BE1023274B1

BE1023274B1 - Schattingsmethode en systeem voor het schatten van een foetale fractie

Info

Publication number: BE1023274B1
Application number: BE2015/5460A
Authority: BE
Inventors: Paul Vauterin; Michaël Vyverman; Schrijver Joachim De
Original assignee: Multiplicom Nv
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2017-01-19
Also published as: BE1023274A9; BE1023274A1

Abstract

Samenvatting Schattingswerkwijze voor het schatten van een foetale fractie, welke werkwijze omvat het meten van allelaanwezigheden voor een vooraf bepaald aantal genetische markeringen in een monster van celvrij DNA van een zwangere vrouw, waarbij elke allelaanwezigheid de aanwezigheid voorstelt op een genetische markering van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen van minstens één van: een referentie-allel van maternale of foetale oorsprong, en een alternatief allel van maternale of foetale oorsprong; op basis van de gemeten allelaanwezigheden, het berekenen van een overeenstemmend aantal allelfrequenties voor het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen; op basis van het berekende aantal allelfrequenties, het detecteren van een deelverzameling van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, welke deelverzameling geassocieerd is met heterozygote allelparen van maternale oorsprong; en het schatten van de foetale fractie op basis van de gedetecteerde deelverzameling, waarbij de foetale fractie de fractie voorstelt van celvrij DNA van foetale oorsprong in het monster.

Description

Schattingswerkwijze en -systeem voor het schatten van een foetale fractie

Domein van de uitvinding

Het domein van voorliggende uitvinding heeft betrekking op het schatten van een foetale fractie. Bijzondere uitvoeringsvormen hebben betrekking tot een schattingswerkwijze en -systeem voor het schatten van een foetale fractie, en tot een computerprogrammaproduct en een digitaal dataopslagmedium voor het schatten van een foetale fractie.

Achtergrond EP 0 994 063 openbaart niet-invasieve prenatale diagnosewerkwijzen, bijvoorbeeld om bepaalde ziekten op te sporen. De prenatale diagnosewerkwijzen omvatten het schatten van de foetale fractie, dat wil zeggen de fractie van het celvrij DNA (deoxyribonucleïnezuur) in het maternale monster die eigenlijk van de foetus komt. Bekende schattingswerkwijzen voor het schatten van de foetale fractie omvatten de detectie van SNP (of single-nucleotide polymorphism, enkele-nucleotidepolymorfismen, dat wil zeggen een genetische markering die een enkele variabele nucleotide omvat) allelen (dat wil zeggen varianten of alternatieve vormen van eenzelfde gen of voor eenzelfde genetische markering) op het foetale celvrije DNA die niet aanwezig zijn in het maternale DNA. Met andere woorden, deze bekende schattingswerkwijzen onderzoeken SNP-allelen waarbij het matemale DNA homozygoot is.

Samenvatting

Uitvoeringsvormen van de uitvinding beogen een aanpak te voorzien voor het schatten van de foetale fractie.

Volgens een eerste aspect van de uitvinding wordt een schattingswerkwijze voorzien voor het schatten van een foetale fractie. De werkwijze omvat het meten van allelaanwezigheden voor een vooraf bepaald aantal genetische markeringen in een monster van celvrij DNA van een zwangere vrouw, waarbij elke allelaanwezigheid de aanwezigheid voorstelt op een genetische markering van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen van ten minste één van: een referentie-allel van maternale of foetale oorsprong, en een alternatief allel van matemale of foetale oorsprong. Voor de volledigheid wordt opgemerkt dat dit niet impliceert dat een onderscheid kan worden gemaakt tussen een allel van matemale oorsprong en een allel van foetale oorsprong, maar slechts dat een allel van één van beide oorsprongen kan gemeten worden. De werkwijze omvat tevens, op basis van de gemeten allelaanwezigheden, het berekenen van een overeenstemmend aantal allelfrequenties voor het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen. De werkwijze omvat tevens, op basis van het berkenede aantal allelfrequenties, het detecteren van een deelverzameling van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, waarbij de deelverzameling geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong. De werkwijze omvat tevens het schatten van de foetale fractie op basis van de gedetecteerde deelverzameling, waarbij de foetale fractie de fractie van celvrij DNA van foetale oorsprong in het monster voorstelt.

In de context van deze specificatie is een ‘genetische markering’ een positie op het genoom waarvan geweten is dat die verscheidene mogelijke toestanden aanneemt over individuen in een populatie.

Door deze schattingswerkwijze te voorzien, voorzien uitvoeringsvormen van de uitvinding een aanpak voor het schatten van de foetale fractie.

Verder ontwikkelde uitvoeringsvormen kunnen onder meer rusten op het inventieve inzicht dat het schatten van de foetale fractie op basis van de gedetecteerde deelverzameling toelaat om de foetale fractie zoals geschat in bekende schattingswerkwijzen te verifiëren, onafhankelijk van onderzochte SNP-allelen waarbij het matemale DNA homozygoot is. deze verificatie verbetert de nauwkeurigheid van een foetale fractie zoals geschat in bekende schattingswerkwijzen.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het detecteren van de deelverzameling, op basis van het berekende aantal allelfrequenties, het selecteren uit het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, als die deelverzameling van een tweede aantal genetische markeringen waarvan overeenstemmende allelfrequenties een vooraf bepaalde minimum allelfrequentiedrempel overschrijden. Volgens een verder ontwikkelde uitvoeringsvorm overschrijden de overeenstemmende allelfrequenties van het tweede aantal genetische markeringen een vooraf bepaalde maximum allelfrequentiedrempel niet. Volgens een verder ontwikkelde voorkeursuitvoeringsvorm overschrijden de overeenstemmende allelfrequenties van het tweede aantal genetische markeringen de vooraf bepaalde minimum allelfrequentiedrempel en overschrijden ze niet de vooraf bepaalde maximum allelfrequentiedrempel.

Op deze wijze kunnen matemaal heterozygote genetische markeringen op een meer directe wijze worden gedetecteerd, zonder het detecteren van allelen van foetale oorsprong die niet aanwezig zijn in het DNA van matemale oorsprong.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het schatten het produceren van een initiële schatting voor de foetale fractie en het optimaliseren van de initiële schatting over de gedtecteerde deelverzameling.

Op deze wijze is een schatting direct beschikbaar, en kunnen betere schattingen worden verkregen door meer rekenkracht aan te wenden.

Volgens een verder ontwikkelde uitvoeringsvorm omvat het optimaliseren het maximaliseren van de waarschijnlijkheid van de initiële schatting, door het herhaaldelijk uitvoeren van de volgende verzameling operaties terwijl de schatting wordt gevarieerd. Voor een gegeven waarde van de schatting die wordt gevarieerd, voor elke genetische markering in de gedetecteerde deelverzameling, worden de respectievelijke probabiliteiten berekend dat de genetische markering geassocieerd is met ene homozygoot referentie-allelpaar van foetale oorsprong, een heterozygoot allelpaar van foetale oorsprong, en een homozygoot alternatief allelpaar van foetale oorsprong. Eveneens wordt een waarschijnlijkheid berekend van de gegeven waarde van de schatting die wordt gevarieerd, voor de gedetecteerde deelverzameling, op basis van de berekende respectievelijke probabiliteiten voor elke genetische markering in de gedetecteerde deelverzameling.

Op deze wijze wordt een structurele strategie gebruikt om te zoeken naar een betere schatting voor de foetale fractie, rekening houdend met de genetische markeringen in de gedetecteerde deelverzameling.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de werkwijze het corrigeren van allel-specifiek vooroordeel voor minstens één van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, waarbij het allel-specifieke vooroordeel te wijten is aan ongelijke amplificatie voor respectievelijk een referentie-allel en een alternatief allel voor een genetische markering.

