<Desc/Clms Page number 1>
Titel Mannelijk steriele groente Cichorium en het gebruik ervan voor de productie van hybride zaad Samenvatting De uitvinding heeft betrekking op een gecultiveerde groente Cichorium plant, die mannelijk steriel is door de aanwezigheid in het genoom van de plant van een recessief allel in homozygote toestand, dat codeert voor mannelijke steriliteit. De uitvinding heeft verder betrekking op het gebruik van moleculaire merkers voor het introduceren van het mannelijk steriliteitkenmerk in ouderlijnen van groente Cichorium voor de productie van hybride zaad.
De inhoud van de in de vermelde referenties wordt bij deze in de aanvraag ingesloten.
Achtergrond van de uitvinding De productie van hybriden is een belangrijke doelstelling van veel veredelingsbedrijven. Hybride rassen (gewassen) vertonen verschillende voordelen voor veredelaars ten opzichte van open bestoven rassen (gewassen), zoals uniformiteit en heterosis van de eigenschappen van beide ouderlijnen.
Cichorium planten vertegenwoordigen significante landbouw belangen. Cichorium intybus wordt gekweekt voor het lof dat als groente wordt verkocht (algemeen gekend als witlof) en van de wortels wordt een koffie substituut aangemaakt. Men heeft ook aangetoond dat de wortels een belangrijke bron kunnen zijn van inuline en kunnen dienen voor de aanmaak van siroop met hoog fructose-gehalte.
Omdat alle Cichorium planten hermafrodiete bloemen hebben, heeft men al aanzienlijk geïnvesteerd in de ontwikkeling van gecultiveerde ingeteelde lijnen die in min of meerdere mate zelfincompatibel zijn De productie van hybnden wordt dan verwezenlijkt door combinatie van ouderlijnen met gedeeltelijke zelfincompatibiliteit
<Desc/Clms Page number 2>
en hieruit de optimale combinatie te kiezen om op die manier een zo laag mogelijk percentage aan uit inteelt voortgekomen zaden te verkrijgen. Door de moeilijkheden van het genetisch stabiliseren en controleren van dit kenmerk samen met andere agronomisch belangrijke kenmerken, kan het percentage aan uit inteelt voorkomende individuen in een commercieel zaadlot variëren tussen 10% and 90%, wat leidt tot een heterogeen gewas bij het oogsten.
Om deze beperking te overwinnen heeft men in witlof een cytoplasmatisch mannelijk steriliteitsysteem (CMS) ontwikkeld, op basis van kruisingen met wilde variëteiten of door somatische hybridisatie van witlof protoplast met CMS protoplast van zonnebloemen (Rambaud et al. 1993, Theoretical and Applied Genetics 87(3):347- 352). Het is echter zo dat de meeste CMS systemen niet 100% betrouwbaar zijn, de cytoplasmatisch-geëncodeerde eigenschappen soms slechts moeizaam in de verkozen ouderlijnen geïntroduceerd kunnen worden en dat het vaak leidt tot de gelijktijdige overdracht van ongewilde eigenschappen die eraan gekoppeld zijn.
Het nucleair mannelijk steriliteitsysteem dat beschreven is in PCT publicatie WO 89/10396 is ook met succes ontwikkeld voor witlof. Mannelijk steriele planten werden verkregen door introductie van een gen coderend voor het ribonuclease barnase dat onder de regulatorische controle staat van de TA29 promoter die expressie in de tapetumcellen verzekert (Reynaerts et al. 1993, Scientia Horticulturae 55:125- 139). Zoals alle projecten voor transgene groenten zal de rentabiliteit van dit systeem voor groente Cichorium echter afhangen van de vraag of het commercieel voordeel (dat mede bepaald wordt door de aanvaarding van GMO's) zal opwegen tegen de aanzienlijke kosten van deregulatie.
De hierin beschreven uitvinding heeft betrekking op een gecultiveerde mannelijk steriele groente Cichorium plant, waarin het mannelijk steriliteitkenmerk gecodeerd wordt door een genetische factor die overerft als een enkelvoudig nucleair recessief allel, en op een proces voor het introduceren van het mannelijk steriliteitkenmerk in verschillende gecultiveerde groente Cichorium cultivars. De beschikbaarheid van een dergelijk mannelijk steriliteitkenmerk in verschillende groente Cichorium cultivars vergemakkelijkt de productie van volwaardig hybnde zaad evenals de ontwikkeling van nieuwe variëteiten.
<Desc/Clms Page number 3>
Samenvatting van de uitvinding De hierin beschreven uitvinding heeft betrekking op een gecultiveerde groente Cichorium plant, of zaden, cellen of weefsels van deze plant, die in het genoom een DNA regio bevat, die een genetische factor bevat, die, wanneer het aanwezig is in homozygote toestand, de plant mannelijke steriel maakt. De genetische factor die voor dit mannelijk steriliteits fenotype codeert, is, in het genoom van het zaad van depot nummer NCIMB 41116, gelokaliseerd tussen AFLP merkers E44/M76 en E46/M75, waaraan het gekoppeld is.
