarvan uiterst onvoorspelbaar, als gevolg van hun verschillende specificiteit, hun verschillende hydrolyseproducten, hun mogelijke synergieën, de procesomstandigheden of de substraten. Derhalve bestaat er momenteel nog steeds behoefte aan composities en werkwijzen om de eigenschappen van gebakken producten, zoals de tolerantie, het volume en/of de versheid van deeg of beslag, verder te verbeteren.Although certain lipases and / or phospholipases have already been described due to their positive properties in the preparation of baked products, the result of their use is extremely unpredictable, due to their different specificity, their different hydrolysis products, their possible synergies, the process conditions or the substrates. Therefore, there is still a current need for compositions and methods to further improve the properties of baked products, such as the tolerance, volume and / or freshness of dough or batter.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDINGSUMMARY OF THE INVENTION

De uitvinders hebben ontdekt dat het gebruik van een specifiek fosfolipase in bakkerijtoepassingen, en in het bijzonder bij het maken van brood, de textuur van cakes en de tolerantie van bakkerijdegen verbetert.The inventors have discovered that the use of a specific phospholipase in bakery applications, and in particular in bread making, improves the texture of cakes and the tolerance of bakery dough.

Dienovereenkomstig heeft de onderhavige uitvinding in een eerste aspect betrekking op een verbetermiddelcompositie, omvattende een fosfolipase die een verhouding van fosfolipase A1-activiteit/fosfolipase A2-activiteit heeft in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en die een optimumtemperatuur van fosfolipase heeft van 45¾ of meer.Accordingly, in a first aspect, the present invention relates to an enhancer composition comprising a phospholipase having a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and which has an optimum phospholipase temperature of 45¾ or more.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat voor fosfolipase A1 -activiteit één milliunit (PAImU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1 -positie van N-((6-(2,4- DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine bij 40¾ en pH 7,4 en voor fosfolipase A2-activiteit één milliunit (PA2mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-2-positie van 1-O(6-B0DIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine bij 40¾ en pH 8,9.In a particular embodiment, the improver composition as described in this application provides that for phospholipase A1 activity, one milliunit (PAImU) is defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomol (nmol) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-1 position of N - ((6- (2,4-DNP) Amino) Hexanoyl) -1- (BODIPY® FL C5) -2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine at 40¾ and pH 7.4 and before phospholipase A2 activity one milliunit (PA2mU) is defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomol (nmol) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-2 position of 1-O (6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl) -2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-phosphocholine at 40¾ and pH 8.9.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemde fosfolipase wordt gekozen uit een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Chaetomium thermophilum, een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus ruber en/of een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus silvanus.In a particular embodiment, the enhancer composition described in this application provides for said phospholipase to be selected from a lipolytic enzyme with phospholipase activity from Chaetomium thermophilum, a lipolytic enzyme with phospholipase activity from Meiothermus ruber and / or a lipolytic enzyme with phospholipase activity from Meiothermus silvanus.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemde fosfolipase een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aaneen van de sequenties SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.In a particular embodiment, the enhancer composition as described in this application provides that said phospholipase has a sequence that is at least 85% identical to one of the sequences SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, and / or SEQ ID NO 3.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemde fosfolipase meer dan 40% van zijn fosfoiipaseactiviteit behoudt nadat hij gedurende 60 minuten bij 50°C is ge'incubeerd, bij voorkeur meer dan 50% van zijn activiteit behoudt nadat hij gedurende 60 minuten bij 50°C is geïncubeerd.In a particular embodiment, the enhancer composition as described in this application provides that said phospholipase retains more than 40% of its phosphoipase activity after being incubated at 50 ° C for 60 minutes, preferably more than 50% of its activity after it has been incubated incubated for 60 minutes at 50 ° C.

In een bijzondere uitvoeringsvorm is de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven een broodverbetermiddelcompositie of een banketbakkersmix of -premix.In a special embodiment, the improver composition as described in this application is a bread improver composition or a pastry mix or pre-mix.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op het gebruik van een fosfolipase in bakkerijtoepassingen, waarbij genoemde fosfolipase een verhouding van fosfolipase A1 -activiteit/fosfolipase A2-activiteit heeft in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en een optimumtemperatuur van fosfolipase heeft van 45^0 of meer.Furthermore, in another aspect, the present invention relates to the use of a phospholipase in bakery applications, wherein said phospholipase has a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and has an optimum temperature of phospholipase of 45% or more.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven verschaft, waarbij genoemde fosfolipase een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.In a particular embodiment, the use of the composition as described in this application is provided, wherein said phospholipase has a sequence that is at least 85% identical to a sequence of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, and / or SEQ ID NO. 3.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven in brood of banketbakkersproducten verschaft.In a special embodiment, the use of the composition as described in this application is provided in bread or pastry products.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven bij de bereiding van cakes verschaft.In a particular embodiment, the use of the composition as described in this application is provided in the preparation of cakes.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een gebakken product, omvattende de stappen van het toevoegen aan het deeg of beslag, voorafgaande aan het bakken, van een fosfolipase die een verhouding van fosfolipase A1-activiteit/fosfolipase A2-activiteit heeft in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en die een optimumtemperatuur van fosfolipase heeft van 45*C of meer. *Furthermore, in another aspect, the present invention relates to a method for preparing a baked product, comprising the steps of adding to the dough or batter, prior to baking, a phospholipase that has a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity has in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0, 01 and 10; and which has an optimum phospholipase temperature of 45 ° C or more. *

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd deeg of beslag tussen 5000 en 100000 PmU / 100 kg bloem, bij voorkeur tussen 7000 en 70000 PmU /100 kg bloem, met meer voorkeur tussen 10000 en 60000 PmU /100 kg bloem van genoemde fosfolipase omvat.In a particular embodiment, the method as described in this application provides that said dough or batter between 5000 and 100000 PmU / 100 kg of flour, preferably between 7000 and 7000 PmU / 100 kg of flour, more preferably between 10000 and 60000 PmU / 100 kg of flour of said phospholipase.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd deeg of beslag een verbeterde tolerantie vertoont.In a special embodiment, the method as described in this application provides that said dough or batter has an improved tolerance.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd gebakken product een verbeterde versheid vertoont.In a special embodiment, the method as described in this application provides that said baked product exhibits improved freshness.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een gebakken product bereid van een deeg of beslag omvattende een fosfolipase die een verhouding van fosfolipase A1-activiteit/fosfolipase A2-activiteit heeft in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en het fosfolipase een optimale temperatuur heeft van 45“Ό of meer. ·Furthermore, in another aspect, the present invention relates to a baked product prepared from a dough or batter comprising a phospholipase that has a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and the phospholipase has an optimum temperature of 45 "or more. ·

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVINGDETAILED DESCRIPTION

Voordat de onderhavige producten, composities, toepassingen en werkwijzen van de uitvinding worden beschreven, dient duidelijk te zijn dat deze uitvinding niet beperkt is tot specifieke producten, composities, toepassingen en werkwijzen of combinaties die worden beschreven, aangezien dergelijke producten, composities, toepassingen en werkwijzen en combinaties uiteraard kunnen variëren. Het dient eveneens duidelijk te zijn dat de terminologie die in deze aanvraag wordt gebruikt niet bedoeld is als beperkend, aangezien de reikwijdte van de onderhavige uitvinding uitsluitend wordt beperkt door de aangehechte conclusies.Before describing the present products, compositions, applications and methods of the invention, it should be understood that this invention is not limited to specific products, compositions, applications, and methods or combinations described, since such products, compositions, applications, and methods and combinations can of course vary. It is also to be understood that the terminology used in this application is not intended to be limiting, since the scope of the present invention is limited solely by the appended claims.

Zoals in deze aanvraag gebruikt, omvatten de enkelvoudige vormen “de", “het” en “een” zowel de enkelvoudige als meervoudige verwijzingen, tenzij de context duidelijk anders aangeeft.As used in this application, the singular forms "the", "it", and "one" include both the singular and plural references, unless the context clearly indicates otherwise.

De termen “omvattende”, “omvat” en "samengesteld uit” zijn, zoals in deze aanvraag gebruikt, synoniem met “inclusief”, “met inbegrip van” of “bevattende", “bevat” en zijn inclusief of met een open uiteinde en sluiten geen bijkomende, niet-vermelde leden, onderdelen of werkwijzestappen uit. Het zal duidelijk zijn dat de termen “omvattende”, “omvat” en “samengesteld uit” zoals in deze aanvraag gebruikt de termen “bestaand uit" en “bestaat uit” omvatten.The terms "comprising", "includes" and "composed of" are, as used in this application, synonymous with "including", "including" or "containing", "contains" and include or with an open end and do not exclude additional, unlisted members, parts or process steps. It will be understood that the terms "comprising", "includes" and "composed of" as used in this application include the terms "consisting of" and "consists of".

De vermelding van numerieke bereiken met eindpunten omvat alle getallen en fracties die binnen de bijbehorende bereiken vallen, evenals de vernielde eindpunten.The indication of numerical ranges with end points includes all numbers and fractions that fall within the corresponding ranges, as well as the destroyed end points.

De term “ongeveer” of “bij benadering” is, zoals in deze aanvraag gebruikt wanneer wordt verwezen naar een meetbare waarde zoals een parameter, een hoeveelheid, een tijdsduur en dergelijke, bedoeld variaties van +/-10% of minder, bij voorkeur +1-5% of minder, met meer voorkeur +/-1% of minder en met nog meer voorkeur +/-0,1% of minder van de gespecifieerde waarde te omvatten, voor zover dergelijke variaties geschikt zijn om in de beschreven uitvinding te worden uitgevoerd. Het dient duidelijk te zijn dat de waarde waarnaar de modificatie “ongeveer” of “bij benadering” verwijst zelf ook specifiek is, en bij voorkeur wordt beschreven.The term "approximately" or "approximate" is, as used in this application when reference is made to a measurable value such as a parameter, a quantity, a duration and the like, intended variations of +/- 10% or less, preferably + 1-5% or less, more preferably +/- 1% or less and even more preferably +/- 0.1% or less of the specified value, insofar as such variations are suitable for incorporating in the described invention. are carried out. It should be understood that the value to which the modification "approximately" or "approximate" refers is also specific, and is preferably described.

Hoewel de termen “één of meer” of “ten minste één”, zoals één of meer leden of ten minste één lid van een groep leden op zich duidelijk zijn, omvatten de termen bij wijze van verdere toelichting onder andere een verwijzing naar één van de genoemde leden of naar elke willekeurige twee of meer van genoemde leden, zoals elke willekeurige £ 3, s 4, > 5, £ 6 of > 7 etc. van genoemde leden, en tot aan alle genoemde leden.Although the terms "one or more" or "at least one", such as one or more members or at least one member of a group of members are per se clear, the terms include, by way of further explanation, a reference to one of the said members or to any two or more of said members, such as any £ 3, s 4,> 5, £ 6 or> 7 etc. of said members, and up to all said members.

Alle verwijzingen die in de onderhavige beschrijving worden aangehaald, zijn hiermee door verwijzing in hun geheel opgenomen. In het bijzonder is de leer van alle verwijzingen waarnaar in deze aanvraag specifiek wordt verwezen door verwijzing opgenomen.All references cited in the present description are hereby incorporated by reference in their entirety. In particular, the doctrine of all references to which this application specifically refers is incorporated by reference.

Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle termen die bij het beschrijven van de uitvinding worden gebruikt, met inbegrip van technische en wetenschappelijke termen, dezelfde betekenis als wordt begrepen door iemand met gemiddelde kennis van het vakgebied waartoe deze uitvinding behoort. Bij wijze van verdere begeleiding, worden de definities van de termen opgenomen om de uitleg van de onderhavige uitvinding beter te begrijpen.Unless defined otherwise, all terms used in describing the invention, including technical and scientific terms, have the same meaning as understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. By way of further guidance, the definitions of the terms are included to better understand the explanation of the present invention.

In de volgende passages worden verschillende aspecten van de uitvinding meer in detail gedefinieerd. Elk aspect dat als zodanig wordt gedefinieerd, kan met elk willekeurig ander aspect of alle willekeurige andere aspecten worden gecombineerd, tenzij het tegendeel duidelijk wordt aangegeven. In het bijzonder kan elk kenmerk dat wordt aangeduid als de voorkeur genietend of voordelig worden gecombineerd met elk willekeurig ander kenmerk of alle willekeurige andere kenmerken waarvan is aangegeven dat ze de voorkeur genieten of voordelig zijn.In the following passages, various aspects of the invention are defined in more detail. Any aspect defined as such can be combined with any other aspect or all other aspects, unless the contrary is clearly stated. In particular, any feature designated as preferred or advantageous may be combined with any other feature or any other features that are indicated to be preferred or advantageous.