Op deze wijze wordt nauwkeurigheid verbetert, ongeacht allel-specifiek vooroordeel.

Volgens een verder ontwikkelde uitvoeringsvorm omvat het corrigeren van een allel-specifiek vooroordeel voor een genetische markering het verkrijgen van meerdere monsters van celvrij DNA van zwangere vrouwen, voor welke monsters de genetische markeringen respectievelijk geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong. Het corrigeren omvat tevens het berekenen van de gemiddelde allelfrequentie voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters. Het corrigeren omvat tevens, op basis van een afwijking van de berekende gemiddelde allelfrequentie van een verwachtingswaarde daarvan, het bepalen van een correctiefector om te gebruiken voor het corrigeren.

Op deze wijze wordt allel-specifïek vooroordeel efficiënt gecorrigeerd.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de werkwijze het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door: het bepalen voor minstens één genetische markering van de gedetecteerde deelverzameling van een statistische waarschijnlijkheid om geassocieerd te zijn met een homozygoot allelpaar van matemale oorsprong; en, op basis van de bepaalde statistische waarschijnlijkheid of waarschijnlijkheden, het uitsluiten van minstens één genetische markering uit de gedetecteerde deelverzameling. Met andere woorden, dit zal toelaten om genetische markeringen weg te laten die waarschijnlijk geassocieerd zijn met een homozygoot allelpaar van matemale oorsprong.

Op deze wijze wordt de nauwkeurigheid verbeterd door gebruik te maken van genetische markeringen van hogere kwaliteit.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de werkwijze het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door: het verkrijgen van een veelvoud aan monsters van celvrij DNA van zwangere vrouwen, voor welke monsters een genetische markering respectievelijk geassocieerd is met heterozygote allelparen van maternale oorsprong; het berekenen van de standaardafwijking van de allelfrequentie voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters; en op basis van de berekende standaardafwijking van de allelfrequentie, het uitsluiten van minstens één genetische markering uit de gedetecteerde deelverzameling.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de werkwijze het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door: het verkrijgen van een veelvoud aan monsters van celvrij DNA van zwangere vrouwen, voor welke monsters de genetische markering respectievelijk geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong; het berekenen van de gemiddelde allelfrequentie voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters; en op basis van een afwijking van de berekende gemiddelde allelfrequentie van een verwachtingswaarde daarvan, het uitsluiten van minstens één genetische markering uit de gedetecteerde deelverzameling.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de werkwijze het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door het uitsluiten van minstens één genetische markering uit de gedetecteerde deelverzameling, welke minstens één genetische markering minder gemeten allelaanwezigheden heeft dan een vooraf bepaalde drempelwaarde, voor het gebruikte monster.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm is het monster matemaal bloed, plasma, urine, cerebrospinale vloeistof, serum, saliva of transcervicale spoelingsvloeistof.

Op deze wijze is de werkwijze toepasbaar voor een veelheid aan monsters die gecreëerd kunnen worden van een zwangere vrouw.

In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het meten het verwerken van het monster gebruikmakend van minstens één van de volgende: polymerase kettingreactie (PCR), ligase kettingreactie, nucleïnezuur sequentiegebaseerde amplificatie (NASBA), en vertakte DNA werkwijzen; en bij voorkeur PCR.

In voorbeelduitvoeringsvormen van de uitvinding kan het meten van allelaanwezigheden het meten van SNP-allelaanwezigheden en/of het meten van allelaanwezigheden voor korte inserties en/of deleties omvatten.

Volgens een verder aspect van de uitvinding wordt een computerprogrammaproduct voorzien omvattende computeruitvoerbare instructies om, wanneer het programma wordt uitgevoerd op een computer, ten minste de stap uit te voeren van het schatten van de foetale fractie van uitvoeringsvormen van de werkwijze die hierboven is geopenbaard. De referentie naar computeruitvoerbare instructie moet zo worden uitgelegd dat ze zowel direct uitvoerbare machinecode, code die gecompileerd moet worden om te worden uitgevoerd, en code die wordt geïnterpreteerd in plaats van per se te worden uitgevoerd omvat.

Volgens een verder aspect van de uitvinding wordt een digitaal dataopslagmedium voorzien dat een machine-uitvoerbaar programma van instructies encodeert om minstens de stap van het schatten van de foetale fractie van uitvoeringsvormen van de werkwijze die hierboven is geopenbaard uit te voeren.

Volgens een verder aspect van de uitvinding wordt een computerprogramma voorzien omvattende computeruitvoerbare instructies om, wanneer het programma wordt uitgevoerd op een computer, één of meer stappen van uitvoeringsvormen van de werkwijze die hierboven is geopenbaard uit te voeren. Volgens een verder aspect van de uitvinding wordt een computertoestel of ander hardware-toestel voorzien geprogrammeerd om één of meer stappen uit te voeren van eender welke van de uitvoeringsvormen van de werkwijze die hierboven is geopenbaard. Volgens een ander aspect wordt een dataopslagtoestel voorzien dat een programma encodeert in machineleesbare en machine-uitvoerbare vorm om één of meer stappen uit te voeren van eender welke van de uitvoeringsvormen van de werkwijze die hierboven is geopenbaard.

Volgens een verder aspect van de uitvinding, wordt een schattingssysteem voor het schatten van een foetale fractie voorzien. Het systeem omvat een metingsmodule, een berekeningsmodule, een detectiemodule en een schattingsmodule. De metingsmodule is ingericht voor het meten van allelaanwezigheden voor een vooraf bepaald aantal genetische markeringen in een monster van celvrij DNA van een zwangere vrouw, waarbij elke allelaanwezigheid de aanwezigheid voorstelt op een genetische markering van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen minstens één van: een referentie-allel van matemale of foetale oorsprong, en een alternatief allel van matemale of foetale oorsprong. De berekeningsmodule is ingericht voor: op basis van de gemeten allelaanwezigheden, het berekenen van een overeenstemmend aantal allelfrequenties voor het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, de detectiemodule is ingericht voor, op basis van het berekende aantal allelfrequenties, het detecteren van een deelverzameling van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, welke deelverzameling geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong. De schattingsmodule is ingericht voor het schatten van de foetale fractie op basis van de gedetecteerde deelverzameling, waarbij de foetale fractie de fractie voorstelt van celvrij DNA van foetale oorsprong in het monster.