De uitvinding heeft eveneens betrekking op een DNA regio die een genetische factor bevat die, wanneer zij aanwezig is in het genoom van de plant in homozygote toestand, een mannelijke steriel fenotype aan de plant verleent. De uitvinding heeft verder betrekking op een DNA regio die een genetische factor bevat, die wanneer zij aanwezig is in het genoom van de plant in homozygote toestand, een mannelijk steriel fenotype aan de plant verleent, waarbij deze DNA regio aanwezig is in het genoom van de zaden neergelegd onder depot nummer NCIMB 41116 en hierin kan aangetoond worden door moleculaire merkers. Meer specifiek kan de genetisch factor geïdentificeerd worden door gebruik te maken van de AFLP merkers E44/M76 en/of E46/M75.
De hierin beschreven uitvinding heeft verder betrekking op een methode voor de introgressie, op een betrouwbare en voorspelbare wijze, van het mannelijk steriliteitsfenotype, in een verkozen gecultiveerde groente Cichorium cultivar. De methode van deze uitvinding omvat het genetisch in kaart brengen van loci die geassocieerd zijn of gekoppeld zijn aan een genetische factor, die wanneer zij aanwezig is in het genoom van de plant in homozygote toestand, een mannelijke steriel fenotype aan de plant verleent, en het gebruik van deze merkers voor het volgen van de introgressie van het mannelijk steriliteitsallel in kruisingen en segregerende populaties.
De uitvinding wordt bij voorkeur verwezenlijkt in een genetische factor die mannelijke steriliteit verleent aanwezig in het genoom van gecultiveerde groente Cichorium zaad van het depot dat neergelegd werd bij het National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCLMB) onder depot
<Desc/Clms Page number 4>
nummer NCIMB 41116, en dat kan geïdentificeerd worden aan de hand van AFLP merkers E44/M76 en/of E46/M75 in het genoom van dit depot.
De methode van deze uitvinding omvat het gebruik van moleculaire merkers voor de selectie van nakomelingen uit een kruising tussen een plant die in het genoom de genetische factor die het mannelijke steriel fenotype aan de plant verleent bevat, met een plant waarbij deze genetische factor niet in het genoom aanwezig is.
In een specifieke toepassing van de uitvinding wordt de introductie van een DNA regio, die een genetische factor bevat die het mannelijk steriel fenotype aan de plant verleent, in een preferentiële cultivar door herhaalde terugkruisingen vergemakkelijkt door het veredelen met behulp van merkers, meer bepaald door selectie aan de hand van moleculaire merkers die gekoppeld zijn aan de DNA regio, zoals bijvoorbeeld (maar niet beperkt tot), de AFLP merkers E44/M76 en E46/M75, meer bepaald de merkers die gekenmerkt zijn als E44/M76-303F, 297f en E46/M75-260f (verder gespecificeerd als E44/M76-303F, 297f en E46/M75-260f).
In een verdere toepassing van de hierin beschreven uitvinding worden gecultiveerde mannelijk steriele groente Cichorium planten verkregen door introgressie van een DNA regio die een genetische factor bevat die het mannelijk steriel fenotype aan de plant verleent, gebruik makende van AFLP merkers gekoppeld aan de DNA regio van deze uitvinding, zoals bijvoorbeeld, maar niet enkel merkers E44/M76 en E46/M75.
In een meer specifieke belichaming van de uitvinding wordt introgressie van een DNA regio in een preferentiële cultivar uitgevoerd door het kruisen van een plant van de preferentiële cultivar met een plant met een plant die uit het zaad van het depot werd opgegroeid gevolgd door herhaalde terugkruisingen met de preferentiële cultivar, gebruik makend van moleculaire merkers.
Volgens een bijkomende toepassing van de hierin beschreven uitvinding wordt het genetisch materiaal van de zaden die neergelegd werden als depot nummer NCIMB 41116 voor de identificatie van loei die geassocieerd zijn met de DNA regio die een genetische factor bevat die aan de plant een mannelijk steriel fenotype verleent. Voor toepassing (bij voorkeur) zijn de moleculaire merkers gelegen op minder dan 50 cM van de DNA regio, bij voorkeur is de afstand minder dan 20 cM In een meer
<Desc/Clms Page number 5>
specifieke toepassing van de uitvinding zijn de moleculaire merkers gelegen op minder dan 5 cM van de genetische factor die het mannelijk steriel fenotype aan de plant kan verlenen.