Verwijzing in deze beschrijving naar “één uitvoeringsvorm” of “een uitvoeringsvorm” betekent dat een specifiek kenmerk, specifieke structuur of eigenschap die wordt beschreven in verband met de uitvoeringsvorm is opgenomen in ten minste één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Zodoende verwijzen verschijningen van de zinnen “in één uitvoeringsvorm” of “in een uitvoeringsvorm” op verschillende plaatsen in deze beschrijving niet noodzakelijk allemaal naar dezelfde uitvoeringsvorm, maar dat zou wel kunnen. Voorts kunnen de specifieke kenmerken, structuren of eigenschappen op elke geschikte wijze gecombineerd worden in één of meer uitvoeringsvormen, zoals uit deze beschrijving duidelijk zou zijn aan een deskundige op het vakgebied. Hoewel bepaalde uitvoeringsvormen die in deze aanvraag worden beschreven sommige kenmerken omvatten die in andere uitvoeringsvormen zijn opgenomen, maar andere niet, zijn combinaties van kenmerken van verschillende uitvoeringsvormen voorts bedoeld om binnen de reikwijdte van de uitvinding te vallen, en afzonderlijke uitvoeringsvormen te vormen, zoals duidelijk zou zijn voor deskundigen op het vakgebied. In de aangehechte conclusies kan bijvoorbeeld elk van de geclaimde uitvoeringsvormen in elke willekeurige combinatie worden gebruikt.Reference in this description to "one embodiment" or "an embodiment" means that a specific feature, specific structure or feature described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment of the present invention. Thus, appearances of the sentences "in one embodiment" or "in an embodiment" at different places in this description do not necessarily all refer to the same embodiment, but it could. Furthermore, the specific features, structures or properties may be combined in any suitable manner in one or more embodiments, as would be apparent to one skilled in the art from this disclosure. While certain embodiments described in this application include some features included in other embodiments, but others do not, combinations of features of different embodiments are further intended to fall within the scope of the invention, and to form individual embodiments as clearly would be for experts in the field. For example, in the appended claims, any of the claimed embodiments can be used in any combination.

In deze aanvraag worden composities beschreven die een enzym omvatten dat een lage verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit heeft; en dat een optimumtemperatuur voor fosfolipase heeft van 45of hoger, dat in het bijzonder geschikt is voor gebruik in bakkerijtoepassingen en in het bijzonder voor gebruik als of in een verbetermiddelcompositie.This application describes compositions comprising an enzyme that has a low ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity; and which has an optimum temperature for phospholipase of 45 or higher, which is particularly suitable for use in bakery applications and in particular for use as or in an improver composition.

De uitvinders hebben verrassend ontdekt dat het gebruik van een specifieke fosfolipase in bakkerijtoepassingen met de specifieke eigenschappen zoals in deze aanvraag beschreven het verkrijgen van gebakken producten met verbeterde eigenschappen mogelijk maakt. In het bijzonder worden de eigenschappen (bijv. de tolerantie) van het beslag en/of deeg aanzienlijk verbeterd. Ook bleken de gebakken producten een verbeterd volume en/of verbeterde versheid te vertonen.The inventors have surprisingly discovered that the use of a specific phospholipase in bakery applications with the specific properties described in this application permits the production of baked products with improved properties. In particular the properties (e.g. the tolerance) of the batter and / or dough are considerably improved. The baked products also appeared to exhibit an improved volume and / or improved freshness.

De composities zoals in deze aanvraag beschreven verbeteren in het bijzonder (de kwaliteit van) bakkerijproducten en banketbakkersproducten, bij voorkeur banketbakkersproducten.The compositions as described in this application particularly improve (the quality of) bakery products and pastry products, preferably pastry products.

Meer in het bijzonder verbeteren de composities zoals in deze aanvraag beschreven de tolerantie van bakkerijdegen en de versheid van banketbakkersproducten, zoals cakes, bij voorkeur de versheid van cakes.More specifically, the compositions described in this application improve the tolerance of bakery doughs and the freshness of pastry products, such as cakes, preferably the freshness of cakes.

Binnen de onderhavige context verwijst de deegtolerantie naar het vermogen van een deeg of beslag, bij voorkeur een bakkerijdeeg, om zijn vorm te behouden onder stressomstandigheden, zoals een langere /ijstijd of mechanische schokken tijdens of na het : rijzen en om na het bakken een gebakken product te verschaffen met eigenschappen (bijv. volume) die vergelijkbaar zijn met een gebakken product dat verkregen is met een deeg of beslag dat zonder stressomstandigheden is verkregen.In the present context, the dough tolerance refers to the ability of a dough or batter, preferably a bakery dough, to retain its shape under stress conditions, such as a longer / ice age or mechanical shocks during or after proofing and after baking a baked dough. to provide a product with properties (e.g., volume) that are comparable to a baked product obtained with a dough or batter obtained without stress conditions.

Binnen de onderhavige context verwijst versheid naar een combinatie van textuurparameters zoals zachtheid, natheid, samenhang, elasticiteit en veerkracht. Verlies van versheid wordt doorgaans in verband gebracht met oudbakken worden. Meer in het bijzonder correspondeert een verbeterde versheid van een gebakken product met een verbeterde zachtheid en/of een verbeterde natheid en/of een verbeterde krokante beet ten opzichte van een referentie. Deze parameters kunnen op voordelige wijze worden gemeten door middel van fysische werkwijzen, zoals met een textuurmeter, of door middel van zintuiglijke analyse uitgevoerd met een panel van ervaren juryleden.Within the present context, freshness refers to a combination of texture parameters such as softness, wetness, cohesion, elasticity and resilience. Loss of freshness is usually associated with being stale. More specifically, an improved freshness of a baked product corresponds to an improved softness and / or an improved wetness and / or an improved crispy bite relative to a reference. These parameters can advantageously be measured by physical methods, such as with a texture meter, or by sensory analysis performed with a panel of experienced judges.

De zachtheid van een cake verwijst naar het gevoel met betrekking tot de kracht die nodig is om de cakekruim samen te drukken en af te bijten. De natheid van cake is het gevoel van vochtigheid (tegenovergestelde van droogheid) dat wordt ervaren bij het aanraken en eten van de cake. Het aanraken van een natte cake met de lippen en/of de handen geeft een kouder gevoel op de lippen ten opzichte van een droge cake. In de mond wordt een natte cake als vochtig en sappig ervaren. Bij het eten van een natte cake, is er niet het gevoel dat hij water absorbeert uit de binnenkant van de mond. Zachtheid en natheid van cakes zijn verschillende parameters. Traditionele sponscakes zijn bijvoorbeeld erg zacht, hoewel ze niet als nat worden ervaren (erg droog). Bepaalde brownies kunnen daarentegen als zeer nat worden ervaren, en toch hard en compact zijn. Migratie van vocht vanuit de kruim naar de korst en retrogradatie van amylopectine worden aangewezen als de belangrijkste oorzaken van het hard worden van cake en het uitdrogen van cake tijdens de opslag.The softness of a cake refers to the feeling regarding the force needed to compress and bite the cake crumb. The wetness of cake is the feeling of humidity (opposite of dryness) that is experienced when touching and eating the cake. Touching a wet cake with the lips and / or hands gives a colder feeling on the lips compared to a dry cake. In the mouth a wet cake is experienced as moist and juicy. When eating a wet cake, there is no feeling that it absorbs water from the inside of the mouth. Softness and wetness of cakes are different parameters. For example, traditional sponge cakes are very soft, although they are not experienced as wet (very dry). Certain brownies, on the other hand, can be experienced as very wet, yet hard and compact. Moisture migration from the crumb to the crust and retrogradation of amylopectin are indicated as the main causes of cake hardening and cake drying during storage.

Zoals in deze aanvraag gebruikt, verwijst de term “lipase" in het algemeen naar triacylglycerollipasen of triacylglycerolacylhydrolase zoals gedefinieerd door enzym onderverdeling EC 3.1.13. Lipasen worden in deze aanvraag gedefinieerd als enzymen die de hydrolyse van triacylglycerolen katalyseren om vrije vetzuren, diacylglycerolen, monoacylglycerolen en glycerol op te leveren. De lipase die wordt gebruikt in de composities die in deze aanvraag worden gedefinieerd, kan enzymatische nevenactiviteiten omvatten, zoals fosfolipaseactiviteit.As used herein, the term "lipase" generally refers to triacylglycerol lipases or triacylglycerol acylhydrolase as defined by enzyme subsection EC 3.1.13. Lipases are defined in this application as enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to free fatty acids, diacylglycerols, monoacylglycerols The lipase used in the compositions defined in this application may include enzymatic side activities, such as phospholipase activity.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding wordt de lipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylpalmitaat (pNPP) als substraat en volgens de in deze aanvraag beschreven werkwijze. De·, enzymactiviteit kan ook met andere analysemethoden voor lipaseactiviteit worden gemeten die bekend zijn aan deskundigen op het vakgebied (zie voor een bespreking bijvoorbeeld Stoytcheva M. & al, 2012, Current Analytical Chemistry, vol 8, p. 400). .In the context of the present invention, lipase activity is measured using p-nitrophenyl palmitate (pNPP) as a substrate and according to the method described in this application. The enzyme activity can also be measured with other methods of analysis for lipase activity known to those skilled in the art (for a discussion, see, for example, Stoytcheva M. & al, 2012, Current Analytical Chemistry, vol. 8, p. 400). .

In het bijzonder wordt de lipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylpalmitaat (pNPP) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylpalmitaat door lipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén lipase milliunit (LmU) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) p-nitrofenol per minuut vrij te maken uit p-nitrofenylpalmitaat bij 40*C en pH 7.5. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de lipaseactiviteit gegeven. Zoals in deze aanvraag gebruikt, verwijst de term “fosfolipase” in het algemeen naar enzymen die fosfolipiden hydrolyseren tot vetzuren en andere lipofiele stoffen, zoals lysofosfolipiden, diacylglycerolen, cholinefosfaat en fosfatidaten, afhankelijk van de plaats van hydrolyse. Afhankelijk van de specifieke binding in de fosfolipidenmolecule waarop ze zich richten, worden fosfolipasen ingedeeld in verschillende typen, zoals A, B, C en D.In particular, lipase activity is measured using p-nitrophenyl palmitate (pNPP) as a substrate. The release of yellow p-nitrophenol due to the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate by lipase is measured by spectrophotometry at 414 nm. One lipase milliunit (LmU) is defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) of p-nitrophenol per minute from p-nitrophenyl palmitate at 40 ° C and pH 7.5. More details about measuring lipase activity are given in the examples. As used in this application, the term "phospholipase" generally refers to enzymes that hydrolyze phospholipids to fatty acids and other lipophilic substances such as lysophospholipids, diacylglycerols, chine phosphate and phosphatidates, depending on the site of hydrolysis. Depending on the specific binding in the phospholipid molecule they are targeting, phospholipases are classified into different types, such as A, B, C and D.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding wordt de fosfolipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine als substraat, terwijl de fosfolipaseactiviteit wordt uitgedrukt als milliunits (PmU) die gedefinieerd worden als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) p-nitrofenol vrij te maken uit p-nitrofenylfosforylcholine per minuut bij 50 °C en pH 7,5. De fosfolipaseactiviteit kan ook worden gemeten met andere analysemethoden voor fosfolipaseactiviteit zoals bekend aan deskundigen op het vakgebied, zoals de hydrolyse van fosfatidylcholine.Within the context of the present invention, phospholipase activity is measured using p-nitrophenylphosphorylcholine as a substrate, while phospholipase activity is expressed as milliunits (PmU) defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) of p-nitrophenol from p-nitrophenylphosphorylcholine per minute at 50 ° C and pH 7.5. The phospholipase activity can also be measured with other methods of analysis for phospholipase activity known to those skilled in the art, such as the hydrolysis of phosphatidylcholine.

In het bijzonder wordt de fosfolipaseactiviteit gemeten met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine (pNPPC) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylfosforylcholine door fosfolipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén fosfolipase milliunit (PmU) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om 1 nmol p-nitrofenol per minuut vrij te maken bij 50°C en pH 7,5. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de fosfolipaseactiviteit gegeven.In particular, the phospholipase activity is measured using p-nitrophenyl phosphorylcholine (pNPPC) as a substrate. The release of yellow p-nitrophenol as a result of the hydrolysis of p-nitrophenyl phosphorylcholine by phospholipase is measured by spectrophotometry at 414 nm. One phospholipase milliunit (PmU) is defined as the amount of enzyme required to release 1 nmol of p-nitrophenol per minute at 50 ° C and pH 7.5. In the examples, more details about measuring the phospholipase activity are given.

Zoals in deze aanvraag gebruikt, verwijst de term “fosfolipase A” naar lipolytische enzymen die bij de hydrolyse van één of meer bindingen in fosfolipiden katalyseren. Er kunnen twee verschillende typen fosfolipase A-activiteit worden onderscheiden die één of meer esterbindingen hydrolyseren die de vetacylgroepen koppelen aan de glycerolhoofdketen. Fosfolipase A1, zoals gedefinieerd door enzym onderverdeling EC 3.1.1.32, en Fosfolipase A2, zoals gedefinieerd door enzym onderverdeling EC 3.1.1.4, katalyseren de deacylering van één vetacylgroep op respectievelijk de sn-1- en sn-2-positie van een diacylglycerofosfolipide om lysofosfolipide te produceren.As used in this application, the term "phospholipase A" refers to lipolytic enzymes that catalyze upon hydrolysis of one or more bonds in phospholipids. Two different types of phospholipase A activity can be distinguished that hydrolyze one or more ester linkages linking the fatty acyl groups to the glycerol backbone. Phospholipase A1, as defined by enzyme subdivision EC 3.1.1.32, and Phospholipase A2, as defined by enzyme subdivision EC 3.1.1.4, catalyze the deacylation of one fatty acyl group at the sn-1 and sn-2 positions of a diacyl glycerophospholipid, respectively. produce lysophospholipid.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding worden de fosfolipaseactiviteiten gemeten met gebruik van respectievelijk een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine (voor fosfolipase A1) of een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde 1-0-(6-B0DIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODlPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine (voor fosfolipase A2) als substraten en volgens de in deze aanvraag beschreven werkwijzen. De fosfolipaseactiviteiten kunnen ook worden gemeten met andere analysemethoden voor lipaseactiviteit zoals bekend aan deskundigen op het vakgebied, zoals met gebruik van rac-1,2-S,0-didecanoyl-3-fosfocholine-1-mercapto-2,3-propaandiol als substraat voor het analyseren van fosfolipase A1-activiteit en 2-hexadecanoylthio-1-ethyl-fosfocholine als substraat voor het analyseren van fosfolipase A2-activiteit.Within the context of the present invention, phospholipase activities are measured using, respectively, a lipid mixture of dioleoyl phosphatidylcholine, dioleoyl phosphatidyl glycerol and dye-labeled N - ((6- (2,4-DNP) Amino) Hexanoyl) -1- (BODIPY® FL C5 ) -2-Hexyl-Sn-Glycero-3-phosphoethanolamine (for phospholipase A1) or a lipid mixture of dioleoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylglycerol and dye-labeled 1-0- (6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl) -2-BOX ® FL C5-Sn-Glycero-3-phosphocholine (for phospholipase A2) as substrates and according to the methods described in this application. The phospholipase activities can also be measured with other methods of analysis for lipase activity known to those skilled in the art, such as using rac-1,2-S, O-didecanoyl-3-phosphocholine-1-mercapto-2,3-propanediol as substrate for analyzing phospholipase A 1 activity and 2-hexadecanoylthio-1-ethyl-phosphocholine as a substrate for analyzing phospholipase A 2 activity.