Uitvoeringsvormen van het systeem kunnen worden belichaamd als een geheel in hardware, in software, of in een combinatie van hardware en software. In een voorkeursuitvoeringsvorm van het systeem, kan de metingsmodule een hardware-inrichting omvatten, aangepast voor het verkrijgen van het monster en voor het uitvoeren van de metingen op het monster (typisch door software gecontroleerd). De berekeningsmodule kan worden voorzien als een stukje software dat kan worden uitgevoerd op een computerprocessor gekoppeld met de metingsmodule, of kan anderszins worden aangepast om de gemeten allelaanwezigheden te verkrijgen die zijn geproduceerd door de metingsmodule, bijvoorbeeld via een datacommunicatiekanaal van de metingsmodule naar de computerprocessor waarop het stukje software kan worden uitgevoerd - of in een bijzondere uitvoeringsvorm kan de berekeningsmodule worden voorzien als een hardware-module gekoppeld met de hardware-metingsmodule. In de voorkeursuitvoeringsvonn kan de detectiemodule worden voorzien als een stukje software dat kan worden uitgevoerd op een computerprocessor (dezelfde computerprocessor als hierboven of een andere computerprocessor), of kan anderszins worden aangepast om het berekende aantal allelfrequenties te verkrijgen van de berekeningsmodule, bijvoorbeeld via het datacommunicatiekanaal of via een andere geschikt datacommunicatiekanaal. De schattingsmodule kan worden voorzien als een stukje software dat kan worden uitgevoerd op een computerprocessor (dezelfde computerprocessor als verder hierboven, of dezelfde andere computerprocessor als hierboven, of nog een andere computerprocessor), of kan anderszins worden aangepast om de gedetecteerde deelverzameling te verkrijgen, bijvoorbeeld via het datacommunicatiekanaal of via een ander geschikt datacommunicatiekanaal. In een bijzondere uitvoeringsvorm omvat het systeem een hardware-metingsmodule, gekoppeld met één of meer computerprocessoren met geassocieerde computergeheugenopslag. De metingsmodule, de detectiemodule en de schattingsmodule zijn aanwezig als softwaremodules die geïnstalleerd zijn in de geassocieerde computergeheugenopslag, of die kunnen worden geactiveerd of op andere wijze aangevraagd door het systeem om te worden uitgevoerd op de één of meer computerprocessoren.

De vakman zal inzien dat de stappen van eender welke van de voorkeurs- en verder ontwikkelde uitvoeringsvormen van de werkwijze die hierboven is geopenbaard kunnen worden uitgevoerd door de respectieve overeenkomstige modules van het systeem.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het systeem een vooroordeelcorrectiemodule ingericht voor het corrigeren van allel-specifiek vooroordeel voor minstens één van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, welk allel-specifiek vooroordeel te wijten is aan ongelijke amplificatie voor respectievelijk een referentie-allel en een alternatief allel voor een genetische markering.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het systeem een beperkingsmodule ingericht voor het uitvoeren van de stap van het beperken van de gedetecteerde deelverzameling van eender welke van de uitvoeringsvormen van de werkwijze die hierboven is geopenbaard.

Korte figuurbeschriiving

De bijgaande tekeningen worden gebruikt om niet-beperkende voorbeelduitvoeringsvormen van toestellen van de voorliggende uitvinding die tegenwoordig de voorkeur genieten te illustreren. De hierboven beschreven en andere voordelen van de maatregelen en doelen van de uitvinding zullen duidelijker worden en de uitvinding zal beter worden begrepen aan de hand van de volgende gedetailleerde beschrijving wanneer die wordt gelezen samen met de bijgaande tekeningen, waarin:

Figuur 1 illustreert schematisch een puntgrafiek die data toont voor een monster zoals gebruikt in een uitvoeringsvorm van een werkwijze volgens voorliggende uitvinding;

Figuur 2 illustreert schematisch een andere puntgrafiek die data toont voor een monster zoals gebruikt in een uitvoeringsvorm van een werkwijze volgens voorliggende uitvinding;

Figuur 3 illustreert schematisch een voorbeeldoptimalisatie zoals uitgevoerd in een uitvoeringsvorm van een werkwijze volgens voorliggende uitvinding; en Figuur 4 illustreert schematisch een voorbeeldpuntgrafiek die data toont van meerdere monsters zoals gebruikt in een uitvoeringsvorm van een werkwijze volgens voorliggende uitvinding.

Gedetailleerde beschrijving van voorbeelduitvoeringsvormen

In een Niet-Invasieve Prenatale Test (Non-Invasive Prénatal Test, NIPT), bekend in de stand van de techniek, wordt celvrij DNA (cfDNA) in een matemaal serum of plasmamonster van een zwangere vrouw gesequentieerd om de aanwezigheid van chromosomale aneuploïdieën in de foetus op te sporen, zoals trisomie van chromosoom 21. Een factor om te schatten om de data te interpreteren is de foetale fractie (FF), die de fractie is van het celvrije DNA in het matemale monster die afstamt van de foetus. Typische foetale fracties liggen tussen 2 % en 6 %, of zelfs tussen 0.39 % en 11.4 %. Volgens voorbeelduitvoeringsvormen van de uitvinding wordt een werkwijze voorzien voor het schatten van de foetale fractie gebruikmakend van data van de Clarigo-test van de Aanvraagster die niet de detectie omvatten van SNP-allelen op het foetale DNA die niet aanwezig zijn in het DNA van de zwangere vrouw.

De Clarigo-test bestaat uit het doelgericht sequentiëren van een aantal gebieden op het menselijke genoom (met andere woorden het doelen op specifieke genetische markeringen), gebruikmakend van bekende SNP’s (enkele-nucleotide polymorfisme - single-nucleotide polymorphism) met grote (bijvoorbeeld groter dan 1 %, bij voorkeur groter dan 10 %) populatieprevalentie en twee mogelijke allelen (te weten een referentie-allel ook gekend als REF; en een alternatief allel ook gekend als ALT). Meer details over de Clarigo-test kunnen worden gevonden op het internet op http://www.multiplicom.com/product/clarigo, en in WO 2013/057568 ten name van de Aanvraagster.

Document EP 0 994 063 uit de stand van de techniek openbaart niet-invasieve prenatale diagnosemethoden, bijvoorbeeld om bepaalde ziekten op te sporen. De prenatale diagnosemethoden omvatten het schatten van de foetale fractie. Bekende schattingswerkwijzen voor het schatten van de foetale fractie omvatten de detectie van SNP-allelen op het foetale celvrije DNA die niet aanwezig zijn in het matemale DNA. Met andere woorden, deze bekende schattings werkwijzen onderzoeken SNP-allelen waarbij het matemale DNA homozygoot is.

Uitvoeringsvormen van voorliggende uitvinding beogen een aanpak te voorzien van het schatten van de foetale fractie.

Het baseren van schatting van de foetale fractie op onderzoeken van deze allelen kan de betrouwbaarheid beperken. Bijzondere uitvoeringsvormen van voorliggende uitvinding kunnen daarom beogen een verificatie toe te laten van de bevindingen van bekende schattingswerkwijzen. Deze bijzondere uitvoeringsvormen zijn onder meer gebaseerd op het inventieve inzicht dat het schatten van de foetale fractie op basis van de gedetecteerde deelverzameling van het aantal genetische markeringen toelaat om de foetale fractie te verifiëren zoals geschat in bekende schattingswerkwijzen, onafhankelijk van de onderzochte SNP-allelen waarbij het matemale DNA homozygoot is. Deze verificatie verbetert de betrouwbaarheid van de foetale fractie zoals geschat in bekende schattingswerkwijzen, door de nauwkeurigheid van die schattingen te meten.

Bovendien kan het bijzonder voordelig zijn om de bekende schattingswerkwijzen te combineren met uitvoeringsvormen van voorliggende uitvinding, om de betrouwbaarheid van de geschatte foetale fractie verder te verbeteren. Door het combineren van schattingswerkwijzen die de detectie omvatten van SNP-allelen op het foetale celvrije DNA die niet aanwezig zijn in het matemale DNA en uitvoeringsvormen van voorliggende uitvinding kan de betrouwbaarheid van de geschatte foetale fractie verder worden verbeterd, aangezien schattingen gebaseerd kunnen zijn op SNP-allelen waarbij het matemale DNA homozygoot is zowel als op SNP-allelen (of korte inserties en deleties) waarbij het matemale DNA heterozygoot is.