Figuren De hierna volgende uitgebreide beschrijving, gegeven bij wijze van voorbeeld, maar niet met de bedoeling de uitvinding te beperken tot de specifieke uitwerkingsvormen hierin beschreven, kan verduidelijkt worden door de hierbij ingesloten figuren, waarbij: Figuur 1: Score tabel van 3 AFLP merkers gekoppeld aan het mannelijk steriliteitsallel, waarvan 2 dominant F-gekoppeld zijn (E35/M55-183F and E40/M58-166F) en één co-dominant is (E33/M48-272F, 273f). De gegevens zijn verkregen op 1 fertiele ("F. ") and 19 steriele ("ff') pools ; zijn aangegeven als "+" - band aanwezig ; = band afwezig ; = twijfelscore.
Figuur 2 : tabel van 3 AFLP merkers op individuen van steriele pools ("ffll" tot "ffl9" - zie Figuur 1) die een recombinatie vertonen tussen het mannelijk steriliteitsallel en de AFLP merkers. Op basis van deze resultaten worden de volgorde en de afstand van de merkers bepaald. (gd = geen detectie) Figuur 3 : kaart van het MS-locus in witlof op basis van segregerende BC4-BC5 populaties van in totaal ongeveer 4000 individuen. Co-dominante merkers zijn onderstreept, merkers gekoppeld aan het f-allel zijn omkaderd om een onderscheid te maken met de F-gekoppelde merkers.
Gedetailleerde beschrijving De hierin beschreven uitvinding heeft betrekking op een gecultiveerde groente Cichornum plant die mannelijk steriel is door de aanwezigheid in het genoom, van een mannelijk steriliteitsallel in homozygote toestand, welk het mannelijk steriel fenotype
<Desc/Clms Page number 6>
aan de plant verleent. De uitvinding heeft verder betrekking op een gecultiveerde groente Cichorium plant, waarvan het genoom een mannelijk steriliteitsallel bevat dat, wanneer het aanwezig is in homozygote toestand, een mannelijk steriel fenotype aan de plant verleent. Het mannelijk steriliteitslocus (MS-locus) is gekenmerkt door het feit dat in het genetisch materiaal van het depot NCIMB 41116, het geflankeerd wordt op minder dan 5cM door de AFLP merkers E44/M76-303F,297f en E46/M75-260f.
De term 'gecultiveerde groente Cichorium plant', zoals hierin gebruikt verwijst naar een plant die dankzij veredelingsmethodes ontwikkeld is tot een commerciële groente als witlof andijvie of radicchio. Meer bepaald gaat het hier om een witlof, andijvie of radicchio plant die scheuten (kroppen of bladeren) aanmaken die geschikt zijn voor menselijke of dierlijke consumptie. Bij voorkeur gaan het hier om Cichorium intybus L. of Cichorium endiva L. planten, zoals bijvoorbeeld (maar niet beperkt tot) witlof, roodlof, radicchio (rosette witlof), en andijvie (gecultiveerde andijvie, gekrulde andijvie, breed-bladige andijvie, en smal-bladige andijvie). Desalniettemin worden hieronder ook andere groente Cichorium soorten beoogt zoals bij voorbeeld Cichorium spinosum L..
De hierin beschreven uitvinding heeft betrekking op gecultiveerde groente Cichorium planten, en alle onderdelen hiervan, inclusief (maar niet beperkt tot) de scheuten, cellen (of celculturen) of zaden. Een gecultiveerde groente witlof plant kan zowel een door inteelt verkregen variëteit zijn als een haploïde lijn of een hybride hiervan.
Een mannelijk steriele plant of een plant met een mannelijk steriel fenotype zoals hierin aangehaald verwijst naar een plant die niet in staat is mannelijk fertiele gameten aan te maken en daardoor op zich ook geen zaad kan zetten door zelfbevruchting.
De term 'DNA regio' zoals hierin gebruikt verwijst naar een regio in het nucleair genoom van de plant die, volgens de hierin beschreven uitvinding een locus omvat dat een bepaald kenmerk codeert. Een mannelijk steriliteitslocus (of MS-locus), refereert in het kader van deze uitvinding naar een locus waarvan één of meerdere allelen een genetische factor kunnen bevatten die voor mannelijke steriliteit codeert.
Meer specifiek, wanneer een dergelijk mannelijk steriliteitsallel (f) aanwezig is in het genoom van de plant in homozygote toestand, zal de plant een mannelijk steriel fenotype hebben en dus mannelijk stenel zijn Een dergelijke genetische factor op een
<Desc/Clms Page number 7>
recessief allel dat mannelijke steriliteit codeert kan één of meerdere allelen bevatten van één of meerdere genen, waarbij een plant dat deze genetische factor in homozygote toestand bevat (in afwezigheid van andere beïnvloedende factoren) mannelijk steriel is. Het mannelijk steriel fenotype kan te wijten zijn aan één of meerdere mutaties in één of verschillende (eventueel geclusterde) genen die vereist zijn voor mannelijke fertiliteit bijvoorbeeld voor de productie van fertiele mannelijke gameten.