In het bijzonder wordt de fosfolipase A1-activiteit (PLA1) genieten met gebruik van een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine (PED-A1) als substraat (dat bijvoorbeeld gevonden kan worden in de EnzChek Fosfolipase A1-analysekit - ThermoFisher Scientific). De PED-A1 is specifiek voor PLA1 en is een met kleurstof gelabelde glycerofosfo-ethanolamine met een met BODIPY® FL-kleurstof gelabelde acylketen op de sn-1-positie en een met dinitrofenylquencher gemodificeerde hoofdgroep. Eén fosfolipase A1 milliunit (PA1mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1-positie van PED-A1 bij 40°C en pH 7,4. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de fosfolipase-A1 -activiteit gegeven. In het bijzonder wordt de fosfolipase A2-activiteit (PLA2) gemeten met gebruik van een lipidenmengsel van dioleoylfosfatidylcholine, dioleoylfosfatidylglycerol en met kleurstof gelabelde 1-0-(6-B0DIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine (Rood/Groen BODIPY® PC-A2) als substraat (dat bijvoorbeeld gevonden kan worden in de EnzChek Fosfolipase A2-analysekit - ThermoFisher Scientific). Het Rood/Groen BODIPY® PC-A2-substraat is selectief voor PLA2 en verschaft de mogelijkheid om gevoelig, continu, snel en in real-time PLA2-enzymactiviteiten op te volgen. Eén fosfolipase A2 milliunit (PA2mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur dat is gesubstitueerd op de sn-2-positie van Rood/Groen BODIPY® PC-A2 bij 40¾ en pH 8,9. In de voorbeelden worden meer details over het meten van de fosfolipase A2-activiteit gegeven.In particular, the phospholipase A1 activity (PLA1) is enjoyed using a lipid mixture of dioleoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylglycerol and dye-labeled N - ((6- (2,4-DNP) Amino) Hexanoyl) -1- (BODIPY® FL C5) -2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (PED-A1) as substrate (which can be found for example in the EnzChek Phospholipase A1 analysis kit - ThermoFisher Scientific). The PED-A1 is specific for PLA1 and is a dye-labeled glycerophosphoethanolamine with an acyl chain labeled with BODIPY® FL dye at the sn-1 position and a main group modified with dinitrophenyl quencher. One phospholipase A1 milliunit (PA1mU) is defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) per minute from fluorescent fatty acid substituted at the sn-1 position of PED-A1 at 40 ° C and pH 7, 4. In the examples, more details about measuring the phospholipase A1 activity are given. In particular, the phospholipase A2 activity (PLA2) is measured using a lipid mixture of dioleoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylglycerol and dye-labeled 1-0- (6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl) -2-BODIPY® FL C5-Sn -Glycero-3-Phosphocholine (Red / Green BODIPY® PC-A2) as a substrate (which can be found, for example, in the EnzChek Phospholipase A2 analysis kit - ThermoFisher Scientific). The Red / Green BODIPY® PC-A2 substrate is selective for PLA2 and provides the ability to monitor PLA2 enzyme activities in a sensitive, continuous, fast and real-time manner. One phospholipase A2 milliunit (PA2mU) is defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) per minute from fluorescent fatty acid substituted at the sn-2 position of Red / Green BODIPY® PC-A2 at 40¾ and pH 8.9. In the examples, more details about measuring the phospholipase A2 activity are given.

Dienovereenkomstig heeft de onderhavige uitvinding in een eerste aspect betrekking op een verbetermiddelcompositie omvattende een fosfolipase met een verhouding van fosfolipase A1-activiteit/fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en die een optimumtemperatuur van fosfolipase heeft van 45¾ of meer. in het bijzonder heeft de fosfolipase een optimumtemperatuur die gelijk is aan of hoger is dan 45 °C en behoudt hij meer dan 40%, bij voorkeur meer dan 50% van zijn activiteit na 60 minuten bij 50¾.Accordingly, in a first aspect, the present invention relates to an enhancer composition comprising a phospholipase with a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80 , more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and which has an optimum phospholipase temperature of 45¾ or more. in particular, the phospholipase has an optimum temperature that is equal to or higher than 45 ° C and retains more than 40%, preferably more than 50% of its activity after 60 minutes at 50¾.

De activiteit wordt gemeten door het bepalen van de fosfolipaseactiviteit zoals in deze aanvraag aangegeven (met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine als substraat).The activity is measured by determining the phospholipase activity as indicated in this application (using p-nitrophenyl phosphorylcholine as substrate).

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat voor fosfolipase A1 -activiteit één milliunit (PA1mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1 -positie van N-((6-(2,4- DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyi-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethano!amine bij 40¾ en pH 7,4 en voor fosfolipase A2-activiteit één milliunit (PA2mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmoi) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-2-positie van 1-0-(6-B0DIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine bij 40¾ en pH 8,9.In a particular embodiment, the improver composition as described in this application provides that for phospholipase A1 activity, one milliunit (PA1mU) is defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomol (nmol) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-1 position of N - ((6- (2,4-DNP) Amino) Hexanoyl) -1- (BODIPY® FL C5) -2-Hexyi-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine at 40¾ and pH 7.4 and for phospholipase A2 activity, one milliunit (PA2mU) is defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomol (nmoi) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-2 position of 1- (6-BODIPY® 558/568) -Aminohexyl) -2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-phosphocholine at 40¾ and pH 8.9.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemde fosfolipase een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentie van SEQID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3 (zie tabel A).In a particular embodiment, the enhancer composition as described in this application provides that said phospholipase has a sequence that is at least 85% identical to a sequence of SEQID NO 1, SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 3 (see Table A ).

Meer in het bijzonder heeft genoemde fosfolipase een sequentie die voor ten minste 85%, bij voorkeur ten minste 90%, met meer voorkeur ten minste 95% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3 (zie tabel A).More specifically, said phospholipase has a sequence that is at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% identical to a sequence of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 3 (see table A).

Meer in het bijzonder heeft genoemde fosfolipase een sequentie die voor 100% identiek is aan een sequentie van SEQ ID N01, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.More specifically, said phospholipase has a sequence that is 100% identical to a sequence of SEQ ID NO1, SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 3.

Tabel ATable A.

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet het verbetermiddel zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Chaetomium thermophilum, bij voorkeur een enzym met SEQ ID NO 1, of een zeer goed daarop lijkende variant. In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet het verbetermiddel zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Meiothermus ruber, bij voorkeur een enzym met SEQ ID NO 2, of een zeer goed daarop lijkende variant. In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet het verbetermiddel zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemd enzym een lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit is van Meiothermus silvanus, bij voorkeur een enzym met SEQ ID NO 3, of een zeer goed daarop lijkende variant.In a particular embodiment, the enhancer as described in this application provides that said enzyme is a lipolytic enzyme with phospholipase activity of Chaetomium thermophilum, preferably an enzyme with SEQ ID NO 1, or a very similar to variant. In a particular embodiment, the enhancer as described in this application provides that said enzyme is a lipolytic enzyme with phospholipase activity of Meiothermus ruber, preferably an enzyme with SEQ ID NO 2, or a very similar to variant. In a particular embodiment, the enhancer as described in this application provides that said enzyme is a lipolytic enzyme with phospholipase activity of Meiothermus silvanus, preferably an enzyme with SEQ ID NO 3, or a very similar to variant.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding is een “zeer goed daarop lijkende variant”, zoals in deze aanvraag gebruikt, een enzym dat (de kwaliteit van) gebakken producten zoals hierboven beschreven verbetert en dat voor een significant deel identiek is aan SEQ ID N01 tot 3. “Significant identiek" verwijst binnen de context van de onderhavige uitvinding naar voor ten minste 85% identiek, bij voorkeur voor ten minste 90% identiek, bij voorkeur voor ten minste 91.%, met meer voorkeur voor ten minste 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% of zelfs voor ten minste 99% identiek aan SEQ ID N01 tot 3.Within the context of the present invention, a "very similar variant" as used in this application is an enzyme that improves (the quality of) baked products as described above and that is significantly identical to SEQ ID N01 to 3. "Significantly identical" within the context of the present invention refers to at least 85% identical, preferably at least 90% identical, preferably at least 91%, more preferably at least 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or even at least 99% identical to SEQ ID N01 to 3.

De verwantschap tussen twee aminozuursequenties of tussen twee nucleotidensequenties wordt beschreven door de parameter “identiek”. Voor de onderhavige doeleinden wordt de mate van overeenkomst tussen twee aminozuursequenties bepaald zoals in WO 2010/0142 697 met gebruik van het Needleman-Wunsch-algoritme zoals geïmplementeerd in het Needle-programma van het EMBOSS-pakket, bij voorkeur versie 3.0.0 of nieuwer. De optionele parameters die zijn gebruikt, zijn een gap open penalty van 10, een gap extension penalty van 0,5 en de EBLOSUM62 (EMBOSS-versie van BLOSUM62) substitutiematrix. De uitvoer van Needle gelabeld als “langste overeenkomst” (verkregen met gebruik van de -nobrief-optie) wordt gebruikt als het percentage overeenkomst en wordt als volgt berekend: (identieke residuen x 100)/(lengte van uitlijning - totaal aantal gaten in uitlijning).The relationship between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is described by the "identical" parameter. For the present purposes, the degree of similarity between two amino acid sequences is determined as in WO 2010/0142 697 using the Needleman-Wunsch algorithm as implemented in the Needle program of the EMBOSS package, preferably version 3.0.0 or newer . The optional parameters used are a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5 and the EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62) substitution matrix. The output of Needle labeled as "longest match" (obtained using the -nobrief option) is used as the percentage match and is calculated as follows: (identical residues x 100) / (length of alignment - total number of holes in alignment ).

In een bijzondere uitvoeringsvorm voorziet de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven erin dat genoemde fosfolipase meer dan 40% van zijn fosfolipaseactiviteit behoudt nadat hij gedurende 60 minuten bij 50 °C is geïncubeerd, bij voorkeur meer dan 50% van zijn activiteit behoudt nadat hij gedurende 60 minuten bij 50*0 is geïncubeerd.In a particular embodiment, the enhancer composition as described in this application provides that said phospholipase retains more than 40% of its phospholipase activity after being incubated at 50 ° C for 60 minutes, preferably more than 50% of its activity after it has been incubated for 60 minutes. minutes at 50 * 0.

In uitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten omvat de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven een fosfolipase met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 1, of SEQ ID NO 2, of SEQ ID NO 3 of sterk daarop lijkende varianten waarbij genoemde fosfolipase wordt gekenmerkt door het hebben van een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en heeft een optimumtemperatuur voor fosfolipase van 45 ¾ of meer.In even more preferred embodiments, the enhancer composition as described in this application comprises a phospholipase having the amino acid sequence of SEQ ID NO 1, or SEQ ID NO 2, or SEQ ID NO 3 or highly similar variants wherein said phospholipase is characterized by having of a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, with more preferably in the range between 0.01 and 10; and has an optimum phospholipase temperature of 45 ¾ or more.

In uitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten omvat de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven een fosfolipase met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 1 of sterk daarop lijkende varianten, waarbij genoemde fosfolipase wordt gekenmerkt door het hebben van een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en heeft een optimumtemperatuur voor fosfolipase van 45¾ of meer.In even more preferred embodiments, the enhancer composition as described in this application comprises a phospholipase with the amino acid sequence of SEQ ID NO 1 or highly similar variants, said phospholipase being characterized by having a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10 ; and has an optimum temperature for phospholipase of 45¾ or more.

In uitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten omvat de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven een fosfolipase met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 2 of sterk daarop lijkende varianten, waarbij genoemde fosfolipase wordt gekenmerkt door het hebben van een verhouding van fosfolipase A1 -activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en heeft een optimumtemperatuur voor fosfolipase van 45¾ of meer.In even more preferred embodiments, the enhancer composition as described in this application comprises a phospholipase with the amino acid sequence of SEQ ID NO 2 or variants very similar, said phospholipase being characterized by having a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10 ; and has an optimum temperature for phospholipase of 45¾ or more.

In uitvoeringsvormen die nog meer voorkeur genieten omvat de verbetermiddelcompositie zoals in deze aanvraag beschreven een fosfolipase met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 3 of sterk daarop lijkende varianten, waarbij genoemde fosfolipase wordt gekenmerkt door het hebben van een verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en heeft een optimumtemperatuur voor fosfolipase van 45¾ of meer.In even more preferred embodiments, the enhancer composition as described in this application comprises a phospholipase with the amino acid sequence of SEQ ID NO 3 or variants very similar, said phospholipase being characterized by having a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10 ; and has an optimum temperature for phospholipase of 45¾ or more.

