BE1022875B1 - COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS - Google Patents

COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS Download PDF

Info

Publication number
BE1022875B1
BE1022875B1 BE2015/5177A BE201505177A BE1022875B1 BE 1022875 B1 BE1022875 B1 BE 1022875B1 BE 2015/5177 A BE2015/5177 A BE 2015/5177A BE 201505177 A BE201505177 A BE 201505177A BE 1022875 B1 BE1022875 B1 BE 1022875B1
Authority
BE
Belgium
Prior art keywords
antigen
omv
antigens
seq
spa
Prior art date
Application number
BE2015/5177A
Other languages
French (fr)
Inventor
Fabio Bagnoli
Guido Grandi
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals S.A. filed Critical Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Application granted granted Critical
Publication of BE1022875B1 publication Critical patent/BE1022875B1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'invention concerne des antigènes de S. aureus qui peuvent être utiles pour une immunisation lorsqu'ils sont utilisés en combinaison et en particulier, une composition pharmaceutique d'au moins deux antigènes choisis parmi (i) un antigène hla, (ii) un antigène sta006, (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa comme étant particulièrement utiles pour une immunisation. Les antigènes peuvent être compris au sein de vésicules de la membrane externe (OMV).

FIG.1 L'invention propose également une OMV à partir d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus. L'antigène/les antigènes peut/peuvent être partiellement présent (s) dans la membrane de l'OMV et partiellement présent (s) dans la lumière de l'OMV ou libres dans la lumière de l'OMV. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention.

The invention relates to S. aureus antigens which may be useful for immunization when used in combination and in particular a pharmaceutical composition of at least two antigens selected from (i) an hla antigen, (ii) a antigen sta, (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen as being particularly useful for immunization. The antigens can be included within outer membrane vesicles (OMV).

FIG. 1 The invention also provides OMV from a Gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen. The antigen / antigens may be partially present in the OMV membrane and partially present in the OMV lumen or free in the OMV lumen. The invention also proposes a process for preparing an OMV of the invention.

Description

COMPOSITIONS POUR UNE IMMUNISATION CONTRE STAPHYLOCOCCUSCOMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST STAPHYLOCOCCUS

AUREUSAureus

Cette demande revendique la priorité de la demande de brevet européen 14161861.1 (déposée le 26 mars 2014), dont l'intégralité est incorporée dans la présente par référence pour tous les objets.This application claims the priority of the European Patent Application 14161861.1 (filed March 26, 2014), the entirety of which is incorporated herein by reference for all objects.

Domaine techniqueTechnical area

Cette invention concerne des combinaisons d'antigènes de S. aureus et leur utilisation en immunisation.This invention relates to combinations of S. aureus antigens and their use in immunization.

Contexte de l'état de l'artState of the art context

Staphylococcus aureus est une bactérie sphérique Gram positif. Aux Etats-Unis, la mortalité annuelle dépasse celle de toute autre maladie infectieuse, y compris le VIH/SIDA, et S. aureus est la cause majeure d’infections de la circulation sanguine, des voies respiratoires basses, de la peau et des tissus mous. S. aureus provoque tout un éventail de maladies allant des infections mineures de la peau à des maladies menaçant la vie comme la pneumonie, la méningite, l'ostéomyélite, la bactériémie, l'endocardite, le syndrome du choc toxique, les abcès d'organes et la septicémie. La bactérie comporte de multiples facteurs de virulence qui sont exprimés de façon différentielle durant les différentes phases de son cycle de vie, et ainsi un vaccin qui peut prévenir une maladie pourrait ne pas en prévenir une autre. Un objet de l'invention est de proposer un vaccin qui protège contre une maladie provoquée par S. aureus, idéalement contre de multiples maladies provoquées par S. aureus.Staphylococcus aureus is a gram-positive spherical bacterium. In the United States, annual mortality exceeds that of any other infectious disease, including HIV / AIDS, and S. aureus is the leading cause of infections in the bloodstream, lower respiratory tract, skin and tissues. soft. S. aureus causes a range of diseases ranging from minor skin infections to life-threatening diseases such as pneumonia, meningitis, osteomyelitis, bacteremia, endocarditis, toxic shock syndrome, abscess organs and sepsis. The bacterium has multiple virulence factors that are differentially expressed during the different phases of its life cycle, and so a vaccine that can prevent one disease may not prevent another. An object of the invention is to provide a vaccine that protects against a disease caused by S. aureus, ideally against multiple diseases caused by S. aureus.

Le document WO 2010/119343 divulgue des antigènes de S. aureus qui peuvent être utilisés dans des vaccins pour protéger contre des maladies.WO 2010/119343 discloses S. aureus antigens that can be used in vaccines to protect against diseases.

Toutefois, il demeure le besoin d'identifier des antigènes particuliers et des combinaisons d'antigènes pour une utilisation dans des vaccins contre S. aureus. Il existe également le besoin de développer des vaccins contre S. aureus présentant une immunogénicité améliorée chez les mammifères et des procédés de production et d'administration de tels vaccins.However, there remains the need to identify particular antigens and combinations of antigens for use in S. aureus vaccines. There is also a need to develop S. aureus vaccines with improved immunogenicity in mammals and methods for producing and administering such vaccines.

Divulgation de 1'inventionDisclosure of the invention

Les inventeurs ont identifié des antigènes particuliers de S. aureus qui peuvent être utiles pour une immunisation lorsqu'ils sont utilisés en combinaison. En particulier, les inventeurs ont identifié des combinaisons d'au moins deux antigènes choisis parmi (i) un antigène hla, (ii) un antigène sta006, (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa comme étant particulièrement utiles pour une immunisation. Généralement, la combinaison est d'au moins trois de ces antigènes, et plus généralement des 4 antigènes.The inventors have identified particular S. aureus antigens that may be useful for immunization when used in combination. In particular, the inventors have identified combinations of at least two antigens selected from (i) a hla antigen, (ii) a stain antigen, (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen as being particularly useful for immunization. Generally, the combination is at least three of these antigens, and more generally 4 antigens.

Par conséquent, l'invention propose une composition pharmaceutique comprenant au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. Généralement, les combinaisons comprennent au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. Dans un aspect, la composition pharmaceutique comprend un antigène lukE et un antigène choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006, et (iii) un antigène spa. Au moins un antigène peut être compris au sein de vésicules de la membrane externe (OMV) . Lorsqu'ils sont compris au sein d'OMV, 1'antigène/les antigènes peut/peuvent être compris au sein d'OMV distinctes ou au sein de la même OMV. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Généralement, les combinaisons comprennent au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins cinq des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. Dans un aspect, la composition pharmaceutique comprend un antigène lukE et un antigène choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène spa ; (iv) un antigène staOll ; (v) un antigène esxA et (vi) un antigène esxB. Au moins un antigène peut être compris au sein de vésicules de la membrane externe (OMV). Lorsqu'ils sont compris au sein d'OMV, 1'antigène/les antigènes peut/peuvent être compris au sein d'OMV distinctes ou au sein de la même OMV. L'invention propose également une OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Les OMV peuvent comprendre au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou' elles peuvent comprendre au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elles peuvent comprendre au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi)'un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elles peuvent comprendre au moins cinq des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elles peuvent comprendre les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou elles peuvent comprendre les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention. L'invention propose également une OMV à partir d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus dans sa membrane où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Généralement, l'OMV comprend au moins deux antigènes dans sa membrane du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes dans sa membrane du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elle peut comprendre les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou elle peut comprendre les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de 1'invention. L'invention propose également une OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Généralement, l'OMV comprend au moins deux antigènes dans sa lumière du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes dans sa lumière du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'antigène ou les antigènes peut/peuvent être partiellement présent (s) dans la membrane et partiellement présent (s) dans la lumière de l'OMV. Comme variante, l'antigène ou les antigènes peut/peuvent être libre(s) dans la lumière de l'OMV. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention. Le procédé peut comprendre l'étape d'expression de l'antigène de S. aureus dans le périplasme de la bactérie Gram négatif. Le procédé peut comprendre l'étape d'expression de l'antigène de S. aureus dans le périplasme de la bactérie Gram négatif en utilisant un vecteur d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'antigène liée de façon fonctionnelle à un acide nucléique codant pour une séquence signal d'une protéine périplasmique. La séquence signal native de l'antigène de S. aureus peut être remplacée par la séquence signal d'une protéine périplasmique. L'invention propose également une OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, où la bactérie Gram négatif comprend un génome synthétique dans lequel : a) une ou plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules sont absentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences absentes, le génome est entre 1 % et 50 % plus petit, et b) une ou plusieurs séquences sont présentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences présentes, la bactérie produit des vésicules qui comprennent un ou plusieurs antigènes supplémentaires. Généralement, 1'OMV comprend au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'antigène peut être dans la lumière de l'OMV, et éventuellement libre dans la lumière de l'OMV. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins une OMV de l'invention et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique peut comprendre au moins une OMV qui comprend au moins deux antigène de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie au sein de la même OMV. En variante, la composition pharmaceutique peut comprendre de multiples OMV différentes qui comprennent au moins un antigène de S. aureus choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie dans des OMV distinctes.Accordingly, the invention provides a pharmaceutical composition comprising at least two antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen. Generally, the combinations comprise at least three antigens from the group consisting of: (i) hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen. In one aspect, the pharmaceutical composition comprises a lukE antigen and an antigen selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen, and (iii) a spa antigen. At least one antigen may be included within outer membrane vesicles (OMV). When included within OMV, the antigen / antigens can be included within separate OMVs or within the same OMV. The invention also provides a pharmaceutical composition comprising at least two antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. Generally, the combinations comprise at least three antigens from the group consisting of: (i) hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least four of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least five of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a staOOδ antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a staOOδ antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB and (iv) staOll antigen. In one aspect, the pharmaceutical composition comprises a lukE antigen and an antigen selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a spa antigen; (iv) a staOll antigen; (v) an esxA antigen and (vi) an esxB antigen. At least one antigen may be included within outer membrane vesicles (OMV). When included within OMV, the antigen / antigens can be included within separate OMVs or within the same OMV. The invention also provides an OMV from a Gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. The OMVs may comprise at least two antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or they may comprise at least three antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or they may comprise at least four of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or they may comprise at least five of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or they may comprise the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen, or they may comprise the four of the antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB and (iv) staOll antigen. The invention also proposes a process for preparing an OMV of the invention. The invention also provides an OMV from a Gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen in its membrane where the antigen is selected from the group consisting of: (i) an antigen hla ; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. Generally, OMV comprises at least two antigens in its membrane of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least three antigens in its membrane of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least four of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a staOOδ antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or it may comprise the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen, or it may comprise all four of the antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB and (iv) staOll antigen. The invention also provides a process for preparing an OMV of the invention. The invention also provides an OMV from a Gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen in its lumen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an antigen hla ; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. Generally, OMV comprises at least two antigens in its lumen from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least three antigens in its light from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least four of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB and (iv) staOll antigen. The antigen or antigens may be partially present in the membrane and partially present in OMV lumen. Alternatively, the antigen or antigens may be free in the OMV lumen. The invention also proposes a process for preparing an OMV of the invention. The method may include the step of expressing S. aureus antigen in the periplasm of the Gram-negative bacterium. The method may include the step of expressing S. aureus antigen in the periplasm of the Gram-negative bacterium using an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding the antigen operably linked to a nucleic acid encoding a signal sequence of a periplasmic protein. The native signal sequence of the S. aureus antigen may be replaced by the signal sequence of a periplasmic protein. The invention also provides an OMV from a Gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, wherein the gram negative bacterium comprises a synthetic genome in which: a) one or more nonessential sequences for the production of vesicles are absent so that, compared to the same bacteria without said absent sequences, the genome is between 1% and 50% smaller, and b) one or more sequences are present such that, compared to the same bacterium without said sequences present, the bacterium produces vesicles that include a or more additional antigens. Generally, the OMV comprises at least two antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least three antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least four of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB and (iv) staOll antigen. The antigen may be in the OMV lumen, and possibly free in the OMV lumen. The invention also proposes a process for preparing an OMV of the invention. The invention also provides a pharmaceutical composition comprising (a) at least one OMV of the invention and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition may comprise at least one OMV which comprises at least two S. aureus antigens selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, i.e. a combination of antigens is provided within the same OMV. Alternatively, the pharmaceutical composition may comprise multiple different OMVs that comprise at least one S. aureus antigen selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, i.e. a combination of antigens is provided in separate OMVs.

Les compositions pharmaceutiques et/ou les OMV de 1'invention peuvent comprendre en outre au moins un antigène choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. L'invention propose également un -procédé de génération d'une réponse immunitaire contre un antigène de S. aureus chez un mammifère, le procédé comprenant l'administration d'une quantité efficace d'une OMV de l'invention, ou d'une composition pharmaceutique de l'invention, au mammifère, où la réponse immunitaire est dirigée contre l'antigène de S. aureus dans l'OMV. L'invention propose également une OMV de l'invention, ou une composition pharmaceutique de l'invention, pour une utilisation en thérapie.The pharmaceutical compositions and / or OMVs of the invention may further comprise at least one antigen selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. The invention also provides a method of generating an immune response against a S. aureus antigen in a mammal, the method comprising administering an effective amount of an OMV of the invention, or a pharmaceutical composition of the invention, to the mammal, wherein the immune response is directed against the S. aureus antigen in OMV. The invention also provides an OMV of the invention, or a pharmaceutical composition of the invention, for use in therapy.

Combinaisons d'antigènes de S. aureus L'invention propose un ou plusieurs antigènes de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. L'invention peut impliquer en outre un ou plusieurs antigènes de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène staOll ; (ii) un antigène esxA et/ou un antigène esxB et (iii) un antigène,clfA.Combinations of S. aureus antigens The invention provides one or more S. aureus antigens selected from the group consisting of: (i) hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen. The invention may further involve one or more S. aureus antigens selected from the group consisting of: (i) a staOll antigen; (ii) esxA antigen and / or esxB antigen and (iii) antigen, clfA.

Hla L'antigène « Hla » est le « précurseur de l'alpha-hémolysine » également connu comme la « toxine alpha » ou simplement « 1'hémolysine ». Dans la souche NCTC 8325, Hla est SAOUHSC_01121 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 (GI : 88194865) . Dans la souche Newman, il est nwmn_1073 (GI : 151221285). Hla est un déterminant de virulence important produit par la plupart des souches de S. aureus, possédant une activité de formation de pores et hémolytique. Les anticorps anti-Hla peuvent neutraliser les effets délétères de la toxine dans des modèles animaux, et Hla est particulièrement utile pour une protection contre la pneumonie.Hla The "Hla" antigen is the "precursor of alpha-hemolysin" also known as "alpha toxin" or simply "hemolysin". In strain NCTC 8325, Hla is SAOUHSC_01121 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 (GI: 88194865). In the Newman strain, it is nwmn_1073 (GI: 151221285). Hla is an important virulence determinant produced by most strains of S. aureus, possessing pore and hemolytic activity. Anti-Hla antibodies can neutralize the deleterious effects of the toxin in animal models, and Hla is particularly useful for protection against pneumonia.

Les antigènes Hla peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 1 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 1 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines Hla comprennent des variants de SEQ ID NO : 1. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 1. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 1 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 1. Les 2 6 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 1 peuvent être omis de façon utile (par exemple, pour donner SEQ ID NO : 2) . Une troncature à l'extrémité C-terminale peut être également utilisée, par exemple en ne laissant que 50 acides aminés (résidus 27 à 76 de SEQ ID NO : 1) [1] . D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines.Hla antigens can elicit an antibody (e.g., when administered to a human) that recognizes SEQ ID NO: 1 and / or may comprise an amino acid sequence: (a) having 50% or more of identity (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% or more) with SEQ ID NO: 1; and / or (b) comprising a fragment of at least "n" consecutive amino acids of SEQ ID NO: 1, where "n" is 7 or greater (e.g., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or more). These Hla proteins include variants of SEQ ID NO: 1. The preferred fragments of (b) comprise an epitope derived from SEQ ID NO: 1. To other preferred fragments, one or more amino acids are missing (for example, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the C-terminus and / or one or more amino acids (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 while retaining at least one epitope of SEQ ID NO: 1. The first 26 N-terminal amino acids of SEQ ID NO: 1 can be conveniently omitted (eg, to give SEQ ID NO: 2). Truncation at the C-terminus may also be used, for example leaving only 50 amino acids (residues 27 to 76 of SEQ ID NO: 1) [1]. Other fragments omit one or more protein domains.

La toxicité de Hla peut être évitée dans des compositions de l'invention par une inactivation chimique (par exemple, en utilisant du formaldéhyde, du glutaraldéhyde ou d'autres réactifs de réticulation). Toutefois, à la place, il est préférable d'utiliser des formes mutantes de Hla qui éliminent son activité toxique tout en conservant son immunogénicité. De tels mutants détoxifiés sont déjà connus de l'état de l'art. Un antigène Hla utile comporte une mutation au niveau du résidu 61 de SEQ ID NO : 1, qui est le résidu 35 de l'antigène mature (c'est-à-dire, après omission des 26 premiers acides aminés N-terminaux = résidu 35 de SEQ ID NO : 2) . Ainsi, le résidu 61 peut ne pas être l'histidine et peut être à la place, par exemple, Ile, Val ou de préférence Leu. Une mutation His-Arg au niveau de cette position peut être également utilisée. Par exemple, SEQ ID NO : 3 est la séquence du mutant mature Hla-H35L (c'est-à-dire, SEQ ID NO : 2 avec une mutation H35L) et un antigène Hla utile comprend SEQ ID NO : 3. Une autre mutation utile remplace une longue boucle par une courte séquence, par exemple pour remplacer le 39-mer au niveau des résidus 136 à 174 de SEQ ID NO : 1 par un tétramère comme PSGS, comme dans SEQ ID NO : 4 (qui comprend également la mutation H35L) et SEQ ID NO : 5 (qui ne comprend pas la mutation H35L). Une autre mutation utile remplace le résidu Y101, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 6) . Une autre mutation utile remplace le résidu D152, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 7) . Un autre mutant utile remplace les résidus H35 et Y101, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 8). Un autre mutant utile remplace les résidus H35 et D152, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 9). D'autres antigènes utiles de Hla sont divulgués dans les références 2 et 3. SEQ ID NO : 10, 11 et 12 sont trois fragments utiles de SEQ ID NO : 1 ( 'Hla27-76' , 'Hla27-89' et 'Hla27-79' , respectivement) . SEQ ID NO : 13, 14 et 15 sont les fragments correspondants provenant de SEQ ID NO : 3.The toxicity of Hla can be avoided in compositions of the invention by chemical inactivation (e.g., using formaldehyde, glutaraldehyde or other cross-linking reagents). However, instead, it is preferable to use mutant forms of Hla that eliminate its toxic activity while maintaining its immunogenicity. Such detoxified mutants are already known from the state of the art. A useful Hla antigen has a mutation at residue 61 of SEQ ID NO: 1, which is the residue of the mature antigen (i.e., after omission of the first 26 N-terminal amino acids = residue Of SEQ ID NO: 2). Thus, residue 61 may not be histidine and may instead be, for example, Ile, Val or preferably Leu. His-Arg mutation at this position can also be used. For example, SEQ ID NO: 3 is the sequence of the mature Hla-H35L mutant (i.e., SEQ ID NO: 2 with an H35L mutation) and a useful Hla antigen comprises SEQ ID NO: 3. Useful mutation replaces a long loop with a short sequence, for example to replace 39-mer at residues 136 to 174 of SEQ ID NO: 1 with a tetramer such as PSGS, as in SEQ ID NO: 4 (which also includes H35L mutation) and SEQ ID NO: 5 (which does not include the H35L mutation). Another useful mutation replaces the Y101 residue, for example with leucine (SEQ ID NO: 6). Another useful mutation replaces the residue D152, for example with leucine (SEQ ID NO: 7). Another useful mutant replaces residues H35 and Y101, for example with leucine (SEQ ID NO: 8). Another useful mutant replaces residues H35 and D152, for example with leucine (SEQ ID NO: 9). Other useful antigens of Hla are disclosed in references 2 and 3. SEQ ID NO: 10, 11 and 12 are three useful fragments of SEQ ID NO: 1 (Hla27-76 ', Hla27-89' and 'Hla27 -79 ', respectively). SEQ ID NO: 13, 14 and 15 are the corresponding fragments from SEQ ID NO: 3.

Une séquence utile de Hla est SEQ ID NO : 16. Elle comporte une Met N-terminale, puis un dipeptide Ala-Ser provenant du vecteur d'expression, puis SEQ ID NO : 3 (provenant de la souche NCTC8325). Elle est codée par SEQ ID NO : 17.A useful sequence of Hla is SEQ ID NO: 16. It comprises an N-terminal Met, then an Ala-Ser dipeptide from the expression vector, then SEQ ID NO: 3 (from strain NCTC8325). It is encoded by SEQ ID NO: 17.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène Hla est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 121 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 122.In a preferred embodiment, the Hla antigen is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 121 and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122.

StaOOô L'antigène « StaOOô » est annoté comme « protéine de liaison du ferrichrome », et a été déjà appelé « FhuD2 » dans la littérature [4]. Dans la souche NCTC 8325, StaOOô est SAOUHSC_02554 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 18 (GI : 88196199) . Dans la souche Newman, il est nwmn_2185 (GI : 151222397).StaOOô The "StaOOô" antigen is annotated as "ferrichrome binding protein", and has already been called "FhuD2" in the literature [4]. In strain NCTC 8325, StaOOδ is SAOUHSC_02554 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 18 (GI: 88196199). In the Newman strain, it is nwmn_2185 (GI: 151222397).

StaOOô utilisé dans l'invention peut déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 18 et/ou peut comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 18, et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « η » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 18, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines Sta006 comprennent des variants de SEQ ID NO : 18. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 18. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 18 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 18. Les 17 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 18 peuvent être omis de façon utile (pour fournir SEQ ID NO : 19). D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. Des formes mutantes de Sta006 sont rapportées dans la référence 5. Un antigène Sta006 peut être lipidé, par exemple avec une cystéine N-terminale acylée. Une séquence utile de Sta006 est SEQ ID NO : 20, qui comporte une séquence Met-Ala-Ser- à l'extrémité N-terminale. Sta006 peut exister sous la forme d'un monomère ou d'un oligomère (par exemple, dimère) , avec des ions Ca++ favorisant 1'oligomérisation. L'invention peut utiliser des monomères et/ou des oligomères de Sta006. Sta006 peut être un homodimère ou un hétérodimère avec StaOll. L'antigène Sta006 comporte naturellement une cystéine N-terminale sous sa forme mature. Cette cystéine peut être délétée dans l'antigène Sta006 pour stopper la dimérisation et donner une protéine qui est plus facile à caractériser et analyser, sans impacter négativement l'immunogénicité. Les compositions contenant des antigènes Sta006 déficients en cystéine sont plus stables. Ainsi, l'antigène Sta006 peut comprendre une séquence d'acides aminés qui présente au moins 90 % (par exemple, ^ 91 %, ^ 92 %, > 93 %, ^ 94 %, > 95 %, ^ 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ^ 99,5 %) d'identité avec SEQ ID NO : 21, où le polypeptide n'a pas de groupe thiol libre, et peut déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaissent un antigène StaOOô de type sauvage (par exemple, une protéine de S. aureus constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 18) . Le polypeptide ne peut pas former des dimères covalents par l'intermédiaire de liaisons disulfure. SEQ ID NO : 21 correspond aux résidus d'acides aminés 19 à 302 de SEQ ID NO : 18. Comparativement à SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité N-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre. Comparativement à SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 23 comporte une séquence Met-Ala-Ser- à l'extrémité N-terminale. Comparativement à SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24 comporte une séquence Met-Ala-Ser- à l'extrémité N-terminale. Un polypeptide Sta006 comprenant l'une quelconque de SEQ ID NO : 21, 22, 23 ou 24 peut être utilisé dans 1'invention.StaOOO used in the invention may elicit an antibody (e.g., when administered to a human) that recognizes SEQ ID NO: 18 and / or may comprise an amino acid sequence: (a) having 50% or more identity (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% or more) with SEQ ID NO: 18, and / or (b) comprising a fragment of at least "η" consecutive amino acids of SEQ ID NO: 18, where "n" is 7 or more (e.g., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or more) . These Sta006 proteins include variants of SEQ ID NO: 18. The preferred fragments of (b) comprise an epitope derived from SEQ ID NO: 18. To other preferred fragments, one or more amino acids are missing (for example, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the C-terminus and / or one or more amino acids (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the N-terminus of SEQ ID NO: 18 while retaining at least one epitope of SEQ ID NO: 18. The first 17 N-terminal amino acids of SEQ ID NO: 18 can be conveniently omitted (to provide SEQ ID NO: 19). Other fragments omit one or more protein domains. Mutant forms of Sta006 are reported in reference 5. A Sta006 antigen can be lipidated, for example with acylated N-terminal cysteine. A useful sequence of Sta006 is SEQ ID NO: 20, which has a Met-Ala-Ser- sequence at the N-terminus. Sta006 can exist as a monomer or oligomer (eg, dimer), with Ca ++ ions promoting oligomerization. The invention can use Sta006 monomers and / or oligomers. Sta006 can be a homodimer or a heterodimer with StaOll. The Sta006 antigen naturally has an N-terminal cysteine in its mature form. This cysteine can be deleted in the Sta006 antigen to stop dimerization and provide a protein that is easier to characterize and analyze without negatively impacting immunogenicity. The compositions containing Sta006 antigens deficient in cysteine are more stable. Thus, the Sta006 antigen may comprise an amino acid sequence that is at least 90% (eg, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, and the like). %,> 98%,> 99%, 99.5%) identity with SEQ ID NO: 21, where the polypeptide does not have a free thiol group, and can elicit antibodies (for example, when is administered to a human) that recognize a wild type StaOOδ antigen (e.g., a S. aureus protein consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 18). The polypeptide can not form covalent dimers via disulfide bonds. SEQ ID NO: 21 corresponds to amino acid residues 19 to 302 of SEQ ID NO: 18. Compared to SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 has an additional amino acid residue "X" at the end N-terminal, where "X" is an amino acid that does not contain a free thiol group. Compared with SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 has a Met-Ala-Ser- sequence at the N-terminus. Compared to SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 has a Met-Ala-Ser- sequence at the N-terminus. A Sta006 polypeptide comprising any of SEQ ID NO: 21, 22, 23 or 24 may be used in the invention.

Une forme variante utile de Sta006 peut comprendre au moins une mutation ponctuelle qui remplace, modifie ou délète le résidu de cystéine présent dans la forme de type sauvage de l'antigène. Par exemple, un polypeptide Sta006 peut comprendre une séquence d'acides aminés ayant SEQ ID NO : 20, où le résidu de cystéine en position 4 de SEQ ID NO : 20 est remplacé, modifié ou délété. De préférence, le remplacement se fait par une sérine ou un résidu d'alanine. En variante, le résidu de cystéine est délété (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 23).A useful variant form of Sta006 can include at least one point mutation that replaces, modifies or deletes the cysteine residue present in the wild-type form of the antigen. For example, a Sta006 polypeptide may comprise an amino acid sequence having SEQ ID NO: 20, wherein the cysteine residue at position 4 of SEQ ID NO: 20 is replaced, modified or deleted. Preferably, the replacement is by a serine or an alanine residue. Alternatively, the cysteine residue is deleted (e.g., providing SEQ ID NO: 23).

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène Sta006 est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 123 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 124.In a preferred embodiment, the Sta006 antigen is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 123 and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 124.

lukE L'antigène « lukE » est annoté comme « leucotoxine lukE ». Dans la souche NCTC 8325, lukE est SAOUHSC_01955 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 25 (GI : 88195648).lukE The "lukE" antigen is annotated as "leukotoxin lukE". In strain NCTC 8325, lukE is SAOUHSC_01955 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 25 (GI: 88195648).

Les antigènes lukE utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 25 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 24 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 25, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines lukE comprennent des variants de SEQ ID NO : 25. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 25. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 24 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 25. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines.Useful lukE antigens can elicit an antibody (e.g., when administered to a human) that recognizes SEQ ID NO: 25 and / or may comprise an amino acid sequence: (a) having 50% or more of identity (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99.5% or more) with SEQ ID NO: 24; and / or (b) comprising a fragment of at least "n" consecutive amino acids of SEQ ID NO: 25, where "n" is 7 or greater (e.g., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or more). These lukE proteins include variants of SEQ ID NO: 25. The preferred fragments of (b) comprise an epitope derived from SEQ ID NO: 25. To other preferred fragments, one or more amino acids are missing (for example, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the C-terminus and / or one or more amino acids (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the N-terminus of SEQ ID NO: 24 while retaining at least one epitope of SEQ ID NO: 25. Other fragments omit one or more protein domains.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène lukE est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 127 ou SEQ ID NO : 129 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 128 ou SEQ ID NO : 130. spa L'antigène « spa » est annoté « protéine A » ou « SpA ». Dans la souche NCTC 8325, spa est SAOUHSC_00069 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 26 (GI : 88193885). Dans la souche Newman, il est nwmn_0055 (GI : 151220267). Toutes les souches de S. aureus expriment le gène structural pour spa, un facteur de virulence bien caractérisé dont le produit de la protéine de surface ancrée à la paroi cellulaire comporte cinq domaines de liaison d'immunoglobulines hautement homologues désignés par E, D, A, B et C [6]. Ces domaines affichent ~80 % d'identité au niveau des acides aminés, ont une longueur de 56 à 61 résidus, et sont organisés sous forme de répétitions en tandem [7]. SpA est synthétisé sous la forme d'une protéine précurseur avec un peptide signal N-terminal et un signal de tri C-terminal [8,9]. Spa ancré à la paroi cellulaire est présenté en grande abondance sur la surface staphylococcique [10,11]. Chacun de ses domaines de liaison d'immunoglobulines est composé d'hélices a antiparallèles qui s'assemblent en un faisceau à trois hélices et peuvent lier le domaine Fc de l'immunoglobuline G (IgG) [12,13], la chaîne lourde VH3 (Fab) de 1'IgM (c'est-à-dire, le récepteur des lymphocytes B) [14], le facteur de von Willebrand au niveau de son domaine Al [15] et/ou le récepteur I du TNF-α (TNFRI) [16] , qui est présenté sur les surfaces des épithéliums des voies respiratoires.In a preferred embodiment, the lukE antigen is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 127 or SEQ ID NO: 129 and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 or SEQ ID NO. : 130. spa The "spa" antigen is labeled "protein A" or "SpA". In strain NCTC 8325, spa is SAOUHSC_00069 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 26 (GI: 88193885). In the Newman strain, it is nwmn_0055 (GI: 151220267). All strains of S. aureus express the structural gene for spa, a well characterized virulence factor whose cell wall-anchored surface protein product has five highly homologous immunoglobulin binding domains designated E, D, A , B and C [6]. These domains display ~ 80% identity at the amino acid level, 56 to 61 residues in length, and are organized as tandem repeats [7]. SpA is synthesized as a precursor protein with an N-terminal signal peptide and a C-terminal sorting signal [8,9]. Spa anchored to the cell wall is shown in great abundance on the staphylococcal surface [10,11]. Each of its immunoglobulin binding domains is composed of antiparallel helices that assemble into a three-helix bundle and can bind to the Fc domain of immunoglobulin G (IgG) [12,13], the heavy chain VH3 (Fab) of IgM (i.e., B cell receptor) [14], von Willebrand factor at its Al domain [15] and / or TNF-α receptor I (TNFRI) [16], which is presented on the surfaces of airway epithelia.