Het dominant fertiliteitsallel (F), zal, wanneer het aanwezig is in het genoom van de plant, aanleiding geven tot het mannelijk fertiel fenotype.
De term (moleculaire) merker zoals hierin gebruikt verwijst naar een meetbare, genetische eigenschap op een vaste plaats in het genoom, die normaal mendeliaans overerft en die gebruikt kan worden voor het in kaart brengen van een eigenschap waarin men geïnteresseerd is. De aard van de merker is afhankelijk van de moleculaire analysetechniek die gebruikt wordt en kan gedetecteerd worden op DNA, RNA of eiwit niveau. Voor het in kaart brengen van eigenschappen kunnen verschillende in de literatuur beschreven merkers gebruikt worden zoals bijvoorbeeld (maar niet beperkt tot) RFLP, RAPD, AFLP, SNPs of microsatellieten. De geschiktheid van de merkers (probes) wordt bepaald door de methode die gebruikt wordt.
Een AFLP merker wordt volgens standaard terminologie genoemd naar de primer combinatie die gebruikt wordt voor de amplificatie van het karakteriserend DNA fragment (Keygene protocol zoals beschreven door Kuiper en Zabeau 1995, Nucl. Acids Res. 23 :4407-4414) bij voorkeur eveneens door de grootte van het verkregen fragment (of de fragmenten, in het geval van co-dominante merkers) zoals bepaald ten opzichte van de gebruikte standaard (zoals hierna beschreven in de voorbeelden). Het is vanzelfsprekend dat de grootte van deze fragmenten een weinig kan variëren afhankelijk van laboratorium condities en het gebruikte materiaal.
AFLP merkers kunnen omgezet worden in sequentiespecifieke merkers zoals bijvoorbeeld, maar niet beperkt tot 'STS' ("sequenced-tagged-site") of 'SCAR' ("sequencecharacterized-amplified-region") merkers gebruik makend van standaard technologie zoals onder andere beschreven door Meksem et al., 2001 (Mol. Gen. Genomics 265 (2):207-214) of Xu et al , 2001 (Genome 44 (1) Volgens de hienn beschreven uitvinding kan de aanwezigheid van een genetische factor die mannelijke steriliteit codeert in het genoom van een gecultiveerde groente
<Desc/Clms Page number 8>
Cichorium plant aangetoond worden gebruik makend van moleculaire merkers. Bij voorkeur zijn deze merkers co-dominante AFLP merkers, of sequentiespecifieke merkers die hiervan afgeleid zijn.
De term mannelijke steriliteitmerker zoals hierin gebruikt verwijst naar een merker die gekoppeld is aan het MS-locus. Een dergelijke merker kan gekoppeld zijn aan het fertiliteitsallel (F-gekoppeld) of aan het steriliteitsallel (f-gekoppeld) of beide (in het geval van co-dominante merkers of STS-merkers). De 'koppeling' zoals hierin vermeld verwijst naar een genetische afstand tussen de merker en het MS-locus. Bij voorkeur is de merker gelegen op minder dan 20 cM van het MS-locus. Nog liever is de merker gelegen op minder dan 5 cM, en indien mogelijk wordt een voorkeur gegeven aan merkers die gelegen zijn op minder dan 3 cM van het locus.
Een specifieke belichaming van deze uitvinding betreft een DNA regio die een mannelijk steriliteitsallel omvat dat gekenmerkt wordt door merkers die de genetische factor flankeren aanwezig in het genetisch materiaal van het depot NCIMB 41116.
Preferentieel volgens de hierin beschreven uitvinding, kan het MS-locus gevolgd worden in de veredeling van gecultiveerde groente Cichorium door gebruik te maken van moleculaire merkers die gekoppeld zijn aan het MS-locus, bij voorkeur aan het steriliteitsallel van dit locus.
De term introgressie zoals hierin gebruikt verwijst naar de overdracht van een allel van één plantenlijn naar een andere plantenlijn, bij voorkeur van één cultivar naar een andere. Verschillende methodes kunnen door plantenveredelaars gebruikt worden om het gewenste allel in te brengen in een verkozen cultivar. Wanneer uit de kruising van een plant van de gewenste cultivar met een plant van deze uitvinding die een genetische factor bevat die codeert voor mannelijke steriliteit, een plant wordt verkregen met de genetische factor die mannelijke steriliteit codeert, is het meestal nodig om terugkruisingen en/of zelf-kruisingen uit te voeren met deze plant om het ongewenste genetische materiaal te verwijderen en een uniforme lijn te verkrijgen.
Een populatie die wordt aangeduid als "BC" gevolgd door een nummer verwijst naar het aantal terugkruisingen dat uitgevoerd werd om deze populatie te verkrijgen.