De compositie van de onderhavige uitvinding kan op voordelige wijze deel uitmaken van een broodverbetermiddel of een banketbakkersmix of een premix. “Broodverbetermiddelen” (ook “deegverbetermiddelen” of “verbetermiddel” of “bloembehandelmiddel” genoemd) worden doorgaans tijdens het bakken aan het deeg toegevoegd om de textuur, het volume, de smaak en de versheid van het gebakken product te verbeteren, evenals om de verwerkbaarheid en stabiliteit van het deeg te verbeteren. Een broodverbetermiddel omvat doorgaans of bestaat doorgaans uit: één of meer enzymen (zoals amylasen (alfa-amylasen, bèta-amylasen, glucoamylasen, ruw zetmeel afbrekende amylasen), xylanasen (hemicellulasen), cellulasen, pectinasen, proteasen, pectaatlyasen, oxidasen (peroxidasen, glucoseoxidase, pyranoseoxidasen, hexoseoxidasen, L-aminozuuroxidasen, koolhydraatoxidasen, sulfhydryloxidasen), lipoxygenasen, dehydrogenasen, laccasen, transglutaminasen, acyltransferasen, eiwitdisulfide-isomerasen), één of meer oxiderende of reducerende middelen (zoals ascorbinezuur, glutathion, cysteïne), één of meer emulgatoren (zoals diacetylwijnsteenzuuresters van monoglyceriden (DATEM), natriumstearoyllactylaat (SSL), calciumstearoyllactylaat (CSL), glycerolmonostearaat (GMS), rhamnolipiden, lecithinen, sucro-esters, galzouten), één of meer lipidematerialen (zoals margarine, boter, olie, bakvet), één of meer vitaminen (zoals pantotheenzuur en vitamine E), één of meer gommen, en/of · één of meer vezelbronnen (zoals havervezel). Cakemixen (banketbakkersmixen) omvatten doorgaans alle ingrediënten van een cakerecept, met uitzondering van water, vet (olie, boter, margarine) en eieren. Cakepremixen zijn doorgaans cakemixen waarbij een deel van of alle bloem en suiker is verwijderd.The composition of the present invention can advantageously form part of a bread improver or a pastry mix or a premix. "Bread improvers" (also called "dough improvers" or "improver" or "flour treating agent") are usually added to the dough during baking to improve the texture, volume, taste and freshness of the baked product, as well as to improve processability and improve stability of the dough. A bread improver generally comprises or usually consists of: one or more enzymes (such as amylases (alpha-amylases, beta-amylases, glucoamylases, crude starch-degrading amylases), xylanases (hemicellulases), cellulases, pectinases, proteases, pectate lyases, oxidases (peroxidases) glucose oxidase, pyranose oxidases, hexose oxidases, L-amino acid oxidases, carbohydrate oxidases, sulfhydryloxidases), lipoxygenases, dehydrogenases, laccases, transglutaminases, acyltransferases, protein disulphide isomerases), one or more oxidizing or reducing agents (such as ascorbic acid, glutamine, glutamine, glutamine, glutamine, glutamine, and more) (such as diacetyl tartaric acid esters of monoglycerides (DATEM), sodium stearoyl lactylate (SSL), calcium stearoyl lactylate (CSL), glycerol monostearate (GMS), rhamnolipids, lecithins, sucroesters, bile salts), one or more lipid materials (such as margarine, butter, etc.) one or more vitamins (such as pantothenic acid and vitamin E), one or more gums, and / or · é one or more fiber sources (such as oat fiber). Cake mixes (pastry mixes) generally include all ingredients of a cake recipe, with the exception of water, fat (oil, butter, margarine) and eggs. Cake premixes are usually cake mixes in which some or all of the flour and sugar has been removed.

In bijzondere uitvoeringsvormen omvat de compositie één of meer fosfolipasen met een lage verhouding van fosfolipase A1-activiteit / fosfolipase A2-activiteit zoals hierboven beschreven; en ten minste één, bij voorkeur twee bijkomende bestanddelen gekozen uit de lijst van enzym(en), oxiderend(e) middel(en), reducerend(e) middel(en), emulgator(en), lipide(n), vitamine(n), vezel(s). De uitvinders hebben ontdekt dat het bijzonder voordelig was om in de compositie één of meer enzymen op te nemen gekozen uit de groep van amylasen (alfaamylasen, bèta-amylasen, glucoamylasen, ruw zetmeel afbrekende amylasen), xylanasen (hemicellulasen), cellulasen, pectinasen, proteasen, pectaatlyasen, oxidasen (peroxidasen, glucoseoxidase, pyranoseoxidase, hexoseoxidasen, L-aminozuuroxidasen, koolhydraatoxidasen, sulfhydryloxidasen), lipoxygenasen, dehydrogenasen, laccasen, transglutaminasen, acyltransferasen, eiwitdisulfide-isomerasen.In particular embodiments, the composition comprises one or more phospholipases with a low ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity as described above; and at least one, preferably two additional components selected from the list of enzyme (s), oxidizing agent (s), reducing agent (s), emulsifier (s), lipid (s), vitamin (s) n), fiber (s). The inventors have discovered that it was particularly advantageous to include in the composition one or more enzymes selected from the group of amylases (alpha-yylases, beta-amylases, glucoamylases, crude starch-degrading amylases), xylanases (hemicellulases), cellulases, pectinases, proteases, pectate lyases, oxidases (peroxidases, glucose oxidase, pyranose oxidase, hexose oxidases, L-amino acid oxidases, carbohydrate oxidases, sulfhydryloxidases), lipoxygenases, dehydrogenases, laccases, transglutaminases, acyltransferases, protein disulfide isomerases.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op het gebruik van een fosfolipase in bakkerijtoepassingen, waarbij genoemde fosfolipase een verhouding van fosfolipase A1-activiteit/fosfolipase A2-activiteit heeft in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en een optimumtemperatuur van fosfolipase heeft van 45 of meer.Furthermore, in another aspect, the present invention relates to the use of a phospholipase in bakery applications, wherein said phospholipase has a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and has an optimum phospholipase temperature of 45 or more.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het gebruik van de compositie zoals in deze aanvraag beschreven verschaft waarbij genoemde fosfolipase een sequentie heeft die voor ten minste 85% identiek is aan een sequentie van SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 en/of SEQ ID NO 3.In a particular embodiment, the use of the composition as described in this application is provided wherein said phospholipase has a sequence that is at least 85% identical to a sequence of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 3 .

In deze aanvraag worden ook werkwijzen beschreven voor het bereiden van gebakken producten waarbij bij de bereidingswijze een enzym met een lage verhouding var· fosfolipase A1 -activiteit/ fosfolipase A2-activiteit wordt gebruikt.This application also describes processes for the preparation of baked products in which an enzyme with a low ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity is used in the preparation method.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een gebakken product, omvattende de stappen van het toevoegen aan het deeg of beslag, voorafgaande aan het bakken, van een fosfolipase die een verhouding van fosfolipase A1-activiteit/fosfolïpase A2-activiteit heeft in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en een optimumtemperatuur van fosfolipase heeft van 45of meer.Furthermore, in another aspect, the present invention relates to a method for preparing a baked product, comprising the steps of adding to the dough or batter, prior to baking, a phospholipase that has a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity has in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0, 01 and 10; and has an optimum temperature of phospholipase of 45 or more.

In een bijzondere uitvoeringsvorm behoudt de fosfolipase meer dan 40%, bij voorkeur meer dan 50% van zijn fosfolipaseactiviteit na 60 minuten bij 50 O.In a particular embodiment, the phospholipase retains more than 40%, preferably more than 50% of its phospholipase activity after 60 minutes at 50 O.

In genoemde werkwijze wordt de lipaseactiviteit uitgedrukt in milliunits (LmU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut van p-nitrofenol vrij te maken uit p-nitrofenylpalmitaat bij 40*0 en pH 7,5, wordt de fosfolipase A1-activiteit uitgedrukt in milliunits (PA1mU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1-positie van N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine bij 40 Ό en pH 7,4 en wordt de fosfolipase A2-activiteit uitgedrukt in milliunits (PA2mU) per minuut die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die één nanomol (nmol) per minuut hydrolyseert van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-2-positie van 1-0-(6-B0DIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine bij 40°C en pH 8,9, en de fosfolipaseactiviteit wordt uitgedrukt in milliunits (PmU) die zijn gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van p-nitrofenol uit p-nitrofenylfosforylcholine per minuut bij 50*0 en pH 7,5.In said method, the lipase activity is expressed in milliunits (LmU) defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) per minute of p-nitrophenol from p-nitrophenyl palmitate at 40 * 0 and pH 7.5 , the phospholipase A1 activity is expressed in milliunits (PA1mU) defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomole (nmol) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-1 position of N - ((6- (2, 4-DNP) Amino) Hexanoyl) -1- (BODIPY® FL C5) -2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine at 40 Ό and pH 7.4 and the phospholipase A2 activity is expressed in milliunits ( PA2mU) per minute defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomol (nmol) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-2 position of 1-0- (6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl) -2- BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Phosphocholine at 40 ° C and pH 8.9, and the phospholipase activity is expressed in milliunits (PmU) are defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) per minute of p-nitrophenol from p-nitrophenylphosphorylcholine per minute at 50 * 0 and pH 7.5.

De werkwijze zoals in deze aanvraag beschreven maakt het op voordelige wijze mogelijk om de tolerantie van het beslag of het deeg te verbeteren en/of om de eigenschappen van de gebakken producten, zoals het volume of de versheid, te verbeteren.The method as described in this application advantageously makes it possible to improve the tolerance of the batter or the dough and / or to improve the properties of the baked products, such as the volume or the freshness.

De uitvinders hebben ontdekt dat het gebruik van een specifiek enzym zoals in deze aanvraag beschreven in bakkerijtoepassingen een verbeterd effect heeft op de tolerantie van deeg of beslag.The inventors have discovered that the use of a specific enzyme as described in this application in bakery applications has an improved effect on the tolerance of dough or batter.

Binnen de onderhavige context verwijst de tolerantie van deeg of beslag naar het vermogen van een deeg of beslag om zijn vorm te behouden onder stressomstandigheden, zoals een langere rijstijd of mechanische schokken tijdens of na het rijzen en om na het bakken een gebakken product te verschaffen met eigenschappen (bijv. volume) die vergelijkbaar zijn met een gebakken product dat verkregen is met een deeg of beslag dat zonder stressomstandigheden is verkregen.In the present context, the tolerance of dough or batter refers to the ability of a dough or batter to retain its shape under stress conditions, such as a longer ripening time or mechanical shocks during or after proofing, and to provide a baked product after baking with properties (e.g. volume) comparable to a baked product obtained with a dough or batter obtained without stress conditions.

Binnen de onderhavige context verwijst versheid naar een combinatie van textuurparameters zoals zachtheid, vochtigheid, samenhang, elasticiteit en veerkrachtigheid. Verlies van versheid wordt doorgaans in verband gebracht met oudbakken worden. Meer in het bijzonder komt een verbeterde versheid van een gebakken product overeen met een verbeterde zachtheid en/of een verbeterde vochtigheid en/of een verbeterde krokante beet ten opzichte van een referentie. Deze parameters kunnen op voordelige wijze worden gemeten door middel van fysische werkwijzen, zoals met een textuurmeter, of door middel van zintuiglijke analyse uitgevoerd met een panel van ervaren juryleden.Within the present context, freshness refers to a combination of texture parameters such as softness, moisture, cohesion, elasticity and resilience. Loss of freshness is usually associated with being stale. More particularly, an improved freshness of a baked product corresponds to an improved softness and / or an improved humidity and / or an improved crispy bite relative to a reference. These parameters can advantageously be measured by physical methods, such as with a texture meter, or by sensory analysis performed with a panel of experienced judges.

In deze aanvraag worden ook gebakken producten beschreven die een enzym omvatten met een lage verhouding van fosfolipase A1 -activiteit/ fosfolipase A2-activiteit.This application also describes baked products comprising an enzyme with a low ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een gebakken product bereid uit een deeg of beslag dat de compositie zoals in deze aanvraag beschreven omvat.Furthermore, in another aspect, the present invention relates to a baked product prepared from a dough or batter comprising the composition as described in this application.

Binnen de context van de onderhavige uitvinding is een gebakken product een bakkerijproduct of banketbakkersproduct dat bekend is in het vakgebied, zoals de gebakken producten gekozen uit de groep omvattende: brood, zachte broodjes, bagels, donuts, bladerdeeggebak, hamburgerbroodjes, pizza, pitabrood, ciabatta, sponscakes, roomcakes, pondcakes, muffins, cupcakes, gestoomde cakes, wafels, brownies, cakedonuts, met gist gerezen donuts, stokbroden, broodjes, crackers, biscuits, koekjes, taartkorsten, beschuit en andere gebakken producten. Met meer voorkeur heeft de onderhavige uitvinding betrekking op brood, stokbroden en broodjes.Within the context of the present invention, a baked product is a bakery product or pastry product known in the art, such as the baked products selected from the group comprising: bread, soft buns, bagels, donuts, puff pastry, hamburger buns, pizza, pita bread, ciabatta , sponge cakes, cream cakes, pound cakes, muffins, cupcakes, steamed cakes, waffles, brownies, cake donuts, yeast-raised donuts, baguettes, sandwiches, crackers, biscuits, cookies, pie crusts, rusks and other baked goods. More preferably, the present invention relates to bread, baguettes, and rolls.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebruik van composities, broodverbetermiddelen, banketbakkersmixen en/of banketbakkerspremixen om gebakken producten mee te bereiden.Another object of the present invention relates to the use of compositions, bread improvers, pastry mixes and / or pastry premixes to prepare baked products.