In een typische uitvoeringsvorm is het matemale serum of plasmamonster afgeleid van het maternale bloed. Dit kan een kleine hoeveelheid serum of plasma zijn, bijvoorbeeld 1-20 ml. Afhankelijk van de gewenste nauwkeurigheid, kan het de voorkeur genieten om grotere volumes te gebruiken. De preparatie van het serum of plasma van het matemale bloedmonster kan worden uitgevoerd gebruikmakend van standaardtechnieken. Geschikte technieken omvatten: centrifugatie, matrixgebaseerde technieken, etc. In mogelijke uitvoeringsvormen kan een sequentiegebaseerde verrijkingswerkwijze worden gebruikt op het matemale serum of plasma om het specifiek te verrijken voor foetale nucleïnezuursequenties.

Uitvoeringsvormen van de werkwijze van de uitvinding kunnen het bepalen omvatten of een monster al dan niet foetaal DNA bevat op een foetale fractie groter dan een vooraf bepaalde drempelwaarde.

In voofkeursuitvoeringsvormen wordt een amplificatie van de foetale DNA-sequenties in het monster uitgevoerd. Eender welke amplificatiewerkwijze bekend voor de vakman kan worden gebruikt, zoals een PCR- (polymerase kettingreactie, polymerase chain reaction) werkwijze.

Nu zal in detail een eerste uitvoeringsvorm van een werkwijze voor het schatten van een foetale fractie worden besproken. Allelaanwezigheden worden gemeten voor een vooraf bepaald aantal genetische markeringen in een monster van celvrij DNA van een zwangere vrouw. Elke allelaanwezigheid stelt de aanwezigheid voor op een genetische markering van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen van minstens één van: een referentie-allel van maternale of foetale oorsprong, en een alternatief allel van maternale of foetale oorsprong.

Met andere woorden, voor een aantal DNA-sequenties met een bekende locatie op een chromosoom, wordt bepaald al of niet, en hoe vaak, hetzij een referentie-allel, een alternatief allel, of beide aanwezig zijn. De allelen kunnen elk van respectievelijk matemale of foetale oorsprong zijn, aangezien de metingen uitgevoerd worden op een monster van celvrij DNA van een zwangere vrouw, en bijgevolg DNA bevatten van zowel de vrouw als de foetus.

Een voordelige manier om de resultaten voor te stellen van het meten van allelaanwezigheden voor een genetische markering is om de volgende informatie te associëren met een variantdatapunt voor die genetische markering. Een variantdatapunt (hetgeen een datapunt is geassocieerd met een aantal varianten, zoals allelen) wordt gebruikt in deze specificatie als een handige weergave voor een genetische markering, en stelt dus het resultaat voor van het meten van allelaanwezigheden in een aantal amplicons voor genetische markeringen. Een amplicon is een stukje DNA of RNA dat (de bron en/of) het product van amplificatie- of replicatiegebeurtenissen is - met andere woorden, een amplicon is een biofysisch stukje replicatiemateriaal, ontworpen om een bekende SNP-positie te bevatten met een hoge populatieprevalentie (bijvoorbeeld groter dan 1 %, bij voorkeur groter dan 10 %). Elk variantdatapunt wordt dus geassocieerd met een bekend SNP met grote populatieprevalentie (bijvoorbeeld groter dan 1 %, bij voorkeur groter dan 10 %) en met twee mogelijke allelen (te weten een referentie-allel ook gekend als REF; en een alternatief allel ook gekend als ALT). Voor elk variantdatapunt □□ kunnen de volgende getallen worden bepaald gebruikmakend van bijvoorbeeld aan standaard bio-informaticapijplijn toegepast op de sequentiëringsdata: • Het aantal inlezingen die het REF-allel op de bekende SNP-positie bevatten,

• Het aantal inlezingen die het ALT-allel op de bekende SNP-positie bevatten,

• De totale dekking

• De allelfrequentie, of de fractie van ALT-allelinlezingen op de totale dekking

Bijgevolg kunnen, voor een gegeven genetische markering i, de allelaanwezigheden worden gemeten voor zowel het REF-allel, voor het ALT-allel, als voor beide allelen, door het meten van de aantallen inlezingen die respectievelijk het REF-allel, het ALT-allel en zowel het REF- als het ALT-allel bevatten. Op basis van de gemeten allelaanwezigheden wordt een overeenstemmend aantal allelfrequenties berekend voor het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen.

Voor elke positie in het genoom (dat wil zeggen voor elke genetische locus) - met uitsluiting van de geslachtschromosomen en aannemend dat er geen relevante chromosoomstoomissen zijn, zijn er vier kopieën aanwezig in het monster (aannemend dat de positie geen deel uitmaakt van een aneuploïdieregio), die het totale aantal inlezingen bepalen: twee kopieën van het matemale DNA en twee kopieën van het foetale DNA.

Voor een individueel variantdatapunt (dat wil zeggen voor een individuele genetische markering) laat A en B het REF- en ALT-allel aanduiden voor de bekende SNP op het matemale DNA voor die genetische markering, en a en b de overeenstemmende toestanden voor het foetale DNA. Dit betekent dat het variantdatapunt in de mogelijke toestanden opgelijst in Tabel 1 kan zijn:

Tabel 1

Ter illustratie toont de puntgrafïek geïllustreerd in Figuur 1 data voor een monster, waarbij: • Elk punt een variantdatapunt is (en het resultaat van metingen gemaakt op amplicons voor een gegeven genetische markering voorstelt). • De horizontale as de fractie inlezingen toont met het ALT-SNP-allel (dat wil zeggen de allelfrequentie Fj). • De verticale as de totale inlezingsdekking CTi toont.

Het valt te zien uit Figuur 1 dat specifieke variantdatapunten geassocieerd zijn met een specifieke allelfrequentie.

Bijvoorbeeld wordt variantdatapunt 111 getoond aan de linkerzijde, en stelt het een genetische markering voor waarvoor ongeveer 2800 inlezingen werden uitgevoerd. Alle of bijna alle inlezingen voor deze genetische markering hebben gemeten dat de allelaanwezigheid aangeeft dat REF-allelen (dat wil zeggen A) aanwezig zijn, maar niet dat ALT-allelen aanwezig zijn (dat wil zeggen B). Bijgevolg is variantdatapunt 111 aan de linkerzijde geplot in Figuur 1, waar de allelfrequentie (bijna) 0 is, en waarschijnlijk een homozygote genetische markering AAaa voorstelt.

Variantdatapunt 112 wordt aan de rechterzijde getoond, en stelt een genetische markering voor waarvoor ongeveer 2700 inlezingen werden uitgevoerd. Alle of bijna alle inlezingen voor deze genetische markering hebben gemeten dat de allelaanwezigheid aangeeft dat REF-allelen (dat wil zeggen A) niet aanwezig zijn, maar dat ALT-allel (dat wil zeggen B) aanwezig zijn. Bijgevolg is variantdatapunt 112 aan de rechterzijde geplot in Figuur 1, waar de allelfrequentie (bijna) 1 is, en waarschijnlijk een homozygote genetische markering BBbb voorstelt.

Variantdatapunt 121 stelt een genetische markering voor waarvoor ongeveer 3000 inlezingen werden uitgevoerd. De gemeten allelaanwezigheden laten toe om de allelfrequentie te berekenen, die relatief laag is, maar niet 0. Bijgevolg stelt variantdatapunt 121 waarschijnlijk een genetische markering voor die matemaal homozygoot is voor het referentie-allelpaar maar een heterozygoot allelpaar van foetale origine heeft (dus AAab), aangezien de fractie van matemaal DNA aanwezig in het monster voor de genetische markering (veel) groter is dan de fractie van foetaal DNA aanwezig in het monster voor de genetische markering.