<Desc/Clms Page number 9>
VOORBEELDEN 1. Ontwikkeling van een gecultiveerde groente Cichorium plant Een wilde witlof plant (Cichorium intybus L. var. sativus) die mannelijk steriel was werd geïdentificeerd door F. Desprez en "Edith" genoemd. Gecultiveerde mannelijk steriele witlof werd ontwikkeld door deze plant, die als lijn onderhouden werd door vegetatieve vermeerdering, te kruisen met een gecultiveerde witlof variëteit, gevolgd door herhaalde terugkruisingen over verschillende jaren, en zelfbestuiving en selectie op het mannelijk steriel fenotype.
Zaden van een gecultiveerde witlof plant, die de genetische factor die codeert voor mannelijke steriliteit in het genoom bevatten, werden gedeponeerd bij het NCIMB (23 St. Marchar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, UK), op 2 Oktober, 2001 en werden het depot nummer NCIMB 41116 toegewezen.
Het werd bevestigd dat het mannelijk steriliteits fenotype gecodeerd werd door een genetische factor die als een monogeen recessief kenmerk overerft (ff) en dat deze de geschikte kenmerken vertoont in een gecultiveerde witlof achtergrond. Om het veredelingsprogramma in witlof te versnellen en te vereenvoudigen werden moleculaire merkers geïdentificeerd die gekoppeld zijn aan het MS-locus, en meer specifiek aan het mannelijk steriliteitsallel.
2. Koppeling van de merkers aan het mannelijk steriliteitsallel 'Bulked segregant analysis' (BSA) werd uitgevoerd zoals beschreven door Michelmore (Michelmore et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9832).
AFLP werd uitgevoerd volgens het protocol van Keygene (Kuiper en Zabeau 1995, Nucl. Acids Res. 23 :4407-4414). werden geanalyseerd op denaturerende 6% polyacrylamide gels (FMC-LC-6) gebruik makend van de 100bp standaard van Research Genetics Inc. AFLP detectie werd uitgevoerd op een 'LI-cor sequence gel system' (Westburg, Nederland).
<Desc/Clms Page number 10>
Opeenvolgende screenings werden uitgevoerd met 213 AFLP primer combinaties op 2 pools van mannelijk fertiele (8 individuen per pool) en 2 pools van mannelijk steriele individuen (4 individuen per pool) om kandidaat merkers voor het MS-locus te identificeren. 16 kandidaat merkers die gekoppeld zijn aan het fertiliteitsallel (F) werden aangetoond.
Door de aanwezigheid van heterozygote individuen (Ff) in de fertiele pool konden geen merkers aangetoond worden die gekoppeld zijn aan het steriliteitsallel (f).
Koppeling van de 16 merkers werd bepaald op bijkomende pools (4 steriele individuen per pool) afkomstig uit 10 populaties die segregeerden voor mannelijke steriliteit. Van de pools die een recombinatie vertoonden tussen de merkers en het MS-locus werden ook de individuen getest. Een tabel van de score van 3 nauw gekoppelde AFLP merkers op 1 fertiele en 19 steriele pools is weergegeven in Figuur 1. Individuen in de recombinante pools werden getest ; resultaten hiervan worden weergegeven in Figuur 2. Co-dominante AFLP merkers werden geïdentificeerd als geprefereerde merkers. De co-dominante merker E33/M48-272F,273f werd gelocaliseerd op ongeveer 4.5cM van het mannelijk steriliteitsallel.
Om merkers te identificeren die nog dichter bij het steriliteitsallel gelocaliseerd zijn, werd een tweede BSA screening uitgevoerd. Er werden pools aangemaakt van fertiele en steriele individuen die een recombinatie vertoonden tussen het MS-locus en de nauwst gekoppelde merkers zoals hierboven beschreven. 256 nieuwe primer combinaties werden getest en kandidaat-merkers die gekoppeld bleken aan het MSlocus werden gecontroleerd op bijkomende pools. Een selectie hiervan werd nog eens nagekeken op ongeveer 4000 individuen. Een co-dominante merker E44/M76- 303F, 297f gelegen op 1.6cM werd geïdentificeerd.
Verdere identificatie van een merker gekoppeld aan het mannelijk steriliteitsallel Kandidaat merkers gekoppeld aan het mannelijk steriel fenotype werden verkregen uit een BSA screening met twee FF pools, een ff pool en een recombinatie tussen twee merkers flankerend aan het MS-locus. 13 f-gekoppelde kandidaat merkers werden getoetst op verschillende achtergronden in het witlof veredelingsprogramma en op bijkomende pools van fertiele (FF) individuen. De AFLP merkers E46/M75-260f
<Desc/Clms Page number 11>
gelegen op 2.5cM en E36/M78-255f gelegen op 3.0cM van het MS-locus bleken een goede voorspellende waarde te hebben.