Voorts heeft de onderhavige uitvinding in een ander aspect betrekking op een gebakken product bereid van een deeg of beslag omvattende een fosfolipase met een verhouding van fosfolipase A1-activitei1/fosfolipase A2-activiteit in het bereik tussen 0,01 en 100, bij voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 80, met meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 50, met nog meer voorkeur in het bereik tussen 0,01 en 10; en die een optimumtemperatuur van fosfolipase heeft van 45of meer.Furthermore, in another aspect the present invention relates to a baked product prepared from a dough or batter comprising a phospholipase with a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range of range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and which has an phospholipase optimum temperature of 45 or more.

VOORBEELDENEXAMPLES

Voorbeeld 1: bepaling van de enzymatische activiteiten Lipase:Example 1: determination of enzymatic activities Lipase:

De lipaseactiviteit wordt gemeten met gebruik van p-nitrofenylpalmitaat (pNPP) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylpalmitaat door lipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén lipase milliunit (LmU) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) p-nitrofenol per minuut vrij te maken uit p-nitrofenylpalmitaat bij 40*€ en pH 7,5. Voor uitvoering van de test wordt 120 μΙ van 1 mM pNPP-oplossing (opgelost in 0,05 M Na-fosfaatbuffer bij pH 7,5 die 0,69 M aceton en 0,0049 M Triton X-100 bevat) gemengd met 60 μΐ enzymmonster en gedurende 30 minuten bij 45°C geïncubeerd. De extinctie wordt gemeten bij 414 nm tegen een substraatblanco in microtiterplaten met 96 cups.The lipase activity is measured using p-nitrophenyl palmitate (pNPP) as a substrate. The release of yellow p-nitrophenol due to the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate by lipase is measured by spectrophotometry at 414 nm. One lipase milliunit (LmU) is defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) of p-nitrophenol per minute from p-nitrophenyl palmitate at 40 € and pH 7.5. To perform the test, 120 μΙ of 1 mM pNPP solution (dissolved in 0.05 M Na phosphate buffer at pH 7.5 containing 0.69 M acetone and 0.0049 M Triton X-100) is mixed with 60 μΐ enzyme sample and incubated at 45 ° C for 30 minutes. The absorbance is measured at 414 nm against a substrate blank in microtiter plates with 96 cups.

De activiteit wordt uitgedrukt als:The activity is expressed as:

LmU/ml = (((Abs enzym - Abs blanco) / 30) x 0,18)) / (13380 x 0,06)) x monsterverdunning x 1000000 [ 30 = reactietijd in minuten; 0,18 = reactievolume in ml; 13380 = molaire extinctiecoëfficiënt bij 414 nm (M'1 cm"1); 0,06 = volume enzymmonster in ml; 1000000 om te converteren naar LmU/ml ]LmU / ml = (((Abs enzyme - Abs blank) / 30) x 0.18)) / (13380 x 0.06)) x sample dilution x 1000000 [30 = reaction time in minutes; 0.18 = reaction volume in ml; 13380 = molar extinction coefficient at 414 nm (M'1 cm "1); 0.06 = volume of enzyme sample in ml; 1000000 to convert to LmU / ml]

Fosfolipase:Phospholipase:

De fosfolipaseactiviteit wordt gemeten met gebruik van p-nitrofenylfosforylcholine (pNPPC) als substraat. Het vrijkomen van gele p-nitrofenol als gevolg van de hydrolyse van p-nitrofenylfosforylcholine door fosfolipase wordt gemeten door middel van spectrofotometrie bij 414 nm. Eén fosfolipase milliunit (PmU) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om 1 nmol p-nitrofenol per minuut vrij te maken bij 50 “Ό en pH 7,5. Voor uitvoering van de test wordt 120 μΙ van 0,02 mM pNPPC-oplossing (opgelost in 0,05 M Na-fosfaatbuffer bij pH 7,5 die 0,69 M aceton en 0,0049 M Triton X-100 bevat) gemengd met 60 μΙ enzymmonster en gedurende 30 minuten bij 50°C geïncubeerd. Na afloop wordt 720 μΙ 1 M Na2CC>3 toegevoegd om de reactie te stoppen. De extinctie wordt gemeten bij 414 nm tegen een substraatblanco in microtiterplaatjes met 96 cup.The phospholipase activity is measured using p-nitrophenyl phosphorylcholine (pNPPC) as a substrate. The release of yellow p-nitrophenol as a result of the hydrolysis of p-nitrophenyl phosphorylcholine by phospholipase is measured by spectrophotometry at 414 nm. One phospholipase milliunit (PmU) is defined as the amount of enzyme required to release 1 nmol of p-nitrophenol per minute at 50 Ό and pH 7.5. To perform the test, 120 μΙ of 0.02 mM pNPPC solution (dissolved in 0.05 M Na phosphate buffer at pH 7.5 containing 0.69 M acetone and 0.0049 M Triton X-100) is mixed with 60 μΙ enzyme sample and incubated at 50 ° C for 30 minutes. Afterwards 720 μ M 1 M Na2CC> 3 is added to stop the reaction. The absorbance is measured at 414 nm against a substrate blank in 96 cup microtiter plates.

De activiteit wordt uitgedrukt als:The activity is expressed as:

PmU /ml «= (((Abs enzym - Abs blanco) / 30) x 0,9)) / (13380 x 0,06)) x monsterverdunning x 1000000 [ 30 - reactietijd in minuten; 0,9 = reactievolume in ml; 13380 = molaire extinctiecoëfficiënt bij 414 nm (M"1 cm'1); 0,06 = volume enzymmonster in ml; 1000000 om te converteren naar PmU/ml ]PmU / ml (= (((Abs enzyme - Abs blank) / 30) x 0.9)) / (13380 x 0.06)) x sample dilution x 1000000 [30 - reaction time in minutes; 0.9 = reaction volume in ml; 13380 = molar extinction coefficient at 414 nm (M "1 cm -1); 0.06 = volume of enzyme sample in ml; 1000000 to convert to PmU / ml]

Fosfolipase A1 :Phospholipase A1:

De fosfolipase A1-activiteit (PLA1) wordt gemeten met gebruik van een lipidenmengsel van 16.5 μΜ dioIeoylfosfatidylcholine, 16,5 μΜ dioleoylfosfatidylglycerol en 3,3 μΜ met kleurstof gelabelde N-((6-(2,4-DNP)Amino)Hexanoyl)-1-(BODIPY® FL C5)-2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Fosfo-ethanolamine (PED-A1) als substraat (verkregen uit de EnzChek Fosfolipase A1-analysekit - ThermoFisher Scientific). De PED-A1 is specifiek voor PLA1 en is een met kleurstof gelabelde glycerofosfo-ethanolamine met een met BODIPY® FL-kleurstof gelabelde acylketen op de sn-1-positie en een met dinitrofenylquencher gemodificeerde hoofdgroep. Eén fosfolipase A1 milliunit (PA1 mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur gesubstitueerd op de sn-1-positie van PED-A1 bij 40^ en pH 7,4. De test wordt uitgevoerd in microtiterplaten met 96 cups met gebruik van een totaal volume van 100 μΙ per cup. Er werden verschillende lipidenoplossingen bereid in reactiebuffer die 250 mM Tris-HCI, 0,7 M NaCI en10 mM CaCI2 bij pH 7,4 bevatte. Monsters en controles worden gemengd met de lipidenmix in een verhouding van 1:1 (50 μΙ monster/controle en 50 μΙ lipidenmix). De enzymatische reactie wordt uitgevoerd bij 40*0 gedurende 30 minuten. Er wordt een ijkkromme geconstrueerd met gebruik van verschillende concentraties fosfolipase A1 die in de kit zijn verschaft (Lecitase ultra). De fluorescentiemeting wordt uitgevoerd met excitatie bij 480 nm en met emissie bij 515 nm.The phospholipase A1 activity (PLA1) is measured using a lipid mixture of 16.5 μΜ dioIeoylphosphatidylcholine, 16.5 μΜ dioleoylphosphatidylglycerol and 3.3 μΜ dye-labeled N - ((6- (2,4-DNP) Amino) Hexanoyl) -1- (BODIPY® FL C5) -2-Hexyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (PED-A1) as substrate (obtained from the EnzChek Phospholipase A1 analysis kit - ThermoFisher Scientific). The PED-A1 is specific for PLA1 and is a dye-labeled glycerophosphoethanolamine with an acyl chain labeled with BODIPY® FL dye at the sn-1 position and a main group modified with dinitrophenyl quencher. One phospholipase A1 milliunit (PA1 mU) is defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) per minute from fluorescent fatty acid substituted at the sn-1 position of PED-A1 at 40 and pH 7, 4. The test is performed in microtiter plates with 96 cups using a total volume of 100 μΙ per cup. Various lipid solutions were prepared in reaction buffer containing 250 mM Tris-HCl, 0.7 M NaCl and 10 mM CaCl 2 at pH 7.4. Samples and controls are mixed with the lipid mix in a ratio of 1: 1 (50 μΙ sample / control and 50 μΙ lipid mix). The enzymatic reaction is carried out at 40 ° C for 30 minutes. A calibration curve is constructed using different concentrations of phospholipase A1 provided in the kit (Lecitase ultra). The fluorescence measurement is performed with excitation at 480 nm and with emission at 515 nm.

De activiteit wordt uitgedrukt als: PAImll /ml = (((fluorescentie-intensiteit enzym - fluorescentie-intensiteit blanco) -interceptwaarde) / hellingwaarde van ijkkromme) x monsterverdunning x 1000 [1000 om te converteren naar PA1 mU/ml]The activity is expressed as: PAImll / ml = (((fluorescence-intensity enzyme - fluorescence-intensity blank) -intercept value) / slope value of calibration curve) x sample dilution x 1000 [1000 to convert to PA1 mU / ml]

Fosfolipase A2:Phospholipase A2:

De fosfolipase A2-activiteit (PLA2) wordt gemeten met gebruik van een lipidenmengsel van 16.5 μΜ dioleoylfosfatidylcholine, 16,5 μΜ dioleoylfosfatidylglycerol en 1,7 μΜ met kleurstof gelabelde 1-0-(6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl)-2-BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Fosfocholine (Rood/Groen BODIPY® PC-A2) als substraat (verkregen uit de EnzChek Fosfolipase A2-analysekit - ThermoFisher Scientific). Het Rood/Groen BODIPY® PC-A2-substraat is selectief voor PLA2 en verschaft de mogelijkheid om gevoelig,continu, snel en in real-time PLA2-enzymactiviteiten op te volgen. Eén fosfolipase A2 milliunit (PA2mU) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om één nanomol (nmol) per minuut vrij te maken van fluorescerend vetzuur dat is gesubstitueerd op de sn-2-positie van Rood/Groen BODIPY® PC-A2 bij 40*0 en pH 8,9. De test wordt uitgevoerd in microtiterplaten met 96 cups met gebruik van een totaal volume van 100 μΙ per cup. Er werden verschillende lipidenoplossingen bereid in reactiebuffer die 250 mM Tris-HCI, 500 M NaCI en 5 mM CaClï bij pH 8,9 bevatte. Monsters en controles worden gemengd met lipidenmix in een verhouding van 1:1 (50 μΙ monster/controle en 50 μΙ lipidenmix). De enzymatische reactie wordt uitgevoerd bij 40°C gedurende 10 minuten. Er wordt een ijkkromme geconstrueerd met gebruik van verschillende concentraties fosfolipase A2 uit gif van de honingbij, verschaft in de kit. De fluorescentiemeting wordt uitgevoerd met excitatie bij 480 nm en met emissie bij 515 nm.The phospholipase A2 activity (PLA2) is measured using a lipid mixture of 16.5 μΜ dioleoylphosphatidylcholine, 16.5 μΜ dioleoylphosphatidylglycerol and 1.7 μΜ dye-labeled 1-0- (6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl) -2 -BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-Phosphocholine (Red / Green BODIPY® PC-A2) as substrate (obtained from the EnzChek Phospholipase A2 analysis kit - ThermoFisher Scientific). The Red / Green BODIPY® PC-A2 substrate is selective for PLA2 and provides the ability to monitor PLA2 enzyme activities in a sensitive, continuous, fast and real-time manner. One phospholipase A2 milliunit (PA2mU) is defined as the amount of enzyme required to release one nanomol (nmol) per minute from fluorescent fatty acid substituted at the sn-2 position of Red / Green BODIPY® PC-A2 at 40 * 0 and pH 8.9. The test is performed in microtiter plates with 96 cups using a total volume of 100 μΙ per cup. Various lipid solutions were prepared in reaction buffer containing 250 mM Tris-HCl, 500 M NaCl and 5 mM CaCl 2 at pH 8.9. Samples and controls are mixed with lipid mix in a 1: 1 ratio (50 μ / sample / control and 50 μΙ lipid mix). The enzymatic reaction is carried out at 40 ° C for 10 minutes. A calibration curve is constructed using different concentrations of phospholipase A2 from honey bee poison provided in the kit. The fluorescence measurement is performed with excitation at 480 nm and with emission at 515 nm.

De activiteit wordt uitgedrukt als: PA2mU /ml = (((fluorescentie-intensiteit enzym - fluorescentie-intensiteit blanco) -interceptwaarde) / hellingwaarde van ijkkromme) x monsterverdunning x 1000 [1000 = PA2mU/ml]The activity is expressed as: PA2mU / ml = (((fluorescence-intensity enzyme - fluorescence-intensity blank) -intercept value) / slope value of calibration curve) x sample dilution x 1000 [1000 = PA2mU / ml]

Voorbeeld 2: enzymenExample 2: enzymes

De volgende enzymen werden in de onderstaande voorbeelden gebruikt.The following enzymes were used in the examples below.

Lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Chaetomium thermophilum (PH2) met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 1. - Lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus ruber (PH3) met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 2. - Lipolytisch enzym met fosfolipaseactiviteit van Meiothermus silvanus (PH4) met de aminozuursequentie van SEQ ID NO 3. - Lipopan® F (lipase van Fusarium oxysporum; Novozymes) (LIF) - Lipopan® Max (lipase van Thermomyces lanuginosus; Novozymes) (LIM) ' - Cakezyme® SMART (lipase van de alvleesklier van een varken; DSM) (CAK)Lipolytic enzyme with phospholipase activity from Chaetomium thermophilum (PH2) with the amino acid sequence of SEQ ID NO 1. - Lipolytic enzyme with phospholipase activity from Meiothermus ruber (PH3) with the amino acid sequence of SEQ ID NO 2. - Lipolytic enzyme with phospholipase activity from Meiothermus silvanus (PH4) with the amino acid sequence of SEQ ID NO 3. - Lipopan® F (lipase from Fusarium oxysporum; Novozymes) (LIF) - Lipopan® Max (lipase from Thermomyces lanuginosus; Novozymes) (LIM) '- Cakezyme® SMART (pancreatic lipase from a pig; DSM) (CAK)

De PH2-, PH3- en PH4-enzymen zijn verkregen via klonering en het tot expressie brengen van de corresponderende genen, zoals hierna beschreven. De overige enzymen werden verkregen via de respectievelijke leveranciers.The PH2, PH3, and PH4 enzymes have been obtained via cloning and expressing the corresponding genes, as described below. The remaining enzymes were obtained through the respective suppliers.

Kloneren van de PH2-. PH3- en PH4-oenenCloning the PH2. PH3 and PH4 onions

Gebaseerd op de geïdentificeerde sequenties van vermoedelijke genen van lipolytische enzymen zijn de DNA-sequenties die coderen voor de enzymen gesynthetiseerd om tot expressie te worden gebracht in de pET22b-plasmide met gebruik van de pelB-leadersequentie en volgens standaardprotocollen.Based on the identified sequences of putative genes from lipolytic enzymes, the DNA sequences encoding the enzymes have been synthesized to be expressed in the pET22b plasmid using the pelB leader sequence and according to standard protocols.

De DNA-sequenties die corresponderen met PH2, PH3 en PH4 worden getoond in figuur 1 en zijn respectievelijk SEQID NO 4, SEQ ID NO 5 en SEQ ID NO 6 (zie tabel A).The DNA sequences corresponding to PH2, PH3 and PH4 are shown in Figure 1 and are SEQID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6, respectively (see Table A).

De volledig gesynthetiseerde DNA-fragmenten werden gesubkloneerd in een plasmide afgeleid van pl)C19. Deze plasmiden werden gebruikt om ultracompetente E. coli DH5a®-cellen te transformeren. Gezuiverde plasmidepreparaten gemaakt met het Pure Yield Midiprep System (Promega) werden geknipt met gebruik van geschikte restrictie-enzymen om het DNA-fragment dat de voor lipolytische enzymen coderende sequenties bevat te isoleren. Deze fragmenten werden gesubkloneerd in de pET 22b(+) kloneervector (Novagen) en de resulterende recombinante plasmiden werden getransformeerd in E. coli BL21 (DE3)-cellen (Agilent Technologies). Van de gezuiverde plasmidepreparaten gemaakt met het Pure Yield Midiprep System (Promega) werd de sequentie bepaald met gebruik van een ABI3700 DNA-sequencer (Applied Biosystems). Het bepalen van de sequentie van de geïnserteerde fragmenten werd uitgevoerd met gebruik van de universele primers T7-promotor en T7-terminator, evenals primers die corresponderen met interne DNA-sequenties. De verkregen sequenties waren identiek aan de verwachte sequenties.The fully synthesized DNA fragments were subcloned into a plasmid derived from p1) C19. These plasmids were used to transform ultra-competent E. coli DH5a® cells. Purified plasmid preparations made with the Pure Yield Midiprep System (Promega) were cut using appropriate restriction enzymes to isolate the DNA fragment containing the lipolytic enzyme encoding sequences. These fragments were subcloned into the pET 22b (+) cloning vector (Novagen) and the resulting recombinant plasmids were transformed into E. coli BL21 (DE3) cells (Agilent Technologies). The purified plasmid preparations made with the Pure Yield Midiprep System (Promega) were sequenced using an ABI3700 DNA sequencer (Applied Biosystems). Sequencing of the inserted fragments was performed using the universal primers T7 promoter and T7 terminator, as well as primers corresponding to internal DNA sequences. The sequences obtained were identical to the expected sequences.

Culturen van de recombinante stammen en productie van PH2. PH3 en PH4 15 ml van een precultuur van 5 uur (37 O) van de E. coli BL21 (DE3)-cellen die de lipolytische enzymgenen dragen, werd gedurende 1 minuut bij 10000 g gecentrifugeerd en de pellet werd geresuspendeerd in 500 ml Terrifie broth (12 g/l Bacto trypton (Difco), 24 g/l gistextract (Difco), 4 ml/l glycerol, 12,54 g/l K2HP04, 2,31 g/l KH2P04) dat 200 pg/ml ampicilline bevatte in een schudkolf van 2 liter. De culturen werden geïncubeerd bij 37°0 en 250 rpm tot een extinctie tussen 3 en 4 bij 550 nm bekomen werd, op welk moment de expressie van het enzym werd geïnduceerd met 1mM isopropyl-1-thio-ß-galactopyranoside.Cultures of the recombinant strains and production of PH2. PH3 and PH4 15 ml of a 5 hour preculture (37 O) of the E. coli BL21 (DE3) cells carrying the lipolytic enzyme genes was centrifuged for 1 minute at 10000 g and the pellet was resuspended in 500 ml of Terrifie broth (12 g / l Bacto trypton (Difco), 24 g / l yeast extract (Difco), 4 ml / l glycerol, 12.54 g / l K2 HPO4, 2.31 g / l KH2 PO4) containing 200 pg / ml ampicillin in a 2 liter shake flask. The cultures were incubated at 37 ° 0 and 250 rpm until an extinction between 3 and 4 at 550 nm was achieved, at which time the expression of the enzyme was induced with 1mM isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside.

Terugwinnen van PH2. PH3 en PH4Recovering PH2. PH3 and PH4

Na 15 uur incubatie bij 37°C werden de cellen geoogst door middel van centrifugatie bij 13000 g gedurende 30 minuten bij 4°C, geresuspendeerd in 50 mM BICINE dat 10 mM NaCI bevatte, gelyseerd in een voorgekoelde celdisruptie-inrichting (Panda 2K, Niro Soavi, GEA Process Engineering Division) bij 1500 bar en gedurende 30 minuten bij 40000 g gecentrifugeerd. Chromosomaal DNA werd uit de ruwe cellysaten verwijderd door behandeling met 0,2% protaminesulfaat (Calbiochem) en centrifugatie gedurende 30 minuten bij 40000 g. Vervolgens werden 25 units benzonase (Merck, Darmstadt, Duitsland) aan de oplossing toegevoegd.After 15 hours of incubation at 37 ° C, the cells were harvested by centrifugation at 13000 g for 30 minutes at 4 ° C, resuspended in 50 mM BICINE containing 10 mM NaCl, lysed in a precooled cell disruption device (Panda 2K, Niro Soavi, GEA Process Engineering Division) at 1500 bar and centrifuged at 40,000 g for 30 minutes. Chromosomal DNA was removed from the crude cell lysates by treatment with 0.2% protamine sulfate (Calbiochem) and centrifugation at 40,000 g for 30 minutes. Then 25 units of benzonase (Merck, Darmstadt, Germany) were added to the solution.

Na een dergelijke behandeling worden de lipolytische enzympreparaten gezuiverd door een filtratie op een Millipore POD-systeem met een cut-off bereik van 0,05 tot 1 pm, vervolgens geconcentreerd door middel van ultrafiltratie op een cross-flow filtratiesysteem (Satocon-Sartorius) met een cut-off van 5 kDa. De geconcentreerde enzymoplossingen werden gefiltreerd op een steriel filtratiesysteem, met inbegrip van een eindfiltratie van 0,8 en 0,22 pm (absoluut filter).After such treatment, the lipolytic enzyme preparations are purified by filtration on a Millipore POD system with a cut-off range of 0.05 to 1 µm, then concentrated by ultrafiltration on a cross-flow filtration system (Satocon-Sartorius) with a cut-off of 5 kDa. The concentrated enzyme solutions were filtered on a sterile filtration system, including a final filtration of 0.8 and 0.22 µm (absolute filter).

De lipase- en fosfolipaseactiviteiten van de enzymen zijn bepaald met gebruik van de protocollen van voorbeeld 1. De resultaten worden in tabel 1 getoond.The lipase and phospholipase activities of the enzymes were determined using the protocols of Example 1. The results are shown in Table 1.

Tabel 1Table 1

De activiteiten van de enzymen als functie van de temperatuur zijn bepaald met gebruik van de fosfolipase analysemethode van voorbeeld 1, met uitzondering van de temperatuur van de test. De resultaten worden weergegeven in tabel 2.The activities of the enzymes as a function of the temperature were determined using the phospholipase analysis method of Example 1, with the exception of the temperature of the test. The results are shown in Table 2.

Tabsl 2Tabsl 2

De stabiliteit van de enzymen is bepaald door een monster van het enzym voor te incuberen bij 50¾ gedurende 30, 60 en 240 minuten voorafgaande aan het uitvoeren van de fosfolipase analysemethode zoals in voorbeeld 1. De resultaten worden weergegeven in tabel 3.The stability of the enzymes was determined by pre-incubating a sample of the enzyme at 50¾ for 30, 60 and 240 minutes prior to performing the phospholipase analysis method as in Example 1. The results are shown in Table 3.

Tabel 3Table 3

Voorbeeld 3: SponscakesExample 3: Sponge cakes

Er werden sponscakes gemaakt met gebruik van een gebruikelijk recept voor cakebeslag: 23,4% eieren, 25,2% bloem, 7,5% zetmeel, 2,1% plantaardig vet, 22,3% suiker (monosacchariden, disacchariden, polyolen), 1,9% magere-melkpoeder, 1,1% bakpoeder (natriumbicarbonaat en SAPP (zuurnatriumpyrofosfaat) of natriumaluminiumpyrofosfaat), 3,2% cakegel (emulgatoren) en water tot 100%.Sponge cakes were made using a conventional cake batter recipe: 23.4% eggs, 25.2% flour, 7.5% starch, 2.1% vegetable fat, 22.3% sugar (monosaccharides, disaccharides, polyols) , 1.9% skimmed milk powder, 1.1% baking powder (sodium bicarbonate and SAPP (acid sodium pyrophosphate) or sodium aluminum pyrophosphate), 3.2% cake cone (emulsifiers) and water up to 100%.

Aan de droge ingrediënten werden eerst enzymen toegevoegd. Vervolgens werden de vloeibare ingrediënten (eieren, water, glycerol,...) aan de mix toegevoegd. Alle ingrediënten werden gedurende 5 minuten bij hoge snelheid met elkaar gemengd in een Hobart-mixer. Het beslag werd geklopt tot een beslagdichtheid van ongeveer 300 tot 600 gram per liter. Er werden per test vier sponscakebeslagen van 900 g bereid en gedurende 30 minuten bij een temperatuur van 180*€ gebakken. Na afloop werden de sponscakes afgekoeld bij kamertemperatuur en verpakt in een plastic zak.Enzymes were first added to the dry ingredients. The liquid ingredients (eggs, water, glycerol, ...) were then added to the mix. All ingredients were mixed together at high speed for 5 minutes in a Hobart mixer. The batter was whipped to a batter density of approximately 300 to 600 grams per liter. Four sponge cake batteres of 900 g were prepared per test and baked for 30 minutes at a temperature of € 180. Afterwards, the sponge cakes were cooled at room temperature and packed in a plastic bag.

Het volume van de cakes werd geëvalueerd met gebruik van de raapzaadvervangingsmethode. De hoogte van de cakes werd geëvalueerd met gebruik van een schuifmaat.The volume of the cakes was evaluated using the rapeseed replacement method. The height of the cakes was evaluated using a caliper.

Textuur eigenschappen (hardheid, samenhang en veerkracht) van de cakes werden gemeten op 1, 14 en/of 21 dagen na het bakken door middel van textuurprofielanalyse (TPA) met gebruik van een TAXTplus-inrichting (Stable Micro Systems).Texture properties (hardness, cohesion and resilience) of the cakes were measured at 1, 14 and / or 21 days after baking by texture profile analysis (TPA) using a TAXTplus device (Stable Micro Systems).

Twee opeenvolgende vervormingen van een cilindrisch kruimmonster (<|>=45mm) uitgevoerd met een cilindrische sonde (<|>=100mm) met een maximale vervorming van 50% van de beginhoogte van het product worden uitgevoerd bij een vervormingssnelheid van 2 mm/s en een wachttijd tussen opeenvolgende vervormingen van 3 s. Kracht wordt vastgelegd als een functie van de tijd.Two consecutive deformations of a cylindrical crumb sample (<|> = 45 mm) performed with a cylindrical probe (<|> = 100 mm) with a maximum deformation of 50% of the initial height of the product are carried out at a deformation speed of 2 mm / s and a waiting time between successive deformations of 3 s. Force is recorded as a function of time.

Hardheid wordt gemeten als de kracht van de sonde op de kruim die nodig is om de eerste vervorming te maken (hoogte van de eerste piek).Hardness is measured as the force of the probe on the crumb required to make the first deformation (height of the first peak).

Samenhang wordt berekend als de verhouding (uitgedrukt in procenten) tussen het oppervlak onder de tweede vervormingskromme (neerwaarts en opwaarts) en het oppervlak onder de eerste vervormingskromme (neerwaarts en opwaarts).Consistency is calculated as the ratio (expressed as a percentage) between the area under the second distortion curve (down and up) and the area under the first distortion curve (down and up).