Variantdatapunt 122 wordt aan de rechterzijde getoond, en stelt een genetische markering voor waarvoor ongeveer 1800 inlezingen werden uitgevoerd. Door dezelfde redenering stelt variantdatapunt 122 waarschijnlijk een genetische markering voor die matemaal homozygoot is voor het alternatieve allelpaar maar een heterozygoot allelpaar van foetale origine heeft (dus BBab).

Variantdatapunt 131 stelt een genetische markering voor waarvoor ongeveer 2700 inlezingen werden uitgevoerd. De gemeten allelaanwezigheden laten toe om de allelfrequentie te berekenen, waarvan gevonden wordt dat die ongeveer 0.51 is. Bijgevolg stelt variantdatapunt 131 waarschijnlijk een genetische markering voor die matemaal heterozygoot is (dus AB). Het is niet prima facie zo dat het variantdatapunt een genetische markering zou voorstellen die tevens heterozygoot is voor de foetus, hoewel dit gegeven de grote totale inlezingsdekking, waarschijnlijk is.

Variantdatapunt 132 stelt een genetische markering voor waarvoor ongeveer 800 inlezingen werden uitgevoerd. De gemeten allelaanwezigheden laten toe om de allelfrequentie te berekenen, waarvan gevonden wordt dat die ongeveer 0.68 is. Bijgevolg stelt variantdatapunt 132 waarschijnlijk een genetische markering voor die matemaal heterozygoot is (dus AB). Aangezien het variantdatapunt 131 een groter aantal inlezingen voorstelt voor een specifieke genetische markering dan variantdatapunt 132, is variantdatapunt 131 statistisch betrouwbaarder dan variantdatapunt 132.

Bijgevolg kunnen drie groepen variantdatapunten (1 IA en 1 IB, 12A en 12B, en 13) worden onderscheiden: • variantdatapunten 1 IA en 11B die homozygoot zijn in het matemale en foetale DNA (AAaa, BBbb). • variantdatapunten 12A en 12B die homozygoot zijn in het matemale DNA, en heterozygoot in het foetale DNA (AAab, BBab). Merk op dat in deze gevallen het foetale DNA een allel bevat dat overgeërfd is van de vader en dat niet aanwezig is in het matemale DNA. • variantdatapunten 13 die heterozygoot zijn in het matemale DNA (ABaa, ABab, ABbb). Merk op dat voor elk van deze variantdatapunten het foetale DNA enkel allelen bevat die ook aanwezig zijn in het matemale DNA.

Men merkt op dat meerdere variantdatapunten dezelfde (of nagenoeg dezelfde) allelfrequentie kunnen hebben, vooral wanneer ze deel uitmaken van dezelfde groep. Dit betekent dat (nagenoeg) hetzelfde aantal allelaanwezigheden gemeten is geweest voor hen, ten opzichte van het totale aantal inlezingen.

Men merkt tevens op dat, in Figuur 1, variantdatapunten met een grotere totale inlezingsdekking (dichter bij de bovenkant van de grafiek) een nauwkeurigere allelfrequentie hebben, simpelweg omdat er meer metingsdata is. Dit verklaart waarom de groepen 11A-B, 12A-B en 13 van variantdatapunten in Figuur 1 een algemeen taps toelopende vorm hebben. Deze eigenschap kan in rekening worden gebracht wanneer men een statistische betrouwbaarheid bepaalt voor een gegeven variantdatapunt.

De foetale fractie kan worden geschat als volgt.

Op basis van het berekende aantal allelfrequenties, wordt een deelverzameling van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen gedetecteerd. De deelverzameling wordt geassocieerd met heterozygote allelparen van matemale oorsprong. Bijgevolg omvat de gedetecteerde deelverzameling bij voorkeur genetische markeringen waarvan de variantdatapunten zich in de toestanden ABaa, ABab, en ABbb bevinden, en bij voorkeur geen genetische markeringen omvatten waarvan de variantdatapunten zich in de toestanden AAaa en BBbb, en AAab en BBab bevinden. Voor de duidelijkheid, wanneer wordt gezegd dat een variantdatapunt zich in een toestand bevindt, wordt bedoeld dat amplicons voor zijn genetische markering zijn ingelezen als zijnde in die toestand - met andere woorden, metingen voor die genetische markering hebben aangetoond dat het in die toestand is (en bijgevolg dat die genetische markering bijvoorbeeld heterozygoot in zij maternaal DNA is, hetgeen kan worden voorgesteld in de voorliggende specificatie door een variantdatapunt in één van de toestanden ABaa, ABab, of ABbb).

Merk op dat deze detectie niet noodzakelijk de detectie omvat van (SNP-) allelen op het foetale celvrije DNA die niet aanwezig zijn in het matemale DNA. In het bijzonder worden (SNP-) allelen gedetecteerd op het foetale cel vrij DNA die aanwezig zijn in het matemale DNA, aangezien het maternale DNA heterozygoot is voor de gedetecteerde deelverzameling: of de allelen van de foetale oorsprong aa, ab of bb zijn, elk van die allelen behoort tot de zwangere vrouw, die AB heeft.

In een specifieke uitvoeringsvorm wordt deze deelverzameling gedetecteerd, op basis van het berekende aantal allelfrequenties, door het selecteren uit het vooraf bepaalde aantal genetische markering, als die deelverzameling, van een tweede aantal genetische markeringen waarvan overeenstemmende allelfrequenties een vooraf bepaalde minimum allelfrequentiedrempel overschrijden en een vooraf bepaalde maximum allelfrequentiedrempel niet overschrijden. Voorbeelddrempels kunnen respectievelijk 0.3 en 0.7 zijn, of respectievelijk 0.4 en 0.6. Voorbeeldminimum en -maximum drempels kunnen vooraf bepaald worden op basis van één of meer gekende kalibratiemonsters.

Op basis van de gedetecteerde deelverzameling wordt de foetale fractie (dat wil zeggen de fractie van celvrij DNA van foetale oorsprong in het monster) geschat. Dit kan worden begrepen uit de indicatie hierboven dat ten minste enkele van de genetische markeringen van de gedetecteerde deelverzameling (bijvoorbeeld die in de toestanden ABaa en ABbb) probabilistisch verwant zijn aan de foetale fractie. Bijgevolg kan de foetale fractie worden geschat op basis van deze gedetecteerde deelverzameling. Genetische markeringen (voorgesteld door variantdatapunten □□ die inlezingen voorstellen gemaakt op amplicons) van de gedetecteerde deelverzameling zijn heterozygoot in het maternale DNA en kunnen bijgevolg hetzij ABaa, ABab, of ABbb zijn. Echter, de eigenlijke toestand is niet gekend, en het is ondoenlijk om deze te bepalen voor een individueel variantdatapunt aangezien de distributies van de toestanden ABaa, ABab, en ABbb overlappen voor typische waarden van de foetale fractie.

In een specifieke uitvoeringsvorm kan de schatting het produceren omvatten van een initiële schatting voor de foetale fractie en het optimaliseren van de initiële schatting over de gedetecteerde deelverzameling.