Op basis van de resultaten van de verschillende screenings voor F- en f-gekoppelde merkers, werd een genetische kaart opgesteld (Figuur 3). De co-dominante merker
E44/M76 en de f-gekoppelde merker E46/M75 die het MS-locus omspannen werden omgezet tot STS merkers om routine screenings te vergemakkelijken.
3. Bevestiging van de afwezigheid van de moleculaire merker in commerciële witlof variëteiten Om zeker te zijn dat de moleculaire merkers ook nuttig zouden zijn voor het aantonen van het mannelijk steriliteitsallel in de witlof veredeling, werd eerst nagegaan dat zij gebruikt konden worden in verschillende genetische achtergronden, dit wil zeggen dat er geen vals positieve reacties werden waargenomen in commerciële witlof variëteiten.
Hiervoor werden 29 verschillende commerciële witlof variëteiten van verschillende bronnen nagekeken op de aanwezigheid van de f-gekoppelde AFLP merker E44/M76 en de co-dominante E46/M75 AFLP merker. De resultaten worden voorgesteld in Tabel 1. Twee variëteiten waarin het mannelijk steriliteitsallel reeds geïntroduceerd was, werden gebruikt als positieve controles.
Tabel 1: aanwezigheid van de AFLP merkers m commerciële witlof variëteiten
EMI11.1
<tb>
<tb> E44/M76 <SEP> AFLP <SEP> E46/M75 <SEP> AFLP
<tb> Percentage <SEP> negatieve <SEP> scores <SEP> 93% <SEP> 93%
<tb> Percentage <SEP> positieve <SEP> scores <SEP> 0% <SEP> 7%
<tb> Onzekere <SEP> scores <SEP> 7% <SEP> 0%
<tb>
Gebruik makend van de STS merkers afgeleid van de E44/M76 en E46/M75 AFLP merkers, werd aangetoond dat de onzekere scores (voor E44/M76) evenals de positieve scores (voor E46/M75) veroorzaakt werden door banden die toevallig op gelijke hoogte migreerden. De afwezigheid van een STS PCR-product toonde echter aan dat er geen verband was tussen deze banden en het mannelijk steriliteisallel
<Desc/Clms Page number 12>
4. Betrouwbaarheid van de merkers in verschillende genetische achtergronden.
Om de betrouwbaarheid van de merkers in verschillende genetische achtergronden na te gaan werden voor 24 verschillende witlof achtergronden FFxFf kruisingen uitgevoerd, en werden de AFLP merkers E44/M76 en E46/M75 op de nakomelingen nagekeken. De merker E44/M76 bleek bruikbaar in 18 van de 24 achtergronden en de
E46/M75 merker bleek bruikbaar in alle 24 achtergronden die nagekeken werden.
Hieruit kan worden afgeleid dat deze merkers voor de meeste achtergronden aangewend kunnen worden voor de detectie van het mannelijk steriliteitsallel.
5. Introductie van het mannelijk steriliteitkenmerk in andere gecultiveerde groente
Cichorium soorten
Om het mannelijk steriliteitkenmerk binnen te brengen in andijvie en radicchio, werd gecultiveerd witlof, dat het mannelijk steriliteitkenmerk in het genoom bevat, gekruist met respectievelijk een andijvie en radicchio variëteit, en werden de moleculaire merkers gekoppeld aan het mannelijk steriliteitsallel gebruikt om het steriliteitsfenotype gedurende herhaalde terugkruisingen met eigen ouderplanten te volgen.
6. Isolering van de DNA regio coderend voor het mannelijk steriel phenotype in gecultiveerde groente Cichorium.
<Desc / Clms Page number 1>
Title Male sterile vegetable Cichorium and its use for the production of hybrid seed Summary The invention relates to a cultivated vegetable Cichorium plant, which is male sterile due to the presence in the genome of the plant of a recessive allele in a homozygous state, which codes for male sterility. The invention further relates to the use of molecular markers for introducing the male sterility characteristic into parent lines of vegetable Cichorium for the production of hybrid seed.
The content of the references mentioned is enclosed with this in the application.
Background of the invention The production of hybrids is an important objective of many breeding companies. Hybrid varieties (crops) show different advantages for breeders over open pollinated varieties (crops), such as uniformity and heterosis of the properties of both parent lines.
Chicory plants represent significant farming interests. Cichorium intybus is grown for the chicory that is sold as a vegetable (commonly known as chicory) and a coffee substitute is made from the roots. It has also been shown that the roots can be an important source of inulin and can be used to make syrup with a high fructose content.
Because all Cichorium plants have hermaphrodite flowers, considerable investments have already been made in the development of cultivated inbred lines that are more or less self-incompatible The production of hybnden is then achieved by combining parent lines with partial self-incompatibility
<Desc / Clms Page number 2>
and to choose the optimum combination from this in order to obtain the lowest possible percentage of inbred seeds. Due to the difficulties of genetically stabilizing and controlling this trait along with other agronomically important traits, the percentage of inbreeding individuals in a commercial seed lot can vary between 10% and 90%, leading to a heterogeneous crop when harvesting.