Tabel 4Table 4

* Dosering aanbevolen door de leverancier van het enzym* Dosage recommended by the enzyme supplier

De resultaten laten zien dat het gebruik van enzymen volgens de uitvinding de zachtheid verbetert zonder nadelig effect op het volume en de hoogte van de cakes.The results show that the use of enzymes according to the invention improves the softness without adverse effect on the volume and height of the cakes.

Caketextuurparameters werden verder geëvalueerd door het uitvoeren van een zintuiglijke analyse met gebruik van een panel van cakedeskundigen. De cakedeskundigen zijn consumenten van cake die zijn getraind om de verschillende textuureigenschappen van cake te beschrijven en er een score aan toe te kennen die de versheid, zachtheid, natheid en samenhang van cake beschrijven, alles individueel en onafhankelijk van elkaar. De cakedeskundigen gebruiken een scorekaart met een schaal met scores tussen 1 en 9 voor elke parameter. Voor de zachtheid geeft een score van 1 een extreem harde cake aan, moeilijk af te happen, en geeft een score van 9 een extreem zachte cake aan, waarbij veel minder kracht nodig is om de cakekruim af te happen. Voor natheid geeft een score van 1 een extreem droge cakekruim aan en geeft een score van 9 een extreem natte cake aan. Voor samenhang geeft een score van 1 een zeer kruimelige cake aan en geeft een score van 9 een zeer samenhangende cake aan die in één stuk blijft. Zintuiglijke analyses worden gekalibreerd en een waardeverschil van 0,5 wordt als significant beschouwd.Cake texture parameters were further evaluated by performing a sensory analysis using a panel of cake experts. Cake experts are cake consumers who have been trained to describe the different texture properties of cake and give it a score that describes the freshness, softness, wetness and consistency of cake, all individually and independently of each other. The cake experts use a score card with a scale with scores between 1 and 9 for each parameter. For softness, a score of 1 indicates an extremely hard cake, difficult to intercept, and a score of 9 indicates an extremely soft cake, which requires much less force to intercept the cake crumb. For wetness, a score of 1 indicates an extremely dry cake crumb and a score of 9 indicates an extremely wet cake. For consistency, a score of 1 indicates a very crumbly cake and a score of 9 indicates a very cohesive cake that remains in one piece. Sensory analyzes are calibrated and a value difference of 0.5 is considered significant.

De resultaten van de zintuiglijke evaluatie worden weergegeven in tabel 5.The results of the sensory evaluation are shown in Table 5.

Tabel 5Table 5

De resultaten laten zien dat het gebruik van een enzym volgens de uitvinding cakes met verbeterde textuurparameters oplevert.The results show that the use of an enzyme according to the invention yields cakes with improved texture parameters.

Voorbeeld 4: krokante broodjesExample 4: crispy sandwiches

Effect van lipolytische enzymen met fosfolipase activiteit op het maken van krokante broodjes Krokante broodjes werden bereid met gebruik van de deegcomposities van tabel 6.Effect of lipolytic enzymes with phospholipase activity on making crispy rolls Crispy rolls were prepared using the dough compositions of Table 6.

Tabel 6Table 6

De ingrediënten werden gedurende 2 min bij lage snelheid en 5 min bij hoge snelheid gemengd in een Eberhardt N24 mixer. De uiteindelijke deegtemperatuur en de rust- en rijstemperaturen waren 25*C. Na het rusten gedurende 15 minuten bij 25°C werd het deeg opnieuw met de hand bewerkt en liet men het nogmaals 10 min rusten. Daarna werden stukken deeg van 2 kg gemaakt en liet men deze 10 min rijzen. De stukken deeg van 2 kg werden verdeeld en gemaakt met gebruik van de Rotamat. Er werden ronde stukken deeg van 50 gram verkregen. Na nog eens 5 minuten rusttijd werden de deegstukken gesneden door te drukken en onderworpen aan een laatste rijsfase bij 35*0 gedurende 120 min of gedurende 120 min na een schoktest. De schoktest werd als volgt op het gerezen deeg toegepast: na de tweede rijsfase en voor het bakken liet men de plaat die de degén bevatte vallen vanaf een hoogte van 10 cm. De deegstukken werden gebakken bij 230*0 in een MIWE Roll-ln oven met stoom (Michael Wenz-Arnstein-Germany). Het volume van 6 broodjes werd gemeten met gebruik van de algemeen gebruikte raapzaadvervangingsmethode. De resultaten worden weergegeven in tabel 7.The ingredients were mixed in an Eberhardt N24 mixer for 2 minutes at low speed and 5 minutes at high speed. The final dough temperature and the resting and driving temperatures were 25 ° C. After resting for 15 minutes at 25 ° C, the dough was again manually processed and allowed to rest for another 10 minutes. Pieces of dough of 2 kg were then made and left to rise for 10 minutes. The 2 kg pieces of dough were divided and made using the Rotamat. Round pieces of dough of 50 grams were obtained. After a further 5 minutes of rest, the dough pieces were cut by pressing and subjected to a final proofing phase at 35 ° C for 120 minutes or for 120 minutes after a shock test. The shock test was applied to the proofed dough as follows: after the second proofing phase and before baking, the plate containing the doughs was dropped from a height of 10 cm. The dough pieces were baked at 230 ° C in a MIWE Roll-in oven with steam (Michael Wenz-Arnstein-Germany). The volume of 6 rolls was measured using the commonly used rapeseed replacement method. The results are shown in Table 7.

Tabel 7Table 7

De resultaten laten zien dat het gebruik van een volgens de uitvinding een betere deegtolerantie oplevert ten opzichte van de referentie en ten opzichte van een in de handel verkrijgbaar enzym.The results show that the use of a according to the invention yields a better dough tolerance with respect to the reference and to a commercially available enzyme.

SEQUENCE LISTING <110> PURATOS NV <120> IMPROVED BAKERY PRODUCTS <130> PURA-519-BEprio <160> 6 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 333SEQUENCE LISTING <110> PURATOS NV <120> IMPROVED BAKERY PRODUCTS <130> PURA-519-BEprio <160> 6 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 333

<212> PRT <213> Chaetomium thermophilum <400> 1<212> PRT <213> Chaetomium thermophilum <400> 1

Met Lys Gly Phe Leu Leu Ala Ser Leu Ala Ala Leu Ala val Ala Ala 15 10 15With Lys Gly Phe Leu Ala Alau Leu Ala Alau Leu Ala val Ala Ala 15 10 15

Pro Ser Ser Lys Lys Gin Arg Ala Ala Pro Val Thr Ala Gin Gin Leu 20 25 30Pro Ser Ser Lys Lys Gin Arg Ala Ala Pro Val Thr Ala Gin Gin Leu 20 25 30

Asn Asn Phe Lys Leu Tyr Met Gin Trp Ser Ser Ala ser His Cys Ala 35 40 45Asn Asn Phe Lys Leu Tyr With Gin Trp Ser Ser Ala ser His Cys Ala 35 40 45

Asn Glu Ala Pro île Gly Ser Val Val Thr Cys Thr Asp Asn Gin Cys 50 55 60Asn Glu Ala Pro Gly Ser Val Val Thr Cys Thr Asp Asn Gin Cys 50 55 60

Ser Met Phe Gin ser His Asn Ala Thr Val Ala Ala Thr Phe Ile Gly 65 70 75 80Ser Met Phe Gin ser His Asn Ala Thr Val Ala Ala Thr Phe Ile Gly 65 70 75 80

Ser île Leu Asp Met Arg Gly Phe Leu Gly île Asp Asp Val Asp Lys 85 90 95Ser île Leu Asp With Arg Gly Phe Leu Gly ile Asp Asp Val Asp Lys 85 90 95

Asn Ile val Leu Ser phe Arg Gly Ser Thr Ser Trp Arg Asn Trp Ile 100 105 110Asn Ile val Leu Ser phe Arg Gly Ser Thr Ser Trp Arg Asn Trp Ile 100 105 110

Ala Asp Ala île Phe val Gin Thr Pro Cys Asp Leu Thr Pro Gly Cys 115 120 125Ala Asp Ala Phe val Gin Thr Pro Cys Asp Leu Thr Pro Gly Cys 115 120 125

Leu val His Ala Gly Phe Tyr Ala ser Trp Leu Glu Ile Lys Asn ser 130 135 140 val Ile Asp Ala val Lys Ala Ala Lys Ala Ala His Pro Asn Tyr Lvs 145 150 155 160Leu fall His Ala Gly Phe Tyr Ala ser Trp Leu Glu Ile Lys Asn ser 130 135 140 fall Ile Asp Ala fall Lys Ala Ala Lys Ala Ala His Pro Asn Tyr Lvs 145 150 155 160

Leu val Thr Thr Gly His ser Leu Gly Ala Ala val Ala Thr Leu Ala 165 170 175Leu val Thr Thr Gly His ser Leu Gly Ala Ala val Ala Thr Leu Ala 165 170 175

Ala Ala Thr Leu Arg Lys Ala Gly Ile Pro Ile Glu Leu Tyr Thr Tvr 180 185 190 yAla Ala Thr Leu Arg Lys Ala Gly Ile Pro Ile Glu Leu Tyr Thr Tvr 180 185 190 y

Gly Ser Pro Arg val Gly Asn Lys Ala Phe Ala Glu Phe val Thr Asn 195 200 205Gly Ser Pro Arg trap Gly Asn Lys Ala Phe Ala Glu Phe trap Thr Asn 195 200 205

Gin Ala Gly Gly Glu Tyr Arg Leu Thr His Ser Ala Asp Pro Ile Pro 210 215 220Gin Ala Gly Gly Glu Tyr Arg Leu Thr His Ser Ala Asp Pro Ile Pro 210 215 220

Arg Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Tyr Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr 225 250 235 240Arg Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Tyr Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr 225 250 235 240

Trp Phe Asp Glu Gly Glu Asp Gly Val Val Thr Val Asp Glu Phe Gin 245 250 255 île Cys Glu Gly Tyr Ala Asn val Asn cys Asn Ala Ala Thr Ser Gly 260 265 270Trp Phe Asp Glu Gly Glu Asp Gly Fall Fall Thr Fall Asp Glu Phe Gin 245 250 255 île Cys Glu Gly Tyr Ala Asn fall Asn cys Asn Ala Ala Thr Ser Gly 260 265 270

Phe Asn Met Asp Leu His Gly Trp Tyr Phe Gin Asn His Gin Gly Cys 275 280 285Phe Asn With Asp Leu His Gly Trp Tyr Phe Gin Asn His Gin Gly Cys 275 280 285

Ser Leu Gly Tyr Thr Pro Trp Arg Ala Val Lys Glu Arg Glu Leu Ser 290 295 300Ser Leu Gly Tyr Thr Pro Trp Arg Ala Val Lys Glu Arg Glu Leu Ser 290 295 300

Asp Pro Glu Leu Glu Ala Leu val Asn Arg Phe Ala Glu Met Asp Lys 305 310 315 320Asp Pro Glu Leu Glu Ala Leu val Asn Arg Phe Ala Glu With Asp Lys 305 310 315 320

Ala Tyr Val Glu Asn Leu Asn Leu Glu Gly Leu Glu Pro 325 330 <210> 2 <211> 191Ala Tyr Val Glu Asn Leu Asn Leu Glu Gly Leu Glu Pro 325 330 <210> 2 <211> 191

<212> PRT <213> Meiothermus ruber <400> 2<212> PRT <213> Meiothermus ruber <400> 2

Met Gly Lys Pro Met Arg Phe Ala val Gly Ile Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15With Gly Lys Pro With Arg Phe Ala val Gly Ile Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15

Ala Ala Cys Ser Gin Pro Ala Thr Glu Ser Thr Ser Ala Ser île Val 20 25 30Ala Ala Cys Ser Gin Pro Ala Thr Glu Ser Thr Ser Ala Serial Val 20 25 30

Glu Asp Met Arg Gin Leu Gly Val Glu Pro Glu Ala Ile Ala Ala Tyr 35 40 45Glu Asp With Arg Gin Leu Gly Val Glu Pro Glu Ala Ile Ala Ala Tyr 35 40 45

Thr Glu Ala Leu Gin Asn Leu Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Gin Ser 50 55 60Thr Glu Ala Leu Gin Asn Leu Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Gin Ser 50 55 60

Leu Gly Ala Gly Asp Leu Leu Leu val Gin Ser Ile Ala Leu Gly Ser 65 70 75 80Leu Gly Ala Gly Asp Leu Leu Leu val Gin Ser Ile Ala Leu Gly Ser 65 70 75 80

Val Ala Asn Tyr Asp Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Ala Ser Tyr Pro Gin 85 90 95Val Ala Asn Tyr Asp Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Ala Ser Tyr Pro Gin 85 90 95

Phe Asp Trp Ser Arg Asn Gly Cys Ser Ala Pro Glu Gly Leu Gly Leu 100 105 110Phe Asp Trp Ser Arg Asn Gly Cys Ser Ala Pro Glu Gly Leu Gly Leu 100 105 110

Gl y Tyr Arg Glu Thr Phe Arg Pro Ala Cys Asn Val His Asp Phe Gly 115 120 125Gl y Tyr Arg Glu Thr Phe Arg Pro Ala Cys Asn Val His Asp Phe Gly 115 120 125

Tyr Ala Asn Phe Pro Arg Phe Pro Ser Leu Tyr Asn Glu Thr Gly Arg 130 135 140Tyr Ala Asn Phe Pro Arg Phe Pro Ser Leu Tyr Asn Glu Thr Gly Arg 130 135 140