Les antigènes spa utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 26 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 2 6 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 26, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines spa comprennent des variants de SEQ ID NO : 26. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 26. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 26 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 26. Les 35 acides aminés C-terminaux finaux de SEQ ID NO : 26 peuvent être omis de façon utile. Les 36 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 26 peuvent être omis de façon utile. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. La référence 17 suggère gue les domaines de liaison d'IgG individuels pourraient être des immunogènes utiles, seuls ou en combinaison. SEQ ID NO : 27 est un fragment utile de SEQ ID NO : 26 ( 'Spa37-325' ) . Ce fragment contient les cinq domaines de liaison d'Ig de SpA (qui sont arrangés naturellement de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dans l'ordre E, D, A, B, C) et comprend le domaine le plus exposé de SpA. Il réduit également la similarité de l'antigène avec les protéines humaines. D'autres fragments utiles peuvent omettre 1, 2, 3 ou 4 des domaines naturels A, B, C, D et/ou E pour empêcher l'expansion excessive des lymphocytes B et ensuite l'apoptose qui pourrait survenir si spa fonctionne comme un superantigène des lymphocytes B. Comme il est rapporté dans la référence 17, d'autres fragments utiles peuvent comprendre seulement 1, 2, 3 ou 4 des domaines naturels A, B, C, D et/ou E, par exemple, ils peuvent comprendre seulement le domaine SpA(A) mais pas B à E, ou comprendre seulement le domaine SpA(D) mais pas A, B, C ou E, etc. Ainsi, un antigène spa utile pour l'invention peut comprendre 1, 2, 3, 4 ou 5 domaines de liaison d'IgG, mais idéalement il en comprend 4 ou moins.Useful spa antigens can elicit an antibody (e.g., when administered to a human) that recognizes SEQ ID NO: 26 and / or may include an amino acid sequence: (a) having 50% or more of identity (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99.5% or more) with SEQ ID NO: 26; and / or (b) comprising a fragment of at least "n" consecutive amino acids of SEQ ID NO: 26, where "n" is 7 or greater (e.g., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or more). These spa proteins include variants of SEQ ID NO: 26. The preferred fragments of (b) comprise an epitope derived from SEQ ID NO: 26. To other preferred fragments, one or more amino acids are missing (for example, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the C-terminus and / or one or more amino acids (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the N-terminus of SEQ ID NO: 26 while retaining at least one epitope of SEQ ID NO: 26. The final 35 C-terminal amino acids of SEQ ID NO: 26 may be omitted in a useful manner. The first 36 N-terminal amino acids of SEQ ID NO: 26 may be omitted in a useful manner. Other fragments omit one or more protein domains. Reference 17 suggests that individual IgG binding domains could be useful immunogens, alone or in combination. SEQ ID NO: 27 is a useful fragment of SEQ ID NO: 26 ('Spa37-325'). This fragment contains the five SpA Ig binding domains (which are naturally arranged from the N-terminus to the C-terminus in the order E, D, A, B, C) and includes the domain. the most exposed of SpA. It also reduces the similarity of the antigen with human proteins. Other useful fragments may omit 1, 2, 3 or 4 of the natural domains A, B, C, D and / or E to prevent excessive expansion of B cells and then apoptosis that could occur if spa functions as a B-cell superantigen As reported in reference 17, other useful fragments may comprise only 1, 2, 3 or 4 of the A, B, C, D and / or E natural domains, for example, they may comprise only the SpA domain (A) but not B to E, or include only the SpA domain (D) but not A, B, C or E, etc. Thus, a spa antigen useful for the invention may comprise 1, 2, 3, 4 or 5 IgG binding domains, but ideally it comprises 4 or less.

Si un antigène comprend seulement un type de domaine de spa (par exemple, seulement le domaine SpA(A) ou SpA(D)), il peut comprendre plus d'une copie de ce domaine, par exemple des domaines SpA(D) multiples dans une seule chaîne polypeptidique.If an antigen comprises only one type of spa domain (for example, only the SpA (A) or SpA (D) domain), it may include more than one copy of this domain, for example multiple SpA (D) domains. in a single polypeptide chain.

Un domaine individuel au sein de l'antigène peut être muté au niveau de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides aminés ou plus par rapport à SEQ ID NO : 26 (par exemple, voir la référence 17, divulguant des mutations au niveau des résidus 3 et/ou 24 du domaine D, au niveau du résidu 46 et/ou 53 du domaine A, etc.). De tels mutants ne devront pas éliminer la capacité de l'antigène à déclencher un anticorps qui reconnaît SEQ ID NO : 26, mais ils peuvent éliminer la liaison de l'antigène aux IgG et/ou d'autres protéines humaines (comme des protéines du sang humain).An individual domain within the antigen can be mutated at the level of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acids compared to SEQ ID NO: 26 (e.g. see reference 17, disclosing mutations at residues 3 and / or 24 of domain D, at residue 46 and / or 53 at domain A, etc.). Such mutants should not eliminate the ability of the antigen to elicit an antibody that recognizes SEQ ID NO: 26, but they can eliminate antigen binding to IgG and / or other human proteins (such as human blood).

Dans certains aspects, un antigène spa comprend (a) une ou plusieurs substitutions d'acides aminés dans un sous-domaine de liaison de Fc d'IgG de domaine SpA A, B, C, D et/ou E, ce qui perturbe ou diminue la liaison au Fc d'IgG, et (b) une ou plusieurs substitutions d'acides aminés dans un sous-domaine de liaison de Vh3 de domaine SpA A, B, C, D et/ou E, ce qui perturbe ou diminue la liaison au Vh3 . Dans certains modes de réalisation, un SpA variant comprend au moins ou au plus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 peptides de domaine D de SpA variant ou plus.In some aspects, a spa antigen comprises (a) one or more amino acid substitutions in a SpA domain IgG Fc binding subdomain A, B, C, D and / or E, which disrupts or decreases binding to IgG Fc, and (b) one or more amino acid substitutions in a SpA domain Vh3 binding subdomain A, B, C, D and / or E, which disrupts or decreases the link to Vh3. In some embodiments, a variant SpA comprises at least or at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more variant D domain peptides of SpA.

Dans certains aspects, les résidus d'acides aminés F5, Q9, Q10, Sil, F13, Y14, L17, N28, 131, et/ou K35 du sous-domaine de liaison de Fc d'IgG du domaine D sont modifiés ou substitués, c'est-à-dire les acides aminés 100, 104, 105, 106, 108, 109, 112, 123, 126 et/ou 130 de SEQ ID NO : 26. Dans certains aspects, les résidus d'acides aminés Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, et/ou E47 du sous-domaine de liaison de VH3 du domaine D sont modifiés ou substitués de telle façon que la liaison au Fc ou au VH3 est atténuée, c'est-à-dire les acides aminés 121, 124, 125, 128, 131, 132, 135, 138 et/ou 141 de SEQ ID NO : 26. Dans d'autres aspects, des modifications ou des substitutions correspondantes peuvent être créées dans des positions correspondantes du domaine A, B, C et/ou E. Les positions correspondantes sont définies par l'alignement de la séquence d'acides aminés du domaine D avec une ou plusieurs des séquences d'acides aminés provenant d'autres domaines de liaison d'IgG de SpA. Dans certains aspects, la substitution d'acide aminé peut être de l'un quelconque des 20 autres acides aminés. Dans un autre aspect, des substitutions d'acides aminés conservatives peuvent être exclues spécifiquement des substitutions d'acides aminés possibles. Dans d'autres aspects, seules des substitutions non conservatives sont incluses. Dans tous les cas, il est envisagé toute substitution ou combinaison de substitutions qui réduit la liaison du domaine de telle façon que la toxicité de SpA est significativement réduite. La signification de la réduction de liaison se rapporte à un variant qui produit une toxicité minimale ou aucune toxicité lorsqu'il est introduit chez un sujet et elle peut être estimée en utilisant des procédés in vitro décrits dans la présente.In some aspects, amino acid residues F5, Q9, Q10, Sil, F13, Y14, L17, N28, 131, and / or K35 of the domain D IgG Fc binding subdomain are modified or substituted. , i.e., amino acids 100, 104, 105, 106, 108, 109, 112, 123, 126 and / or 130 of SEQ ID NO: 26. In some aspects, amino acid residues Q26 , G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, and / or E47 of the domain D VH3 binding subdomain are modified or substituted such that the binding to Fc or VH3 is attenuated, that is, amino acids 121, 124, 125, 128, 131, 132, 135, 138 and / or 141 of SEQ ID NO: 26. In other aspects, corresponding modifications or substitutions can be made in corresponding positions of the domain A, B, C and / or E. The corresponding positions are defined by the alignment of the amino acid sequence of the domain D with one or more of the amino acid sequences from other domains of made friends SpA IgG sound. In some aspects, the amino acid substitution may be of any of the other 20 amino acids. In another aspect, conservative amino acid substitutions may be specifically excluded from possible amino acid substitutions. In other aspects, only non-conservative substitutions are included. In any case, any substitution or combination of substitutions which reduces the binding of the domain is contemplated such that the toxicity of SpA is significantly reduced. The significance of the binding reduction refers to a variant that produces minimal toxicity or no toxicity when introduced into a subject and can be estimated using in vitro methods described herein.

Dans un aspect de l'invention, les résidus de glutamine en position 9 et/ou 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire les acides aminés 104 et/ou 105 de SEQ ID NO : 26 (ou des positions correspondantes dans d'autres domaines) sont mutés. Dans un autre aspect, les résidus d'acide aspartique 36 et/ou 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire les acides aminés 131 et 132 de SEQ ID NO : 26 (ou les positions correspondantes dans d'autres domaines) sont mutés. Dans un autre aspect, les résidus de glutamine 9 et 10, et d'acide aspartique 36 et 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire les acides aminés 104, 105, 131 et 132 de SEQ ID NO : 26 (ou les positions correspondantes dans d'autres domaines) sont mutés.In one aspect of the invention, glutamine residues at position 9 and / or 10 of SpA domain D, i.e., amino acids 104 and / or 105 of SEQ ID NO: 26 (or in other areas) are mutated. In another aspect, aspartic acid residues 36 and / or 37 of SpA domain D, i.e., amino acids 131 and 132 of SEQ ID NO: 26 (or corresponding positions in other domains) are mutated. In another aspect, residues of glutamine 9 and 10, and aspartic acid 36 and 37 of domain D of SpA, i.e., amino acids 104, 105, 131 and 132 of SEQ ID NO: 26 (or corresponding positions in other areas) are mutated.

Dans d'autres aspects, l'acide aminé glutamine (Q) en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 2 6 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N) , un acide aspartique (D) , une cystéine (C) , un acide glutamique (E) , une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H) , une isoleucine (I) , une lysine (K) , une leucine (L) , une méthionine (Μ) , une proline (P) , une sérine (S), une thréonine (T) , une valine (V), un tryptophane (W), ou une tyrosine (Y). Dans certains aspects, la glutamine en position 9 peut être substituée par une arginine (R) . Dans un autre aspect, la glutamine en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substituée par une lysine ou une glycine.In other aspects, the amino acid glutamine (Q) at position 9 of SpA domain D, i.e., amino acid 104 of SEQ ID NO: 26 (or its analogous amino acid in other domains of SpA) can be replaced by alanine (A), asparagine (N), aspartic acid (D), cysteine (C), glutamic acid (E), phenylalanine (F), glycine (G), a histidine (H), an isoleucine (I), a lysine (K), a leucine (L), a methionine (Μ), a proline (P), a serine (S), a threonine (T) ), a valine (V), a tryptophan (W), or a tyrosine (Y). In some aspects, 9-position glutamine may be substituted with arginine (R). In another aspect, glutamine at position 9 of SpA domain D, i.e., amino acid 104 of SEQ ID NO: 26, or its equivalent, may be substituted with lysine or glycine.

Dans un autre aspect, l'acide aminé glutamine (Q) en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N) , un acide aspartique (D) , une cystéine (C) , un acide glutamique (E) , une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H), une isoleucine (I), une lysine (K), une leucine (L) , une méthionine (M) , une proline (P) , une sérine (S), une thréonine (T), une valine (V), un tryptophane (W), ou une tyrosine (Y). Dans certains aspects, la glutamine en position 10 peut être substituée par une arginine (R). Dans un autre aspect, la glutamine en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substituée par une lysine ou une glycine.In another aspect, the amino acid glutamine (Q) at position 10 of domain D of SpA, i.e., amino acid 105 of SEQ ID NO: 26 (or its analogous amino acid in other SpA domains) can be replaced by an alanine (A), an asparagine (N), an aspartic acid (D), a cysteine (C), a glutamic acid (E), a phenylalanine (F), a glycine (G ), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), proline (P), serine (S), threonine (T), valine (V), tryptophan (W), or tyrosine (Y). In some aspects, glutamine at the 10-position may be substituted with arginine (R). In another aspect, glutamine at position 10 of SpA domain D, i.e., amino acid 105 of SEQ ID NO: 26, or its equivalent, may be substituted with lysine or glycine.

Dans certains aspects, l'acide aspartique (D) en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N), une arginine (R), une cystéine (C), une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H) , une isoleucine (I), une lysine (K), une leucine (L), une méthionine (M) , une proline (P) , une glutamine (Q) , une sérine (S) , une thréonine (T) , une valine (V) , un tryptophane (W) , ou une tyrosine (Y) . Dans certains aspects, l'acide aspartique en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26 peut être substitué par un acide glutamique (E). Dans certains aspects, un acide aspartique en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substitué par une alanine ou une sérine.In some aspects, aspartic acid (D) at position 36 of SpA domain D, i.e., amino acid 131 of SEQ ID NO: 26 (or its analogous amino acid in other SpA) can be replaced by alanine (A), asparagine (N), arginine (R), cysteine (C), phenylalanine (F), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), a lysine (K), a leucine (L), a methionine (M), a proline (P), a glutamine (Q), a serine (S), a threonine (T), a valine (V) ), tryptophan (W), or tyrosine (Y). In some aspects, aspartic acid at position 36 of the SpA D domain, i.e., amino acid 131 of SEQ ID NO: 26 may be substituted with glutamic acid (E). In some aspects, an aspartic acid at position 36 of the SpA D domain, i.e., amino acid 131 of SEQ ID NO: 26, or its equivalent, may be substituted with alanine or serine.

Dans un autre aspect, l'acide aspartique (D) en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N), une arginine (R), une cystéine (C), une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H) , une isoleucine (I), une lysine (K), une leucine (L), une méthionine (M) , une proline (P) , une glutamine (Q) , une sérine (S) , une thréonine (T) , une valine (V) , un tryptophane (W) , ou une tyrosine (Y). Dans certains aspects, l'acide aspartique en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 peut être substitués par un acide glutamique (E). Dans certains aspects, un acide aspartique en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substitué par une alanine ou une sérine.In another aspect, aspartic acid (D) at position 37 of domain D of SpA, i.e., amino acid 132 of SEQ ID NO: 26 (or its analogous amino acid in other domains of SpA) can be replaced by alanine (A), asparagine (N), arginine (R), cysteine (C), phenylalanine (F), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), proline (P), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), valine ( V), tryptophan (W), or tyrosine (Y). In some aspects, aspartic acid at position 37 of SpA domain D, i.e., amino acid 132 of SEQ ID NO: 26 may be substituted with glutamic acid (E). In some aspects, aspartic acid at position 37 of SpA domain D, i.e., amino acid 132 of SEQ ID NO: 26, or its equivalent, may be substituted with alanine or serine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 2 6 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V). Dans certains aspects, l'acide aminé en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une glycine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une lysine.In a particular embodiment, the amino acid at position 9 of domain D of SpA, i.e., amino acid 104 of SEQ ID NO: 26 (or a similar amino acid in another field of SpA) is replaced by alanine (A), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), proline (P), serine (S), or valine (V). In some aspects, the amino acid at position 9 of SpA domain D, i.e., amino acid 104 of SEQ ID NO: 26 is replaced by a glycine. In another aspect, the amino acid at position 9 of SpA domain D, i.e., amino acid 104 of SEQ ID NO: 26 is replaced with lysine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 2 6 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V) . Dans certains aspects, l'acide aminé en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une glycine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une lysine.In a particular embodiment, the amino acid at position 10 of domain D of SpA, that is, amino acid 105 of SEQ ID NO: 26 (or a similar amino acid in another field of SpA) is replaced by alanine (A), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), proline (P), serine (S), or valine (V). In some aspects, the amino acid at position 10 of SpA domain D, i.e., amino acid 105 of SEQ ID NO: 26 is replaced by a glycine. In another aspect, the amino acid at position 10 of domain D of SpA, i.e., amino acid 105 of SEQ ID NO: 26 is replaced by lysine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 2 6 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V). Dans certains aspects, l'acide aminé en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 2 6 est remplacé par une sérine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une alanine.In a particular embodiment, the amino acid at position 36 of domain D of SpA, i.e., amino acid 131 of SEQ ID NO: 26 (or a similar amino acid in another field of SpA) is replaced by alanine (A), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), proline (P), serine (S), or valine (V). In some aspects, the amino acid at position 36 of SpA domain D, i.e., amino acid 131 of SEQ ID NO: 26 is replaced with serine. In another aspect, the amino acid at position 36 of SpA domain D, i.e., amino acid 131 of SEQ ID NO: 26 is replaced by alanine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V). Dans certains aspects, l'acide aminé en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une sérine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une alanine.In a particular embodiment, the amino acid at position 37 of domain D of SpA, that is, amino acid 132 of SEQ ID NO: 26 (or a similar amino acid in another SpA domain ) is replaced by alanine (A), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), proline (P), serine (S), or valine (V). In some aspects, the amino acid at position 37 of domain D of SpA, i.e., amino acid 132 of SEQ ID NO: 26 is replaced by serine. In another aspect, the amino acid at position 37 of domain D of SpA, i.e., amino acid 132 of SEQ ID NO: 26 is replaced by alanine.

Un variant utile de Spa est SpakkAA5 (SEQ ID NO : 28) qui comprend les cinq domaines de liaison d'immunoglobulines avec quatre substitutions d'acides aminés, correspondant à Gln9Lys, GlnlOLys, Asp36Ala et Asp37Ala du domaine D, c'est-à-dire les acides aminés 104, 105, 131 et 132 de SEQ ID NO : 26, dans chacun de ses cinq domaines de liaison d'immunoglobulines (E, D, A, B et C) .A useful Spa variant is SpakkAA5 (SEQ ID NO: 28) which comprises the five immunoglobulin binding domains with four amino acid substitutions, corresponding to Gln9Lys, GlnlOLys, Asp36Ala and Asp37Ala of the D domain, i.e. ie amino acids 104, 105, 131 and 132 of SEQ ID NO: 26, in each of its five immunoglobulin binding domains (E, D, A, B and C).

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène Spa est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 125 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 126.In a preferred embodiment, the Spa antigen is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 125 and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 126.

StaOll L'antigène « StaOll » a été annoté à l'origine simplement comme « lipoprotéine ». Dans la souche NCTC 8325, StaOll est SAOUHSC_00052 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 41 (GI : 88193872). L'antigène StaOll connu comporte une cystéine N-terminale sous sa forme mature, et il peut être lipidé. StaOll de type sauvage contenant une cystéine peut exister sous la forme d'un monomère ou d'un oligomère (par exemple, dimère covalent), avec des ions Ca++ favorisant 1'oligomérisation.StaOll The "StaOll" antigen was originally annotated simply as "lipoprotein". In strain NCTC 8325, StaO11 is SAOUHSC_00052 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 41 (GI: 88193872). The known StaOll antigen has an N-terminal cysteine in its mature form, and it can be lipidized. Wild-type StaOll containing a cysteine may exist as a monomer or oligomer (eg, covalent dimer), with Ca ++ ions promoting oligomerization.

Il peut être utilisé une forme variante de StaOll qui ne peut pas former des dimères covalents par l'intermédiaire de liaisons disulfure. Dans de tels modes de réalisation, le polypeptide ne contient aucun groupe thiol libre (dans des conditions réductrices). Il peut déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaissent un antigène StaOll de type sauvage (par exemple, SEQ ID NO : 45, 53, 54 ou 55). Le polypeptide peut comprendre une séquence d'acides aminés présentant 80 % ou plus d'identité (par exemple, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 47 à 52. SEQ ID NO : 47 correspond aux résidus d'acides aminés 26 à 256 de SEQ ID NO . : 41. Comparativement à SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité N-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, est Ser = SEQ ID NO : 52) . SEQ ID NO : 4 9 comporte une séquence Met-Gly- à l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 47. SEQ ID NO : 50 comporte une séquence Met-Gly- à l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 48. SEQ ID NO : 51 a la séquence de SEQ ID NO : 50, dans laquelle « X » est une sérine. Un polypeptide StaOll comprenant l'une quelconque de SEQ ID NO : 47 à 52 peut être utilisé dans l'invention.A variant form of StaOll can be used which can not form covalent dimers via disulfide bonds. In such embodiments, the polypeptide does not contain any free thiol groups (under reducing conditions). It can elicit antibodies (e.g., when administered to a human) that recognize a wild-type StaOll antigen (e.g., SEQ ID NO: 45, 53, 54 or 55). The polypeptide may comprise an amino acid sequence having 80% or more identity (e.g., 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%). %, 99%, 99.5% or greater) with any of SEQ ID NO: 47 to 52. SEQ ID NO: 47 corresponds to amino acid residues 26 to 256 of SEQ ID NO. : 41. Compared with SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 has an additional amino acid residue "X" at the N-terminus, where "X" is an amino acid that does not contain a thiol group free (for example, is Ser = SEQ ID NO: 52). SEQ ID NO: 49 contains a Met-Gly- sequence at the N-terminus of SEQ ID NO: 47. SEQ ID NO: 50 has a Met-Gly- sequence at the N-terminus of SEQ ID NO : 48. SEQ ID NO: 51 has the sequence of SEQ ID NO: 50, wherein "X" is a serine. A StaOll polypeptide comprising any of SEQ ID NOs: 47 to 52 may be used in the invention.

Des formes variantes de SEQ ID NO : 41 qui peuvent être également utilisées comprennent, mais n'y sont pas limitées, SEQ ID NO : 42, 43 et 44 avec diverses substitutions Ile/Val/Leu. Comparativement à SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 42 a Leu-146 à la place de Ile-146 et Ile-165 à la place de Leu-165. Comparativement à SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 43 a Val-146 à la place de Ile-146 et Ile-165 à la place de Leu-165. Comparativement à SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 44 a Leu-146 à la place de Ile-146 et Val-165 à la place de Leu-165. Les 23 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 41 à 44 (c'est-à-dire, le peptide signal) peuvent être omis de façon utile pour fournir SEQ ID NO : 45, 53, 54 et 55, respectivement. Ainsi, un polypeptide StaOll de l'invention peut comprendre les résidus 26 à 256 de l'une quelconque de SEQ ID NO : 41 à 44, et il peut déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaissent l'antigène StaOll mature (par exemple, SEQ ID NO : 45, 53, 54 ou 55).Alternative forms of SEQ ID NO: 41 which may also be used include, but are not limited to, SEQ ID NO: 42, 43 and 44 with various Ile / Val / Leu substitutions. Compared with SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 a Leu-146 in place of Ile-146 and Ile-165 in place of Leu-165. Compared to SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 has Val-146 instead of Ile-146 and Ile-165 instead of Leu-165. Compared with SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44a Leu-146 instead of Ile-146 and Val-165 instead of Leu-165. The first 23 N-terminal amino acids of SEQ ID NO: 41 to 44 (i.e., the signal peptide) can be conveniently omitted to provide SEQ ID NOs: 45, 53, 54 and 55, respectively . Thus, a StaOll polypeptide of the invention may comprise residues 26 to 256 of any of SEQ ID NO: 41 to 44, and may elicit antibodies (e.g., when administered to a human) which recognize the mature StaOll antigen (e.g., SEQ ID NO: 45, 53, 54 or 55).

Une forme variante utile de StaOll peut comprendre au moins une mutation ponctuelle qui remplace, modifie ou délète le résidu de cystéine présent dans la forme de type sauvage de l'antigène. Par exemple, un polypeptide StaOll peut comprendre une séquence d'acides aminés ayant SEQ ID NO : 46, dans laquelle le résidu de cystéine en position 3 de SEQ ID NO : 4 6 est remplacé, modifié ou délété. De préférence, le remplacement est réalisé par un résidu de sérine (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 51) ou un résidu d'alanine. En variante, le résidu de cystéine est délété.A useful variant form of StaOll may include at least one point mutation that replaces, modifies or deletes the cysteine residue present in the wild-type form of the antigen. For example, a StaOll polypeptide may comprise an amino acid sequence having SEQ ID NO: 46, wherein the cysteine residue at position 3 of SEQ ID NO: 46 is substituted, modified or deleted. Preferably, the replacement is by a serine residue (eg, providing SEQ ID NO: 51) or an alanine residue. Alternatively, the cysteine residue is deleted.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène StaOll est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 131 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 132.In a preferred embodiment, the StaOll antigen is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 131 and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 132.

EsxABEsxAB

esxAesxA

Dans la souche NCTC 8325, esxA est SAOUHSC_00257 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 56 (GI : 88194063) . SEQ ID NO : 56 n'a aucun résidu de cystéine et ne contient aucun groupe thiol libre. EsxA utilisé dans l'invention ne devra pas non plus avoir de groupe thiol libre.In strain NCTC 8325, esxA is SAOUHSC_00257 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 56 (GI: 88194063). SEQ ID NO: 56 has no cysteine residues and contains no free thiol groups. EsxA used in the invention should also have no free thiol group.

Les antigènes esxA utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 56 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 56 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 56, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou plus). Ces protéines esxA comprennent des variants de SEQ ID NO : 56. Des fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 10. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 56 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 56. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines.Useful esxA antigens can elicit an antibody (e.g., when administered to a human) that recognizes SEQ ID NO: 56 and / or can include an amino acid sequence: (a) having 50% or more of identity (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99.5% or more) with SEQ ID NO: 56; and / or (b) comprising a fragment of at least "n" consecutive amino acids of SEQ ID NO: 56, where "n" is 7 or greater (e.g., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or more). These esxA proteins include variants of SEQ ID NO: 56. Preferred fragments of (b) include an epitope derived from SEQ ID NO: 10. To other preferred fragments, one or more amino acids are missing (for example, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the C-terminus and / or one or more amino acids (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the N-terminus of SEQ ID NO: 56 while retaining at least one epitope of SEQ ID NO: 56. Other fragments omit one or more protein domains.

EsxA peut être présent sous la forme d'un polypeptide hybride avec EsxB comme il est discuté ci-dessous.EsxA may be present as a hybrid polypeptide with EsxB as discussed below.

esxBesxB

Dans la souche NCTC 8325, esxB est SAOUHSC_00265 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 57 (GI : 88194070). L'invention utilise une forme de EsxB qui ne peut pas former des dimères covalents par l'intermédiaire de liaisons disulfure. Le polypeptide ne contient aucun groupe thiol libre (dans des conditions réductrices).In strain NCTC 8325, esxB is SAOUHSC_00265 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 57 (GI: 88194070). The invention uses an EsxB form that can not form covalent dimers via disulfide bonds. The polypeptide does not contain any free thiol group (under reducing conditions).

Les antigènes esxB utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 57 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 57, 60 à 68 et 77 à 82 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de l'une quelconque de SEQ ID NO : 57, 60 à 68 et 77 à 82, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou plus) . Ces protéines esxB comprennent des variants de SEQ ID NO : 57. Des fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 57. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 57 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 57. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. SEQ ID NO : 61 est l'extrémité C-terminale de SEQ ID NO : 57, à partir des acides aminés 32 à 104. Comparativement à SEQ ID NO : 61, SEQ ID NO : 64 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité N-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, Ala = SEQ ID NO : 10) . Comparativement à SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 66 ne comporte pas de méthionine N-terminale, et comporte un résidu d'acide aminé « X » à la place de Cys-31, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, Ala = SEQ ID NO : 67). Comparativement à SEQ ID NO : 57, Met-1 et Cys-31 sont absents dans SEQ ID NO : 68. SEQ ID NO : 60 correspond aux résidus d'acides aminés 2 à 30 de SEQ ID NO : 57. Comparativement à SEQ ID NO : 60, SEQ ID NO : 62 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité C-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, Ala, pour donner SEQ ID NO : 63).Useful esxB antigens can elicit an antibody (e.g., when administered to a human) that recognizes SEQ ID NO: 57 and / or may comprise an amino acid sequence: (a) having 50% or more of identity (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99.5% or greater) with any of SEQ ID NO: 57, 60-68 and 77-82; and / or (b) comprising a fragment of at least "n" consecutive amino acids of any one of SEQ ID NO: 57, 60 to 68 and 77 to 82, where "n" is 7 or more (e.g. , 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or more). These esxB proteins include variants of SEQ ID NO: 57. Preferred fragments of (b) comprise an epitope derived from SEQ ID NO: 57. To other preferred fragments, one or more amino acids are missing (for example, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the C-terminus and / or one or more amino acids (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the N-terminus of SEQ ID NO: 57 while retaining at least one epitope of SEQ ID NO: 57. Other fragments omit one or more protein domains. SEQ ID NO: 61 is the C-terminus of SEQ ID NO: 57, from amino acids 32 to 104. Compared to SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 64 has an additional amino acid residue " X "at the N-terminus, where" X "is an amino acid that does not contain a free thiol group (e.g., Ala = SEQ ID NO: 10). Compared with SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 66 does not contain N-terminal methionine, and has an amino acid residue "X" in place of Cys-31, where "X" is an amino acid which does not contain a free thiol group (for example, Ala = SEQ ID NO: 67). Compared to SEQ ID NO: 57, Met-1 and Cys-31 are absent in SEQ ID NO: 68. SEQ ID NO: 60 corresponds to amino acid residues 2 to 30 of SEQ ID NO: 57. Compared to SEQ ID No. NO: 60, SEQ ID NO: 62 has an additional amino acid residue "X" at the C-terminus, where "X" is an amino acid that does not contain a free thiol group (eg, Ala, to give SEQ ID NO: 63).