To overcome this limitation, a cytoplasmic male sterility system (CMS) has been developed in chicory, based on cross-breeding with wild varieties or by somatic hybridization of chicory protoplast with CMS protoplast of sunflowers (Rambaud et al. 1993, Theoretical and Applied Genetics 87 ( 3): 347-352). However, most CMS systems are not 100% reliable, the cytoplasmic encoded properties can sometimes only be introduced with difficulty in the preferred parent lines and it often leads to the simultaneous transfer of unintended properties associated with them.
The nuclear male sterility system described in PCT publication WO 89/10396 has also been successfully developed for chicory. Male sterile plants were obtained by introducing a gene encoding the ribonuclease barnase that is under the regulatory control of the TA29 promoter that ensures expression in the tapetum cells (Reynaerts et al. 1993, Scientia Horticulturae 55: 125-139). Like all transgenic vegetable projects, however, the profitability of this Cichorium vegetable system will depend on whether the commercial advantage (which is partly determined by the acceptance of GMOs) will outweigh the significant costs of deregulation.
The invention described herein relates to a cultivated male sterile vegetable Cichorium plant, in which the male sterility trait is encoded by a genetic factor that inherits as a single nuclear recessive allele, and to a process for introducing the male sterility trait into different cultivated vegetable Cichorium cultivars. The availability of such a male sterility trait in various vegetable Cichorium cultivars facilitates the production of fully mature seed as well as the development of new varieties.
<Desc / Clms Page number 3>
Summary of the Invention The invention described herein relates to a cultivated vegetable Cichorium plant, or seeds, cells or tissues of this plant, which in the genome contains a DNA region, which contains a genetic factor, which, when present in homozygote condition, makes the plant male sterile. The genetic factor encoding this male sterility phenotype is, in the seed genome of deposit number NCIMB 41116, located between AFLP markers E44 / M76 and E46 / M75 to which it is linked.
The invention also relates to a DNA region which contains a genetic factor which, when present in the genome of the plant in a homozygous state, confers a male sterile phenotype on the plant. The invention further relates to a DNA region which contains a genetic factor, which when present in the genome of the plant in homozygous state confers a male sterile phenotype on the plant, said DNA region being present in the genome of the seeds deposited under deposit number NCIMB 41116 and can be detected herein by molecular markers. More specifically, the genetic factor can be identified by using the AFLP markers E44 / M76 and / or E46 / M75.
The invention described herein further relates to a method of introgression, in a reliable and predictable manner, of the male sterility phenotype, into a preferred cultivated vegetable Cichorium cultivar. The method of this invention includes genetically mapping loci that are associated or linked to a genetic factor that, when present in the genome of the plant in homozygous state, imparts a male sterile phenotype to the plant, and use of these markers to follow the introgression of the male sterility allele in crossings and segregating populations.
The invention is preferably realized in a genetic factor conferring male sterility present in the genome of cultivated Cichorium seed from the deposit filed with the National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCLMB) under deposit
<Desc / Clms Page number 4>
number NCIMB 41116, and that can be identified by AFLP markers E44 / M76 and / or E46 / M75 in the genome of this deposit.
The method of this invention comprises the use of molecular markers for the selection of offspring from a cross between a plant containing in the genome the genetic factor conferring the male sterile phenotype on the plant, with a plant in which this genetic factor is not in the genome is present.
In a specific application of the invention, the introduction of a DNA region containing a genetic factor conferring the male sterile phenotype on the plant in a preferential cultivar is facilitated by repeated backcrossing by breeding using markers, in particular by selection using molecular markers that are linked to the DNA region, such as (but not limited to), the AFLP markers E44 / M76 and E46 / M75, in particular those marked as E44 / M76-303F, 297f and E46 / M75-260f (further specified as E44 / M76-303F, 297f and E46 / M75-260f).
In a further application of the invention described herein, cultivated male sterile vegetable Cichorium plants are obtained by introgression of a DNA region that contains a genetic factor conferring the male sterile phenotype on the plant, using AFLP markers linked to the DNA region of this plant. invention, such as, for example, but not only markers E44 / M76 and E46 / M75.
In a more specific embodiment of the invention, introgression of a DNA region into a preferential cultivar is carried out by crossing a plant of the preferential cultivar with a plant with a plant grown from the seed of the deposit followed by repeated backcrosses with the preferential cultivar, using molecular markers.
According to an additional application of the invention described herein, the genetic material of the seeds deposited as depot number NCIMB 41116 for the identification of loci associated with the DNA region containing a genetic factor conferring a male sterile phenotype on the plant . For use (preferably), the molecular markers are less than 50 cM from the DNA region, preferably the distance is less than 20 cM.