Lys Leu Ser Asp Asp Asn phe Leu Val Asn Met Asn Gin Ile Cys Arg 145 150 155 160 pro Arg Ser phe Leu Ser Arg Ser Ala Cys Tyr Ser Ala Ala Tyr Ala 165 170 175Lys Leu Ser Asp Asp Asn phe Leu Val Asn With Asn Gin Ile Cys Arg 145 150 155 160 pro Arg Ser phe Leu Ser Arg Ser Ala Cys Tyr Ser Ala Ala Tyr Ala 165 170 175

Tyr Tyr Leu Ala Val Arg Ser Ala Gly Trp Ala Tyr Phe Tyr Asp 180 185 190 <210> 3 <211> 140Tyr Tyr Leu Ala Val Arg Ser Ala Gly Trp Ala Tyr Phe Tyr Asp 180 185 190 <210> 3 <211> 140

<212> PRT <213> Meiothermus silvanus <400> 3<212> PRT <213> Meiothermus silvanus <400> 3

Met Arg Val val Leu Leu Met Leu Val Leu Val Leu Ala Ala Cys Gly 15 10 15With Arg Val val Leu Leu With Leu Val Leu Val Leu Ala Ala Cys Gly 15 10 15

Ser Gin Thr Gly Ala Pro Asn Trp Thr Leu Glu Gin Ile Ala Ala Leu 20 25 30Ser Gin Thr Gly Ala Pro Asn Trp Thr Leu Glu Gin Ile Ala Ala Leu 20 25 30

Thr Pro Glu Gin Ile Asp Ala Leu Ser Glu Gly Glu Leu Gin Lys Ile 35 40 45Thr Pro Glu Gin Ile Asp Ala Leu Ser Glu Gly Glu Leu Gin Lys Ile 35 40 45

Gin Thr Ile Leu Gin Pro Glu Phe Ala Arg Val Glu Ser Gin Leu Ile 50 55 60Gin Thr Ile Leu Gin Pro Glu Phe Ala Arg Val Glu Ser Gin Leu Ile 50 55 60

Gin Leu Gin ser Gin Leu Glu Ala Leu val Ala Ala Gin Asp Ser Arg 65 70 75 80Gin Leu Gin ser Gin Leu Glu Ala Leu val Ala Ala Gin Asp Ser Arg 65 70 75 80

Trp Pro Asn Phe Asp Tyr Thr val Tyr Leu Ala Thr Ala Ile Pro Tyr 85 90 95Trp Pro Asn Phe Asp Tyr Thr val Tyr Leu Ala Thr Ala Ile Pro Tyr 85 90 95

Gly Thr Phe Phe Thr Tyr Tyr Arg Thr Tyr Ser Gly Pro Asp Trp Ser 100 105 HOGly Thr Phe Phe Thr Tyr Tyr Arg Thr Tyr Ser Gly Pro Asp Trp Ser 100 105 HO

Asn Asp Gly cys Ser Tyr Ser pro Asp Lys Pro Leu Phe Leu Asn Phe 115 120 125Asn Asp Gly cys Ser Tyr Ser pro Asp Lys Pro Leu Phe Leu Asn Phe 115 120 125

Lys Asp Pro cys Asn His His Asp Phe Gly Tyr Arg 130 135 140 <210> 4 <211> 999Lys Asp Pro cys Asn His His Asp Phe Gly Tyr Arg 130 135 140 <210> 4 <211> 999

<212> DNA <213> Chaetomium thermophilum <400> 4 atgaagggct tcctgctggc cagcctggcc gccctggccg tggccgcccc cagcagcaag 60 aagcagcgcg ccgcccccgt gaccgcccag cagctgaaca acttcaagct gtacatgcag 120 tggagcagcg ccagccactg cgccaacgag gcccccatcg gcagcgtggt gacctgcacc 180 gacaaccagt gcagcatgtt ccagagccac aacgccaccg tggccgccac cttcatcggc 240 agcatcctgg acatgcgcgg cttcctgggc atcgacgacg tggacaagaa catcgtgctg 300 agcttccgcg gcagcaccag ctggcgcaac tggatcgccg acgccatctt cgtgcagacc 360 ccctgcgacc tgacccccgg ctgcctggtg cacgccggct tctacgccag ctggctggag 420 atcaagaaca gcgtgatcga cgccgtgaag gccgccaagg ccgcccaccc caactacaag 480 ctggtgacca ccggccacag cctgggcgcc gccgtggcca ccctggccgc cgccaccctg 540 cgcaaggccg gcatccccat cgagctgtac acctacggca gcccccgcgt gggcaacaag 600 gccttcgccg agttcgtgac caaccaggcc ggcggcgagt accgcctgac ccacagcgcc 660 gaccccatcc cccgcctgcc ccccatcatc ttcaactacc gccacaccag ccccgagtac 720 tggttcgacg agggcgagga cggcgtggtg accgtggacg agttccagat ctgcgagggc 780 tacgccaacg tgaactgcaa cgccgccacc agcggcttca acatggacct gcacggctgg 840 tacttccaga accaccaggg ctgcagcctg ggctacaccc cctggcgcgc cgtgaaggag 900 cgcgagctga gcgaccccga gctggaggcc ctggtgaacc gcttcgccga gatggacaag 960 gcctacgtgg agaacctgaa cctggagggc ctggagccc 999 <210> 5 <211> 573<212> DNA <213> Chaetomium thermophilum <400> 4 atgaagggct tcctgctggc cagcctggcc gccctggccg tggccgcccc cagcagcaag 60 aagcagcgcg ccgcccccgt gaccgcccag cagctgaaca acttcaagct gtacatgcag 120 tggagcagcg ccagccactg cgccaacgag gcccccatcg gcagcgtggt gacctgcacc 180 gacaaccagt gcagcatgtt ccagagccac aacgccaccg tggccgccac cttcatcggc 240 agcatcctgg acatgcgcgg cttcctgggc atcgacgacg tggacaagaa catcgtgctg 300 agcttccgcg gcagcaccag ctggcgcaac tggatcgccg acgccatctt cgtgcagacc 360 ccctgcgacc tgacccccgg ctgcctggtg cacgccggct tctacgccag ctggctggag 420 atcaagaaca gcgtgatcga cgccgtgaag gccgccaagg ccgcccaccc caactacaag 480 ctggtgacca ccggccacag cctgggcgcc gccgtggcca ccctggccgc cgccaccctg 540 cgcaaggccg gcatccccat cgagctgtac acctacggca gcccccgcgt gggcaacaag 600 gccttcgccg agttcgtgac caaccaggcc ggcggcgagt accgcctgac ccacagcgcc 660 gaccccatcc cccgcctgcc ccccatcatc ttcaactacc gccacaccag ccccgagtac 720 tggttcgacg agggcgagga cggcgtggtg accgtggacg agttccagat ctgcgagggc 780 tacgccaacg tgaactgcaa cgccgccacc agcggcttca acatggacct gcacggctgg 840 tacttccaga accaccaggg ctgcagcctg ggctacaccc cctggcgcgc cgtgaaggag 900 cgcgagctga gcgaccccga gctggaggcc ctggtgaacc gcttcgccga gatggacacggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg

<212> DNA <213> Meiothermus ruber <400> 5 atgggcaagc ccatgcgctt cgccgtgggc atcctggccc tgctgctggc cgcctgcagc 60 cagcccgcca ccgagagcac cagcgccagc atcgtggagg acatgcgcca gctgggcgtg 120 gagcccgagg ccatcgccgc ctacaccgag gccctgcaga acctggagca ggcccgcctg 180 gccctgcaga gcctgggcgc cggcgacctg ctgctggtgc agagcatcgc cctgggcagc 240 gtggccaact acgacgccta ctacaacgcc cgcgccagct acccccagtt cgactggagc 300 cgcaacggct gcagcgcccc cgagggcctg ggcctgggct accgcgagac cttccgcccc 360 gcctgcaacg tgcacgactt cggctacgcc aacttccccc gcttccccag cctgtacaac 420 gagaccggcc gcaagctgag cgacgacaac ttcctggtga acatgaacca gatctgccgc 480 ccccgcagct tcctgagccg cagcgcctgc tacagcgccg cctacgccta ctacctggcc 540 gtgcgcagcg ccggctgggc ctacttctac gac 573 <210> 6 <211> 420<212> DNA <213> Meiothermus ruber <400> 5 atgggcaagc ccatgcgctt cgccgtgggc atcctggccc tgctgctggc cgcctgcagc 60 cagcccgcca ccgagagcac cagcgccagc atcgtggagg acatgcgcca gctgggcgtg 120 gagcccgagg ccatcgccgc ctacaccgag gccctgcaga acctggagca ggcccgcctg 180 gccctgcaga gcctgggcgc cggcgacctg ctgctggtgc agagcatcgc cctgggcagc 240 gtggccaact acgacgccta ctacaacgcc cgcgccagct acccccagtt cgactggagc 300 cgcaacggct gcagcgcccc cgagggcctg ggcctgggct accgcgagac cttccgcccc 360 gcctgcaacg tgcacgactt cggctacgcc aacttccccc gcttccccag cctgtacaac 420 gagaccggcc gcaagctgag cgacgacaac ttcctggtga acatgaacca gatctgccgc 480 ccccgcagct tcctgagccg cagcgcctgc tacagcgccg cctacgccta ctacctggcc 540 gtgcgcagcg ccggctgggc ctacttctac gac 573 <210> 6 <211> 420

<212> DNA <213> Meiothermus silvanus <400> 6 atgcgcgtgg tgctgctgat gctggtgctg gtgctggccg cctgcggcag ccagaccggc 60 gcccccaact ggaccctgga gcagatcgcc gccctgaccc ccgagcagat cgacgccctg 120 agcgagggcg agctgcagaa gatccagacc atcctgcagc ccgagttcgc ccgcgtggag 180 agccagctga tccagctgca gagccagctg gaggccctgg tggccgccca ggacagccgc 240 tggcccaact tcgactacac cgtgtacctg gccaccgcca tcccctacgg caccttcttc 300 acctactacc gcacctacag cggccccgac tggagcaacg acggctgcag ctacagcccc 360 gacaagcccc tgttcctgaa cttcaaggac ccctgcaacc accacgactt cggctaccgc 420<212> DNA <213> Meiothermus silvanus <400> 6 atgcgcgtgg tgctgctgat gctggtgctg gtgctggccg cctgcggcag ccagaccggc 60 gcccccaact ggaccctgga gcagatcgcc gccctgaccc ccgagcagat cgacgccctg 120 agcgagggcg agctgcagaa gatccagacc atcctgcagc ccgagttcgc ccgcgtggag 180 agccagctga tccagctgca gagccagctg gaggccctgg tggccgccca ggacagccgc 240 tggcccaact tcgactacac cgtgtacctg gccaccgcca tcccctacgg caccttcttc 300 acctactacc gcacctacag cggccccgac tggagcaacg acggctgcag ctacagcccc 360 gacaagcccc tgttcctgaa cttcaaggac ccctgcaacc accacgactt cggctaccgc 420

Claims

CONCLUSIONS

A improver composition comprising a phospholipase with a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0, 01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and which has an optimum phospholipase temperature of 45 ° C or more.

The improver composition of claim 1, wherein for the phospholipase A1 activity, one milliunit (PAIm11) is defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomol (nmol) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-1 position of N - (( 6- (2,4-DNP) Amino) Hexanoyl) -1- (BODIPY® FL C5) -2-Hexyl-Sn-Glycero-3-phosphoethanolamine at 40 ° C and pH 7.4 and for phospholipase A2- activity one milliunit (PA2mU) is defined as the amount of enzyme that hydrolyses one nanomol (nmol) per minute of fluorescent fatty acid substituted at the sn-2 position of 1-0- (6-BODIPY® 558/568-Aminohexyl) -2 -BODIPY® FL C5-Sn-Glycero-3-phosphocholine at 40 ° C and pH 8.9.

An enhancer according to claim 1 or 2, wherein said phospholipase is selected from a lipolytic enzyme with phospholipase activity from Chaetomium thermophilum, a lipolytic enzyme with phospholipase activity from Meiothermus ruber and / or a lipolytic enzyme with phospholipase activity from Meiothermus sitvanus.

Improving agent according to any one of the preceding claims, wherein said phospholipase has a sequence that is at least 85% identical to a sequence of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 3.

An improver according to any one of the preceding claims, wherein said phospholipase retains more than 40% of its phospholipase activity after being incubated at 50 ° C for 60 minutes, preferably more than 50% of its phospholipase activity after being at δΟΌ for 60 minutes incubated.

Use of a phospholipase in bakery applications, wherein said phospholipase has a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and has an optimum phospholipase temperature of 45 ° C or more.

Use according to claim 6, wherein said phospholipase has a sequence that is at least 85% identical to a sequence of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 3.

Use according to claim 6 or 7 in bread or pastry products.

Use according to any of claims 6 to 8 in cakes.

A method for preparing a baked product comprising the steps of adding to the dough or batter, prior to baking, a phospholipase having a ratio of phospholipase A1 activity to phospholipase A2 activity in the range between 0 01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and has an optimum phospholipase temperature of 45 ° C or more.

The method of claim 10, wherein said dough or batter comprises between 5,000 and 100,000 PmU / 100 kg of flour, preferably between 7,000 and 70,000 PmU / 100 kg of flour, more preferably between 10,000 and 60000 PmU / 100 kg of flour of said phospholipase .

The method of claim 10 or 11, wherein said dough or batter shows improved tolerance.

A method according to claim 10 or 11, wherein said baked product shows improved freshness.

A baked product prepared from a dough or batter comprising a phospholipase that has a ratio of phospholipase A1 activity / phospholipase A2 activity in the range between 0.01 and 100, preferably in the range between 0.01 and 80, with more preferably in the range between 0.01 and 50, even more preferably in the range between 0.01 and 10; and has an optimum phospholipase temperature of 45 ° C or more.