In een verder ontwikkelde uitvoeringsvorm kan het optimaliseren het maximaliseren omvatten van de waarschijnlijkheid van de initiële schatting - dat wil zeggen het vinden van een schatting voor de foetale fractie, op basis van de initiële schatting, die maximaal waarschijnlijk de eigenlijke foetale fractie karakteriseert. Dit kan worden gedaan door het herhaaldelijk uitvoeren van de volgende verzameling operaties terwijl de schatting wordt gevarieerd (dat wil zeggen het nemen van een andere waarde voor de schatting dat haar initiële waarde): voor een gegeven waarde van de schatting die wordt gevarieerd, het berekenen, voor elke genetische markering in de gedetecteerde deelverzameling, van de respectieve probabiliteiten dat die genetische markering geassocieerd is met een homozygoot referentie-allelpaar van foetale oorsprong, een heterozygoot allelpaar van foetale oorsprong, of een homozygoot alternatief allelpaar van foetale oorsprong; en het berekenen van een waarschijnlijkheid van de gegeven waarde van de schatting die gevarieerd wordt, voor de gedetecteerde deelverzameling, op basis van de berekende respectieve probabiliteiten voor elke genetische markering in de gedetecteerde deelverzameling.

In een voorbeelduitvoeringsvorm, om de waarschijnlijkheid te bepalen van een gegeven schatting voor de foetale fractie, worden de respectieve probabiliteiten berekend dat de waargenomen REF-en ALT-inlezingsaantallen overeenstemmen met een genetische markering met een bijzondere toestand van ABaa, ABab, en ABbb, en met de gegeven schatting voor de foetale fractie. Deze berekening kan worden uitgevoerd rekening houdend met een statistische distributie-aanname voor de inlezingsaantallen - bijvoorbeeld gebruikmakend van de aanname dat de inlezingsaantallen een Poissondistributie volgen.

In de voorbeelduitvoeringsvorm kan een algemene waarschijnlijkheid optioneel worden berekend van de gemeten allelaanwezigheden, dat wil zeggen van de waargenomen REF- en ALT-inlezingen voor elk variantdatapunt met de gegeven schatting voor de foetale fractie door de grootste probabiliteit te nemen van de respectieve probabiliteiten berekend voor de mogelijke toestanden ABaa, ABab en ABbb.

In de voorbeelduitvoeringsvorm wordt de waarschijnlijkheid van de gegeven schatting berekend, op basis van de berekende respectieve probabiliteiten voor elke genetische markering in de gedetecteerde deelverzameling - voor deze uitvoeringsvorm in het bijzonder door het nemen van het product van alle algemene probabiliteiten over de gedetecteerde deelverzameling. Deze waarschijnlijkheid kan dan worden gemaximaliseerd, bijvoorbeeld gebruikmakend van een niet-lineaire optimalisatiewerkwijze.

Voor sommige variantdatapunten in de test, vermeerdert de amplificatie in het verwerken van het monster om de allelaanwezigheden te meten de REF- en ALT-allelen niet in gelijke verhoudingen. Het resultaat is een allel-specifiek vooroordeel.

Dit vooroordeel kan worden gecorrigeerd voor een gegeven genetische markering, door het analyseren van een batch van meerder monsters, bij voorkeur gelijktijdig, en het meten van de gemiddelde allelfrequentie van de variantdatapunten voor de gegeven genetische markering over alle monsters in de batch, welke variantdatapunten heterozygoot zijn op het matemale DNA. Als dit gemiddelde gebaseerd is op een voldoende groot aantal monsters, kan zijn afwijking van de verwachtingswaarde 0.5 gebruikt worden om een correctiefactor op te stellen voor elk variantdatapunt.

De nauwkeurigheid van schatting van de foetale fractie kan worden verbeterd door het beperken van de geselecteerde variantdatapunten tot een hoge kwaliteits-deelverzameling. Deze beperking kan gebaseerd zijn op een individueel doelmonster, of op een batch monters. Voorbeelden van filters voor een dergelijke beperking bevatten één of meer van de volgende benaderingen: • weiger variantdatapunten waarbij de totale dekking onder een vooraf bepaalde specifieke drempel voor het doelmonster is; en • voor elk variantdatapunt, bereken de standaardafwijking van de allelfrequenties over alle monsters in een batch, gebruikmakend van slechts die monsters waarbij het variantdatapunt heterozygoot is in het matemaal DNA; en weiger het variantdatapunt indien deze standaardafwijking boven een vooraf bepaalde specifieke drempel is.

Figuur 2 illustreert schematisch een andere puntgrafiek die data toont voor een monster zoals gebruikt in een uitvoeringsvorm van een werkwijze volgens voorliggende uitvinding. De puntgrafiek toont de allelfrequentie Ir van elk variantdatapunt in functie van zijn totale dekking □□□ Met andere woorden, voor elke genetische markering die in beschouwing wordt genomen, toont de verticale as hoeveel allelaanwezigheden in totaal werden gemeten (REF en ALT gecombineerd) voor die genetische markering, en de horizontale as toont hoe frequent de aanwezigheid van het ALT-allel gemeten is geweest voor die genetische markering.

In totaal zijn 3638 variantdatapunten weergegeven in Figuur 2. Zoals voor Figuur 1 kunnen drie groepen variantdatapunten (21A-B, 22A-B en 23) worden onderscheiden: • 1947 variantdatapunten 21A en 21B zijn puur homozygoot en stellen variantdatapunttoestanden AAaa (te weten 21A) en BBbb (te weten 21B) voor. • 647 variantdatapunten 22A en 22B stellen variantdatapunttoestanden AAab (te weten 22A) en BBab (te weten 22B) voor. • 1044 variantdatapunten 23 zijn heterozygoot en stellen alle andere variantdatapunttoestanden voor (te weten ABaa, ABab en ABbb).

De verticale lijnen 24 en 25 bij allelfrequenties 0.3 en 0.7 geven voorbeelddrempelwaarden aan om de heterozygote variantdatapunten te scheiden (dus de heterozygote genetische markeringen) van de rest van de variantdatapunten. Deze variantdatapunten worden in deze uitvoeringsvorm gebruikt om de foetale fractie te schatten, zoals hieronder uitgelegd. De vakman zal begrijpen dat andere minimum en maximum drempelwaarden zouden kunnen zijn gekozen, bijvoorbeeld 0.2 en 0.8, of 0.4 en 0.6, of andere waarden zoals 0.301 en 0.699, of zelf combinaties hiervan, zoals 0.2 en 0.7, of 0.3 en 0.6, of 0.4 en 0.8, etc.

Laat

één van de variantdatapunten in dit voorbeeld zijn, getoond in Figuur 1, met totale dekking

= 1697, waarbij 911 inlezingen het REF-allel bevatten op de bekende SNP-positie (

= 911) en 786 inlezingen het ALT-allel op de bekende SNP-positie bevatten (

= 786). De allelfrequentie

valt tussen de minimum en maximum drempel voor heterozygositeit en dus wordt variantdatapunt üD geselecteerd als deel van de deelverzameling gedetecteerd in de werkwijze-uitvoeringsvorm en gebruikt om de foetale fractie te schatten.

Figuur 3 illustreert schematisch een voorbeeldoptimalisatie zoals uitgevoerd in een uitvoeringsvorm van een werkwijze volgens voorliggende uitvinding. Figuur 3 toont horizontaal de geschatte foetale fractie FF, en toont verticaal de geaggregeerde (logaritmische) waarschijnlijkheid van een overeenstemmende geschatte foetale fractie FF.

Laat

= 4 % een initiële schatting zijn van de foetale fractie FF. Gebruikmakend van deze schatting van de foetale fractie en aannemend dat het aantal inlezingen een Poissondistributie volgt, kunnen probabiliteitswaarden worden berekend die aangeven hoe goed variantdatapunt

overeenstemt met de toestanden ABaa, ABab of ABbb. Voor de duidelijkheid van voorstelling, is de natuurlijke logaritme van de probabiliteitswaarden hier gegeven. De respectieve logaritmewaarden van de probabiliteiten berekend door de werkwijze-uitvoeringsvorm in dit voorbeeld zijn: • Toestand ABaa:-9.9, • Toestand ABab:-13.4, • Toestand ABbb:-19.4.