Les polypeptides EsxB utiles peuvent comprendre une méthionine N-terminale (par exemple, SEQ ID NO : 77 à 82) .Useful EsxB polypeptides may include an N-terminal methionine (eg, SEQ ID NO: 77-82).

Un EsxB utile peut comprendre au moins une mutation ponctuelle qui remplace, modifie ou délète le résidu de cystéine présent dans la forme de type sauvage de l'antigène. Par exemple, un polypeptide EsxB peut comprendre une séquence d'acides aminés ayant SEQ ID NO : 57, dans laquelle le résidu de cystéine en position 31 de SEQ ID NO : 57 est remplacé, modifié ou délété. De préférence, le remplacement est réalisé par un résidu de sérine ou par un résidu d'alanine (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 80). En variante, le résidu de cystéine est délété (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 78).A useful EsxB may comprise at least one point mutation that replaces, modifies or deletes the cysteine residue present in the wild-type form of the antigen. For example, an EsxB polypeptide may comprise an amino acid sequence having SEQ ID NO: 57, wherein the 31 cysteine residue of SEQ ID NO: 57 is replaced, modified, or deleted. Preferably, the replacement is by a serine residue or an alanine residue (eg, providing SEQ ID NO: 80). Alternatively, the cysteine residue is deleted (e.g., providing SEQ ID NO: 78).

EsxB peut être présent sous la forme d'un polypeptide hybride avec EsxA comme il est discuté ci-dessous.EsxB may be present as a hybrid polypeptide with EsxA as discussed below.

Polypeptides hybrides EsxAB et EsxBAHybrid Polypeptides EsxAB and EsxBA

Un antigène hybride EsxAB comprend à la fois les antigènes EsxA et EsxB. Ceux-ci peuvent être dans n'importe quel ordre, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale. SEQ ID NO : 58 qui comprend SEQ ID NO : 56 et 57 ('EsxAB') ; et 44 qui comprend SEQ ID NO : 57 et 56 ('EsxBA' ) sont des exemples de tels hybrides, les deux comportant des lieurs (« linkers ») hexapeptidiques ASGGGS (SEQ ID NO : 101) . Un autre hybride 'EsxAB' comprend SEQ ID NO : 59, où la méthionine N-terminale de EsxB a été éliminée. Le polypeptide hybride utilisé dans l'invention n'a idéalement aucun groupe thiol libre (dans des conditions réductrices) . SEQ ID NO : 69 à 76 et 83 à 98 sont des hybrides 'EsxAB', avec EsxA en amont de EsxB ; au contraire, SEQ ID NO : 99 et 100 sont des hybrides 'EsxBA', avec EsxB à l'extrémité N-terminale de EsxA. Toutes les SEQ ID NO : 69 à 76 et 83 à 100 comprennent un lieur (« linker ») hexapeptidique ASGGGS (SEQ ID NO : 101) et aucun résidu de cystéine. SEQ ID NO : 87 à 100 comprennent des résidus de méthionine N-terminaux, tandis que les hybrides 'EsxAB' de SEQ ID NO : 69 à 76 et 83 à 86 n'en comprennent pas.An EsxAB hybrid antigen comprises both EsxA and EsxB antigens. These can be in any order, from the N-terminus to the C-terminus. SEQ ID NO: 58 which comprises SEQ ID NO: 56 and 57 ('EsxAB'); and 44 which comprises SEQ ID NO: 57 and 56 ('EsxBA') are examples of such hybrids, both of which include ASGGGS hexapeptide linkers (SEQ ID NO: 101). Another 'EsxAB' hybrid comprises SEQ ID NO: 59, where the N-terminal methionine of EsxB has been removed. The hybrid polypeptide used in the invention ideally has no free thiol group (under reducing conditions). SEQ ID NO: 69 to 76 and 83 to 98 are 'EsxAB' hybrids, with EsxA upstream from EsxB; in contrast, SEQ ID NO: 99 and 100 are 'EsxBA' hybrids, with EsxB at the N-terminus of EsxA. All of SEQ ID NOS: 69 to 76 and 83 to 100 include a hexapeptide linker ASGGGS (SEQ ID NO: 101) and no cysteine residues. SEQ ID NO: 87 to 100 include N-terminal methionine residues, whereas the 'EsxAB' hybrids of SEQ ID NOs: 69 to 76 and 83 to 86 do not include them.

Ainsi, un polypeptide utile comprend une séquence d'acides aminés présentant 80 % ou plus d'identité (par exemple, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 69 à 76 et 84 à 98. Ces polypeptides peuvent déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaissent à la fois la protéine staphylococcique de type sauvage comprenant SEQ ID NO : 56 et la protéine staphylococcique de type sauvage comprenant SEQ ID NO : 57. Ainsi, la réponse immunitaire reconnaîtra les antigènes staphylococciques à la fois EsxA et EsxB.Thus, a useful polypeptide comprises an amino acid sequence having 80% or more identity (e.g., 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99%, 99.5% or more) with any of SEQ ID NOS: 69-76 and 84-98. These polypeptides can elicit antibodies (e.g., when administered to a human) that recognize both the wild-type staphylococcal protein comprising SEQ ID NO: 56 and the wild type staphylococcal protein comprising SEQ ID NO: 57. Thus, the immune response will recognize staphylococcal antigens both EsxA and EsxB.

De façon utile, ces polypeptides hybrides peuvent déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaissent chacune des protéines staphylococciques de type sauvage (par exemple, comme il est montré dans le listage de séquences) représentées dans l'hybride, par exemple, qui reconnaissent à la fois EsxA de type sauvage et EsxB de type sauvage.Usefully, these hybrid polypeptides can elicit antibodies (e.g., when administered to a human) that recognize each of the wild-type staphylococcal proteins (e.g., as shown in the sequence listing) shown in US Pat. the hybrid, for example, which recognize both wild-type EsxA and wild-type EsxB.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène EsxAB est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 133 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 134.In a preferred embodiment, the EsxAB antigen is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 133 and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134.

Clf A L'antigène « ClfA » est annoté comme « facteur d'agglutination A ». Dans la souche NCTC 8325, clfA est SAOUHSC_00812 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 102 (GI : 88194572). Dans la souche Newman, il est nwmn_0756 (GI : 151220968).Clf A The "ClfA" antigen is annotated as "agglutination factor A". In strain NCTC 8325, clfA is SAOUHSC_00812 and has the amino acid sequence SEQ ID NO: 102 (GI: 88194572). In the Newman strain, it is nwmn_0756 (GI: 151220968).

Les antigènes clfA utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 102 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 102 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 102, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines clfA comprennent des variants de SEQ ID NO : 102. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 102. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 102 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 102. Les 368 acides aminés C-terminaux finaux de SEQ ID’NO : 102 peuvent être omis de façon utile. Les 39 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 102 peuvent être omis de façon utile. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. SEQ ID NO : 103 est un fragment utile de SEQ ID NO : 102 ( 'ClfA40—559' ) . tç fragment omet la longue région répétitive vers l'extrémité C-terminale de SEQ ID NO : 102.Useful clfA antigens can elicit an antibody (e.g., when administered to a human) that recognizes SEQ ID NO: 102 and / or may comprise an amino acid sequence: (a) having 50% or more of identity (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99.5% or more) with SEQ ID NO: 102; and / or (b) comprising a fragment of at least "n" consecutive amino acids of SEQ ID NO: 102, where "n" is 7 or greater (e.g., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or more). These clfA proteins include variants of SEQ ID NO: 102. The preferred fragments of (b) comprise an epitope derived from SEQ ID NO: 102. To other preferred fragments, one or more amino acids are missing (for example, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 or more) from the C-terminus and / or one or more amino acids (e.g. 2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25 or more) from the N-terminus of ID NO: 102. The final 368 C-terminal amino acids of SEQ ID NO: 102 may be conveniently omitted. The first 39 N-terminal amino acids of SEQ ID NO: 102 may be omitted in a useful manner. Other fragments omit one or more protein domains. SEQ ID NO: 103 is a useful fragment of SEQ ID NO: 102 ('ClfA40-559'). This fragment omits the long repetitive region towards the C-terminus of SEQ ID NO: 102.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène ClfA a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 135.In a preferred embodiment, the ClfA antigen has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 135.

OMVOMV

Les OMV sont bien connues de l'état de l'art et sont libérées spontanément dans le milieu de culture par les bactéries. Les « OMV natives » (« NOMV » [18]), les microvésicules (MV [19] ) , les OMV extraites par un détergent (DOMV), les OMV dérivées d'un mutant (m-OMV), et les bourgeons, qui sont des protubérances sur la membrane externe qui demeurent fixées aux bactéries avant la libération sous forme de MV ([20] ; [21]), forment tous une partie de l'invention et sont qualifiés collectivement d'OMV dans la présente.OMVs are well known in the state of the art and are released spontaneously into the culture medium by bacteria. "Native OMVs" ("NOMV" [18]), microvesicles (MV [19]), detergent-extracted OMVs (DOMV), OMVs derived from a mutant (m-OMV), and buds, which are protrusions on the outer membrane that remain attached to the bacteria prior to release as MV ([20]; [21]), all form a part of the invention and are collectively referred to herein as OMV.

Les OMV de 1'invention peuvent être obtenues à partir de toute bactérie Gram négatif appropriée. La bactérie Gram négatif est généralement E. coli. Toutefois, à la place d'E. coli, ce peut être une bactérie Gram négatif différente. Les bactéries Gram négatif préférées pour une utilisation dont fait l'invention comprennent des bactéries qui ne sont pas pathogènes chez les êtres humains. Par exemple, les bactéries peuvent être commensales chez les êtres humains. Toutefois, dans certains modes de réalisation, il est utilisé des bactéries qui généralement ne sont pas trouvées du tout chez les hôtes humains.The OMVs of the invention can be obtained from any suitable Gram negative bacterium. The Gram-negative bacterium is usually E. coli. However, in place of E. coli, it can be a different Gram negative bacterium. Preferred Gram-negative bacteria for use in the invention include bacteria that are not pathogenic in humans. For example, bacteria can be commensal in humans. However, in some embodiments, bacteria are used which are generally not found at all in human hosts.

Les exemples d'espèces pour une utilisation dont fait l'invention comprennent des espèces dans n'importe lequel des genres Escherichia, Shigella, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia Haemophilus, Legionella, Pseudomonas, Yersinia, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, etc. En particulier, la bactérie peut être une espèce de Shigella (comme S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii ou S.sonnei). En variante, elle peut être une espèce de Neisseria, particulièrement une espèce non w„pa_thogène comme N. bacilliformis, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, ' N. lactamica, N. macacae, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca ou N. subflava, et en particulier N. lactamica. En variante, une espèce pathogène de Neisseria peut être utilisée, par exemple N. gonorrhoeae ou N. meningitidis. Dans d'autres exemples, la bactérie peut être Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae (y compris des souches non typables), Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori, Salmonella enterica (y compris les sérovars typhi et typhimurium, ainsi que les sérovars paratyphi et enteritidis), Vibrio cholerae, Proteus, Citrobacter, Serratia, Erwinia, Pasteurelia etc. Des bactéries Gram négatif photosynthétiques peuvent être également utilisées. Généralement, la bactérie est une souche compétente. Ce caractère facilite la modification génétique de la bactérie.Examples of species for use according to the invention include species in any of the genera Escherichia, Shigella, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia Haemophilus, Legionella, Pseudomonas, Yersinia, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, etc. In particular, the bacterium may be a species of Shigella (such as S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii or S.sonnei). Alternatively, it may be a Neisseria species, particularly a non-native species such as N. bacilliformis, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. lactamica, N. macacae, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca or N. subflava, and in particular N. lactamica. Alternatively, a pathogenic species of Neisseria can be used, for example N. gonorrhoeae or N. meningitidis. In other examples, the bacterium may be Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae (including non-typeable strains), Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica , Helicobacter pylori, Salmonella enterica (including serovars typhi and typhimurium, as well as serovars paratyphi and enteritidis), Vibrio cholerae, Proteus, Citrobacter, Serratia, Erwinia, Pasteurelia etc. Photosynthetic Gram negative bacteria can also be used. Generally, the bacterium is a competent strain. This character facilitates the genetic modification of the bacteria.

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie Gram négatif est une souche « hyperbourgeonnante » de cette bactérie. Des bactéries Gram négatif hyperbourgeonnantes à partir desquelles des bourgeons peuvent être fabriqués plus facilement en rendement supérieur et peuvent être plus homogènes en nature sont décrites dans le document WO 02/062378. Par exemple, les bourgeons peuvent être dérivés de bactéries choisies dans le groupe constitué de Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa et Moraxella catarrhalis.In a particular embodiment, the gram-negative bacterium is a "hyperbourgeonnante" strain of this bacterium. Gram-negative hyperbourgeonating bacteria from which buds can be manufactured more easily in higher yield and can be more homogeneous in nature are described in WO 02/062378. For example, the buds may be derived from bacteria selected from the group consisting of Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa and Moraxella catarrhalis.

La bactérie Gram négatif à partir de laquelle les OMV sont produites peut comprendre une ou plusieurs adaptation(s) pour la production de vésicules. En particulier, comparativement à la même bactérie sans ladite/lesdites adaptation (s), la bactérie comprend un génome dans lequel une ou plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules sont absentes. Les séquences absentes peuvent être totalement absentes du génome, ou elles peuvent être partiellement délétées si bien qu'elles sont sous une forme inactivée. En plus de l'absence d'une ou de plusieurs séquences, une ou plusieurs autres séquences qui ne sont pas essentielles à la production des vésicules peuvent être inactivées par insertion de séquence. L'absence de séquences signifie que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences absentes, c'est-à-dire, comparativement à la même bactérie avec les séquences), la bactérie comprend généralement un génome de taille réduite. Généralement, le génome est entre 1 % et 50 % plus petit (en nombre total de paires de bases) comparativement à la même bactérie sans les séquences absentes. En particulier, le génome peut être entre 5 % et 50 %, entre 5 % et 40 %, entre 5 % et 30 %, entre 5 % et 20 %, entre 10 % et 30 % ou entre 10 % et 20 % plus petit. Lorsque la bactérie est une bactérie Gram négatif quelconque, il est utile que le gène de l'ARNr 16S soit présent dans le génome parce que les différences dans la séquence de ce gène peuvent être utilisées pour distinguer différentes espèces de bactéries. Il peut être également utile qu'un ou plusieurs gènes qui rendent la bactérie compétente soient présents. Ce caractère facilite la modification génétique de la bactérie. Séquences non essentielles à la production des vésiculesThe Gram-negative bacterium from which OMVs are produced may include one or more adaptation (s) for vesicle production. In particular, compared to the same bacterium without said adaptation (s), the bacterium comprises a genome in which one or more non-essential sequences for the production of vesicles are absent. The absent sequences may be totally absent from the genome, or they may be partially deleted so that they are in an inactivated form. In addition to the absence of one or more sequences, one or more other sequences that are not essential for vesicle production may be inactivated by sequence insertion. The absence of sequences means that, compared to the same bacteria without said absent sequences, i.e., compared to the same bacterium with the sequences), the bacterium generally comprises a reduced size genome. Generally, the genome is between 1% and 50% smaller (in total number of base pairs) compared to the same bacteria without the missing sequences. In particular, the genome can be between 5% and 50%, between 5% and 40%, between 5% and 30%, between 5% and 20%, between 10% and 30% or between 10% and 20% smaller . When the bacterium is any Gram-negative bacterium, it is useful for the 16S rRNA gene to be present in the genome because differences in the sequence of that gene can be used to distinguish different species of bacteria. It can also be useful to have one or more genes that make the bacteria competent. This character facilitates the genetic modification of the bacteria. Sequences not essential for the production of vesicles

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut comprendre des gènes pour des processus métaboliques qui ne sont pas nécessaires à la production des vésicules. Par exemple, des gènes pour la biosynthèse de nutriments peuvent être absents lorsque ces nutriments peuvent être fournis de façon artificielle, par exemple, dans des conditions de culture. Par conséquent, la bactérie peut être auxotrophe pour un ou plusieurs nutriments. L'homme du métier connaît le (s) gène (s) qui peut/ peuvent être absent (s) pour produire une auxotrophie donnée. Par exemple, la bactérie peut être auxotrophe pour un ou plusieurs des acides aminés suivants, particulièrement lorsque la bactérie est E. coli (par exemple, en délétant les gènes indiqués) : arginine (argA) ; asparagine (à la fois asnA et asnB) ; acide aspartique (aspC et tyrB) ; cystéine (cysE) ; acide glutamique (à la fois gltB et gdhA) ; glutamine (glnA) ; glycine (glyA) ; histidine (hisB) ; isoleucine (ilvA) ; leucine (leuB) ; lysine (lysA) ; méthionine (metA) ; phénylalanine (pheA) ; proline (proA) ; sérine (serA) ; thréonine (thrC) ; tryptophane (trpC) ; tyrosine (tyrA) ; et valine, isoleucine et leucine (ilvD). Toutefois, dans certains modes de réalisation, la bactérie ne présente pas d'auxotrophie comparativement à la même bactérie sans les séquences absentes. En particulier, la bactérie est capable de se développer sur des milieux minimaux. D'autres processus métaboliques qui ne sont pas requis pour la production des vésicules peuvent comprendre les voies de transport. Par conséquent, les gènes pour des composants de ces voies de transport peuvent être absents. Par exemple, il peut manquer à la bactérie les gènes pour les transporteurs ABC et/ou des composants des systèmes de sécrétion de type I, II, III, IV, V et/ou VI.The category of nonessential sequences for vesicle production may include genes for metabolic processes that are not necessary for vesicle production. For example, genes for nutrient biosynthesis may be absent when these nutrients can be artificially provided, for example, under culture conditions. As a result, the bacteria may be auxotrophic for one or more nutrients. Those skilled in the art are aware of the gene (s) that may be absent to produce a given auxotrophy. For example, the bacterium may be auxotrophic for one or more of the following amino acids, particularly when the bacterium is E. coli (for example, by deleting the indicated genes): arginine (argA); asparagine (both asnA and asnB); aspartic acid (aspC and tyrB); cysteine (cysE); glutamic acid (both gltB and gdhA); glutamine (glnA); glycine (glyA); histidine (hisB); isoleucine (ilvA); leucine (leuB); lysine (lysA); methionine (metA); phenylalanine (pheA); proline (proA); serine (serA); threonine (thrC); tryptophan (trpC); tyrosine (tyrA); and valine, isoleucine and leucine (ilvD). However, in some embodiments, the bacterium does not exhibit auxotrophy compared to the same bacteria without the absent sequences. In particular, the bacterium is able to grow on minimal media. Other metabolic processes that are not required for vesicle production may include transport routes. Therefore, genes for components of these transport pathways may be absent. For example, the genes for ABC transporters and / or components of type I, II, III, IV, V and / or VI secretory systems may be missing from the bacterium.

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre d'autres séquences. Par exemple, il est préférable que les séquences qui donnent naissance à une instabilité génétique soient absentes, par exemple les éléments transposables, y compris les rétrotransposons, les transposons d'ADN et les séquences d'insertion ; les introns de bactériophages et du groupe II. Par exemple, jusqu'à 50 % du plasmide de virulence de Shigella est constitué d'éléments de séquences d'insertion ; lorsque la bactérie est une espèce de Shigella, ces séquences d'insertion sont de préférence absentes. Les gènes qui codent pour les gènes des systèmes de modifications des restrictions peuvent être également absents (par exemple, les régions hsd dans E. coli), comme le peuvent des gènes codant pour d'autres nucléases endogènes qui détruisent 1'ADN étranger. Ces gènes ne sont pas essentiels à la croissance bactérienne dans des environnements de culture contrôlés, c'est-à-dire les conditions typiques de GM P durant la croissance pour la fabrication de vaccins. Toutefois, il peut être utile de conserver au moins un système de modification de restriction de telle façon que le génome peut être transformé en une cellule hôte déficiente en restriction (voir ci-dessous). Les gènes codant pour des composants du flagelle bactérien peuvent être également absents parce que ceux-ci ne sont pas essentiels. Les éléments Rhs peuvent être également absents. Ceux-ci sont de grandes régions répétées homologues qui facilitent le réarrangement du génome par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue et elles peuvent donc mener à une instabilité génomique. Les régions non transcrites peuvent être aussi généralement absentes parce qu'elles ne sont pas nécessaires à la croissance bactérienne. De façon similaire, les prophages et/ou les pseudogènes peuvent être absents, comme le peuvent les gènes des récepteurs des bactériophages.The category of sequences not essential for vesicle production may also include other sequences. For example, it is preferable that sequences that give rise to genetic instability are absent, for example transposable elements, including retrotransposons, DNA transposons and insertion sequences; the bacteriophage and group II introns. For example, up to 50% of the Shigella virulence plasmid is composed of insertion sequence elements; when the bacterium is a Shigella species, these insertion sequences are preferably absent. Genes that encode genes in restriction modification systems may also be absent (e.g., hsd regions in E. coli), as may genes encoding other endogenous nucleases that destroy foreign DNA. These genes are not essential for bacterial growth in controlled culture environments, that is, typical GM P conditions during growth for vaccine manufacture. However, it may be useful to maintain at least one restriction modification system such that the genome can be transformed into a restriction-restricted host cell (see below). Genes encoding bacterial flagella components may also be absent because they are not essential. Rh elements can also be absent. These are large homologous repeat regions that facilitate rearrangement of the genome through homologous recombination and can therefore lead to genomic instability. Nontranscribed regions may also be generally absent because they are not necessary for bacterial growth. Similarly, prophages and / or pseudogenes may be absent, as can the bacteriophage receptor genes.

Des procédés pour identifier les séquences non essentielles sont bien connus de l'état de l'art, par exemple, d'après les références [22] et [23] . Par exemple, un procédé pour identifier les séquences qui ne sont pas essentielles à la croissance consiste à comparer les génomes de deux souches ou plus de la bactérie et à identifier les séquences qui ne sont pas présentes dans la totalité des souches. Ces séquences sont moins susceptibles d'être nécessaires à la croissance bactérienne et sont donc des candidates pour une absence dans l'invention. Toutefois, il est possible qu'une séquence soit essentielle à la croissance d'une souche mais pas d'une autre. Si une séquence est essentielle dans la souche particulière utilisée dans l'invention, alors la séquence devra être présente dans le génome ou remplacée par une autre séquence possédant une fonction complémentaire pour permettre la croissance de la souche. Pour confirmer qu'une séquence n'est pas essentielle à la production des vésicules, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur la production des vésicules est déterminé. Encore une fois, il est possible qu'une séquence soit essentielle à la production des vésicules dans une souche mais pas dans une autre. Si une séquence est essentielle à la production des vésicules dans au moins une souche, alors elle est de préférence présente dans le génome de l'invention.Methods for identifying non-essential sequences are well known in the state of the art, for example, from references [22] and [23]. For example, a method for identifying sequences that are not essential for growth involves comparing the genomes of two or more strains of the bacterium and identifying sequences that are not present in all strains. These sequences are less likely to be necessary for bacterial growth and thus are candidates for an absence in the invention. However, it is possible that one sequence is essential for the growth of one strain but not another. If a sequence is essential in the particular strain used in the invention, then the sequence should be present in the genome or replaced by another sequence having a complementary function to allow the growth of the strain. To confirm that a sequence is not essential for vesicle production, the sequence can be deleted from a vesicle producing strain and the effect on vesicle production is determined. Again, it is possible that one sequence is essential for the production of vesicles in one strain but not in another. If a sequence is essential for the production of the vesicles in at least one strain, then it is preferably present in the genome of the invention.

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre des séquences qui provoquent la réactogénicité des vésicules, par exemple, des gènes codant pour des composants associés à la membrane qui induisent des réponses immunogènes indésirables et/ou une toxicité. Par exemple, il est préférable que les gènes impliqués dans la production d'endotoxine, par exemple, le lipopolysaccharide (LPS) ou le lipooligosaccharide (LOS), soient absents. Par exemple, dans E. coli, il est préférable que les gènes msbB et pagA soient absents, si bien que la bactérie exprime un lipopolysaccharide détoxifié (LPS penta-acylé). Ceci peut être obtenu en utilisant une procédure d'échange allélique assisté par les recombinases Red portées dans pKD46 [24 ; 25] . pKD3 peut être utilisé comme matrice pour la PCR pour générer des allèles mutés contenant la cassette du chloramphénicol. Ensuite, pCP20 peut être utilisé pour exciser la cassette du chloramphénicol à partir de l'ADN chromosomique du mutant [25]. Afin de provoquer une délétion interne à partir de l'ORF de msb et l'ORF de pagP, des amorces peuvent être conçues pour porter une séquence d'extension homologue et la séquence d'hybridation pour la matrice pKD3 [2 6] . Pour déterminer si une séquence provoque la réactogénicité des vésicules, et par conséquent pour identifier une séquence qui peut être absente dans l'invention, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur la réactogénicité des vésicules est déterminé. La réactogénicité est généralement déterminée en utilisant des modèles in vitro ou animaux, par exemple, en mesurant la pyrogénicité chez des lapins, la production de cytokines proinflammatoires par les cellules monocytaires humaines, et/ou le degré d'inflammation au niveau du site d'injection chez des souris et des lapins (voir, par exemple, la référence 27) .The category of nonessential sequences for vesicle production may also include sequences that cause vesicle reactogenicity, for example, genes encoding membrane-associated components that induce undesirable immunogenic responses and / or toxicity. For example, it is preferred that the genes involved in the production of endotoxin, for example, lipopolysaccharide (LPS) or lipooligosaccharide (LOS), be absent. For example, in E. coli it is preferred that the msbB and pagA genes be absent, so that the bacterium expresses a detoxified lipopolysaccharide (penta-acylated LPS). This can be achieved using an allelic exchange procedure assisted by Red recombinases carried in pKD46 [24; 25]. pKD3 can be used as a template for PCR to generate mutated alleles containing the chloramphenicol cassette. Then, pCP20 can be used to excise the chloramphenicol cassette from the chromosomal DNA of the mutant [25]. In order to induce an internal deletion from the msb ORF and the pagP ORF, primers can be designed to carry a homologous extension sequence and the hybridization sequence for the pKD3 template [2 6]. To determine whether a sequence causes the reactogenicity of the vesicles, and therefore to identify a sequence that may be absent in the invention, the sequence may be deleted from a vesicle-producing strain and the effect on the reactogenicity of the vesicles is determined . Reactogenicity is generally determined using in vitro or animal models, for example, by measuring pyrogenicity in rabbits, production of proinflammatory cytokines by human monocytic cells, and / or the degree of inflammation at the site of infection. injection in mice and rabbits (see, for example, reference 27).

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre des séquences qui suppriment la production des vésicules, particulièrement des gènes qui suppriment la libération des bourgeons. Ces gènes sont souvent impliqués dans le maintien de l'intégrité de la membrane externe de la bactérie. Par exemple, de nombreuses bactéries Gram- négatif possèdent un système Tol-Pal qui est constitué des protéines TolA, TolB, TolQ, TolR et Pal. L'absence d'un ou · de plusieurs gènes pour un ou plusieurs composants de ce système peut provoquer la libération par la bactérie de quantités supérieures de bourgeons dans son milieu de culture durant la réplication bactérienne. Par exemple, au moins l'un des cinq gènes de Tol-Pal peut être absent. Ainsi, il peut manquer à la bactérie 1, 2, 3, 4 ou les 5 des gènes tolA, tolB, tolQ, tolR et Pal. De préférence, le gène tolR est absent, particulièrement dans E. coli. Ainsi, la bactérie peut être tolA+ tolB+ tolQ+ TolR~ Pal +. La bactérie peut également libérer des quantités supérieures de bourgeons s'il lui manque la protéine OmpA. Par conséquent, il est également préférable que le gène ompA soit absent du génome de la bactérie, particulièrement dans E. coli. Pour déterminer si une séquence supprime la production des vésicules, et par conséquent pour identifier une séquence qui peut être absente dans l'invention, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur la production des vésicules est déterminé.The category of nonessential sequences for vesicle production may also include sequences that suppress the production of vesicles, particularly genes that suppress the release of buds. These genes are often involved in maintaining the integrity of the outer membrane of the bacteria. For example, many Gram-negative bacteria have a Tol-Pal system which consists of TolA, TolB, TolQ, TolR and Pal proteins. The absence of one or more genes for one or more components of this system may cause the bacterium to release greater amounts of buds into its culture medium during bacterial replication. For example, at least one of the five Tol-Pal genes may be absent. Thus, the bacteria 1, 2, 3, 4 or 5 of the genes tolA, tolB, tolQ, tolR and Pal may be missing. Preferably, the tolR gene is absent, particularly in E. coli. Thus, the bacterium can be tolA + tolB + tolQ + TolR ~ Pal +. The bacteria can also release larger amounts of buds if it lacks the OmpA protein. Therefore, it is also preferable that the ompA gene be absent from the genome of the bacterium, particularly in E. coli. To determine whether a sequence suppresses the production of vesicles, and therefore to identify a sequence that may be absent in the invention, the sequence may be deleted from a vesicle-producing strain and the effect on vesicle production is determined .

Dans un mode de réalisation spécifique, la bactérie est un mutant ompA d'E. coli et/ou un mutant tolR d'E. coli. Dans certains modes de réalisation, la bactérie est choisie parmi E. coli BL21(DE3)AompA, E. coli BL21(DE3)AompAAtolR, E. coli BL21 (DE3) AtolR, E. coli Δηΐρΐ, ou E. coli AdegP. Le symbole Δ est utilisé dans la présente pour se rapporter à une souche bactérienne à partir de laquelle la séquence codante du gène cité après le symbole Δ a été délétée. Ainsi, une souche bactérienne qui est « AompA » ne comprend pas la séquence codante pour le gène ompA. De la même façon, une souche bactérienne qui est « AtolR » ne comprend pas la séquence codante pour le gène tolR. La séquence codante entière peut être délétée. Toutefois, la séquence codante peut, en variante, être délétée en partie. Par exemple, la moitié N-terminale ou la moitié C-terminale peut être délétée. En variante, les gènes ompA et/ou tolR peuvent être mutés par l'introduction d'une ou de plusieurs substitutions et/ou insertions.In a specific embodiment, the bacterium is an ompA mutant of E. coli and / or a tolR mutant of E. coli. In some embodiments, the bacterium is selected from E. coli BL21 (DE3) AompA, E. coli BL21 (DE3) AompAAtolR, E. coli BL21 (DE3) AtolR, E. coli Δηΐρΐ, or E. coli AdegP. The Δ symbol is used herein to refer to a bacterial strain from which the coding sequence of the gene named after the Δ symbol has been deleted. Thus, a bacterial strain that is "AompA" does not include the coding sequence for the ompA gene. Similarly, a bacterial strain that is "AtolR" does not include the coding sequence for the tolR gene. The entire coding sequence can be deleted. However, the coding sequence may alternatively be partially deleted. For example, the N-terminal half or the C-terminal half can be deleted. Alternatively, the ompA and / or tolR genes may be mutated by introduction of one or more substitutions and / or insertions.