Dit betekent dat toestand ABaa de meest waarschijnlijke toestand voor

is, gegeven de huidige waarde van de schatting

voor de foetale fractie FF. Wanneer de logaritmische waarden van de probabiliteiten van alle variantdatapunten worden geaggregeerd, dus voor alle genetische markeringen in de gedetecteerde deelverzameling, is de logaritmische waarschijnlijkheid Q van

= 4%-7916.08.

Varieer vervolgens de schatting zodanig dat ze

=10 % wordt. Dan zijn de logaritmische waarden van de probabiliteiten voor variantdatapunt

: • Toestand ABaa:-9.0, • Toestand ABab:-13.4, • Toestand ABbb: -32.9.

Dit betekent dat toestand ABaa de meest waarschijnlijke toestand voor

is, gegeven de nieuwe waarde van de schattig

voor de foetale fractie FF. De logaritmische waarschijnlijkheid Q voor

= 10% over alle genetische markeringen in de gedetecteerde deelverzameling is -7672.53. Deze waarschijnlijkheid is groter dan de vorige schatting, hetgeen

=10% een meer waarschijnlijke kandidaat maakt voor de eigenlijke foetale fractie.

Analoge berekeningen kunnen worden uitgevoerd door uitvoeringsvormen van de werkwijze voor het variëren van schattingen

van de foetale fractie (bijvoorbeeld 301-306) gebruikmakend van een niet-lineaire optimalisatiewerkwijze, hetgeen kromme 31 geeft. Probabiliteiten van schattingen van de foetale fractie voor dit voorbeeld zijn getoond in Figuur 3. De maximale waarschijnlijkheid wordt bereikt (bij lijn 33) voor

= 9.5 % (bij lijn 32).

Figuur 4 illustreert schematisch een voorbeeldpuntgrafiek die data toont van meerdere monsters zoals gebruikt in een uitvoeringsvorm van een werkwijze volgens voorliggende uitvinding, en voorziet een voorbeeld van mogelijke filtering van onbetrouwbare variantdatapunten door het beperken van de gedetecteerde deelverzameling van genetische markeringen. De data stelt een batch monsters van celvrij DNA van zwangere vrouwen voor, voor welke monsters een genetische markering respectievelijk is geassocieerd met heterozygote allelparen van matemale oorsprong (dat wil zeggen ABaa, ABab, of ABbb). Voor elk heterozygoot datapunt in de voorbeeldbatch wordt de gemiddelde allelfrequentie <F;> in die gevallen waarbij ze matemaal heterozygoot (x-as) is versus de standaardafwijking SD van die allelfrequenties (te weten voor die gevallen waarbij de genetische markeringen matemaal heterozygoot zijn) geplot.

Voor een optionele eerste beperking kan de standaardafwijking van de allelffequentie worden berekend voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters. Op basis van de berekende standaardafwijking van de allelfrequentie kan minstens één genetische markering worden uitgesloten van de gedetecteerde deelverzameling (bij voorkeur alle genetische markeringen die meer dan een vooraf bepaalde afwijkingsdrempel afwijken).

Voor een optionele tweede beperking die apart of tezamen met de eerste beperking kan worden gebruikt, kan de gemiddelde allelffequentie worden berekend voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters. Op basis van een afwijking van de berekende gemiddelde allelfrequentie van een verwachtingswaarde daarvan, kan minstens één genetische markering worden uitgesloten van de gedetecteerde deelverzameling (bij voorkeur alle genetische markeringen waarvan het gemiddelde te ver verwijderd is).

De lijnen 41,42 en 43 geven voorbeelddrempels aan voor het filteren om te gebruiken in dergelijke uitsluitingen. Variantdatapunten met grote standaardafwijking (bijvoorbeeld die boven drempel 43) worden gefilterd (dat wil zeggen hun overeenstemmende genetische markeringen worden uitgesloten van de gedetecteerde deelverzameling), alsook variantdatapunten waarvan de gemiddelde heterozygote allelfrequentie te ver van 0.5 afwijkt (bijvoorbeeld die buiten drempel 41 en 42), zodoende allel-specifiek vooroordeel in de data voorstellend. Dit laat de datacluster 40 van hogere kwaliteit (meer betrouwbaarheid) over.

Een vakman zou zonder meer erkennen dat stappen van verschillende hierboven beschreven werkwijzen kunnen worden uitgevoerd door geprogrammeerde computers. Hierbij is het de bedoeling dat sommige uitvoeringsvormen eveneens programmaopslagtoestellen afdekken, bijvoorbeeld, digitale opslagmedia, die machine- of computerleesbaar zijn en machine-uitvoerbare of computeruitvoerbare instructieprogramma’s encoderen, waarbij de instructies enkele of alle stappen van de hierboven beschreven werkwijzen uitvoeren. De programmaopslagtoestellen kunnen, bijvoorbeeld, digitale geheugens, magnetische opslagmedia zoals magnetische schijven en magnetische tapes, harde schijven, of optisch leesbare digitale dataopslagmedia zijn. Het is tevens de bedoeling dat de uitvoeringsvormen computers afdekken die geprogrammeerd zijn om de stappen van de hierboven beschreven werkwijzen uit te voeren.

De functies van de verschillende elementen getoond in de figuren, inclusief functionele blokken gelabeld als “processoren” of “modules”, kunnen worden voorzien door het gebruik van toegewijde hardware zowel als hardware in staat om software uit te voeren in overeenstemming met geschikte software. Indien voorzien door een processor, kunnen de functies worden voorzien door een enkele toegewijde processor, door een enkele gedeelde processor, of door een veelvoud aan individuele processoren, waarvan er enkele gedeeld zijn. Bovendien hoort expliciet gebruik van de term "processor” of “controller” niet te worden uitgelegd als exclusief verwijzen naar hardware in staat om software uit te voeren, en mag dit impliciet omvatten, zonder beperking, digitale signaal verwerkings- (DSV) hardware, netwerkprocessor, application specific integrated circuit (ASIC), field programmable gâte array (FPGA), read only memory (ROM) voor het opslaan van software, random access memory (RAM), en niet-volatiele opslag. Andere hardware, conventioneel en/of specifiek ontworpen, kan eveneens worden omvat. Op gelijkaardige wijze zijn schakelaars getoond in de figuren slechts conceptueel. Hun functie kan uitgevoerd worden door het bedienen van programmalogica, door middel van specifieke logica, door interactie van programmacontrole en specifieke logica, of zelfs manueel, waarbij de specifieke techniek geselecteerd kan worden door een persoon die de functie implementeert zoals in het bijzonder begrepen wordt uit de context.

De vakman zal begrijpen dat blokschema’s conceptuele aanzichten van voorbeeldschakelingen waarin de principes van de uitvinding geïmplementeerd zijn, tonen. Op gelijkaardige wijze zal begrepen worden dat grafieken, stroomschema’s, toestandtransitïeschema’s, pseudocode, en gelijkaardig verscheidene processen voorstellen die in hoofdzaak voorgesteld kunnen zijn door een computerleesbaar medium, en zo uitgevoerd kunnen worden door een computer of processor, ook al is een dergelijke computer of processor niet expliciet getoond.

Ofschoon de principes van de uitvinding hierboven zijn uiteengezet in verbinding met specifieke uitvoeringsvormen, moet men verstaan dat deze beschrijving slechts als voorbeeld is gedaan en niet als beperking van de beschermingsomvang die wordt bepaald door de bijgevoegde conclusies.