Les souches mutantes d'E. coli AtolR et les souches mutantes d'E. coli AompA surproduisent des OMV par rapport à E. coli de type sauvage. Ainsi, la mutation du gène ompA et/ou d'un ou de plusieurs composants du complexe Tol-Pal se traduit par la bactérie mutante produisant un nombre accru d'OMV comparativement à sa souche respective de type sauvage qui porte un gène ompA et/ou un complexe Tol-Pal de type sauvage. OmpA est une protéine intégrale de la membrane et elle est la plus abondante des protéines de la membrane externe dans E. coli. Par conséquent, il est surprenant qu'un E. coli auquel il manque la protéine OmpA soit viable. En effet, selon Murakami et al. [28], un mutant simple ompA d 'E. coli ne peut pas favoriser la libération des vésicules.Mutant strains of E. AtolR coli and mutant strains of E. coli. AompA coli overproduce OMVs compared to wild-type E. coli. Thus, the mutation of the ompA gene and / or one or more components of the Tol-Pal complex results in the mutant bacterium producing an increased number of OMVs compared to its respective wild-type strain which carries an ompA gene and / or or a wild type Tol-Pal complex. OmpA is an integral protein of the membrane and is the most abundant protein of the outer membrane in E. coli. Therefore, it is surprising that an E. coli lacking the OmpA protein is viable. Indeed, according to Murakami et al. [28], a simple ompA mutant of E. coli can not promote the release of vesicles.

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre des gènes pour des protéines qui ne sont pas requises dans les vésicules, selon leur utilisation prévue. Par exemple, des gènes pour des antigènes indésirables peuvent être éliminés, par exemple des gènes pour des protéines contre lesquelles il n'est pas souhaité d'induire une réponse immunitaire (comme des antigènes non protecteurs, particulièrement des antigènes immunodominants). Les protéines qui ne sont pas requises dans les vésicules peuvent être identifiées en préparant des vésicules à partir d'une bactérie comprenant un génome qui comprend encore les gènes (non encore identifiés) pour ces protéines, et en analysant la teneur en protéines de ces vésicules en utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à haut débit, comme il est décrit ci-dessous. Une fois que les protéines ont été identifiées, les gènes correspondants peuvent être omis du génome de la bactérie de l'invention et par conséquent absents.The category of nonessential sequences for vesicle production may also include genes for proteins that are not required in vesicles, depending on their intended use. For example, genes for undesirable antigens may be removed, for example genes for proteins against which it is not desired to induce an immune response (such as non-protective antigens, particularly immunodominant antigens). Proteins that are not required in the vesicles can be identified by preparing vesicles from a bacterium comprising a genome that still includes genes (not yet identified) for these proteins, and by analyzing the protein content of these vesicles using proteomics based on high throughput mass spectrometry, as described below. Once the proteins have been identified, the corresponding genes can be omitted from the genome of the bacterium of the invention and therefore absent.

De préférence, la catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules ne comprend pas des séquences qui permettent aux vésicules de posséder des propriétés d'adjuvant. Par exemple, il est utile qu'une ou plusieurs séquences qui codent pour des ligands du TLR-2, par exemple des lipoprotéines, soient présentes dans le génome. De façon similaire, il est utile qu'une ou plusieurs séquences qui codent pour des ligands du TLR-4, par exemple des composants du LPS, soient présentes dans le génome. De telles séquences sont utiles parce qu'elles contribuent à l'efficacité des vésicules en tant qu'immunogènes, par exemple, pour une utilisation en tant que vaccins. Pour identifier de telles séquences, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur 1'adjuvanticité des vésicules est déterminé. L'adjuvanticité est généralement déterminée en comparant la réponse immunitaire à un antigène en présence ou en l'absence de l'adjuvant putatif, par exemple, en mesurant le titre en anticorps dirigés contre 1'antigène.Preferably, the category of sequences not essential for the production of vesicles does not include sequences which allow the vesicles to possess adjuvant properties. For example, it is useful that one or more sequences that encode TLR-2 ligands, e.g., lipoproteins, be present in the genome. Similarly, it is useful that one or more sequences that encode TLR-4 ligands, e.g., LPS components, be present in the genome. Such sequences are useful because they contribute to the effectiveness of the vesicles as immunogens, for example, for use as vaccines. To identify such sequences, the sequence can be deleted from a vesicle-producing strain and the effect on the adjuvancy of the vesicles is determined. Adjuvanticity is generally determined by comparing the immune response to an antigen in the presence or absence of the putative adjuvant, for example, by measuring the antibody titer against the antigen.

La bactérie contient de préférence d'autres adaptations pour la production de vésicules. En particulier, la bactérie comprend généralement un génome dans lequel une ou plusieurs séquences sont présentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans ladite/lesdites séquence(s), la bactérie produit des quantités supérieures de vésicules. Une fois encore, les séquences qui augmentent la production des vésicules peuvent être identifiées en ajoutant ou en délétant la séquence à une souche productrice de vésicules et en déterminant l'effet sur la production des vésicules.The bacterium preferably contains other adaptations for the production of vesicles. In particular, the bacterium generally comprises a genome in which one or more sequences are present such that, compared to the same bacterium without said sequence (s), the bacterium produces higher amounts of vesicles. Once again, sequences that increase vesicle production can be identified by adding or deleting the sequence to a vesicle-producing strain and determining the effect on vesicle production.

Procédé de fabrication du génomeMethod of making the genome

Les procédés pour produire des génomes bactériens de taille réduite par rapport au génome de type sauvage sont connus de l'état de l'art. Par exemple, la référence 29 décrit diverses approches « descendantes » qui impliquent la délétion des séquences indésirables (décrit dans, par exemple, les références 22 et 23) et des approches « ascendantes » qui impliquent la synthèse du génome de novo, sans les séquences indésirables (décrit dans, par exemple, les références 30 et 31) .The methods for producing reduced size bacterial genomes relative to the wild-type genome are known in the art. For example, reference 29 describes various "top-down" approaches that involve the deletion of unwanted sequences (described in, for example, references 22 and 23) and "bottom-up" approaches that involve de novo genome synthesis, without the sequences undesirable (described in, for example, references 30 and 31).

Par conséquent, un procédé de fabrication d'un génome pour une utilisation dans une bactérie pour produire des OMV comprend les étapes suivantes : (a) la fourniture d'un génome provenant d'une bactérie Gram négatif ; et (b) la délétion d'une ou de plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules de telle façon que, comparativement au génome dans l'étape (a), le génome est de taille réduite. Le procédé comprend en outre une étape (c) d'insertion dans le génome d'une ou de plusieurs séquences qui codent pour une protéine choisie dans le groupe constitué de (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. Les étapes (b) et (c) peuvent être réalisées dans cet ordre ou dans l'ordre (c) puis (b), à condition que la/les séquence (s) insérée(s) dans l'étape (c) demeure(nt) après l'étape (b).Accordingly, a method of making a genome for use in a bacterium to produce OMVs comprises the following steps: (a) providing a genome from a Gram-negative bacterium; and (b) deleting one or more nonessential sequences for vesicle production so that, compared to the genome in step (a), the genome is reduced in size. The method further comprises a step (c) of inserting into the genome one or more sequences that encode a protein selected from the group consisting of (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen. Steps (b) and (c) can be performed in this order or order (c) then (b), provided that the sequence (s) inserted in step (c) remains (nt) after step (b).

Un autre procédé de fabrication d'un génome pour une utilisation dans une bactérie pour la production d'OMV implique des techniques de génomique synthétique. Ces techniques permettent de préparer des génomes synthétiques par synthèse chimique au moins en partie, par exemple, comme il est divulgué dans la référence 31. Le procédé de synthèse peut impliquer la division théorique de la séquence d'ADN souhaitée du génome en fragments. Ces fragments peuvent à nouveau être divisés de façon théorique en une ou plusieurs fois, parvenant éventuellement à un ensemble de fragments qui sont chacun d'une taille qui peut être préparée par un procédé de synthèse d'ADN choisi, par exemple, par la chimie des phosphoramidites. Ces fragments sont ensuite synthétisés et joints pour donner les fragments plus longs à partir du stade de division théorique, et ces fragments plus longs sont ensuite joints, etc. jusqu'à la préparation éventuelle de la séquence complète. De cette façon, la référence 31 a préparé un génome de 583 kpb par assemblage de ~104 oligonucléotides 50-mer dans divers stades. Les 50-mers ont été assemblés en cassettes d'une longueur de 5 à 7 kb, et ces cassettes ont été ensuite assemblées en fragments de ~24 kpb, qui ont été ensuite 'assemblés en fragments de ~72 kpb, puis de ~144 kpb, donnant ensuite deux constructions de ~290 kpb, qui ont été finalement jointes pour donner le génome complet. Les fragments sont conçus pour se chevaucher, permettant de cette façon de les assembler dans l'ordre correct. Par exemple, les cassettes se sont chevauchées d'au moins 80 pb, permettant de cette façon leur assemblage en fragments de ~24 kpb, etc. Ainsi, le procédé implique la synthèse d'une pluralité de fragments se chevauchant de la molécule d'ADN souhaitée, de telle façon que les fragments se chevauchant couvrent la molécule d'ADN complète. Les deux extrémités de chaque fragment se chevauchent avec un fragment 5’ ou 3' voisin, à l'exception des fragments terminaux d'une molécule linéaire où aucun chevauchement n'est requis (mais pour synthétiser une molécule circulaire, les deux fragments terminaux devront se chevaucher). Les fragments à chaque stade peuvent être maintenus sous la forme d'inserts dans des vecteurs, par exemple, dans des plasmides ou des vecteurs BAC ou YAC. L'assemblage des fragments durant le procédé de synthèse peut impliquer une recombinaison in vitro et/ou in vivo. Pour les procédés in vitro, la digestion avec une exonucléase 3' peut être utilisée pour exposer les extrémités protubérantes d'un fragment, et les extrémités protubérantes complémentaires dans les fragments se chevauchant peuvent être ensuite hybridés, ceci suivi de la réparation des jonctions (méthode de « chew-back assembly »). Pour les procédés in vivo, les clones se chevauchant peuvent être assemblés en utilisant, par exemple, le procédé de clonage TAR divulgué dans la référence 31. Lorsqu'il est préparé par ces procédés, un génome de l'invention peut comprendre une ou plusieurs séquences en « filigrane ». Ce sont des séquences qui peuvent être utilisées pour identifier ou coder des informations dans le génome. Il peut s'agir de séquences soit non codantes soit codantes. Le plus couramment, elles codent des informations au sein des séquences codantes sans modifier les séquences d'acides aminés.Another method of making a genome for use in a bacterium for producing OMV involves synthetic genomic techniques. These techniques make it possible to prepare synthetic genomes by chemical synthesis at least in part, for example, as disclosed in reference 31. The synthesis method may involve the theoretical division of the desired DNA sequence of the genome into fragments. These fragments can again be theoretically divided into one or more times, possibly to a set of fragments which are each of a size that can be prepared by a DNA synthesis method chosen, for example, by chemistry. phosphoramidites. These fragments are then synthesized and joined to give the longer fragments from the theoretical division stage, and these longer fragments are then joined, etc. until the eventual preparation of the complete sequence. In this way, reference 31 prepared a 583 kbp genome by assembling ~ 104 50-mer oligonucleotides in various stages. The 50-mers were assembled into cassettes 5 to 7 kb in length, and these cassettes were then assembled into ~ 24 kbp fragments, which were then assembled into ~ 72 kbp fragments and then ~ 144 kbp. kpb, then giving two ~ 290 kbp constructs, which were finally joined to give the complete genome. The fragments are designed to overlap, allowing this way to assemble them in the correct order. For example, the cassettes overlapped by at least 80bp, thereby allowing them to be assembled into ~ 24kbp fragments, and so on. Thus, the method involves the synthesis of a plurality of overlapping fragments of the desired DNA molecule, so that the overlapping fragments cover the entire DNA molecule. Both ends of each fragment overlap with a neighboring 5 'or 3' fragment, with the exception of the terminal fragments of a linear molecule where no overlap is required (but to synthesize a circular molecule, the two terminal fragments will have to overlap). Fragments at each stage can be maintained as inserts in vectors, for example, in plasmids or BAC or YAC vectors. The assembly of the fragments during the synthesis process may involve in vitro and / or in vivo recombination. For in vitro methods, digestion with a 3 'exonuclease can be used to expose the protruding ends of a fragment, and the complementary protruding ends in the overlapping fragments can then be hybridized, followed by repair of the junctions (method "chew-back assembly"). For in vivo methods, the overlapping clones can be assembled using, for example, the TAR cloning method disclosed in reference 31. When prepared by these methods, a genome of the invention may include one or more sequences in "watermark". These are sequences that can be used to identify or encode information in the genome. It can be either non-coding or coding sequences. Most commonly, they encode information within the coding sequences without modifying the amino acid sequences.

Une fois que le génome a été produit, il peut être introduit dans une cellule hôte par transformation selon le procédé de la référence 32. Dans un procédé, une cellule hôte déficiente en restriction est transformée avec un génome qui code pour un système de restriction qui est exprimé dans la cellule hôte dégradant le génome de la cellule hôte. Le génome adapté peut comprendre une ou plusieurs séquences qui ne sont pas intégrées dans le chromosome bactérien. Cette/ces séquence(s) est/sont présente (s) dans un ou plusieurs éléments génomiques non intégrés, par exemple un ou plusieurs plasmides. Dans ces modes de réalisation, la transformation peut comprendre des sous-étapes, par exemple la transformation de la cellule hôte avec le chromosome bactérien et la transformation de la cellule hôte avec l'élément ou les éléments génomiques non intégrés. Ces sous-étapes peuvent être réalisées dans n'importe quel ordre, bien que généralement la cellule hôte soit transformée avec le chromosome bactérien avant toute(s) autre(s) transformation(s) avec un ou plusieurs éléments génomiques non intégrés.Once the genome has been produced, it can be introduced into a host cell by transformation according to the method of reference 32. In one method, a restriction-deficient host cell is transformed with a genome that encodes a restriction system that is expressed in the host cell degrading the genome of the host cell. The adapted genome may include one or more sequences that are not integrated into the bacterial chromosome. This / these sequence (s) is / are present in one or more non-integrated genomic elements, for example one or more plasmids. In these embodiments, the transformation may comprise substeps, eg, transformation of the host cell with the bacterial chromosome and transformation of the host cell with the non-integrated genomic element or elements. These sub-steps can be performed in any order, although generally the host cell is transformed with the bacterial chromosome prior to any other transformation (s) with one or more non-integrated genomic elements.

Procédés de production d'OMVOMV production processes

Les OMV peuvent être préparées à partir d'une bactérie comme il a été décrit ci-dessus. Le procédé comprend une étape d'obtention des vésicules à partir d'une culture de la bactérie. Les vésicules peuvent être obtenues par rupture de ou bourgeonnement à partir de la membrane externe de la bactérie pour former des vésicules à partir de là.OMVs can be prepared from a bacterium as described above. The method comprises a step of obtaining vesicles from a culture of the bacterium. The vesicles can be obtained by bursting or budding from the outer membrane of the bacterium to form vesicles therefrom.

Les OMV sont préparées artificiellement à partir de bactéries, et elles peuvent être préparées en utilisant un traitement par détergent (par exemple, avec du désoxycholate ou du sarkosyl), ou par un moyen non détergent (par exemple, voir la référence 33). Les techniques pour former des OMV comprennent le traitement des bactéries avec un détergent à base de sel d'acide biliaire (par exemple, des sels de l’acide lithocholique, l'acide chénodésoxyçholique, l'acide ursodésoxycholique, l'acide désoxycholique, l'acide cholique, l'acide ursocholique, etc., avec le désoxycholate de sodium [34 et 35] étant préféré pour le traitement de Neisseria) à un pH suffisamment élevé pour ne pas précipiter le détergent [36]. D'autres techniques peuvent être réalisées substantiellement en l'absence de détergent [33] en utilisant des techniques comme la sonication, l'homogénéisation, la microfluidisation, la cavitation, le choc osmotique, le broyage, la presse de French, le mélange, etc. Les procédés utilisant peu ou pas de détergent peuvent retenir des antigènes utiles tels que NspA [33]. Ainsi, un procédé peut utiliser un tampon d'extraction des OMV avec environ 0,5 % de désoxycholate ou moins, par exemple, environ 0,2 %, environ 0,1 %, < 0,05 % ou zéro.OMVs are artificially prepared from bacteria, and may be prepared using detergent treatment (e.g., with deoxycholate or sarkosyl), or by non-detergent means (e.g., see reference 33). Techniques for forming OMVs include treating the bacteria with a bile acid salt detergent (e.g., salts of lithocholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, deoxycholic acid, cholic acid, ursocholic acid, etc., with sodium deoxycholate [34 and 35] being preferred for the treatment of Neisseria) at a pH sufficiently high not to precipitate the detergent [36]. Other techniques can be performed substantially in the absence of detergent [33] using techniques such as sonication, homogenization, microfluidization, cavitation, osmotic shock, grinding, French press, mixing, etc. Processes using little or no detergent can retain useful antigens such as NspA [33]. Thus, one method can use an OMV extraction buffer with about 0.5% deoxycholate or less, for example, about 0.2%, about 0.1%, <0.05%, or zero.

Un procédé utile pour la préparation d'OMV est décrit dans la référence 37 et implique l'ultrafiltration sur des OMV brutes, plutôt qu'une centrifugation à haute vitesse. Le procédé peut impliquer une étape d'ultracentrifugation après que l'ultrafiltration prenne place.A useful method for the preparation of OMV is described in reference 37 and involves ultrafiltration on crude OMVs rather than high speed centrifugation. The process may involve an ultracentrifugation step after ultrafiltration takes place.

Antigènes dans les OMVAntigens in OMVs

La combinaison d'antigènes choisis dans le groupe constitué de (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa peut être présente dans une seule OMV ou dans des OMV distinctes multiples. Les antigènes peuvent être ciblés sur et exprimés dans le périplasme de la bactérie Gram négatif de telle façon que l'antigène soit dans la lumière de l'OMV. Dans certains modes de réalisation, l'antigène est présent dans la membrane de l'OMV, c'est-à-dire que seulement une partie de l'antigène est présent dans la lumière de l'OMV. Dans certains modes de réalisation, l'antigène est libre dans la lumière de l'OMV.The combination of antigens selected from the group consisting of (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen may be present in a single OMV or in multiple distinct OMVs. The antigens can be targeted to and expressed in the periplasm of the Gram-negative bacterium such that the antigen is in the OMV lumen. In some embodiments, the antigen is present in the OMV membrane, i.e., only a portion of the antigen is present in the OMV lumen. In some embodiments, the antigen is free in the OMV lumen.

Le terme « dans la lumière » de l'OMV englobe à la fois des protéines qui sont associées à la membrane mais pas exposées à la surface, et des protéines qui sont libres dans la lumière de l'OMV. L'antigène est généralement libre dans la lumière de l'OMV dans la présente invention. Par « libre dans la lumière », cela signifie que l'antigène n'est pas associé intégralement à la membrane de l'OMV. Une association intégrale à la membrane décrit ces protéines qui nécessitent l'utilisation d'un détergent ou d'un autre solvant apolaire pour dissocier la protéine de la membrane. Une description des ancres membranaires pour une association intégrale à la membrane peut être trouvée dans la référence 38. Une protéine qui est libre dans la lumière de l'OMV peut être associée à la membrane ou à une protéine intégrale de la membrane par des interactions non covalentes ou elle peut ne pas s'associer du tout à la membrane de l'OMV. Par exemple, la protéine peut s'associer de façon lâche ou temporaire à la membrane, par exemple, par l'intermédiaire d'interactions hydrophobes, électrostatiques, ioniques et/ou autres non covalentes avec la bicouche lipidique et/ou à une protéine intégrale.The term "in the light" of OMV encompasses both proteins that are membrane associated but not exposed at the surface, and proteins that are free in the OMV lumen. The antigen is generally free in OMV lumen in the present invention. By "free in the light" this means that the antigen is not integrally associated with the OMV membrane. Integral membrane association describes these proteins that require the use of a detergent or other apolar solvent to dissociate the protein from the membrane. A description of the membrane anchors for integral membrane association can be found in reference 38. A protein that is free in the OMV lumen can be associated with the membrane or an integral membrane protein through non-membrane interactions. covalent or it may not associate with the OMV membrane at all. For example, the protein may associate loosely or temporarily with the membrane, for example, via hydrophobic, electrostatic, ionic and / or other non-covalent interactions with the lipid bilayer and / or an integral protein. .

Un avantage de l'antigène étant dans la lumière de l'OMV, plutôt qu'étant associé à la membrane et exposé, est qu'il peut être protégé contre la dégradation par les protéases in vivo. Cette protection peut à son tour entraîner une activation plus efficace des lymphocytes B. L'OMV est capable de déclencher une réponse immunitaire contre l'antigène lorsqu'elle est administrée à un mammifère. La réponse immunitaire peut être une réponse immunitaire cellulaire ou humorale. Généralement, la réponse immunitaire est une réponse en anticorps.An advantage of the antigen being in the OMV lumen, rather than being associated with the membrane and exposed, is that it can be protected against degradation by proteases in vivo. This protection may in turn result in more efficient activation of B cells. OMV is able to elicit an immune response against the antigen when administered to a mammal. The immune response may be a cellular or humoral immune response. Generally, the immune response is an antibody response.

Dans un mode de réalisation, l'OMV de l'invention est capable de déclencher une réponse immunitaire contre l'agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Par exemple, l'antigène déclenche de préférence une réponse immunitaire des lymphocytes T qui peuvent neutraliser l'infection et/ou la virulence de l'agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Les antigènes préférés pour une utilisation dont fait l'invention sont donc ceux qui sont reconnus par le système immunitaire cellulaire lors d'une infection avec un agent pathogène d'intérêt. Sont davantage préférés, ces antigènes qui déclenchent une réponse immunitaire protectrice des lymphocytes T contre un agent pathogène d'intérêt.In one embodiment, the OMV of the invention is capable of eliciting an immune response against the pathogen from which the antigen is derived, i.e., S. aureus. For example, the antigen preferably triggers an immune response of T cells that can neutralize the infection and / or virulence of the pathogen from which the antigen is derived, i.e., S. aureus. The preferred antigens for a use of which the invention is thus are those which are recognized by the cellular immune system during an infection with a pathogen of interest. More preferred are those antigens that elicit a protective immune response of T cells against a pathogen of interest.

Dans un mode de réalisation, l'OMV de l'invention est capable de déclencher des anticorps qui reconnaissent un agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Par exemple, l'antigène déclenche de préférence des anticorps qui peuvent se lier à, et de préférence neutralisent l'infection et/ou la virulence de l'agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Les antigènes préférés pour une utilisation dont fait l'invention sont donc ceux qui sont reconnus par des antisérums lors d'une infection avec l'agent pathogène. Sont davantage préférés, ces antigènes qui déclenchent une réponse immunitaire protectrice contre un agent pathogène d'intérêt. L'antigène peut présenter une immunogénicité accrue lorsqu'il est présenté dans l'OMV comparativement à lorsqu'il est administré sous forme purifiée.In one embodiment, the OMV of the invention is capable of eliciting antibodies that recognize a pathogen from which the antigen is derived, i.e., S. aureus. For example, the antigen preferably triggers antibodies that can bind to, and preferably neutralize, the infection and / or virulence of the pathogen from which the antigen is derived, i.e. , S. aureus. The preferred antigens for a use of which the invention is thus are those which are recognized by antisera during infection with the pathogen. More preferred are those antigens that elicit a protective immune response against a pathogen of interest. The antigen may exhibit increased immunogenicity when presented in OMV compared to when administered in purified form.

Dans un mode de réalisation, les antigènes de l'invention sont fonctionnellement actifs dans la lumière de l'OMV et/ou lors de la libération à partir de la lumière de l'OMV (par exemple, par une rupture médiée par un détergent de l'OMV). L'activité fonctionnelle est un indicateur que l'antigène est replié correctement et a la même ou substantiellement la même structure tertiaire et quaternaire que la même protéine dans son état natif. Par « fonctionnellement actif », cela signifie que l'antigène conserve au moins 50 % ou plus d'au moins une activité biologique de la même protéine lorsqu'il est exprimé dans son environnement natif (par exemple, dans l'organisme à partir duquel il est dérivé). Par exemple, l'antigène peut être considéré comme fonctionnellement actif s'il conserve au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou plus d'au moins une activité biologique de la même protéine lorsqu'il est exprimé dans son environnement natif.In one embodiment, the antigens of the invention are functionally active in the OMV lumen and / or upon release from the OMV lumen (e.g., by a detergent-mediated disruption OMV). Functional activity is an indicator that the antigen is correctly folded and has the same or substantially the same tertiary and quaternary structure as the same protein in its native state. By "functionally active" it means that the antigen retains at least 50% or more of at least one biological activity of the same protein when expressed in its native environment (for example, in the organism from which it is derived). For example, the antigen may be considered functionally active if it retains at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more of at least one biological activity of the same protein when expressed. in its native environment.

Dans des modes de réalisation dans lesquels l'antigène comprend ou est constitué d'un fragment d'une protéine de type sauvage ou de l'un de ses variants, le fragment ou le variant peut être fonctionnellement actif. Par « fragment d'une protéine de type sauvage », cela signifie que l'antigène comprend ou est constitué d'au moins 7 acides aminés consécutifs provenant de la protéine de type sauvage. Dans certains modes de réalisation, le fragment est constitué d'au moins 7, 8, 9, 10, 20, 30, 4 0 acides aminés ou plus provenant de la protéine de type sauvage. Le fragment peut être constitué d'au moins 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de la protéine de type sauvage.In embodiments in which the antigen comprises or consists of a fragment of a wild-type protein or a variant thereof, the fragment or variant may be functionally active. By "wild-type protein fragment" this means that the antigen comprises or consists of at least 7 consecutive amino acids from the wild-type protein. In some embodiments, the fragment is comprised of at least 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 amino acids or more from the wild-type protein. The fragment can be at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% of the wild-type protein.

De préférence, le fragment est un fragment immunogène de l'antigène. Par « fragment immunogène », cela signifie que le fragment a au moins un épitope en commun avec l'antigène. Le terme « épitope » englobe toutes sortes d'épitopes et comprend des épitopes à la fois des lymphocytes B et des lymphocytes T, et des épitopes à la fois linéaires et discontinus. Dans un mode de réalisation, un anticorps qui se lie spécifiquement à l'antigène se lie aussi spécifiquement au fragment immunogène, c'est-à-dire que l'antigène et son fragment immunogène contiennent tous les deux l'épitope auquel cet anticorps se lie.Preferably, the fragment is an immunogenic fragment of the antigen. By "immunogenic fragment" this means that the fragment has at least one epitope in common with the antigen. The term "epitope" encompasses all kinds of epitopes and includes epitopes of both B cells and T cells, and both linear and discontinuous epitopes. In one embodiment, an antibody that specifically binds to the antigen also specifically binds to the immunogenic fragment, i.e. the antigen and its immunogenic fragment both contain the epitope to which that antibody is binds.

Par « se lie spécifiquement », cela signifie que les anticorps se lient à l'antigène de l'invention avec une affinité substantiellement supérieure à la BSA. De préférence, l'affinité est au moins 100 fois, 103 fois, 104 fois, 105 fois, 106 fois, etc. supérieure pour l'antigène de l'invention que pour la BSA.By "specifically binds", it means that the antibodies bind to the antigen of the invention with an affinity substantially greater than the BSA. Preferably, the affinity is at least 100 times, 103 times, 104 times, 105 times, 106 times, etc. superior for the antigen of the invention than for BSA.

Les épitopes présents dans les antigènes peuvent être déterminés et/ou prédits en utilisant tous les procédés connus de l'état de l'art. Par exemple, le logiciel de prédiction d'épitopes comme EpiToolKit, qui est un serveur Internet pour 1'immunomique informatique [39]. Ce logiciel de prédiction d'épitopes fournit plusieurs procédés pour prédire des épitopes potentiels de lymphocytes T, des épitopes de liaison à la fois du CMH de classe I et du CMH de classe II.The epitopes present in the antigens can be determined and / or predicted using all known methods of the state of the art. For example, epitope prediction software such as EpiToolKit, which is an Internet server for computer immunomics [39]. This epitope prediction software provides several methods for predicting potential T cell epitopes, both class I MHC and class II MHC binding epitopes.

La présence d'épitopes des lymphocytes B peut être également prédite en utilisant tous les procédés connus de l'état de l'art, par exemple, tels que décrits dans les références [40, 41 et 42] . La présence d'épitopes linéaires continus et/ou d'épitopes discontinus peut être prédite en utilisant les procédés décrits dedans.The presence of B cell epitopes can also be predicted using any of the known methods of the state of the art, for example, as described in references [40, 41 and 42]. The presence of continuous linear epitopes and / or discontinuous epitopes can be predicted using the methods described therein.

Par « variant d'une protéine de type sauvage », cela signifie que l'antigène comprend ou est constitué d'une protéine pleine longueur, par exemple, une protéine avec le même nombre d'acides aminés que la protéine de type sauvage, ou un fragment de la protéine de type sauvage qui contient une ou plusieurs variations dans la séquence d'acides aminés comparativement à la séquence de type sauvage. Un variant peut présenter au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou plus d'identité de séquence avec la protéine de type sauvage. Dans certains modes de réalisation, le variant est également fonctionnellement actif. L'antigène peut être fusionné à un partenaire de fusion, c'est-à-dire que l'antigène peut faire partie d'une protéine de fusion. Les protéines de fusion peuvent comprendre une séquence -X-Y- ou -Y-X-, dans laquelle : -X- est un antigène tel que défini ci-dessus, et -Y- est une séquence polypeptidique supplémentaire. Dans un mode de réalisation particulier, -Y- est un marqueur protéinique qui aide à la détection de l'antigène comme 6xHIS, FLAG, HA, GST, GFP ou une autre protéine fluorescente, et/ou la luciférase ou n'importe quel polypeptide approprié qui aide à la fonction de l'antigène. Lorsque l'antigène fait partie d'une protéine de fusion, la protéine de fusion entière sera dans la lumière de l'OMV. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion sera libre dans la lumière de l'OMV.By "wild type protein variant", it means that the antigen comprises or consists of a full-length protein, for example, a protein with the same number of amino acids as the wild-type protein, or a fragment of the wild-type protein that contains one or more variations in the amino acid sequence compared to the wild-type sequence. A variant may have at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or more sequence identity with the wild-type protein. In some embodiments, the variant is also functionally active. The antigen may be fused to a fusion partner, i.e. the antigen may be part of a fusion protein. The fusion proteins may comprise a sequence -X-Y- or -Y-X-, wherein: -X- is an antigen as defined above, and -Y- is an additional polypeptide sequence. In a particular embodiment, -Y- is a protein marker that assists in the detection of antigen such as 6xHIS, FLAG, HA, GST, GFP or other fluorescent protein, and / or luciferase or any polypeptide suitable for the function of the antigen. When the antigen is part of a fusion protein, the entire fusion protein will be in the OMV lumen. In some embodiments, the fusion protein will be free in the OMV lumen.

Compositions pharmaceutiques L'invention propose une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins deux des antigènes choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins une OMV comprenant au moins l'un des antigènes choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. Généralement, la composition pharmaceutique comprend une OMV qui comprend au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) esxAB et (iv) staOll. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins deux OMV différentes, où chaque OMV comprend au moins l'un des antigènes choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB dans sa lumière et (b) un support pharmaceutiquement acceptable.Pharmaceutical Compositions The invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) at least two of the antigens selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. The invention also provides a pharmaceutical composition comprising (a) at least one OMV comprising at least one of the antigens selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. Generally, the pharmaceutical composition comprises an OMV which comprises at least two antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least three antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally at least four of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen, or more generally the four antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB and (iv) staOll. The invention also provides a pharmaceutical composition comprising (a) at least two different OMVs, wherein each OMV comprises at least one of the antigens selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen in its light and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

La composition pharmaceutique peut comprendre au moins une OMV qui comprend au moins deux antigènes de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie au sein de la même OMV. En variante, la composition pharmaceutique peut comprendre de multiples OMV différentes qui comprennent au moins un antigène de S. aureus choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie dans des OMV distinctes. La composition pharmaceutique peut comprendre (a) au moins une OMV de l'invention et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique peut comprendre au moins deux, au moins trois ou au moins quatre OMV de l'invention. L'invention propose également un procédé de préparation d'une telle composition, comprenant l'étape de mélange des OMV de l'invention avec un support pharmaceutiquement acceptable. L'invention propose également un récipient (par exemple, un flacon) ou un dispositif d'administration (par exemple, une seringue) prérempli avec une composition pharmaceutique de l'invention. L'invention propose également un procédé de fourniture d'un tel récipient ou dispositif, comprenant l'introduction dans le récipient ou le dispositif d'une composition contenant des vésicules de l'invention.The pharmaceutical composition may comprise at least one OMV which comprises at least two S. aureus antigens selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, i.e. a combination of antigens is provided within the same OMV. Alternatively, the pharmaceutical composition may comprise multiple different OMVs that comprise at least one S. aureus antigen selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, i.e. a combination of antigens is provided in separate OMVs. The pharmaceutical composition may comprise (a) at least one OMV of the invention and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition can comprise at least two, at least three or at least four OMVs of the invention. The invention also provides a process for preparing such a composition, comprising the step of mixing the OMV of the invention with a pharmaceutically acceptable carrier. The invention also provides a container (e.g., a vial) or delivery device (e.g., a syringe) pre-filled with a pharmaceutical composition of the invention. The invention also provides a method of providing such a container or device comprising introducing into the container or device a composition containing vesicles of the invention.

La composition immunogène peut comprendre un support pharmaceutiquement acceptable, qui peut être toute substance qui n'induit pas elle-même la production d'anticorps nocifs pour le patient recevant la composition, et qui peut être administrée sans toxicité excessive. Les supports pharmaceutiquement acceptables peuvent comprendre des liquides comme l'eau, le sérum physiologique, le glycérol et l'éthanol. Des substances auxiliaires, comme des agents de mouillage ou d'émulsification, des substances tampons de pH, et analogues, peuvent être également présentes dans de tels véhicules. Une discussion complète portant sur les supports appropriés est disponible dans la référence 43.The immunogenic composition may comprise a pharmaceutically acceptable carrier, which may be any substance which does not itself induce the production of antibodies harmful to the patient receiving the composition, and which can be administered without undue toxicity. Pharmaceutically acceptable carriers may include liquids such as water, saline, glycerol and ethanol. Auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents, pH buffering substances, and the like, may also be present in such vehicles. A full discussion of the appropriate media is available in reference 43.

Les bactéries peuvent affecter diverses zones du corps et ainsi les compositions de l'invention peuvent être préparées sous des formes variées. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous la forme d'un injectable, soit sous la forme de solutions liquides soit sous la forme de suspensions. Des formes solides appropriées pour une solution, ou une suspension, dans des véhicules liquides avant l'injection peuvent être également préparées. La composition peut être préparée pour une administration topique, par exemple, sous la forme d'une pommade, d'une crème ou d'une poudre. La composition peut être préparée pour une administration orale, par exemple, sous la forme d'un comprimé ou d'une capsule, ou sous la forme d'un sirop (éventuellement aromatisé). La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un ovule. La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme de gouttes.The bacteria can affect various areas of the body and thus the compositions of the invention can be prepared in various forms. For example, the compositions may be prepared as an injectable, either in the form of liquid solutions or in the form of suspensions. Solid forms suitable for solution, or suspension, in liquid vehicles prior to injection may also be prepared. The composition may be prepared for topical administration, for example as an ointment, cream or powder. The composition may be prepared for oral administration, for example in the form of a tablet or capsule, or in the form of a syrup (optionally flavored). The composition may be prepared for pulmonary administration, for example, in the form of an inhaler, using a fine powder or spraying. The composition may be prepared in the form of a suppository or an egg. The composition may be prepared for nasal, atrial or ocular administration, for example in the form of drops.

Un support pharmaceutique peut comprendre un agent protecteur contre la température, et ce composant peut être particulièrement utile dans les compositions adjuvées (particulièrement celles contenant un adjuvant minéral, comme un sel d'aluminium). Comme il est décrit dans la référence 44, un agent protecteur contre la température liquide peut être ajouté à une composition vaccinale aqueuse pour abaisser son point de congélation, par exemple, pour réduire le point de congélation en-dessous de 0 °C. Ainsi, la composition peut être stockée en-dessous de 0 °C, mais au-dessus de son point de congélation, pour inhiber la dégradation thermique. L'agent protecteur contre- la température permet également de congeler la composition tout en protégeant les adjuvants à base de sels minéraux contre l'agglomération ou la sédimentation après la congélation et la décongélation, et il peut également protéger la composition à des températures élevées, par exemple, au-dessus de 40 °C. Un vaccin aqueux de départ et l'agent protecteur contre la température liquide peuvent être mélangé de telle façon que l'agent protecteur contre la température liquide forme de 1 à 80 % en volume du mélange final. Les agents protecteurs contre la température appropriés devront être sans risque pour une administration à un être humain, facilement miscibles/solubles dans l'eau, et ils ne devront pas endommager les autres composants (par exemple, l'antigène et l'adjuvant) dans la composition. Les exemples comprennent la glycérine, le propylène glycol, et/ou le polyéthylène glycol (PEG). Les PEG appropriés peuvent avoir un poids moléculaire moyen situé dans la plage de 200 à 20 000 Da. Dans un mode de réalisation préféré, le polyéthylène glycol peut avoir un poids moléculaire moyen d'environ 300 Da (« PEG-300 »).A pharmaceutical carrier may include a temperature-protecting agent, and this component may be particularly useful in adjuvanted compositions (particularly those containing a mineral adjuvant, such as an aluminum salt). As described in reference 44, a liquid temperature protective agent may be added to an aqueous vaccine composition to lower its freezing point, for example, to reduce the freezing point below 0 ° C. Thus, the composition can be stored below 0 ° C, but above its freezing point, to inhibit thermal degradation. The temperature-controlling agent also allows the composition to be frozen while protecting the mineral-based adjuvants against agglomeration or sedimentation after freezing and thawing, and it can also protect the composition at elevated temperatures, for example, above 40 ° C. A starting aqueous vaccine and the liquid temperature protecting agent may be mixed in such a way that the liquid temperature protective agent forms from 1 to 80% by volume of the final mixture. Suitable temperature-protecting agents should be safe for administration to a human, easily miscible / soluble in water, and they should not damage other components (eg, antigen and adjuvant) in the composition. Examples include glycerine, propylene glycol, and / or polyethylene glycol (PEG). Suitable PEG's may have an average molecular weight in the range of 200 to 20,000 Da. In a preferred embodiment, the polyethylene glycol may have an average molecular weight of about 300 Da ("PEG-300").

La composition est de préférence stérile. Elle est de préférence apyrogène. Elle est de préférence tamponnée, par exemple, entre pH 6 et pH 8, généralement autour de pH 7. Les compositions de l'invention peuvent être isotoniques par rapport aux êtres humains.The composition is preferably sterile. It is preferably pyrogen-free. It is preferably buffered, for example, between pH 6 and pH 8, generally around pH 7. The compositions of the invention may be isotonic with respect to humans.

Les compositions immunogènes comprennent une quantité immunologiquement efficace d'antigène ou de vésicules immunogènes, ainsi que de tout autre des autres composants spécifiés, selon les besoins. Par « quantité immunologiquement efficace », cela signifie que l'administration de cette quantité à un individu, soit dans une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie selon la condition de santé et physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, un primate non humain, un primate, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin, l'estimation du médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée par l'intermédiaire d'essais de routine.The immunogenic compositions comprise an immunologically effective amount of immunogenic antigen or vesicles, as well as any other specified components, as needed. By "immunologically effective amount" it means that administration of that amount to an individual, either in a single dose or as part of a series, is effective for treatment or prevention. This quantity varies according to the health and physical condition of the individual to be treated, the age, the taxonomic group of the individual to be treated (for example, a non-human primate, a primate, etc.), the capacity of the system the individual's immune system to synthesize antibodies, the degree of protection desired, the vaccine formulation, the physician's estimate of the medical situation, and other relevant factors. The quantity is expected to be within a relatively wide range that can be determined through routine testing.

Des travaux antérieurs avec des vaccins à base de vésicules (par exemple, pour le méningocoque) offrent des indications pharmaceutiques, posologiques et de formulation pour les compositions de l'invention. La concentration des vésicules dans les compositions de l'invention sera généralement entre 10 et 500 μg/ml, de préférence entre 25 et 200 μς/ηιΐ, et de manière davantage préférée environ 50 μ9/ιη1 ou environ 100 μ9/ιη1 (exprimée en termes de protéines totales dans les vésicules). Un volume de dosage de 0,5 ml est typique pour une injection.Previous work with vesicle-based vaccines (eg for meningococcus) provides pharmaceutical, dosage and formulation indications for the compositions of the invention. The concentration of the vesicles in the compositions of the invention will generally be between 10 and 500 μg / ml, preferably between 25 and 200 μς / ηιΐ, and more preferably about 50 μ9 / ιη1 or about 100 μ9 / ιη1 (expressed as terms of total proteins in the vesicles). A dosage volume of 0.5 ml is typical for an injection.

La composition peut être administrée conjointement avec d'autres agents immunorégulateurs.The composition may be administered together with other immunoregulatory agents.

Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans les compositions de l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : A. Compositions contenant des minérauxAdjuvants which may be used in the compositions of the invention include, but are not limited to: A. Compositions containing minerals

Les compositions contenant des minéraux appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des sels minéraux, comme des sels d'aluminium et des sels de calcium. L'invention comprend des sels minéraux comme des hydroxydes (par exemple, des oxyhydroxydes), des phosphates (par exemple, des hydroxyphosphates, des orthophosphates), des sulfates, etc. [par exemple, voir les chapitres 8 &amp; 9 de la référence 48], ou des mélanges de différents composés minéraux, avec les composés prenant toute forme appropriée (par exemple, gels, cristalline, amorphe, etc.), et avec l'adsorption étant préférée. Les compositions contenant des minéraux peuvent être également formulées sous la forme d'une particule de sel de métal.The mineral-containing compositions suitable for use as adjuvants in the invention include inorganic salts, such as aluminum salts and calcium salts. The invention includes inorganic salts such as hydroxides (eg, oxyhydroxides), phosphates (eg, hydroxyphosphates, orthophosphates), sulfates, and the like. [for example, see chapters 8 &amp; 9 of 48], or mixtures of different inorganic compounds, with compounds of any suitable form (eg, gels, crystalline, amorphous, etc.), and with adsorption being preferred. The mineral-containing compositions may also be formulated as a metal salt particle.

Les adjuvants connus comme « 1'hydroxyde d'aluminium » sont généralement des sels d'oxyhydroxyde d'aluminium, qui sont habituellement au moins partiellement cristallins. L'oxyhydroxyde d'aluminium, qui peut être représenté par la formule AIO(OH), peut se distinguer d'autres composés d'aluminium, comme 1'hydroxyde d'aluminium Al(OH)3, par la spectroscopie infrarouge (IR), en particulier par la présence d'une bande d'adsorption à 1070 cm-1 et un fort épaulement à 3090 à 3100 cm-1 [chapitre 9 de la référence 48] . Le degré de cristallinité d'un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium est reflété par la largeur de la bande de diffraction à mi-hauteur (WHH), avec les particules faiblement cristallines présentant un élargissement de ligne supérieur dû aux tailles plus petites des cristallites. La surface spécifique augmente lorsque la WHH augmente, et il a été observé que les adjuvants avec des valeurs de WHH supérieures présentent une capacité supérieure d'adsorption d'antigène. Une morphologie fibreuse (par exemple, comme il est observé sur les micrographies électroniques à transmission) est typique des adjuvants d'hydroxyde d'aluminium. Le pi des adjuvants d'hydroxyde d'aluminium est généralement d'environ 11, c'est-à-dire que l'adjuvant lui-même possède une charge de surface positive à pH physiologique. Des capacités d'adsorption entre 1,8 et 2,6 mg de protéine par mg de Al+++ à pH 7,4 ont été rapportées pour les adjuvants d'hydroxyde d'aluminium.Adjuvants known as "aluminum hydroxide" are generally aluminum oxyhydroxide salts, which are usually at least partially crystalline. Aluminum oxyhydroxide, which may be represented by the formula IAO (OH), may be distinguished from other aluminum compounds, such as Al (OH) 3 aluminum hydroxide, by infrared spectroscopy (IR) , in particular by the presence of an adsorption band at 1070 cm -1 and a strong shoulder at 3090 at 3100 cm -1 (chapter 9 of reference 48). The degree of crystallinity of an aluminum hydroxide adjuvant is reflected by the width of the mid-height diffraction band (WHH), with the low crystalline particles having higher line broadening due to smaller crystallite sizes . Specific surface area increases as WHH increases, and adjuvants with higher WHH values have been found to exhibit superior antigen adsorption capacity. Fibrous morphology (e.g., as observed on transmission electron micrographs) is typical of aluminum hydroxide adjuvants. The amount of aluminum hydroxide adjuvants is generally about 11, i.e., the adjuvant itself has a positive surface charge at physiological pH. Adsorption capacities between 1.8 and 2.6 mg protein per mg Al +++ at pH 7.4 have been reported for aluminum hydroxide adjuvants.

Les adjuvants connus comme le « phosphate d'aluminium » sont généralement des hydroxyphosphates d'aluminium, contenant souvent aussi une petite quantité de sulfate (c'est-à-dire, hydroxyphosphate sulfate d'aluminium). Ils peuvent être obtenus par précipitation, et les conditions réactionnelles et les concentrations durant la précipitation influencent le degré de substitution du phosphate à l'hydroxyle dans le sel. Les hydroxyphosphates présentent généralement un rapport molaire PO4/AI entre 0,3 et 1,2. Les hydroxyphosphates peuvent se distinguer du AIPO4 strict par la présence de groupes hydroxyle. Par exemple, une bande de spectre IR à 3164 cm-1 (par exemple, à 200 °C) indique la présence d'hydroxyles structuraux [chapitre 9 de la référence 48].Adjuvants known as "aluminum phosphate" are generally aluminum hydroxyphosphates, often also containing a small amount of sulfate (i.e., aluminum hydroxyphosphate sulfate). They can be obtained by precipitation, and the reaction conditions and concentrations during the precipitation influence the degree of substitution of the phosphate for the hydroxyl in the salt. The hydroxyphosphates generally have a molar ratio PO4 / Al between 0.3 and 1.2. Hydroxyphosphates can be distinguished from strict AIPO4 by the presence of hydroxyl groups. For example, an IR spectrum band at 3164 cm-1 (for example, at 200 ° C) indicates the presence of structural hydroxyls [Chapter 9 of Reference 48].

Le rapport molaire P04/A13+ d'un adjuvant de phosphate d'aluminium se situera généralement entre 0,3 et 1,2, de préférence entre 0,8 et 1,2, et de manière davantage préférée 0,95 ± 0,1. Le phosphate d'aluminium sera généralement amorphe, particulièrement pour les sels d1hydroxyphosphate. Un adjuvant type est 1'hydroxyphosphate d'aluminium amorphe avec un rapport molaire PCh/Al entre 0,84 et 0,92, y compris à 0,6 mg de Al3+/ml. Le phosphate d'aluminium sera généralement particulaire (par exemple, une morphologie de type plaque comme il est observé sur les micrographies électroniques à transmission). Les diamètres types des particules se situent dans la plage de 0,5 à 20 pm (par exemple, environ 5 à 10 μπι) après l'adsorption d'un antigène quelconque. Des capacités d'adsorption entre 0,7 et 1,5 mg de protéine par mg de Al+++ à pH 7,4 ont été rapportées pour les adjuvants de phosphate d'aluminium.The P04 / A13 + molar ratio of an aluminum phosphate adjuvant will generally be between 0.3 and 1.2, preferably between 0.8 and 1.2, and more preferably 0.95 ± 0.1. . Aluminum phosphate will generally be amorphous, particularly for the hydroxyphosphate salts. A typical adjuvant is amorphous aluminum hydroxyphosphate with a PCh / Al molar ratio of between 0.84 and 0.92, including 0.6 mg of Al3 + / ml. Aluminum phosphate will generally be particulate (eg, plate-like morphology as observed on transmission electron micrographs). The typical diameters of the particles are in the range of 0.5 to 20 μm (for example, about 5 to 10 μπι) after the adsorption of any antigen. Adsorption capacities between 0.7 and 1.5 mg protein per mg Al +++ at pH 7.4 have been reported for aluminum phosphate adjuvants.

Le point de charge zéro (PZC) du phosphate d'aluminium est inversement proportionnel au degré de substitution du phosphate à l'hydroxyle, et ce degré de substitution peut varier selon les conditions réactionnelles et la concentration des réactifs utilisés pour préparer le sel par précipitation. Le PZC est également modifié en changeant la concentration des ions phosphate libres en solution (plus de phosphate = PZC plus acide) ou en ajoutant un tampon comme un tampon histidine (rend le PZC plus basique). Les phosphates d'aluminium utilisés selon l'invention auront généralement un PZC entre 4,0 et 7,0, de manière davantage préférée entre 5,0 et 6,5, par exemple environ 5,7 .The zero point of charge (PZC) of the aluminum phosphate is inversely proportional to the degree of substitution of the phosphate with the hydroxyl, and this degree of substitution can vary according to the reaction conditions and the concentration of the reagents used to prepare the salt by precipitation. . PZC is also modified by changing the concentration of free phosphate ions in solution (more phosphate = more acidic PZC) or by adding a buffer like a histidine buffer (makes the PZC more basic). The aluminum phosphates used according to the invention will generally have a PZC between 4.0 and 7.0, more preferably between 5.0 and 6.5, for example about 5.7.

Les suspensions de sels d'aluminium utilisées pour préparer des compositions de l'invention peuvent contenir un tampon (par exemple, un tampon phosphate ou un tampon histidine ou un tampon Tris), mais celui-ci n'est pas toujours nécessaire. Les suspensions sont de préférence stériles et apyrogènes. Une suspension peut comprendre des ions phosphate aqueux libres, par exemple, présents à une concentration entre 1,0 et 20 mM, de préférence entre 5 et 15 mM, et de manière davantage préférée environ 10 mM. Les suspensions peuvent également comprendre du chlorure de sodium.The aluminum salt suspensions used to prepare compositions of the invention may contain a buffer (for example, a phosphate buffer or a histidine buffer or a Tris buffer), but this is not always necessary. The suspensions are preferably sterile and pyrogen-free. A suspension may comprise free aqueous phosphate ions, for example, present at a concentration between 1.0 and 20 mM, preferably between 5 and 15 mM, and more preferably about 10 mM. The suspensions may also include sodium chloride.

Dans un mode de réalisation, un composant adjuvant comprend un mélange à la fois d'un hydroxyde d'aluminium et d'un phosphate d'aluminium. Dans ce cas, il peut y avoir plus de phosphate d'aluminium que d'hydroxyde, par exemple, un rapport pondéral d'au moins 2/1, par exemple, ^ 5/1, ^ 6/1, ^ 7/1, ^ 8/1, ^ 9/1, etc.In one embodiment, an adjunct component comprises a mixture of both aluminum hydroxide and aluminum phosphate. In this case, there may be more aluminum phosphate than hydroxide, for example, a weight ratio of at least 2/1, for example, 5/1, 6/1, 7/1 , ^ 8/1, ^ 9/1, etc.

La concentration de Al+++ dans une composition pour une administration à un patient est de préférence inférieure à 10 mg/ml, par exemple, ^ 5 mg/ml, ^ 4 mg/ml, ^ 3 mg/ml, ^ 2 mg/ml, ^ 1 mg/ml, etc. Une plage préférée est entre 0,3 et 1 mg/ml. Un maximum de < 0,85 mg/dose est préféré. B. Emulsions huileusesThe concentration of Al +++ in a composition for administration to a patient is preferably less than 10 mg / ml, for example, 5 mg / ml, 4 mg / ml, 3 mg / ml, 2 mg / ml, ^ 1 mg / ml, etc. A preferred range is between 0.3 and 1 mg / ml. A maximum of <0.85 mg / dose is preferred. B. Oily emulsions

Les compositions d'émulsions huileuses appropriées pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des émulsions squalène-eau, comme le MF59 [chapitre 10 de la référence 48 ; voir également la référence 45] (5 % de squalène, 0,5 % de Tween 80, et 0,5 % de Span 85, formulés dans des particules submicroniques en utilisant un microfluidiseur). De l'adjuvant complet de Freund (CFA) et de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) peuvent être également utilisés.Oily emulsion compositions suitable for use as adjuvants in the invention include squalene-water emulsions, such as MF59 [chapter 10 of reference 48; see also reference 45] (5% squalene, 0.5% Tween 80, and 0.5% Span 85, formulated in submicron particles using a microfluidizer). Freund's Complete Adjuvant (CFA) and Incomplete Freund's Adjuvant (IFA) can also be used.

Diverses émulsions huile dans l'eau appropriées sont connues, et elles comprennent généralement au moins une huile et au moins un tensioactif, avec l'huile/les huiles et le(s) tensioactif (s) étant biodégradable (s) (métabolisable (s)) et biocompatible (s) . Les gouttelettes d'huile dans l'émulsion ont généralement un diamètre inférieur à 5 μπι, et de façon avantageuse l'émulsion comprend des gouttelettes d'huile avec un diamètre submicronique, avec ces petites tailles étant obtenues avec un microfluidiseur pour fournir des émulsions stables. Les gouttelettes avec une taille inférieure à 220 nm sont préférées car elles peuvent être soumises à une stérilisation par filtration. L'invention peut être utilisée avec des huiles telles que celles de source animale (comme de poissons) ou végétale. Les sources pour les huiles végétales comprennent des noix, des graines et des grains. L'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile de noix de coco, et l'huile d'olive, la plus couramment disponible, exemplifient les huiles de noix. L'huile de jojoba peut être utilisée, par exemple, obtenue à partir de la fève de jojoba. Les huiles de graines comprennent l'huile de carthame, l'huile de graines de coton, l'huile de graines de tournesol, l'huile de graines de sésame et analogues. Dans le groupe des grains, l'huile de maïs est la plus facilement disponible, mais l'huile d'autres grains de céréales comme le blé, l'avoine, le seigle, le riz, le teff, le triticale et analogues peut être également utilisée. Des esters d'acides gras à 6 à 10 carbones de glycérol et de 1,2-propanediol, tout en n'existant pas naturellement dans les huiles de graines, peuvent être préparés par hydrolyse, séparation et estérification des matériaux appropriés en démarrant à partir des huiles de noix et de graines. Les graisses et les huiles de laits de mammifères sont métabolisables et peuvent donc être utilisées dans la pratique de cette invention. Les procédures pour la séparation, la purification, la saponification et d'autres moyens nécessaires pour obtenir des huiles pures de sources animales sont bien connus de l'état de l'art. La plupart des poissons contiennent des huiles métabolisables qui peuvent être facilement récupérées. Par exemple, l'huile de foie de morue, les huiles de foie de requin, et l'huile de baleine comme le spermaceti exemplifient plusieurs des huiles de poissons qui peuvent être utilisées dans la présente. Un certain nombre d'huiles à chaîne ramifiée sont synthétisées par biochimie en unités d'isoprène à 5 carbones et elles sont généralement appelées terpénoïdes. L'huile de foie de requin contient un terpénoïde insaturé, ramifié connu sous le nom de squalène, 2,6,10,15,19,23-hexaméthyl-2,6,10,14,18,22-tétracosahexaène. D'autres huiles préférées sont les tocophérols (voir ci-dessous). Les émulsions huile dans l'eau comprenant du squalène sont particulièrement préférées. Des mélanges d'huiles peuvent être utilisés.Various suitable oil-in-water emulsions are known, and they generally comprise at least one oil and at least one surfactant, with the oil / oils and the surfactant (s) being biodegradable (metabolizable (s)). )) and biocompatible (s). The oil droplets in the emulsion generally have a diameter of less than 5 μπι, and advantageously the emulsion comprises oil droplets with a submicron diameter, with these small sizes being obtained with a microfluidizer to provide stable emulsions . Droplets with a size smaller than 220 nm are preferred because they can be sterilized by filtration. The invention can be used with oils such as those of animal source (such as fish) or vegetable. Sources for vegetable oils include nuts, seeds and grains. Peanut oil, soybean oil, coconut oil, and olive oil, the most commonly available, exemplify nut oils. Jojoba oil can be used, for example, obtained from the jojoba bean. Seed oils include safflower oil, cottonseed oil, sunflower seed oil, sesame seed oil and the like. In the grain group, corn oil is most readily available, but the oil of other cereal grains such as wheat, oats, rye, rice, teff, triticale and the like can be also used. 6- to 10-carbon fatty acid esters of glycerol and 1,2-propanediol, while not naturally occurring in seed oils, can be prepared by hydrolysis, separation and esterification of the appropriate materials starting from nuts and seeds oils. Mammalian milk fats and oils are metabolizable and can therefore be used in the practice of this invention. Procedures for separation, purification, saponification and other means necessary to obtain pure oils from animal sources are well known in the art. Most fish contain metabolizable oils that can be easily recovered. For example, cod liver oil, shark liver oils, and whale oil such as spermaceti exemplify many of the fish oils that can be used herein. A number of branched chain oils are synthesized by biochemistry in 5-carbon isoprene units and are generally referred to as terpenoids. Shark liver oil contains a branched, unsaturated terpenoid known as squalene, 2,6,10,15,19,23-hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaene. Other preferred oils are tocopherols (see below). Oil-in-water emulsions comprising squalene are particularly preferred. Oil blends can be used.

Les tensioactifs peuvent être classés par leur « BHL » (balance hydrophile/lipophile). Les tensioactifs préférés de l'invention ont une BHL d'au moins 10, de préférence au moins 15, et de manière davantage préférée au moins 16. L'invention peut être utilisée avec des tensioactifs comprenant, mais n'y étant pas limités, les tensioactifs d'esters de sorbitane polyoxyéthylène (couramment appelés Tween), spécialement le polysorbate 20 et le polysorbate 80 ; des copolymères d'oxyde d'éthylène (EO), d'oxyde de propylène (PO), et/ou d'oxyde de butylène (BO), vendu sous le nom commercial de DOWFAX™, comme les copolymères séquencés EO/PO linéaires, les octoxynols, qui peuvent varier dans le nombre des groupes éthoxy répétitifs (oxy-1,2-éthanediyle), avec l'octoxynol 9 (Triton X-100, ou t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol) étant d'un intérêt particulier ; 1'(octylphénoxy)polyéthoxyéthanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; les phospholipides comme la phosphatidyl-choline (lécithine) ; les éthers gras de polyoxyéthylène dérivés des alcools laurylique, cétylique, stéarylique et oléylique (connus comme les tensioactifs Brij), comme l'éther monolaurylique de triéthylène glycol (Brij 30) ; et les esters de sorbitane (couramment connus comme les SPAN) , comme le trioléate de sorbitane (Span 85) et le monolaurate de sorbitane. Les tensioactifs préférés pour une inclusion dans l'émulsion sont le Tween 80 (monooléate de sorbitane polyoxyéthylène), le Span 85 (trioléate de sorbitane), la lécithine et le Triton X-100. Comme il a été susmentionné, des détergents comme le Tween 80 peuvent contribuer à la stabilité thermique observée dans les exemples ci-dessous.Surfactants can be classified by their "BHL" (hydrophilic / lipophilic balance). The preferred surfactants of the invention have a BHL of at least 10, preferably at least 15, and more preferably at least 16. The invention may be used with surfactants comprising, but not limited to, surfactants. polyoxyethylene sorbitan ester surfactants (commonly called Tween), especially polysorbate 20 and polysorbate 80; copolymers of ethylene oxide (EO), propylene oxide (PO), and / or butylene oxide (BO) sold under the trade name DOWFAX ™, such as linear EO / PO block copolymers octoxynols, which may vary in the number of repeating ethoxy groups (oxy-1,2-ethanediyl), with octoxynol 9 (Triton X-100, or t-octylphenoxypolyethoxyethanol) being of particular interest; 1 '(octylphenoxy) polyethoxyethanol (IGEPAL CA-630 / NP-40); phospholipids such as phosphatidyl choline (lecithin); polyoxyethylene fatty ethers derived from lauryl, cetyl, stearyl and oleyl alcohols (known as Brij surfactants), such as triethylene glycol monolauryl ether (Brij 30); and sorbitan esters (commonly known as SPANs), such as sorbitan trioleate (Span 85) and sorbitan monolaurate. Preferred surfactants for inclusion in the emulsion are Tween 80 (polyoxyethylene sorbitan monooleate), Span 85 (sorbitan trioleate), lecithin and Triton X-100. As mentioned above, detergents such as Tween 80 can contribute to the thermal stability observed in the examples below.