Claims

Conclusies

1. Schattingswerkwijze voor het schatten van een foetale fractie, welke werkwijze omvat: - het meten van allelaanwezigheden voor een vooraf bepaald aantal genetische markeringen in een monster van celvrij DNA van een zwangere vrouw, waarbij elke allelaanwezigheid de aanwezigheid voorstelt op een genetische markering van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen van minstens één van: een referentie-allel van matemale of foetale oorsprong, en een alternatief allel van maternale of foetale oorsprong; - op basis van de gemeten allelaanwezigheden, het berekenen van een overeenstemmend aantal allelfrequenties voor het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen; - op basis van het berekende aantal allelfrequenties, het detecteren van een deelverzameling van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, waarbij de deelverzameling geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong; en - het schatten van de foetale fractie op basis van de gedetecteerde deelverzameling, waarbij de foetale fractie de fractie voorstelt van celvrij DNA van foetale oorsprong in het monster.
2. Schattingswerkwijze volgens conclusie 1, waarbij het detecteren van de deelverzameling omvat: - op basis van het berekende aantal allelfrequenties, het selecteren uit het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, als de deelverzameling, van een tweede aantal genetische markeringen waarvan overeenstemmende allelfrequenties een vooraf bepaalde minimum allelfrequentiedrempel overschrijden en een vooraf bepaalde maximum allelfrequentiedrempel niet overschrijden.
3. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het schatten omvat: - het produceren van een initiële schatting voor de foetale fractie; en - het optimaliseren van de initiële schatting over de gedetecteerde deelverzameling.
4. Schattingswerkwijze volgens conclusie 3, waarbij het optimaliseren het maximaliseren omvat van de waarschijnlijkheid van de initiële schatting, door herhaaldelijk de volgende verzameling operaties uit te voeren terwijl de schatting wordt gevarieerd: - voor een gegeven waarde van de schatting die wordt gevarieerd, het berekenen, voor elke genetische markering in de gedetecteerde deelverzameling, van de respectieve probabiliteiten dat de genetische markering geassocieerd is met een homozygoot referentie-allelpaar van foetale oorsprong, een heterozygoot allelpaar van foetale oorsprong, en een homozygoot alternatief allelpaar van foetale oorsprong; en - het berekenen van een waarschijnlijkheid van de gegeven waarde van de schatting die gevarieerd wordt, voor de gedetecteerde deelverzameling, op basis van de berekende respectieve probabiliteiten voor elke genetische markering in de gedetecteerde deelverzameling.
5. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, omvattende het corrigeren van allel-specifiek vooroordeel voor minstens één van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, welk allel-specifiek vooroordeel te wijten is aan ongelijke amplificatie voor respectievelijk een referentie-allel en een alternatief allel voor een genetische markering.
6. Schattingswerkwijze volgens conclusie 5, waarbij het corrigeren van allel-specifiek vooroordeel voor een genetische markering omvat: - het verkrijgen van een veelvoud aan monsters van celvrij DNA van zwangere vrouwen, voor welke monsters de genetische markering respectievelijk geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong; - het berekenen van de gemiddelde allelfrequentie voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters; en - op basis van een afwijking van de berekende gemiddelde allelfrequentie van een verwachtingswaarde daarvan, het bepalen van een correctiefactor om te gebruiken voor het corrigeren.
7. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, omvattende het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door: - het bepalen voor minstens één genetische markering van de gedetecteerde deelverzameling van een statistische waarschijnlijkheid die geassocieerd is met een homozygoot allelpaar van matemale oorsprong; en - op basis van de bepaalde statistische waarschijnlijkheid of waarschijnlijkheden, het uitsluiten van minstens één genetische markering van de gedetecteerde deelverzameling.
8. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, omvattende het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door: - het verkrijgen van een veelvoud aan monsters van celvrij DNA van zwangere vrouwen, voor welke monsters een genetische markering respectievelijk geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong; - het berekenen van de standaardafwijking van de allelfrequentie voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters; en - op basis van de berekende standaardafwijking van de allelfrequentie, het uitsluiten van minstens één genetische markering van de gedetecteerde deelverzameling.
9. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, omvattende het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door: - het verkrijgen van een veelvoud aan monsters van celvrij DNA van zwangere vrouwen, voor welke monsters de genetische markering respectievelijk geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong; - het berekenen van de gemiddelde allelfrequentie voor de genetische markering over het veelvoud aan monsters; en - op basis van een afwijking van de berekende gemiddelde allelfrequentie van een verwachtingswaarde daarvan, het uitsluiten van minstens één genetische markering van de gedetecteerde deelverzameling.
10. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, omvattende het beperken van de gedetecteerde deelverzameling door: - het uitsluiten van minstens één genetische markering van de gedetecteerde deelverzameling, welke minstens één genetische markering, voor het gebruikte monsters, minder gemeten allelaanwezigheden heeft dan een vooraf bepaalde drempel.
11. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het monster matemaal bloed, plasma, urine, cerebrospinale vloeistof, serum, saliva of transcervicale spoelingsvloeistof is.
12. Schattingswerkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het verkrijgen ten minste één van de volgende omvat: polymerase kettingreactie (polymerase chain reaction, PCR), ligase kettingreactie, nucleïnezuur-sequentiegebaseerde amplificatie (nucleic acid sequence based amplification, NASBA), en vertakte DNA-werkwijzen; en bij voorkeur PCR.
13. Computerprogrammaproduct omvattende computeruitvoerbare instructies om, wanneer het programma wordt uitgevoerd op een computer, minstens de stap uit te voeren van het schatten van de foetale fractie van de werkwijze volgens één der voorgaande conclusies.
14. Digitaal opslagmedium dat een machine-uitvoerbaar programma van instructies encodeert om minstens de stap uit te voeren van het schatten van de foetale fractie van de werkwijze volgens één der conclusies 1-12.
15. Schattingssysteem voor het schatten van een foetale fractie, welk systeem omvat: - een metingsmodule ingericht voor het meten van allelaanwezigheden voor een vooraf bepaald aantal genetische markeringen in een monster van celvrij DNA van een zwangere vrouw, waarbij elke allelaanwezigheid de aanwezigheid voorstelt op een genetische markering van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen van minstens één van: een referentie-allel van maternale of foetale oorsprong, en een alternatief allel van matemale of foetale oorsprong; - een berekeningsmodule ingericht voor, op basis van de gemeten allelaanwezigheden, het berekenen van een overeenstemmend aantal allelfrequenties voor het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen; - een detectiemodule ingericht voor, op basis van het berekende aantal allelfrequenties, het detecteren van een deelverzameling van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, waarbij de deelverzameling geassocieerd is met heterozygote allelparen van matemale oorsprong; en - een schattingsmodule ingericht voor het schatten van de foetale fractie op basis van de gedetecteerde deelverzameling, waarbij de foetale fractie de fractie voorstelt van celvrij DNA van foetale oorsprong in het monster.
16. Schattingssysteem volgens conclusie 15, omvattende een vooroordeelcorrectiemodule ingericht voor het corrigeren van allel-specifiek vooroordeel voor minstens één van het vooraf bepaalde aantal genetische markeringen, welk allel-specifiek vooroordeel te wijten is aan ongelijke amplificatie voor respectievelijk een referentie-allel en een alternatief allel voor een genetische markering.
17. Schattingssysteem volgens conclusie 15 of 16, omvattende een beperkingsmodule ingericht voor het uitvoeren van de stap van het beperken van de gedetecteerde deelverzameling van één der conclusies 7-10.