Des mélanges de tensioactifs peuvent être utilisés, par exemple, des mélanges de Tween 80/Span 85. Une combinaison d'un ester de sorbitane polyoxyéthylène comme le monooléate de sorbitane polyoxyéthylène (Tween 80) et d'un octoxynol comme le t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (Triton X-100) est également appropriée. Une autre combinaison utile comprend du laureth 9 plus un ester de sorbitane polyoxyéthylène et/ou un octoxynol.Surfactant mixtures may be used, for example, Tween 80 / Span 85 mixtures. A combination of a polyoxyethylene sorbitan ester such as polyoxyethylene (Tween 80) sorbitan monooleate and an octoxynol such as t-octylphenoxypolyethoxyethanol ( Triton X-100) is also appropriate. Another useful combination includes laureth 9 plus a polyoxyethylene sorbitan ester and / or an octoxynol.

Les quantités préférées des tensioactifs (% en poids) sont : esters de sorbitane polyoxyéthylène (tel que Tween 80) 0,01 à 1 %, en particulier environ 0,1 % ; octyl- ou nonyl-phénoxypolyoxyéthanols (tel que Triton X-100, ou d'autres détergents dans la série Triton) 0,001 à 0,1 %, en particulier 0,005 à 0,02 % ; éthers de polyoxyéthylène (tel que laureth 9) 0,1 à 20 %, de préférence 0,1 à 10 % et en particulier 0,1 à 1 % ou environ 0,5 %.Preferred amounts of the surfactants (wt%) are: polyoxyethylene (such as Tween 80) sorbitan esters 0.01 to 1%, especially about 0.1%; octyl- or nonyl-phenoxypolyoxyethanols (such as Triton X-100, or other detergents in the Triton series) 0.001 to 0.1%, especially 0.005 to 0.02%; polyoxyethylene ethers (such as laureth 9) 0.1 to 20%, preferably 0.1 to 10% and in particular 0.1 to 1% or about 0.5%.

Les adjuvants à base d'émulsions huile dans l'eau spécifiques utiles pour l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : • une émulsion submicronique de squalène, Tween 80, etAdjuvants based on specific oil-in-water emulsions useful for the invention include, but are not limited to: a submicron emulsion of squalene, Tween 80, and

Span 85. La composition de l'émulsion en volume peut être environ 5 % de squalène, environ 0,5 % de polysorbate 80 et environ 0,5 % de Span 85. En termes de poids, ces rapports deviennent 4,3 % de squalène, 0,5 % de polysorbate 80 et 0,48 % de Span 85. Cet adjuvant est connu sous le nom de « MF59 » [45-47], tel que décrit plus en détail dans le chapitre 10 de la référence 48 et le chapitre 12 de la référence 49. L'émulsion MF59 comprend de façon avantageuse des ions citrate, par exemple, ' 10 mM de tampon citrate de sodium. • Une émulsion comprenant du squalène, un a-tocophérol, et du polysorbate 80. Ces émulsions peuvent avoir de 2 à 10 % de squalène, de 2 à 10 % de tocophérol et de 0,3 à 3 % de Tween 80, et le rapport pondéral du squalène/tocophérol est de préférence ^ 1 (par exemple, 0,90) car ceci fournit une émulsion plus stable. Le squalène et le Tween 80 peuvent être présents dans un rapport de volume d'environ 5/2, ou dans un rapport pondéral d'environ 11/5. Une telle émulsion peut être fabriquée en dissolvant du Tween 80 dans du PBS pour donner une solution à 2 %, puis en mélangeant 90 ml de cette solution avec un mélange de (5 g de DL-a-tocophérol et 5 ml de squalène), puis en microfluidisant le mélange. L'émulsion résultante peut avoir des gouttelettes d'huile submicroniques, par exemple, avec un diamètre moyen entre 100 et 250 nm, de préférence environ 180 nm. •Une émulsion de squalène, d'un tocophérol et d'un détergent Triton (par exemple, Triton X-100). L'émulsion peut également comprendre un 3d-MPL (voir ci-dessous). L'émulsion peut contenir un tampon phosphate. • Une émulsion comprenant un polysorbate (par exemple, polysorbate 80) , un détergent Triton (par exemple, Triton X-100) et un tocophérol (par exemple, un succinate d'a-tocophérol). L'émulsion peut comprendre ces trois composants dans un rapport en masse d'environ 75/11/10 (par exemple, 750 μg/ml de polysorbate 80, 110 μg/ml de Triton X-100 et 100 μg/ml de succinate d'a-tocophérol), et ces concentrations devront comprendre toute contribution de ces composants à partir des antigènes. L'émulsion peut également comprendre du squalène. L'émulsion peut également comprendre un 3d-MPL (voir ci-dessous). La phase aqueuse peut contenir un tampon phosphate. • Une émulsion de squalane, de polysorbate 80 et de poloxamer 401 (« Pluronic™ L121 ») . L'émulsion peut être formulée dans de la solution tampon phosphate, pH 7,4. Cette émulsion est un véhicule d'administration utile pour les muramyl-dipeptides, et a été utilisée avec du thréonyl-MDP dans l'adjuvant « SAF-1 » [50] (0,05 à 1 % de Thr-MDP, 5 % de squalane, 2,5 % de Pluronic L121 et 0,2 % de polysorbate 80) . Elle peut être également utilisée sans le Thr-MDP, comme dans l'adjuvant « AF » [51] (5 % de squalane, 1,25 % de Pluronic L121 et 0,2 % de polysorbate 80). Une microfluidisation est préférée. • Une émulsion comprenant du squalène, un solvant aqueux, un tensioactif non ionique hydrophile d'éther alkylique de polyoxyéthylène (par exemple, l'éther cétostéarylique de polyoxyéthylène (12)) et un tensioactif non ionique hydrophobe (par exemple, un ester de sorbitane ou un ester de mannide, comme le monooléate de sorbitane ou « Span 80 ») . L'émulsion est de préférence thermoréversible et/ou a au moins 90 % des gouttelettes d'huile (en volume) avec une taille inférieure à 200 nm [52]. L'émulsion peut également comprendre un ou plusieurs parmi : un alditol ; un agent cryoprotecteur (par exemple, un sucre, comme le dodécylmaltoside et/ou le saccharose) ; et/ou un alkylpolyglycoside. De telles émulsions peuvent être lyophilisées. • Une émulsion ayant de 0,5 à 50 % d'une huile, 0,1 à 10 % d'un phospholipide, et 0,05 à 5 % d'un tensioactif non ionique. Comme il est décrit dans la référence 53, les composants phospholipides préférés sont la phosphatidylcholine, la phosphatidyl-éthanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, le phosphatidylglycérol, l'acide phosphatidique, la sphingomyéline et le cardiolipide. Des tailles de gouttelettes submicroniques sont avantageuses. • Une émulsion huile dans l'eau submicronique d'une huile non métabolisable (comme une huile minérale légère) et d'au moins un tensioactif (comme la lécithine, le Tween 80 ou le Span 80) . Des additifs peuvent être inclus, comme la saponine QuilA, le cholestérol, un conjugué saponine-lipophile (comme GPI-0100, décrit dans la référence 54, produit par addition d'une amine aliphatique à une désacyl- saponine par l'intermédiaire du groupe carboxyle de l'acide glucuronique), le bromure de diméthyl- dioctadécylammonium et/ou la N,N-dioctadécyl-N,N-bis(2-hydroxyéthyl)propanediamine. • Une émulsion comprenant une huile minérale, un alcool gras éthoxylé lipophile non ionique, et un tensioactif hydrophile non ionique (par exemple, un alcool gras éthoxylé et/ou un copolymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène) [55]. • Une émulsion comprenant une huile minérale, un alcool gras éthoxylé hydrophile non ionique, et un tensioactif lipophile non ionique (par exemple, un alcool gras éthoxylé et/ou un copolymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène) [55]. • Une émulsion dans laquelle une saponine (par exemple,Span 85. The composition of the emulsion by volume can be about 5% squalene, about 0.5% polysorbate 80 and about 0.5% Span 85. In terms of weight, these ratios become 4.3% of squalene, 0.5% polysorbate 80 and 0.48% Span 85. This adjuvant is known as "MF59" [45-47], as further described in chapter 10 of reference 48 and Chapter 12 of reference 49. The MF59 emulsion advantageously comprises citrate ions, for example, 10 mM sodium citrate buffer. An emulsion comprising squalene, an α-tocopherol, and polysorbate 80. These emulsions may have from 2 to 10% of squalene, from 2 to 10% of tocopherol and from 0.3 to 3% of Tween 80, and Weight ratio of squalene / tocopherol is preferably 1 (for example, 0.90) as this provides a more stable emulsion. Squalene and Tween 80 may be present in a volume ratio of about 5/2, or in a weight ratio of about 11/5. Such an emulsion can be made by dissolving Tween 80 in PBS to give a 2% solution, and then mixing 90 ml of this solution with a mixture of (5 g of DL-α-tocopherol and 5 ml of squalene), then microfluidizing the mixture. The resulting emulsion may have submicron oil droplets, for example, with a mean diameter of between 100 and 250 nm, preferably about 180 nm. • An emulsion of squalene, a tocopherol and a Triton detergent (eg Triton X-100). The emulsion may also include a 3d-MPL (see below). The emulsion may contain a phosphate buffer. An emulsion comprising a polysorbate (e.g., polysorbate 80), a Triton detergent (e.g., Triton X-100) and a tocopherol (e.g., α-tocopherol succinate). The emulsion can comprise these three components in a mass ratio of approximately 75/11/10 (for example, 750 μg / ml polysorbate 80, 110 μg / ml Triton X-100 and 100 μg / ml succinate d α-tocopherol), and these concentrations should include any contribution of these components from the antigens. The emulsion may also include squalene. The emulsion may also include a 3d-MPL (see below). The aqueous phase may contain a phosphate buffer. • An emulsion of squalane, polysorbate 80 and poloxamer 401 ("Pluronic ™ L121"). The emulsion can be formulated in phosphate buffer solution, pH 7.4. This emulsion is a useful delivery vehicle for muramyl dipeptides, and has been used with threonyl-MDP in adjuvant "SAF-1" [50] (0.05 to 1% Thr-MDP, 5% squalane, 2.5% Pluronic L121 and 0.2% polysorbate 80). It can also be used without Thr-MDP, as in the adjuvant "AF" [51] (5% squalane, 1.25% Pluronic L121 and 0.2% polysorbate 80). Microfluidization is preferred. An emulsion comprising squalene, an aqueous solvent, a hydrophilic nonionic surfactant of polyoxyethylene alkyl ether (e.g., polyoxyethylene (12) cetostearyl ether) and a hydrophobic nonionic surfactant (e.g., a sorbitan ester or a mannide ester, such as sorbitan monooleate or "Span 80"). The emulsion is preferably thermoreversible and / or has at least 90% of the oil droplets (by volume) with a size of less than 200 nm [52]. The emulsion may also include one or more of: an alditol; a cryoprotectant (e.g., a sugar, such as dodecylmaltoside and / or sucrose); and / or an alkylpolyglycoside. Such emulsions can be lyophilized. • An emulsion having from 0.5 to 50% of an oil, 0.1 to 10% of a phospholipid, and 0.05 to 5% of a nonionic surfactant. As described in reference 53, the preferred phospholipid components are phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, sphingomyelin and cardiolipid. Submicron droplet sizes are advantageous. • An oil emulsion in submicron water of a non-metabolizable oil (such as a light mineral oil) and at least one surfactant (such as lecithin, Tween 80 or Span 80). Additives may be included, such as QuilA saponin, cholesterol, a saponin-lipophilic conjugate (such as GPI-0100, described in reference 54, produced by addition of an aliphatic amine to a deacyl saponin via the group carboxyl of glucuronic acid), dimethyl-dioctadecylammonium bromide and / or N, N-dioctadecyl-N, N-bis (2-hydroxyethyl) propanediamine. • An emulsion comprising a mineral oil, a nonionic lipophilic ethoxylated fatty alcohol, and a nonionic hydrophilic surfactant (for example, an ethoxylated fatty alcohol and / or a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer) [55]. • An emulsion comprising a mineral oil, a nonionic hydrophilic ethoxylated fatty alcohol, and a nonionic lipophilic surfactant (for example, an ethoxylated fatty alcohol and / or a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer) [55]. • An emulsion in which a saponin (for example,

QuilA ou QS21) et un stérol (par exemple, un cholestérol) sont associés sous la forme de micelles hélicoïdales [56].QuilA or QS21) and a sterol (for example, cholesterol) are associated in the form of helicoidal micelles [56].

Les antigènes et les adjuvants dans une composition seront généralement en mélange au moment de l'administration à un patient. Les émulsions peuvent être mélangées avec l'antigène durant la fabrication, ou extemporanément, au moment de l'administration. Ainsi, l'adjuvant et l'antigène peuvent être gardés séparément dans un vaccin conditionné ou distribué, prêts pour la formulation finale au moment de l'utilisation. L'antigène sera généralement sous une forme aqueuse, de telle façon que le vaccin est finalement préparé en mélangeant deux liquides. Le rapport en volume des deux liquides pour le mélange peut varier (par exemple, entre 5/1 et 1/5) mais il est généralement d'environ 1/1. C. Formulation de saponines [chapitre 22 de la référence 48]Antigens and adjuvants in a composition will generally be in admixture at the time of administration to a patient. The emulsions may be mixed with the antigen during manufacture, or extemporaneously, at the time of administration. Thus, adjuvant and antigen can be kept separately in a packaged or dispensed vaccine, ready for final formulation at the time of use. The antigen will generally be in an aqueous form, so that the vaccine is finally prepared by mixing two liquids. The volume ratio of the two liquids for mixing can vary (for example, between 5/1 and 1/5) but is generally about 1/1. C. Saponin Formulation [Chapter 22 of Reference 48]

Des formulations de saponines peuvent être également utilisées en tant qu'adjuvants dans l'invention. Les saponines sont un groupe hétérogène de glycosides de stérol et de glycosides de triterpénoïde qui se trouvent dans l'écorce, les feuilles, les tiges, les racines et même les fleurs d'un large éventail d'espèces de plantes. La saponine issue de l'écorce de l'arbre Quillaia saponaria Molina a été largement étudiée en tant qu'adjuvant. La saponine peut être également obtenue commercialement à partir de Smilax ornata (salsepareille), Gypsophilla paniculata (voile de la mariée), et Saponaria officianalis (racine savon). Les formulations d'adjuvants à base de saponines comprennent des formulations purifiées, comme QS21, ainsi que des formulations lipidiques, comme les ISCOM. QS21 est commercialisé sous le nom de Stimulon™.Saponin formulations may also be used as adjuvants in the invention. Saponins are a heterogeneous group of sterol glycosides and triterpenoid glycosides found in the bark, leaves, stems, roots and even flowers of a wide range of plant species. The saponin from the bark of the Quillaia saponaria Molina tree has been widely studied as an adjuvant. Saponin can also be obtained commercially from Smilax ornata (sarsaparilla), Gypsophilla paniculata (bridal veil), and Saponaria officianalis (soap root). Saponin-based adjuvant formulations include purified formulations, such as QS21, as well as lipid formulations, such as ISCOMs. QS21 is marketed under the name of Stimulon ™.

Les compositions de saponines ont été purifiées en utilisant la CLHP et la RP-CLHP. Des fractions purifiées spécifiques en utilisant ces techniques ont été identifiées, y compris QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B et QH-C. De préférence, la saponine est QS21. Un procédé de production de QS21 est divulgué dans la référence 57. Les formulations de saponines peuvent également comprendre un stérol, comme le cholestérol [58] .The saponin compositions were purified using HPLC and RP-HPLC. Specific purified fractions using these techniques have been identified, including QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B and QH-C. Preferably, the saponin is QS21. A method of producing QS21 is disclosed in reference 57. The saponin formulations may also include a sterol, such as cholesterol [58].

Des combinaisons de saponines et de cholestérols peuvent être utilisées pour former des particules uniques appelées complexes immunostimulants (ISCOM ; voir le chapitre 23 de la référence 48 ; également les références 59 et 60) . Les ISCOM comprennent aussi généralement un phospholipide comme la phosphatidyléthanolamine ou la phosphatidylcholine. Toute saponine connue peut être utilisée dans les ISCOM. De préférence, 1'ISCOM comprend un ou plusieurs de QuilA, QHA et QHC. Eventuellement, les ISCOM peuvent être dépourvus de détergent supplémentaire [61].Combinations of saponins and cholesterols can be used to form unique particles called immunostimulatory complexes (ISCOM, see Chapter 23 of Reference 48, also references 59 and 60). ISCOMs also generally include a phospholipid such as phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. Any known saponin can be used in ISCOMs. Preferably, ISCOM comprises one or more of QuilA, QHA and QHC. Optionally, ISCOMs may lack additional detergent [61].

Une description du développement d'adjuvants à base de saponines peut être trouvée dans les références 62 et 63. D. Dérivés bactériens ou microbiensA description of the development of saponin-based adjuvants can be found in references 62 and 63. D. Bacterial or Microbial Derivatives

Des adjuvants appropriés pour une utilisation dont fait l'invention comprennent des dérivés bactériens ou microbiens comme des dérivés non toxiques du lipopolysaccharide entérobactérien (LPS), des dérivés du lipide A, des oligonucléotides immunostimulants et des toxines ADP-rybosylantes et leurs dérivés détoxifiés.Suitable adjuvants for use in the invention include bacterial or microbial derivatives such as non-toxic enterobacterial lipopolysaccharide (LPS) derivatives, lipid A derivatives, immunostimulatory oligonucleotides, and ADP-rybosylating toxins and their detoxified derivatives.

Les dérivés non toxiques du LPS comprennent le monophosphoryl-lipide A (MPL) et le MPL 3-O-désacylé (3dMPL). Le 3dMPL est un mélange de monophosphoryl-lipide A 3-dés-O-acylé avec 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Une forme préférée de « petites particules » de monophosphoryl-lipide A 3-dés-O-acylé est divulguée dans la référence 64. De telles « petites particules » de 3dMPL sont suffisamment petites pour être stérilisées par filtration à travers une membrane de 0,22 pm [64]. D'autres dérivés non toxiques du LPS comprennent des mimétiques du monophosphoryl-lipide A, comme des dérivés d'aminoalkyl-glucosaminide phosphate, par exemple, RC-529 [65,66].Non-toxic derivatives of LPS include monophosphoryl lipid A (MPL) and 3-O-deacylated MPL (3dMPL). 3dMPL is a mixture of monophosphoryl lipid A 3-de-O-acylated with 4, 5 or 6 acylated chains. A preferred form of "small particles" of 3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A is disclosed in reference 64. Such "small particles" of 3dMPL are small enough to be sterilized by filtration through a membrane of 0. 22 pm [64]. Other non-toxic LPS derivatives include monophosphoryl lipid A mimetics, such as aminoalkylglucosaminide phosphate derivatives, e.g. RC-529 [65,66].

Les dérivés du lipide A comprennent des dérivés du lipide A provenant d'Escherichia coli comme OM-174. OM-174 est décrit par exemple dans les références 67 et 68.The lipid A derivatives include lipid A derivatives from Escherichia coli such as OM-174. OM-174 is described for example in references 67 and 68.

Des oligonucléotides immunostimulants appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des séquences nucléotidiques contenant un motif CpG (une séquence dinucléotidique contenant une cytosine non méthylée liée par une liaison phosphate à une guanosine) . Il a été également montré que des ARN double brin et des oligonucléotides contenant des séquences palindromiques ou poly(dG) sont immunostimulants.Immunostimulatory oligonucleotides suitable for use as adjuvants in the invention include nucleotide sequences containing a CpG motif (a dinucleotide sequence containing unmethylated cytosine linked by a guanosine phosphate linkage). It has also been shown that double-stranded RNAs and oligonucleotides containing palindromic or poly (dG) sequences are immunostimulatory.

Les CpG peuvent comprendre des modifications/analogues de nucléotides comme des modifications de phosphorothioate et ils peuvent être double brin ou simple brin. Les références 69, 70 et 71 divulguent des substitutions analogues possibles, par exemple, le remplacement de la guanosine par la 2'-désoxy-7-déazaguanosine. L'effet adjuvant des oligonucléotides CpG est en outre discuté dans les références 72 à 77.CpGs may include nucleotide modifications / analogs such as phosphorothioate modifications and they may be double-stranded or single-stranded. References 69, 70 and 71 disclose possible analogous substitutions, for example, replacement of guanosine with 2'-deoxy-7-deazaguanosine. The adjuvant effect of CpG oligonucleotides is further discussed in references 72 to 77.

La séquence CpG peut être dirigée contre le TLR9, comme le motif GTCGTT ou TTCGTT [78] . La séquence CpG peut être spécifique pour induire une réponse immunitaire Thl, comme un ODN CpG-A, ou elle peut être plus spécifique pour induire une réponse des lymphocytes B, comme un ODN CpG-B. Des ODN CpG-A et CpG-B sont discutés dans les références 79 à 81. De préférence, le CpG est un ODN CpG-A.The CpG sequence can be directed against the TLR9, such as the GTCGTT or TTCGTT motif [78]. The CpG sequence may be specific to induce a Th1 immune response, such as a CpG-A ODN, or it may be more specific for inducing a B cell response, such as a CpG-B ODN. CpG-A and CpG-B ODNs are discussed in references 79-81. Preferably, CpG is a CpG-A ODN.

De préférence, l'oligonucléotide CpG est construit de telle façon que l'extrémité 5' est accessible pour la reconnaissance des récepteurs. Eventuellement, deux séquences d'oligonucléotides CpG peuvent être fixées à leurs extrémités 3' pour former des « immunomères ». Voir, par exemple, les références 82 à 84.Preferably, the CpG oligonucleotide is constructed such that the 5 'end is accessible for receptor recognition. Optionally, two CpG oligonucleotide sequences may be attached at their 3 'ends to form "immunomers". See, for example, references 82 to 84.

Un adjuvant particulièrement utile basé autour d'oligonucléotides immunostimulants est connu sous le nom de IC-31™ [85-87]. Ainsi, un adjuvant utilisé dans l'invention peut comprendre un mélange de (i) un oligonucléotide (par exemple, entre 15 et 40 nucléotides) y compris au moins (et de préférence de multiples) motif(s) Cpl (c'est-à-dire, une cytosine liée à une inosine pour former un dinucléotide) , et (ii) un polymère polycationique, comme un oligopeptide (par exemple, entre 5 et 20 acides aminés) y compris au moins un (de préférence de multiples) séquence(s) tripeptidique(s) Lys-Arg-Lys. L'oligonucléotide peut être un désoxynucléotide comprenant une séquence 26-mer 5'-(IC)i3-3' (SEQ ID NO : 2). Le polymère polycationique peut être un peptide comprenant une séquence d'acides aminés 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO : 3) . Cette combinaison de SEQ ID NO : 6 et 7 fournit l'adjuvant IC-31™.A particularly useful adjuvant based around immunostimulatory oligonucleotides is known as IC-31 ™ [85-87]. Thus, an adjuvant used in the invention may comprise a mixture of (i) an oligonucleotide (e.g., between 15 and 40 nucleotides) including at least (and preferably multiple) Cpl motif (s) that is, an inosine-linked cytosine to form a dinucleotide), and (ii) a polycationic polymer, such as an oligopeptide (for example, between 5 and 20 amino acids) including at least one (preferably multiple) sequence (s) tripeptide (s) Lys-Arg-Lys. The oligonucleotide may be a deoxynucleotide comprising a 26-mer 5 '- (IC) 13-3' sequence (SEQ ID NO: 2). The polycationic polymer may be a peptide comprising an 11-mer amino acid sequence KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 3). This combination of SEQ ID NO: 6 and 7 provides the IC-31 ™ adjuvant.

Des toxines bactériennes ADP-rybosylantes et leurs dérivés détoxifiés peuvent être utilisés en tant qu'adjuvants dans l'invention. De préférence, la protéine est dérivée d'E. coli (entérotoxine thermolabile « LT » d 'E. coli), du choléra (« CT ») , ou de pertussis (« PT ») . L'utilisation de toxines ADP-rybosylantes détoxifiées en tant qu'adjuvants mucosaux est décrite dans la référence 88 et en tant qu'adjuvants parentéraux dans la référence 89. La toxine ou l'anatoxine est de préférence sous la forme d'une holotoxine, comprenant des sous-unités à la fois A et B. De préférence, la sous-unité A contient une mutation détoxifiante ; de préférence la sous-unité B est non mutée. De préférence, l'adjuvant est un mutant de LT détoxifié comme LT-K63, LT-R72, et LT-G192. L'utilisation de toxines ADP-rybosylantes et de leurs dérivés détoxifiés, particulièrement LT-K63 et LT-R72, en tant qu'adjuvants peut être trouvée dans les références 90 à 97. Un mutant de CT utile est CT-E29H [98]. La référence numérique pour les substitutions d'acides aminés est basée de préférence sur les alignements des sous-unités A et B des toxines ADP-rybosylantes présentées dans la référence 99, incorporée spécifiquement dans la présente par référence dans son intégralité. E. Immunomodulateurs humainsADP-rybosylating bacterial toxins and their detoxified derivatives can be used as adjuvants in the invention. Preferably, the protein is derived from E. coli (heat labile enterotoxin "LT" from E. coli), cholera ("CT"), or pertussis ("PT"). The use of detoxified ADP-rybosylating toxins as mucosal adjuvants is described in reference 88 and as parenteral adjuvants in reference 89. The toxin or toxoid is preferably in the form of a holotoxin, comprising subunits of both A and B. Preferably, subunit A contains a detoxifying mutation; preferably, the subunit B is unmutated. Preferably, the adjuvant is a detoxified LT mutant such as LT-K63, LT-R72, and LT-G192. The use of ADP-rybosylating toxins and their detoxified derivatives, particularly LT-K63 and LT-R72, as adjuvants can be found in references 90 to 97. A useful CT mutant is CT-E29H [98] . The reference numeral for amino acid substitutions is preferably based on the A and B subunit alignments of the ADP-rybosylating toxins presented in reference 99, specifically incorporated herein by reference in its entirety. E. Human immunomodulators

Des immunomodulateurs humains appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des cytokines, comme des interleukines (par exemple, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [100], etc.) [101], des interférons (par exemple, 1'interféron-γ) , le facteur de stimulation des colonies de macrophages, et le facteur de nécrose tumorale. Un immunomodulateur préféré est 1'IL-12. F. Bioadhésifs et mucoadhésifsHuman immunomodulators suitable for use as adjuvants in the invention include cytokines, such as interleukins (e.g., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7). , IL-12 [100], etc.) [101], interferons (e.g. interferon-γ), macrophage colony stimulating factor, and tumor necrosis factor. A preferred immunomodulator is IL-12. F. Bioadhesives and mucoadhesives

Des bioadhésifs et des mucoadhésifs peuvent être également utilisés en tant qu'adjuvants dans l'invention. Les bioadhésifs appropriés comprennent des microsphères d'acide hyaluronique estérifié [102] ou des mucoadhésifs comme des dérivés réticulés de poly(acide acrylique), polyalcool vinylique, polyvinylpyrrolidone, des polysaccharides et la carboxyméthylcellulose. Le chitosane et ses dérivés peuvent être utilisés en tant qu'adjuvants dans l'invention [103]. G. MicroparticulesBioadhesives and mucoadhesives may also be used as adjuvants in the invention. Suitable bioadhesives include microspheres of esterified hyaluronic acid [102] or mucoadhesives such as crosslinked derivatives of polyacrylic acid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polysaccharides and carboxymethylcellulose. Chitosan and its derivatives can be used as adjuvants in the invention [103]. G. Microparticles

Des microparticules peuvent être également utilisées en tant qu'adjuvants dans l'invention. Des microparticules (c'est-à-dire, une particule d'un diamètre de ~100 nm à -150 nm, de manière davantage préférée d'un diamètre de -200 nm à -30 μτη, et de manière préférée entre toutes d'un diamètre de -500 nm à -10 μτη) formées à partir de matériaux qui sont biodégradables et non toxiques (par exemple, un poly(acide a-hydroxylé), un polyacide hydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.), avec un poly(lactide-co-glycolide) sont préférées, éventuellement traitées pour avoir une surface chargée négativement (par exemple, avec du SDS) ou une surface chargée positivement (par exemple, avec un détergent cationique, comme le CTAB). H. Liposomes (chapitres 13 et 14 de la référence 48)Microparticles may also be used as adjuvants in the invention. Microparticles (i.e., a particle having a diameter of ~ 100 nm to -150 nm, more preferably a diameter of -200 nm to -30 μτη, and most preferably a diameter of -500 nm to -10 μτη) formed from materials that are biodegradable and non-toxic (for example, a poly (α-hydroxy acid), a polyhydroxybutyric acid, a polyorthoester, a polyanhydride, a polycaprolactone, etc. .), with a poly (lactide-co-glycolide) are preferred, optionally treated to have a negatively charged surface (e.g., with SDS) or a positively charged surface (e.g., with a cationic detergent, such as CTAB) . H. Liposomes (chapters 13 and 14 of reference 48)

Des exemples de formulations de liposomes appropriées pour une utilisation en tant qu'adjuvants sont décrits dans les références 104 à 106. I. Composés d1imidazoquinoloneExamples of liposome formulations suitable for use as adjuvants are described in references 104-106. I. Imidazoquinolone Compounds

Des exemples de composés d'imidazoquinolone appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent Imiquamod et ses homologues (par exemple, « Resiquimod 3M »), décrits en outre dans les références 107 et 108. L'invention peut également comprendre des combinaisons d'aspects d'un ou de plusieurs des adjuvants identifiés ci-dessus. Par exemple, les compositions d'adjuvants suivantes peuvent être utilisées dans l'invention : (1) une saponine et une émulsion huile dans l'eau [109] ; (2) une saponine (par exemple, QS21) + un dérivé non toxique du LPS (par exemple, 3dMPL) ; (3) une saponine (par exemple, QS21) + un dérivé non toxique du LPS (par exemple, 3dMPL) + un cholestérol ; (4) une saponine (par exemple, QS21) + 3dMPL + IL-12 (éventuellement + un stérol) [111] ; (5) des combinaisons de 3dMPL avec, par exemple, du QS21 et/ou des émulsions huile dans l'eau [112] ; (6) SAF, contenant 10 % de squalane, 0,4 % de Tween 80™, 5 % de polymère séquencé Pluronic L121, et du thr-MDP, soit microfluidisé en une émulsion submicronique soit passé au vortex pour générer une émulsion à plus grosse taille de particule ; (7) le système d'adjuvant Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) contenant 2 % de squalène, 0,2 % de Tween 80, et un ou plusieurs composants de la paroi de la cellule bactérienne du groupe constitué de monophosphoryl-lipide A (MPL), dimycolate de tréhalose (TDM), et squelette de la paroi cellulaire (CWS), de préférence MPL + CWS (Detox™) ; et (8) un ou plusieurs sels minéraux (comme un sel d'aluminium) + un dérivé non toxique du LPS (comme le 3dMPL). D'autres substances qui aqissent comme des agents immunostimulants sont divulguées dans le chapitre 7 de la référence 48.Examples of imidazoquinolone compounds suitable for use as adjuvants in the invention include Imiquamod and its homologs (e.g., "Resiquimod 3M"), further described in references 107 and 108. The invention also include combinations of aspects of one or more of the adjuvants identified above. For example, the following adjuvant compositions may be used in the invention: (1) a saponin and an oil-in-water emulsion [109]; (2) a saponin (eg, QS21) + a nontoxic derivative of LPS (e.g., 3dMPL); (3) a saponin (eg, QS21) + a nontoxic derivative of LPS (e.g., 3dMPL) + cholesterol; (4) a saponin (eg, QS21) + 3dMPL + IL-12 (optionally + a sterol) [111]; (5) combinations of 3dMPL with, for example, QS21 and / or oil-in-water emulsions [112]; (6) SAF, containing 10% squalane, 0.4% Tween 80 ™, 5% Pluronic L121 sequenced polymer, and thr-MDP, either microfluidized into a submicron emulsion or vortexed to generate an emulsion for further large particle size; (7) Ribi ™ adjuvant system (RAS), (Ribi Immunochem) containing 2% squalene, 0.2% Tween 80, and one or more bacterial cell wall components of the monophosphoryl group. lipid A (MPL), trehalose dimycolate (TDM), and cell wall skeleton (CWS), preferably MPL + CWS (Detox ™); and (8) one or more inorganic salts (such as an aluminum salt) + a nontoxic derivative of LPS (such as 3dMPL). Other substances that act as immunostimulatory agents are disclosed in Chapter 7 of Reference 48.

Un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium est utile, et les antigènes sont généralement adsorbés sur ce sel. Des émulsions huile dans l'eau comprenant du squalène, avec des gouttelettes d'huile submicroniques, sont également préférées, particulièrement chez les personnes âgées. Des combinaisons d'adjuvants utiles comprennent des combinaisons d'adjuvants Thl et Th2 comme les CpG et un sel d'aluminium, ou le résiquimod et un sel d'aluminium. Une combinaison d'un sel d'aluminium et de 3dMPL peut être utilisée.An aluminum hydroxide adjuvant is useful, and the antigens are generally adsorbed on this salt. Oil-in-water emulsions comprising squalene, with submicron oil droplets, are also preferred, particularly in the elderly. Useful adjuvant combinations include combinations of Th1 and Th2 adjuvants such as CpG and aluminum salt, or resiquimod and aluminum salt. A combination of an aluminum salt and 3dMPL can be used.

ImmunisationImmunization

En plus de fournir des compositions immunogènes telles que décrites ci-dessus, l'invention propose également un procédé pour soulever une réponse immunitaire chez un mammifère, comprenant l'administration d'une composition immunogène de l'invention au mammifère. Généralement, la réponse immunitaire est une réponse en anticorps. La réponse en anticorps est de préférence une réponse en anticorps protecteurs. L'invention propose également des compositions de l'invention pour une utilisation dans de tels procédés. L'invention propose également un procédé de protection d'un mammifère contre une infection et/ou maladie bactérienne, comprenant l'administration au mammifère d'une composition immunogène de l'invention.In addition to providing immunogenic compositions as described above, the invention also provides a method for raising an immune response in a mammal, comprising administering an immunogenic composition of the invention to the mammal. Generally, the immune response is an antibody response. The antibody response is preferably a protective antibody response. The invention also provides compositions of the invention for use in such methods. The invention also provides a method of protecting a mammal against infection and / or bacterial disease, comprising administering to the mammal an immunogenic composition of the invention.

L'invention propose des compositions de l'invention pour une utilisation en tant que médicaments (par exemple, sous la forme de compositions immunogènes ou sous la forme de vaccins). Elle propose également l'utilisation des combinaisons ou des OMV de l'invention dans la fabrication d'un médicament pour la prévention d'une infection bactérienne chez un mammifère.The invention provides compositions of the invention for use as medicaments (for example, in the form of immunogenic compositions or in the form of vaccines). It also proposes the use of the combinations or OMVs of the invention in the manufacture of a medicament for the prevention of a bacterial infection in a mammal.

Le mammifère est de préférence un être humain. L'être humain peut être un adulte ou, de préférence, un enfant. Lorsque le vaccin est pour une utilisation prophylactique, l'être humain est de préférence un enfant (par exemple, un jeune enfant ou un nourrisson) ; lorsque le vaccin est pour une utilisation thérapeutique, l'être humain est de préférence un adulte. Un vaccin prévu pour des enfants peut être également administré à des adultes, par exemple, pour estimer l'innocuité, le dosage, l'immunogénicité, etc. L'efficacité du traitement thérapeutique peut être testée en suivant l'infection bactérienne après l’administration de la composition de l'invention. L'efficacité du traitement prophylactique peut être testée en suivant les réponses immunitaires contre les protéines immunogènes dans les vésicules ou d'autres antigènes après l'administration de la composition. L'immunogénicité des compositions de l'invention peut être déterminée en les administrant à des sujets à tester (par exemple, des enfants âgés de 12 à 16 mois) et ensuite en déterminant les paramètres sérologiques classiques. Ces réponses immunitaires seront généralement déterminées environ 4 semaines après l'administration de la composition, et comparées à des valeurs déterminées avant l'administration de la composition. Lorsque plus d'une dose de la composition est administrée, il peut être réalisé plus d'une détermination après 1'administration.The mammal is preferably a human. The human being can be an adult or, preferably, a child. When the vaccine is for prophylactic use, the human is preferably a child (e.g., a young child or an infant); when the vaccine is for therapeutic use, the human being is preferably an adult. A vaccine intended for children may also be administered to adults, for example, to estimate safety, dosage, immunogenicity, etc. The effectiveness of the therapeutic treatment can be tested by following the bacterial infection after administration of the composition of the invention. The effectiveness of the prophylactic treatment can be tested by following immune responses against immunogenic proteins in vesicles or other antigens after administration of the composition. The immunogenicity of the compositions of the invention can be determined by administering them to test subjects (e.g., children aged 12 to 16 months) and then determining conventional serological parameters. These immune responses will generally be determined about 4 weeks after administration of the composition, and compared to predetermined values prior to administration of the composition. When more than one dose of the composition is administered, more than one determination may be made after administration.

Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un patient. Une administration directe peut être accomplie par injection parentérale (par exemple, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par administration rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou une autre administration mucosale. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras est préférée. L'injection peut être effectuée à l'aide d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être utilisée en variante. Une dose intramusculaire type est d'environ 0,5 ml. L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale.The compositions of the invention will generally be administered directly to a patient. Direct administration may be accomplished by parenteral injection (e.g., subcutaneously, intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, or interstitally in tissue), or by rectal, oral, vaginal, topical, transdermal administration, intranasal, ocular, atrial, pulmonary or other mucosal administration. Intramuscular administration in the thigh or upper arm is preferred. Injection may be by needle (e.g., hypodermic needle), but needleless injection may be used alternatively. A typical intramuscular dose is about 0.5 ml. The invention can be used to trigger systemic and / or mucosal immunity.

Le traitement posologique peut être un calendrier de dose unique ou un calendrier de doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un calendrier d'immunisation de sensibilisation et/ou dans un calendrier d'immunisation de rappel. Un calendrier de dose de sensibilisation peut être suivi d'un calendrier de dose de rappel. Les temps appropriés entre les doses de sensibilisation (par exemple, entre 4 et 16 semaines), et entre la sensibilisation et le rappel, peuvent être déterminés en routine. GénéralitésThe dosage treatment may be a single dose schedule or a multiple dose schedule. Multiple doses may be used in a sensitization immunization schedule and / or in a booster immunization schedule. An awareness dose schedule may be followed by a booster dose schedule. Appropriate times between sensitization doses (eg, between 4 and 16 weeks), and between sensitization and recall, can be routinely determined. Overview

Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué de », par exemple, une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou elle peut comprendre quelque chose d'autre, par exemple, X + Y.The term "comprising" includes "including" as well as "consisting of", for example, a composition "comprising" X may consist exclusively of X or it may comprise something else, for example, X + Y.

Le terme « substantiellement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « substantiellement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c'est nécessaire, le terme « substantiellement » peut être omis de la définition de 1'invention.The term "substantially" does not exclude "completely", for example, a composition that is "substantially devoid" of Y may be completely devoid of Y. When necessary, the term "substantially" may be omitted from the definition. of the invention.

Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x est facultatif et signifie, par exemple, x ± 10 %. L'identité entre des séquences polypeptidiques est déterminée de préférence par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman tel que mis en œuvre dans le programme MPSRCH (Oxford Molecular), utilisant une recherche de brèche affine avec les paramètres, pénalité d'ouverture de brèche = 12 et pénalité d'extension de brèche = 1.The term "about" in relation to a numerical value x is optional and means, for example, x ± 10%. The identity between polypeptide sequences is preferably determined by the Smith-Waterman homology search algorithm as implemented in the MPSRCH program (Oxford Molecular), using a gap search affine with the parameters, penalty of breach = 12 and gap extension penalty = 1.

Brève description des figuresBrief description of the figures

Figure 1 - Carte du plasmide pET-OmpA. pET-OmpA est dérivé du plasmide pET21b et contient la séquence d'acide nucléique codant pour la séquence signal (SS) d'E. coli OmpA (SS) fusionnée à un gène d'intérêt (GOI) codant pour une protéine hétérologue. La SS OmpA SS cible la protéine codée par le GOI dans la lumière des OMV.'Figure 1 - Map of the pET-OmpA plasmid. pET-OmpA is derived from the plasmid pET21b and contains the nucleic acid sequence encoding the E. OmpA coli (SS) fused to a gene of interest (GOI) encoding a heterologous protein. SS OmpA SS targets the protein encoded by GOI in the light of OMVs.

Figure 2 - Analyse par SDS-PAGE des lysats bactériens totaux issus de souches BL21(DE3)AompA et BL21(DE3)AtolR exprimant des antigènes staphylococciques. Les bactéries ont été analysées avant (-) et après (+) induction avec 1 mM d'IPTG pendant 3 heures. (A) Analyse de souches BL21(DE3)AompA exprimant des antigènes staphylococciques. Les bandes correspondant à HlaH35L, Sta006, LukE (-LP) et LukE (+LP) sont signalées par des flèches. (B) Analyse de souches BL21 (DE3)AtolR exprimant des antigènes staphylococciques. Les bandes correspondant à HlaH35L et Sta006 sont signalées par des flèches.Figure 2 - SDS-PAGE analysis of total bacterial lysates from strains BL21 (DE3) AompA and BL21 (DE3) AtolR expressing staphylococcal antigens. The bacteria were analyzed before (-) and after (+) induction with 1 mM IPTG for 3 hours. (A) Analysis of BL21 (DE3) AompA strains expressing staphylococcal antigens. The bands corresponding to HlaH35L, Sta006, LukE (-LP) and LukE (+ LP) are indicated by arrows. (B) Analysis of BL21 (DE3) AtolR strains expressing staphylococcal antigens. The bands corresponding to HlaH35L and Sta006 are indicated by arrows.

Figure 3 - Analyse par immunoblot sur des souches BL21(DE3)AompA et BL21(DE3)AtolR exprimant des antigènes staphylococciques. (A) L'expression de HlaH35L a été évaluée en utilisant un antisérum anti-Hla. (B) L'expression de Sta006 a été évaluée en utilisant un antisérum anti-Sta006. (C) L'expression de SpA_DEABC a été évaluée en utilisant un antisérum anti-SpA. Les bandes correspondant à HlaH35L et SpA_DEABC sont signalées par des flèches.Figure 3 - Immunoblot analysis on strains BL21 (DE3) AompA and BL21 (DE3) AtolR expressing staphylococcal antigens. (A) Expression of HlaH35L was assessed using anti-Hla antiserum. (B) The expression of Sta006 was evaluated using anti-Sta006 antiserum. (C) Expression of SpA_DEABC was evaluated using anti-SpA antiserum. The bands corresponding to HlaH35L and SpA_DEABC are indicated by arrows.

Figure 4 - Analyse par SDS-PAGE des fractions totales (T) et solubles (S) de lysats bactériens issus de souches BL21(DE3MompA exprimant des antigènes staphylococciques. Les fractions ont été préparées et analysées après 2 heures d'induction avec 1 mM d'IPTG. Les bandes correspondant à Sta006, SpA_DEABC, LukE (-LP) et LukE (+LP) sont signalées par des flèches.4 - SDS-PAGE analysis of the total (T) and soluble (S) fractions of bacterial lysates from BL21 strains (DE3MompA expressing staphylococcal antigens) The fractions were prepared and analyzed after 2 hours of induction with 1 mM d IPTG The bands corresponding to Sta006, SpA_DEABC, LukE (-LP) and LukE (+ LP) are indicated by arrows.

Figure 5 - Quantification des antigènes staphylococciques libérés dans le milieu de culture par immunoblot. La quantité d'antigène libéré dans le surnageant de la culture par des souches BL21 (DE3) ΔοιτιρΑ exprimant des protéines staphylococciques a été déterminée par comparaison des signaux chimioluminescents des échantillons de surnageant avec ceux émanant de quantités connues de protéine recombinante purifiée. (A) 0,7, 7 et 7 0 μΐ de surnageant de culture provenant de BL21(DE3)AompA exprimant LSSOmpA-Sta006 ont été analysés. 10, 20, 40, 80 et 160 ng de Sta006 recombinant purifié ont été chargés en tant que références. 7 μΐ de surnageant contenaient approximativement 20 ng de SSOmpA-Sta006. (B) 0,7, 7 et 70 μΐ de surnageant de culture provenant de BL21 (DE3) ΔοπιρΑ exprimant SSOmpA—SpA_DEABC ont été analysés. 10, 20, 40, 80 et 160 ng de la protéine recombinante purifiée SpA_DEABC ont été chargés en tant que références. 7 μΐ de surnageant contenaient approximativement 40 ng de SSOmpA-SpA_DEABC. (C) 7, 70 et 700 μΐ de surnageant de culture provenant de deux souches BL21(DE3)AompA exprimant SSOmpA-HlaH35L ont été analysés. 20, 40, 80 et 160 ng de la protéine recombinante purifiée HlaH35L ont été chargés en tant que références. Dans les deux souches, 700 μΐ de surnageant contenaient approximativement 10 ng de SSOmpA-HlaH35L.Figure 5 - Quantification of staphylococcal antigens released in the culture medium by immunoblotting. The amount of antigen released into the culture supernatant by BL21 (DE3) ΔοιτιρΑ strains expressing staphylococcal proteins was determined by comparing the chemiluminescent signals of the supernatant samples with those from known amounts of purified recombinant protein. (A) 0.7, 7 and 70 μΐ of culture supernatant from BL21 (DE3) AompA expressing LSSOmpA-Sta006 were analyzed. 10, 20, 40, 80 and 160 ng of purified recombinant Sta006 were loaded as references. 7 μl of supernatant contained approximately 20 ng of SSOmpA-Sta006. (B) 0.7, 7 and 70 μΐ of culture supernatant from BL21 (DE3) ΔοπιρΑ expressing SSOmpA-SpA_DEABC were analyzed. 10, 20, 40, 80 and 160 ng of the purified recombinant protein SpA_DEABC were loaded as references. 7 μl of supernatant contained approximately 40 ng of SSOmpA-SpA_DEABC. (C) 7, 70 and 700 μΐ of culture supernatant from two BL21 (DE3) AompA strains expressing SSOmpA-HlaH35L were analyzed. 20, 40, 80 and 160 ng of the purified recombinant HlaH35L protein were loaded as references. In both strains, 700 μΐ of supernatant contained approximately 10 ng of SSOmpA-HlaH35L.

Modes de réalisation de l'invention Génération de mutants d'E. coli BL21(DE3) AtolR et AompA knock-outEmbodiments of the Invention Generation of E mutants coli BL21 (DE3) AtolR and AompA knockout

Des cellules BL21(DE3) enclines à la recombinaison ont été produites en utilisant le système de recombinaison homologue hautement efficace (opéron « red ») [113] . En bref, des cellules bactériennes électrocompétentes ont été transformées avec 5 μς de plasmide pAJD434 par électroporation (5,9 ms à 2,5 kV). Les bactéries ont été ensuite cultivées pendant 1 h à 37 °C dans 1 ml de bouillon SOC et ensuite déposées sur des plaques Luria-Bertani (LB) contenant du triméthoprime (100 pg/ml). L'expression des gènes « red » portés par pAJD434 a été induite en ajoutant 0,2 % de L-arabinose au milieu.BL21 (DE3) cells prone to recombination were produced using the highly efficient homologous recombination system ("red" operon) [113]. Briefly, electrocompetent bacterial cells were transformed with 5 μl of plasmid pAJD434 by electroporation (5.9 ms at 2.5 kV). The bacteria were then cultured for 1 hour at 37 ° C in 1 ml SOC broth and then plated on Luria-Bertani (LB) plates containing trimethoprim (100 μg / ml). Expression of the "red" genes carried by pAJD434 was induced by adding 0.2% L-arabinose to the medium.

Des souches mutantes d'E. coli BL21 AtolR et AompA, qui sont connues pour produire spontanément une grande quantité d'OMV, ont été produites en remplaçant les séquences codantes de ompA et tolR par des cassettes de résistance à la kanamycine (kmr) et au chloramphénicol (cmr), respectivement. Un protocole de PCR en trois étapes a été utilisé pour fusionner les régions en amont et en aval de ompA et tolR aux gènes kmr et cmr, respectivement. En bref, les régions en amont et en aval des gènes tolR et ompA ont été amplifiées à partir de l'ADN génomique de BL21(DE3) avec les paires d'amorces spécifiques tolR-l/tolR- 2 et tolR-3/tolR-4 ; ompA-1/ ompA-2 et ompA-3/ompA-4, respectivement (tableau 1) . La cassette kmr a été amplifiée à partir du plasmide pUC4K en utilisant les amorces PUC4K-rev et PUC4K-for et la cassette cmr a été amplifiée en utilisant les amorces CMR-for/CMR-rev. Finalement, 100 ng de chacun des trois fragments amplifiés ont été fusionnés ensemble par mélange dans une PCR contenant les amorces 1/4.Mutant strains of E. coli BL21 AtolR and AompA, which are known to spontaneously produce a large amount of OMV, were produced by replacing the coding sequences of ompA and tolR with cassettes of resistance to kanamycin (kmr) and chloramphenicol (cmr) respectively . A three-step PCR protocol was used to fuse the upstream and downstream regions of ompA and tolR to the kmr and cmr genes, respectively. Briefly, the upstream and downstream regions of the genes tolR and ompA were amplified from genomic DNA of BL21 (DE3) with the specific primer pairs tolR-1 / tolR-2 and tolR-3 / tolR -4; ompA-1 / ompA-2 and ompA-3 / ompA-4, respectively (Table 1). The kmr cassette was amplified from plasmid pUC4K using primers PUC4K-rev and PUC4K-for and the cmr cassette was amplified using CMR-for / CMR-rev primers. Finally, 100 ng of each of the three amplified fragments were fused together by mixing in a PCR containing the 1/4 primers.

Les fragments linéaires dans lesquels le gène de résistance à l'antibiotique était flanqué par les régions en amont et en aval de tolR / ompA ont été utilisés pour transformer la souche d'E. coli BL21(DE3) encline à la recombinaison, qui a été rendue électrocompétente par trois étapes de lavage dans de l'eau froide. La transformation a été réalisée par une électroporation de 5,9 ms à 2,5 kV. Les transformants ont été sélectionnés en déposant les cellules sur des plaques LB contenant 30 pg/ml de kanamycine ou 20 pg/ml de chloramphénicol. La délétion des gènes tolR et ompA a été confirmée par amplification par PCR de 1'ADN génomique en utilisant les paires d'amorces tolR-Ι / PUC4K-rev et PUC4K-for /tolR-4 ; ompA-1/CMR-rev et CMR-for/ompA-4.Linear fragments in which the antibiotic resistance gene was flanked by the upstream and downstream regions of tolR / ompA were used to transform the E. coli strain. coli BL21 (DE3) prone to recombination, which was made electrocompetent by three washing steps in cold water. The transformation was performed by electroporation of 5.9 ms at 2.5 kV. Transformants were selected by depositing the cells on LB plates containing 30 μg / ml kanamycin or 20 μg / ml chloramphenicol. Deletion of the genes tolR and ompA was confirmed by PCR amplification of the genomic DNA using the primer pairs tolR-Ι / PUC4K-rev and PUC4K-for / tolR-4; ompA-1 / CMR-rev and CMR-for / ompA-4.

Tableau 1Table 1

Amorces oligonucléotidiquesOligonucleotide primers

Construction de plasmides pour l'expression d'antigènes staphylococciques dans des OMV d'E. coliConstruction of Plasmids for Expression of Staphylococcal Antigens in E. coli OMVs coli

Quatre antigènes provenant de Staphylococcus aureus ont été choisis pour une expression dans des OMV d'E. coli : (i) HlaH35L, un mutant inactif de 1'a-hémolysine (Hla) de la souche de Staphylococcus aureus NCTC8325 ; (ii) Sta006, un transporteur ABC de composés de fer provenant de la souche de Staphylococcus aureus NCTC8325 ; (iii) SpA_DEABC, une forme mutée de la protéine A (SpA) provenant de la souche NCTC8325, qui est incapable de lier les immunoglobulines ; (iv) LukE, l'une des deux sous-unités de la leucotoxine LukED provenant de la souche de Staphylococcus aureus NCTC8325.Four antigens from Staphylococcus aureus were selected for expression in E. coli OMVs. coli: (i) HlaH35L, an inactive mutant of α-hemolysin (Hla) of Staphylococcus aureus strain NCTC8325; (ii) Sta006, an ABC transporter of iron compounds from Staphylococcus aureus strain NCTC8325; (iii) SpA_DEABC, a mutated form of protein A (SpA) from strain NCTC8325, which is incapable of binding immunoglobulins; (iv) LukE, one of two LukED leukotoxin subunits derived from the Staphylococcus aureus strain NCTC8325.

La séquence codante d'acide nucléique de chaque protéine a été clonée dans le plasmide pET-OmpA en utilisant le procédé de clonage d'extension incomplète de l'amorce par la polymérase (PIPE) [114] . pETOmpA (figure 1) est un dérivé de pET21b qui permet l'expression de protéines dans l'espace périplasmique d'E. coli par l'intermédiaire d'une fusion traductionnelle entre une séquence signal d'E. coli (séquence signal de OmpA) et la forme mature de la protéine d'intérêt.The nucleic acid coding sequence of each protein was cloned into the plasmid pET-OmpA using the incomplete primer extension cloning method by polymerase (PIPE) [114]. pETOmpA (Figure 1) is a derivative of pET21b that allows the expression of proteins in the periplasmic space of E. coli through a translational fusion between a signal sequence of E. coli (signal sequence of OmpA) and the mature form of the protein of interest.

Le plasmide pET-OmpA a été amplifié par PCR en utilisant les amorces omprev/nohisflag (tableau 2). HlaH35L a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-HlaH35L en utilisant les amorces OmpA-Hla fl et Hla rl (tableau 2) , qui excluent la séquence signal N-terminale de Hla prédite par le logiciel SignalP 4.1. La séquence de OmpA-HlaH35L qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 121. Sta006 a été amplifié à partir du plasmide pET15TEV-Sta006 en utilisant les amorces OmpA-Sta006 fl et Sta006 rl (tableau 2), qui excluent la partie N-terminale de la séquence codante jusqu'au motif de lipoboîte LXXC, afin d'éviter l'ancrage membranaire. La séquence de OmpA-Sta006 qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 123. SpA_DEABC a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-SpA_DEABC en utilisant les amorces OmpA-SpA_DEABC fl et SpA_DEABC rl (tableau 2). La séquence de OmpA-SpA_DEABC qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 125. LukE a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-LukE dans deux formes : la première, excluant la séquence signal N-terminale prédite par le logiciel SignalP 4.1 et nommée « LukE (-LP) » , a été amplifiée en utilisant les amorces OmpA-LukE fl et LukE rl (tableau 2) ; la seconde, comprenant la séquence codante entière et nommée « LukE(+LP) », a été amplifiée en utilisant les amorces OmpA-The plasmid pET-OmpA was amplified by PCR using primers omprev / nohisflag (Table 2). HlaH35L was amplified by PCR from plasmid pET15TEV-HlaH35L using primers OmpA-HlaI and HlaR1 (Table 2), which exclude the N-terminal signal sequence of Hla predicted by SignalP 4.1 software. The OmpA-HlaH35L sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 121. Sta006 was amplified from plasmid pET15TEV-Sta006 using primers OmpA-Sta006 fl and Sta006 rl (Table 2), which exclude the N part. -terminal coding sequence up to the LXXC lipoboite pattern, to avoid membrane anchoring. The OmpA-Sta006 sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 123. SpA_DEABC was amplified by PCR from the plasmid pET15TEV-SpA_DEABC using primers OmpA-SpA_DEABC fl and SpA_DEABC rl (Table 2). The OmpA-SpA_DEABC sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 125. LukE was amplified by PCR from the plasmid pET15TEV-LukE in two forms: the first, excluding the N-terminal signal sequence predicted by the SignalP software 4.1 and named "LukE (-LP)" was amplified using primers OmpA-LukE fl and LukE rl (Table 2); the second, comprising the entire coding sequence and named "LukE (+ LP)", was amplified using OmpA- primers.

LukE f2 et LukE rl (tableau 2) . La séquence de OmpA-LukE (-LP) qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 127. La séquence de OmpA-LukE(+LP) qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 129. StaOll a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-Sta011 en utilisant les amorces OmpA-StaOll fl et StaOll rl (tableau 2). La séquence de OmpA-StaOll qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 131. EsxAB a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-EsxAB en utilisant les amorces OmpA-EsxAB fl et EsxAB rl (tableau 2). La séquence de OmpA-EsxAB qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 133. ClfA a été amplifié à partir du plasmide pET15TEV-ClfA en utilisant les amorces OmpA-ClfA fl et ClfA rl (tableau 2) . La séquence de OmpA-ClfA qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 135.LukE f2 and LukE rl (Table 2). The OmpA-LukE (-LP) sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 127. The OmpA-LukE (+ LP) sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 129. StaOll was amplified by PCR from the plasmid pET15TEV-Sta011 using primers OmpA-StaOll fl and StaOll rl (Table 2). The OmpA-StaOll sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 131. EsxAB was amplified by PCR from plasmid pET15TEV-EsxAB using primers OmpA-EsxAB1 and EsxAB R1 (Table 2). The OmpA-EsxAB sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 133. ClfA was amplified from the plasmid pET15TEV-ClfA using primers OmpA-ClfA F1 and ClfA R1 (Table 2). The OmpA-ClfA sequence that is produced is represented by SEQ ID NO: 135.

De cette manière, les plasmides pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-StaOO 6, pET21-SSOmpA -SpA_DEABC, pET21-SSOmpA-LukE(-LP), pET21-SSOmpA-LukE (+LP) , pET21-SSOmpA-StaOH, pET21-SSOmp-EsxAB et pET21-SSOmp-ClfA ont été générés.In this manner, plasmids pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-StaOO 6, pET21-SSOmpA -SpA_DEABC, pET21-SSOmpA-LukE (-LP), pET21-SSOmpA-LukE (+ LP), pET21-SSOmpA-StaOH pET21-SSOmp-EsxAB and pET21-SSOmp-ClfA were generated.

Tableau 2Table 2

Expression d'antigènes dans des mutants AompA et AtolR et analyse de l'expression des antigènes dans des lysats bactériens totaux, des fractions bactériennes solubles et des fractions de surnageant de cultureExpression of antigens in AompA and AtolR mutants and analysis of antigen expression in total bacterial lysates, soluble bacterial fractions and culture supernatant fractions

Des mutants d'E. coli BL21(DE3) AompA ont été transformés avec les plasmides pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-Sta006, pET21-SS0mpA-SpA_DEABC, pET21-SS0mpA-LukE(-LP), pET21-SS0mpA-LukE(+LP), pET21-SS0mpA-esxAB et pET21-SSOmpA-Sta011 et des mutants d'E. coli BL21 (DE3) AtolR ont été transformés avec les plasmides pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-StaOO6, pET21-S S OmpA-SpA_DEABC, pET21-SSOmpA-esxAB et pET21-SSOmpA-Sta011. Comme témoin négatif, des souches d'E. coli BL21 (DE3) AtolR et AompA ont été transformées avec le vecteur vide pET-OmpA.Mutants of E. coli BL21 (DE3) AompA were transformed with plasmids pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-Sta006, pET21-SS0mpA-SpA_DEABC, pET21-SS0mpA-LukE (-LP), pET21-SS0mpA-LukE (+ LP), pET21-SS0mpA-esxAB and pET21-SSOmpA-Sta011 and mutants of E. coli BL21 (DE3) AtolR were transformed with plasmids pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-StaOO6, pET21-S SmpA-SpA_DEABC, pET21-SSOmpA-esxAB and pET21-SSOmpA-Sta011. As a negative control, strains of E. coli BL21 (DE3) AtolR and AompA were transformed with the empty vector pET-OmpA.

Toutes les souches ont été cultivées dans du milieu liquide jusqu'à la phase logarithmique, lorsque l'expression des antigènes a été induite par l'addition de 1 mM d'IPTG (isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside) . Pour tester les souches recombinantes pour l'expression des antigènes, les lysats bactériens totaux ont été analysés (avant et après 3 heures d'induction avec l'IPTG) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec du SDS (SDS-PAGE) (figure 2) . Les bandes correspondant à HlaH35L, Sta006, LukE(-LP) et LukE(+LP) ont été détectables dans les échantillons induits dans AompA (figure 2A) , alors que les bandes correspondant à HlaH35L et Sta006 ont été détectables dans les échantillons induits dans AtolR (figure 2B) , indiquant que l'expression de ces antigènes a été induite avec succès dans E. coli. Les bandes correspondant à staOll et EsxAB ont été également détectables dans les échantillons induits dans AompA (non présenté). Les souches AompA et AtolR transformées avec le vecteur vide pET-OmpA ont été utilisées en tant que témoins négatifs (figure 2) . La démonstration de l'expression de SpA_DEABC et la confirmation de l'expression de HlaH35L (figure 3), Sta006 (figure 3), EsxAB (non présenté) et StaOll (non présenté) dans les lysats totaux ont été obtenues par immunoblot).All strains were grown in liquid medium to the log phase, when antigen expression was induced by the addition of 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside). To test for recombinant strains for antigen expression, total bacterial lysates were analyzed (before and after IPTG induction for 3 hours) by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE) (Fig. 2). ). The bands corresponding to HlaH35L, Sta006, LukE (-LP) and LukE (+ LP) were detectable in the samples induced in AompA (Figure 2A), whereas the bands corresponding to HlaH35L and Sta006 were detectable in the samples induced in AtolR (Figure 2B), indicating that the expression of these antigens was successfully induced in E. coli. The bands corresponding to staOll and EsxAB were also detectable in samples induced in AompA (not shown). The AompA and AtolR strains transformed with the empty vector pET-OmpA were used as negative controls (FIG. 2). Demonstration of SpA_DEABC expression and confirmation of expression of HlaH35L (Figure 3), Sta006 (Figure 3), EsxAB (not shown) and StaOll (not shown) in total lysates were obtained by immunoblotting).

Pour tester si les antigènes hétérologues sont solubles, des fractions solubles ont été préparées à partir de souches AompA induites pendant 2 heures avec de l'IPTG et analysées par SDS-PAGE (figure 4) . Une souche AompA transformée avec le vecteur vide pET-OmpA a été utilisée en tant que témoin négatif. Cette analyse a montré que Sta006, SpA_DEABC, LukE(-LP) et LukE(+LP) sont tous solubles.To test whether the heterologous antigens are soluble, soluble fractions were prepared from AompA strains induced for 2 hours with IPTG and analyzed by SDS-PAGE (Figure 4). An AompA strain transformed with the empty vector pET-OmpA was used as a negative control. This analysis showed that Sta006, SpA_DEABC, LukE (-LP) and LukE (+ LP) are all soluble.

Quantification des protéines hétérologues dans les fractions de surnageant de cultureQuantification of heterologous proteins in culture supernatant fractions

Afin de quantifier la quantité de protéines hétérologues libérées dans les surnageants des cultures durant la croissance, une analyse par immunoblot a été réalisée (figure 5) . La quantité d'antigène libéré dans le surnageant de culture par des souches BL21(DE3)AompA exprimant des protéines staphylococciques a été déterminée par comparaison des signaux de chimioluminescence des échantillons de surnageants (préparés par précipitation des protéines avec de l'acide trichloroacétique) avec ceux de quantités connues de protéines recombinantes purifiées. Cette analyse a montré que 7 μΐ de surnageant provenant de la souche AompA exprimant SSOmpA-StaOOô contenaient approximativement 20 ng d'antigène (figure 5A) , 7 μΐ de surnageant provenant de la souche AompA exprimant SSOmpA-SpA_DEABC contenaient approximativement 40 ng d'antigène (figure 5B) et 700 μΐ de surnageant provenant de la souche AompA exprimant SSOmpA-HlaH35L contenaient approximativement 10 ng d'antigène (figure 5C).In order to quantify the amount of heterologous proteins released into the culture supernatants during growth, immunoblotting analysis was performed (Figure 5). The amount of antigen released into the culture supernatant by BL21 (DE3) AompA strains expressing staphylococcal proteins was determined by comparison of the chemiluminescence signals of the supernatant samples (prepared by precipitation of the proteins with trichloroacetic acid) with those of known amounts of purified recombinant proteins. This analysis showed that 7 μΐ of supernatant from AompA strain expressing SSOmpA-StaOOδ contained approximately 20 ng of antigen (FIG. 5A), 7 μΐ of supernatant from AompA strain expressing SSOmpA-SpA_DEABC contained approximately 40 ng of antigen (FIG. 5B) and 700 μl of supernatant from AompA strain expressing SSOmpA-HlaH35L contained approximately 10 ng of antigen (FIG. 5C).

Les OMV peuvent être ensuite utilisées pour former une composition pharmaceutique qui peut être utilisée pour immuniser un mammifère.The OMVs can then be used to form a pharmaceutical composition that can be used to immunize a mammal.

Modèle d'abcès rénal murin et expériences d'immunisationMurine renal abscess model and immunization experiments

Des souris CD1 âgées de quatre ou cinq semaines ont été immunisées par voie intramusculaire (IM) avec des injections de sensibilisation-rappel avec un intervalle de 14 jours de 100 μΐ (IM) contenant 10 μg de chaque protéine purifiée ou d'OMV (voir les détails de la combinaison testée dans le tableau 3) adsorbés sur un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium (alun, 2 mg/ml). Des souris témoins ont reçu des quantités égales d'adjuvant alun seul. Les animaux immunisés ont été stimulés (« challengés ») au jour 24 par une injection intraveineuse d'une dose sous-létale de la souche Newman de S. aureus (~2 à 6 x 107 CFU). Au jour 28, les souris ont été euthanasiées et les reins ont été prélevés et homogénéisés dans 2 ml de PBS et déposés sur du milieu de gélose en double pour la détermination des unités formant une colonie (CFU). Les reins ont été également traités pour une histopathologie.CD1 mice four or five weeks old were immunized intramuscularly (IM) with 14-day sensitization-boosting injections of 100 μM (IM) containing 10 μg of each purified protein or OMV (see details of the combination tested in Table 3) adsorbed on aluminum hydroxide adjuvant (alum, 2 mg / ml). Control mice received equal amounts of alum adjuvant alone. Immunized animals were stimulated ("challenged") on day 24 by intravenous injection of a sub-lethal dose of the Newman strain of S. aureus (~ 2 to 6 x 107 CFU). At day 28, the mice were euthanized and the kidneys were removed and homogenized in 2 ml of PBS and plated on duplicate agar medium for determination of colony forming units (CFU). The kidneys were also treated for histopathology.

Tableau 3 Détails des compositions utilisées pour les expériences d'immunisationTable 3 Details of compositions used for immunization experiments

L'efficacité protectrice des formulations vaccinales candidates contre une infection par S. aureus dans un modèle d'abcès rénal murin est présentée dans le tableau 4 ci-dessous.The protective efficacy of candidate vaccine formulations against S. aureus infection in a murine kidney abscess model is shown in Table 4 below.

Tableau 4Table 4

Afin d'évaluer l'efficacité protectrice de formulations vaccinales candidates contre une infection par S. aureus, un modèle d'abcès murin a été utilisé. Des souris (N = 16 par groupe, deux expériences séparées) ont été immunisées avec de l'alun seul, ou avec les vaccins suivants formulés avec de l'alun (Composition 1) , un vaccin combiné contenant les antigènes recombinants purifiés suivants : HlaH35L, Sta006, StaOll, EsxAB (Composition 2), un mélange d'OMV contenant les quatre antigènes HlaH35L, Sta006, StaOll, EsxAB (Composition 3) , et un mélange d'OMV contenant les quatre antigènes HlaH35L, StaOOô, LukE, SpA (Composition 4). Après avoir été immunisées, les souris ont été ensuite stimulés (« challengés ») avec la souche Newman de S. aureus et les nombres de CFU dans les reins ont été mesurés 4 jours après la stimulation (« challenge ») . Les nombres moyens de CFU mesurés dans le groupe témoin ont été de 6,92 Log, chez les souris vaccinées avec le vaccin de la composition 2, les CFU étaient de 5.87 et chez les souris qui ont reçu les compositions d'OMV 3 et 4, de 1,69. De façon importante, la plupart des souris immunisées avec la formulation contenant des OMV ont montré des taux indétectables de nombres de CFU. En outre, l'efficacité protectrice générée par la formulation des OMV a été statistiquement supérieure à celle associée au vaccin de la composition 1.In order to evaluate the protective efficacy of candidate vaccine formulations against S. aureus infection, a mouse abscess model was used. Mice (N = 16 per group, two separate experiments) were immunized with alum alone, or with the following vaccines formulated with alum (Composition 1), a combined vaccine containing the following purified recombinant antigens: HlaH35L , Sta006, StaOll, EsxAB (Composition 2), a mixture of OMV containing the four antigens HlaH35L, Sta006, StaOll, EsxAB (Composition 3), and a mixture of OMV containing the four antigens HlaH35L, StaOO6, LukE, SpA ( Composition 4). After being immunized, the mice were then stimulated ("challenged") with the Newman strain of S. aureus and the numbers of CFU in the kidneys were measured 4 days after the challenge. The average numbers of CFUs measured in the control group were 6.92 Log, in the mice vaccinated with the vaccine of the composition 2, the CFUs were 5.87 and in the mice which received the compositions of OMV 3 and 4 of 1.69. Importantly, most mice immunized with the OMV-containing formulation showed undetectable levels of CFU numbers. In addition, the protective efficacy generated by the OMV formulation was statistically superior to that associated with the composition 1 vaccine.

REFERENCESREFERENCES

[1] Rable &amp; Wardenburg (2009) Infect Immun 77:2712-8.[1] Rable &amp; Wardenburg (2009) Infect Immun 77: 2712-8.

[2] WO 2007/145689.[2] WO 2007/145689.

[3] WO 2009/029831.[3] WO 2009/029831.

[4] Sebulsky &amp; Heinrichs (2001) J Bacteriol 183:4994-5000.[4] Sebulsky &amp; Heinrichs (2001) J. Bacteriol 183: 4994-5000.

[5] Sebulsky et al. (2003) J Biol Chem 278:49890-900.[5] Sebulsky et al. (2003) J Biol Chem 278: 49890-900.

[6] Sjodahl (1977) J. Biochem. 73:343-351.[6] Sjodahl (1977) J. Biochem. 73: 343-351.

[7] Uhlen et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:1695-1702 &amp; 13628 (Corr.).[7] Uhlen et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1695-1702 &amp; 13628 (Corr.).

[8] Schneewind et al. (1992) Cell 70:267-281.[8] Schneewind et al. (1992) Cell 70: 267-281.

[9] DeDent et al. (2008) EMBO J. 27:2656-2668.[9] DeDent et al. (2008) EMBO J. 27: 2656-2668.

[10] Sjoquist et al. (1972) Eur. J. Biochem. 30:190-194.[10] Sjoquist et al. (1972) Eur. J. Biochem. 30: 190-194.

[11] DeDent et al. (2007) J. Bacteriol. 189:4473-4484.[11] DeDent et al. (2007) J. Bacteriol. 189: 4473-4484.

[12] Deisenhofer et ai., (1978) Hoppe-Seyh Zeitsch. Physiol. Chem. 359:975-985.[12] Deisenhofer et al., (1978) Hoppe-Seyh Zeitsch. Physiol. Chem. 359: 975-985.

[13] Deisenhofer (1981) Biochemistry 20:2361-2370.[13] Deisenhofer (1981) Biochemistry 20: 2361-2370.

[14] Graille et al. (2000) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 97:5399-5404.[14] Graille et al. (2000) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97: 5399-5404.

[15] 0'Seaghdha et al. (2006) FEBS J. 273:4831-41.[15] 0'Seaghdha et al. (2006) FEBS J. 273: 4831-41.

[16] Gomez et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:20190-20196.[16] Gomez et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 20190-20196.

[17] WO 2007/071692.[17] WO 2007/071692.

[18] Katial et al. 2002, Infect Immun, 70: 702-707 [19] WO 02/09643 [20] Bèveridge, 1999,.J. Bacteriol. 181: 4725-4733 [21] Moe et al. 2002, Infect. Immun. 70:6021-6031 [22] WO 03/070880 [23] Pósfai et al. (2006) Science 312(5776):1044-6.[18] Katial et al. 2002, Infect Immun, 70: 702-707 [19] WO 02/09643 [20] Bèveridge, 1999, J.; Bacteriol. 181: 4725-4733 [21] Moe et al. 2002, Infect. Immun. 70: 6021-6031 [22] WO 03/070880 [23] Pósfai et al. (2006) Science 312 (5776): 1044-6.

[24] Kim et al. (2009) Biochim Biophys Acta. 1788:2190-9 [25] Datsenko et al. (2000) PNAS. 97:6640-5 [26] Lee et al. (2011) Vaccine. 29:8293-8301 [27] Poolman et al. (2009) Vaccimonitor 18(2):68-70.[24] Kim et al. (2009) Biochim Biophys Acta. 1788: 2190-9 [25] Datsenko et al. (2000) PNAS. 97: 6640-5 [26] Lee et al. (2011) Vaccine. 29: 8293-8301 [27] Poolman et al. (2009) Vaccimonitor 18 (2): 68-70.

[28] Murakami et al. Oral Microbiol. Immunol. 2007, 22: 356-360 [29] Jewett and Förster (2010) Curr Opin Biotechnol. 21(5):697-703 [30] WO 2008/024129 [31] Gibson et al. (2008) Science. 319(5867):1215-20.[28] Murakami et al. Oral Microbiol. Immunol. 2007, 22: 356-360 [29] Jewett and Förster (2010) Curr Opin Biotechnol. 21 (5): 697-703 [30] WO 2008/024129 [31] Gibson et al. (2008) Science. 319 (5867): 1215-1220.

[32] Gibson et al. (2010) Science 329(5987):52-56.[32] Gibson et al. (2010) Science 329 (5987): 52-56.

[33] WO 2004/019977.[33] WO 2004/019977.

[34] Brevet européen 0011243.[34] European patent 0011243.

[35] Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80.[35] Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann. 14 (2): 67-80.

[36] WO 01/91788.[36] WO 01/91788.

[37] WO 2005/004908.[37] WO 2005/004908.

[38] Alberts et al., (2008) Molecular Biology of The Cell, 5th Ed, page 630 [39] M. Feldhahn et al (2008) Nucleic Acid Research 2008 Jul 1;36 (Web Server issue):W519-22.[38] Alberts et al., (2008) Molecular Biology of The Cell, 6th Ed, page 630 [39] M. Feldhahn et al (2008) Nucleic Acid Research 2008 Jul 1; 36 (Web Server issue): W519-22 .

[40] Larsen et al (2006) Immunome Res 2:2 [41] Haste Andersen P, et al (2006) Protein Sei 15:2558-2567.[40] Larsen et al (2006) Immunome Res 2: 2 [41] Haste Andersen P, et al (2006) Protein Sci 15: 2558-2567.

[42] Ponomarenko JV et al (2008). BMC Bioinformatics 9:514 [43] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of[42] Ponomarenko JV et al (2008). BMC Bioinformatics 9: 514 [43] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of

Pharmacy. 20th édition, ISBN: 0683306472 [44] WO 2006/110603 [45] WO 90/14837 [46] Podda &amp; Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203 [47] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680 [48] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell &amp; Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) [4 9] Vaccine Adjuvants : Préparation Methods and ResearchPharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472 [44] WO 2006/110603 [45] WO 90/14837 [46] Podda &amp; Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2: 197-203 [47] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680 [48] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) [4 9] Adjuvant Vaccine: Preparation Methods and Research

Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan [50] Allison &amp; Byars (1992) Res Immunol 143:519-25 [51] Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55:3486-9 [52] US-2007/014805 [53] WO 95/11700 [54] Brevet US 6 080 725 [55] WO 2006/113373 [56] WO 2005/097181 [57] US 5 057 540 [58] WO 96/33739 [59] EP-A-0109942 [60] WO 96/11711 [61] WO 00/07621 [62] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271 [63] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338 [64] EP-A-0689454 [65] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278 [66] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229 [67] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491 [68] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842 [69] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393- 2400 [70] WO 02/26757 [71] WO 99/62923 [72] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835 [73] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185 [74] WO 98/40100 [75] US 6 207 646 [76] US 6 239 116 [77] US 6 429 199 [78] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658 [79] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068 [80] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65 [81] WO 01/95935 [82] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953 [83] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861 [84] WO 03/035836 [85] Schellack et al. (2006) Vaccine 24:5461-72 [86] Lingnau et al. (2007) Expert Rev Vaccines 6:741-6 [87] WO 2004/084938 [88] WO 95/17211 [89] WO 98/42375 [90] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019 [91] Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541 [92] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461 [93] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306-5313 [94] Ryan et ai. (1999) Infect Immun 67:6270-6280 [95] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216 [96] Peppoloni et ai. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293 [97] Pine et ai. (2002) J Control Release 85:263-270 [98] Tebbey et al. (2000) Vaccine 18:2723-34 [99] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167 [100] WO 99/40936 [101] WO 99/44636 [102] Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276 [103] WO 99/27960 [104] US 6 090 406 [105] US 5 916 588 ' [106] EP-A-0626169 [107] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577 [108] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218 [109] WO 99/11241 [110] WO 94/00153 [111] WO 98/57659 [112] Demandes de brevet européen 0835318, 0735898 et 0761231 [113] Maxson, M. E., and Darwin, A. J. (2004) J. Bacteriol 186:4199-4208 [114] Klock H.E., Lesley S.A. (2009) Methods Mol Biol 498:91- ' 103Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan [50] Allison &amp; Byars (1992) Res Immunol 143: 519-25 [51] Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55: 3486-9 [52] US-2007/014805 [53] WO 95/11700 [54] US Patent 6,080,725 [55] WO 2006/113373 [56] WO 2005/097181 [57] US 5,057,540 [58] WO 96/33739 [59] EP-A-0109942 [60] WO 96/11711 [61] WO 00/07621 [62] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32: 247-271 [63] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32: 321-338 [64] EP-A-0689454 [65] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 2273-2278 [66] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2: 219-229 [67] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21: 2485-2491 [68] Pajak et al. (2003) Vaccine 21: 836-842 [69] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31: 2393-2400 [70] WO 02/26757 [71] WO 99/62923 [72] Krieg (2003) Nature Medicine 9: 831-835 [73] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32: 179-185 [74] WO 98/40100 [75] US 6,207,646 [76] US 6,239,116 [77] US 6,429,199 [78] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3): 654-658 [79] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170: 4061-4068 [80] Krieg (2002) Trends Immunol 23: 64-65 [81] WO 01/95935 [82] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306: 948-953 [83] Bhagat et al. (2003) BBRC 300: 853-861 [84] WO 03/035836 [85] Schellack et al. (2006) Vaccine 24: 5461-72 [86] Lingnau et al. (2007) Rev Vaccines Expert 6: 741-6 [87] WO 2004/084938 [88] WO 95/17211 [89] WO 98/42375 [90] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70: 3012-3019 [91] Pizza et al. (2001) Vaccine 19: 2534-2541 [92] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290: 455-461 [93] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68: 5306-5313 [94] Ryan et al. (1999) Infect Immun 67: 6270-6280 [95] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67: 209-216 [96] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2: 285-293 [97] Pine et al. (2002) J Control Release 85: 263-270 [98] Tebbey et al. (2000) Vaccine 18: 2723-34 [99] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15: 1165-1167 [100] WO 99/40936 [101] WO 99/44636 [102] Singh et al. (2001) J Cont. Release 70: 267-276 [103] WO 99/27960 [ 104] US 6,090,406 [105] US 5,916,588 [106] EP-A-0626169 [107] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27: 571-577 [108] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4: 214-218 [109] WO 99/11241 [110] WO 94/00153 [111] WO 98/57659 [112] European Patent Applications 0835318, 0735898 and 0761231 [113] Maxson, ME, and Darwin, AJ (2004) J. Bacteriol 186: 4199-4208 [114] Klock HE, Lesley SA (2009) Methods Mol Biol 498: 91-103.

Claims (28)

REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique comprenant au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.A pharmaceutical composition comprising at least three antigens from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, comprenant les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa.The pharmaceutical composition of claim 1 comprising the four of the antigens of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen. 3. Composition pharmaceutique selon la revendication. 1, comprenant au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.3. Pharmaceutical composition according to claim. 1, comprising at least four of the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 4. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle ledit au moins un antigène est compris au sein d'OMV provenant d'une bactérie Gram négatif.4. Pharmaceutical composition according to any one of claims 1 and 2, wherein said at least one antigen is included in OMV from a Gram-negative bacterium. 5. OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.5. OMV from a gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 6. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend au moins deux antigènes de S. aureus, où les antigènes sont choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.The OMV of claim 5, wherein the OMV comprises at least two S. aureus antigens, wherein the antigens are selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a staOOδ antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 7. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend au moins trois antigènes de S. aureus, où les antigènes sont choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv)' un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) ün antigène esxB.The OMV of claim 5, wherein the OMV comprises at least three S. aureus antigens, wherein the antigens are selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a staOOδ antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 8. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa.The OMV of claim 5, wherein the OMV comprises four S. aureus antigens, wherein the antigens are (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen. 9. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) un antigène staOll.The OMV of claim 5, wherein the OMV comprises four S. aureus antigens, wherein the antigens are (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB antigen and (iv) staOll antigen. 10. OMV selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, où l'OMV comprend en outre au moins un, au moins deux ou les trois antigènes du groupe constitué de (i) un antigène stall ; (ii) un antigène esxAB et (iii) un antigène elfA.The OMV according to any one of claims 5 to 9, wherein the OMV further comprises at least one, at least two or all three antigens from the group consisting of (i) a stall antigen; (ii) esxAB antigen and (iii) elfA antigen. 11. Procédé de préparation d'une OMV selon l'une quelconque des revendications 5 à 9.11. Process for preparing an OMV according to any one of claims 5 to 9. 12. OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.12. OMV from a Gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen in its lumen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 13. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend au moins deux antigènes de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.The OMV of claim 12, wherein the OMV comprises at least two S. aureus antigens in its lumen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 14. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend au moins trois antigènes de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.The OMV of claim 12, wherein the OMV comprises at least three S. aureus antigens in its lumen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen. 15. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa.The OMV of claim 12, wherein the OMV comprises four S. aureus antigens, wherein the antigens are (i) an hla antigen; (ii) a staOOδ antigen; (iii) a lukE antigen and (iv) a spa antigen. 16. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) un antigène staOll.The OMV of claim 12, wherein the OMV comprises four S. aureus antigens, wherein the antigens are (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) esxAB antigen and (iv) staOll antigen. 17. OMV selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, où l'OMV comprend en outre dans sa lumière au moins un, au moins deux ou les trois des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène staOll ; (ii) un antigène esxAB et (iii) un antigène elf A.The OMV according to any one of claims 12 to 16, wherein the OMV further comprises in its lumen at least one, at least two or all of the antigens of the group consisting of: (i) a staOll antigen; (ii) esxAB antigen and (iii) elf A antigen. 18. OMV selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, dans laquelle 1'antigène/les antigènes est/sont libre(s) dans la lumière de l'OMV.The OMV according to any one of claims 12 to 17, wherein the antigen / antigens are free in the OMV lumen. 19. Procédé de préparation d'une OMV selon l'une quelconque des revendications 12 à 18.19. Process for preparing an OMV according to any one of claims 12 to 18. 20. Procédé selon la revendication 19, comprenant l'étape d'expression de l'antigène dans le périplasme de la bactérie Gram négatif.The method of claim 19 comprising the step of expressing the antigen in the periplasm of the Gram-negative bacterium. 21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel l'antigène est exprimé dans le périplasme de la bactérie Gram négatif en utilisant un vecteur d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'antigène liée à un acide nucléique codant pour une séquence signal d'une protéine périplasmique.The method of claim 20, wherein the antigen is expressed in the periplasm of the Gram-negative bacterium using an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding the nucleic acid-bound antigen encoding a signal sequence of a periplasmic protein. 22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel la séquence signal native de l'antigène est remplacée par la séquence signal d'une protéine périplasmique.The method of claim 21, wherein the native signal sequence of the antigen is replaced by the signal sequence of a periplasmic protein. 23. OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, où la bactérie Gram négatif comprend un génome synthétique dans lequel : a)-une ou plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules sont absentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences absentes, le génome est entre 1 % et 50 % plus petit ; et b) une ou plusieurs séquences sont présentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences présentes, la bactérie produit des vésicules qui comprennent un ou plusieurs antigènes supplémentaires.23. OMV from a Gram-negative bacterium, wherein the OMV comprises at least one S. aureus antigen, wherein the antigen is selected from the group consisting of: (i) an hla antigen; (ii) a sta006 antigen; (iii) a lukE antigen; (iv) a spa antigen; (v) a staOll antigen; (vi) an esxA antigen and (vii) an esxB antigen, wherein the gram negative bacterium comprises a synthetic genome in which: a) one or more nonessential sequences to the production of vesicles are absent such that, compared to even bacteria without said absent sequences, the genome is between 1% and 50% smaller; and b) one or more sequences are present such that, compared to the same bacterium without said sequences present, the bacterium produces vesicles that comprise one or more additional antigens. 24. OMV ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 23, où la bactérie Gram négatif est choisie dans le groupe constitué d'E. coli, N. meningitidis, Salmonella sp., et Shigella sp.An OMV or method according to any one of claims 4 to 23, wherein the gram negative bacterium is selected from the group consisting of E. coli, N. meningitidis, Salmonella sp., and Shigella sp. 25. OMV ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 23, où la bactérie Gram négatif est une souche hyperbourgeonnante de la bactérie Gram négatif.An OMV or method according to any one of claims 4 to 23, wherein the Gram-negative bacterium is a hyperbourgeonating strain of the Gram-negative bacterium. 26. OMV ou procédé selon la revendication 25, où la bactérie Gram négatif est une souche d'E. coli AtolR ou une souche d’E. coli AompA.The OMV or method of claim 25, wherein the Gram-negative bacterium is a strain of E. coli. AtolR coli or a strain of E. coli. AompA coli. 27. Composition pharmaceutique comprenant (a) au moins une OMV selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou 12 à 17 et (b) un support pharmaceutiquement acceptable.27. A pharmaceutical composition comprising (a) at least one OMV according to any one of claims 4 to 9 or 12 to 17 and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. 28. Composition pharmaceutique selon la revendication 27, comprenant au moins deux OMV différentes selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou 12 à 17.28. The pharmaceutical composition according to claim 27, comprising at least two different OMVs according to any one of claims 4 to 9 or 12 to 17.
BE2015/5177A 2014-03-26 2015-03-24 COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS BE1022875B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14161861 2014-03-26
EP14161861.1 2014-03-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BE1022875B1 true BE1022875B1 (en) 2016-09-30

Family

ID=50389863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BE2015/5177A BE1022875B1 (en) 2014-03-26 2015-03-24 COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Country Status (2)

Country Link
BE (1) BE1022875B1 (en)
WO (1) WO2015144691A1 (en)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2763695A1 (en) * 2011-09-01 2014-08-13 Novartis AG Adjuvanted formulations of staphylococcus aureus antigens
US10709776B2 (en) * 2014-04-07 2020-07-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for producing outer membrane vesicles
EP3312192B1 (en) * 2016-10-24 2023-02-22 BiOMVis Srl Immunogenic compositions containing bacterial outer membrane vesicles
WO2018081350A1 (en) * 2016-10-27 2018-05-03 Medimmune, Llc Signal polypeptide for improved secretion of protein
AR111760A1 (en) 2017-05-19 2019-08-14 Novartis Ag COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF SOLID TUMORS THROUGH INTRATUMORAL ADMINISTRATION
EP3536706A1 (en) 2018-03-09 2019-09-11 BiOMVis Srl Fusion proteins for the outer membrane vesicle (omv) delivery of heterologous polypeptides and immunogenic compositions thereof
EP3725371A1 (en) 2019-04-18 2020-10-21 BiOMVis Srl Method for the production of outer membrane vesicles and immunogenic compositions thereof
EP3777884A1 (en) * 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CN112402601B (en) * 2019-08-22 2022-09-13 四川大学 Staphylococcus aureus membrane vesicle and preparation method and application thereof
WO2021031270A1 (en) * 2019-08-22 2021-02-25 四川大学 Bacterial membrane vesicles, and separation and preparation system and method therefor
KR20220107166A (en) 2019-10-02 2022-08-02 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Staphylococcus Peptides and Methods of Use
EP4150096A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Biomvis S.R.L. Bacterial outer membrane vesicles carrying coronavirus polypeptides, method of preparation, compositions and use thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010119343A2 (en) * 2009-04-14 2010-10-21 Novartis Ag Compositions for immunising against staphylococcus aureus
WO2011005341A2 (en) * 2009-04-03 2011-01-13 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) variants
WO2011127032A1 (en) * 2010-04-05 2011-10-13 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) antibodies as an enhancer of immune response
WO2011161551A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-29 Novartis Ag Omv vaccines
WO2012034067A1 (en) * 2010-09-09 2012-03-15 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
WO2012177658A2 (en) * 2011-06-19 2012-12-27 New York Univeristy Methods of treating and preventing staphylococcus aureus infections and associated conditions
WO2013030378A1 (en) * 2011-09-01 2013-03-07 Novartis Ag Adjuvanted formulations of staphylococcus aureus antigens
WO2014044728A1 (en) * 2012-09-18 2014-03-27 Novartis Ag Outer membrane vesicles

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011005341A2 (en) * 2009-04-03 2011-01-13 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) variants
WO2010119343A2 (en) * 2009-04-14 2010-10-21 Novartis Ag Compositions for immunising against staphylococcus aureus
WO2011127032A1 (en) * 2010-04-05 2011-10-13 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) antibodies as an enhancer of immune response
WO2011161551A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-29 Novartis Ag Omv vaccines
WO2012034067A1 (en) * 2010-09-09 2012-03-15 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
WO2012177658A2 (en) * 2011-06-19 2012-12-27 New York Univeristy Methods of treating and preventing staphylococcus aureus infections and associated conditions
WO2013030378A1 (en) * 2011-09-01 2013-03-07 Novartis Ag Adjuvanted formulations of staphylococcus aureus antigens
WO2014044728A1 (en) * 2012-09-18 2014-03-27 Novartis Ag Outer membrane vesicles

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. J. CHEN ET AL: "Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 107, no. 7, 16 February 2010 (2010-02-16), pages 3099 - 3104, XP055035314, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.0805532107 *
KIM S H ET AL: "Structural modifications of outer membrane vesicles to refine them as vaccine delivery vehicles", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - BIOMEMBRANES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 1788, no. 10, 1 October 2009 (2009-10-01), pages 2150 - 2159, XP026684863, ISSN: 0005-2736, [retrieved on 20090818], DOI: 10.1016/J.BBAMEM.2009.08.001 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015144691A1 (en) 2015-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BE1022875B1 (en) COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS
ES2846901T3 (en) Hypervesiculating Shigella strains
US9926344B2 (en) Stabilised proteins for immunising against Staphylococcus aureus
BE1022744B1 (en) MUTANT STAPHYLOCOCCAL ANTIGENS
WO2012049662A1 (en) Hyperblebbing salmonella strains
CA2910150A1 (en) Mutant bacteria for production of generalized modules for membrane antigens
US20180256701A1 (en) Pseudomonas antigens and antigen combinations
US20150202277A1 (en) Stabilised proteins for immunising against staphylococcus aureus
EP2890395A1 (en) Stabilised proteins for immunising against staphylococcus aureus
US20150191513A1 (en) Stabilised proteins for immunising against staphylococcus aureus
BE1022857B1 (en) IMMUNIZATION AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS
BR112016022011B1 (en) MUTANT STAPHYLOCOCCA PROTEIN ANTIGEN, FUSION PROTEIN, AND IMMUNOGENIC COMPOSITION
Chatterjee et al. Outer Membrane Vesicles: Physiological Medical Applications

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Effective date: 20160930

MM Lapsed because of non-payment of the annual fee

Effective date: 20170331