<Desc / Clms Page number 5>
Specific application of the invention are the molecular markers located less than 5 cM of the genetic factor that the male sterile phenotype can confer on the plant.
Figures The following detailed description, given by way of example, but not with the intention of limiting the invention to the specific embodiments described herein, may be clarified by the figures enclosed herein, wherein: Figure 1: Score table of 3 AFLP markers linked to the male sterility allele, 2 of which are dominant F-linked (E35 / M55-183F and E40 / M58-166F) and one is co-dominant (E33 / M48-272F, 273f). The data was obtained on 1 fertile ("F.") and 19 sterile ("ff") pools, are indicated as "+" - band present; = band absent; = doubt score.
Figure 2: Table of 3 AFLP markers on individuals from sterile pools ("ff11" to "ffl9" - see Figure 1) showing a recombination between the male sterility allele and the AFLP markers. The order and distance of the markers are determined based on these results. (gd = no detection) Figure 3: map of the MS locus in chicory based on segregating BC4-BC5 populations of a total of approximately 4000 individuals. Co-dominant markers are underlined, markers linked to the f-allele are framed to make a distinction with the F-linked markers.
Detailed Description The invention described herein relates to a cultivated vegetable Cichornum plant that is male sterile due to the presence in the genome of a male sterility allele in a homozygous state, which is the male sterile phenotype
<Desc / Clms Page number 6>
to the plant. The invention further relates to a cultivated vegetable Cichorium plant, the genome of which contains a male sterility allele which, when present in a homozygous state, imparts a male sterile phenotype to the plant. The male sterility locus (MS locus) is characterized by the fact that in the genetic material of the NCIMB 41116 deposit, it is flanked at less than 5cM by the AFLP markers E44 / M76-303F, 297f and E46 / M75-260f.
The term "cultivated Cichorium plant" as used herein refers to a plant that has been developed, thanks to breeding methods, into a commercial vegetable such as chicory endive or radicchio. More specifically, this is a chicory, endive or radicchio plant that produces shoots (heads or leaves) that are suitable for human or animal consumption. These are preferably Cichorium intybus L. or Cichorium endiva L. plants, such as for example (but not limited to) chicory, red chicory, radicchio (rosette chicory), and endive (cultivated endive, curly endive, broad-leaved endive, and narrow-leaf endive). Nevertheless, other vegetable Cichorium species are also contemplated below, such as, for example, Cichorium spinosum L.
The invention described herein relates to cultivated vegetable Cichorium plants, and all components thereof, including (but not limited to) the shoots, cells (or cell cultures) or seeds. A cultivated vegetable chicory plant can be either a variety obtained by inbreeding or a haploid line or a hybrid thereof.
A male-sterile plant or a plant with a male-sterile phenotype as referred to herein refers to a plant that is unable to produce male-fertile gametes and therefore cannot in itself produce seed through self-fertilization.
The term "DNA region" as used herein refers to a region in the plant's nuclear genome that, according to the invention described herein, comprises a locus encoding a particular characteristic. A male sterility locus (or MS locus), within the scope of this invention, refers to a locus whose one or more alleles may contain a genetic factor encoding male sterility.
More specifically, when such a male sterility allele (f) is present in the genome of the plant in a homozygous state, the plant will have a male sterile phenotype and thus be a male stem. Such a genetic factor on a
<Desc / Clms Page number 7>
recessive allele encoding male sterility may contain one or more alleles of one or more genes, a plant containing this genetic factor in the homozygous state (in the absence of other influencing factors) being male sterile. The male sterile phenotype can be due to one or more mutations in one or several (optionally clustered) genes required for male fertility, for example for the production of fertile male gametes.
The dominant fertility allele (F), when present in the genome of the plant, will give rise to the male fertile phenotype.
The term (molecular) marker as used herein refers to a measurable genetic trait at a fixed location in the genome that normally inherits Mendelian and that can be used to map a trait that one is interested in. The nature of the marker depends on the molecular analysis technique that is used and can be detected at DNA, RNA or protein level. Various markers described in the literature can be used to map properties, such as (but not limited to) RFLP, RAPD, AFLP, SNPs or microsatellites. The suitability of the markers (probes) is determined by the method used.
An AFLP marker is named according to standard terminology after the primer combination used for the amplification of the characterizing DNA fragment (Keygene protocol as described by Kuiper and Zabeau 1995, Nucl. Acids Res. 23: 4407-4414), preferably also by the size of the fragment obtained (or the fragments, in the case of co-dominant markers) as determined with respect to the standard used (as described below in the examples). It goes without saying that the size of these fragments may vary slightly depending on laboratory conditions and the material used.
AFLP markers can be converted into sequence-specific markers such as, for example, but not limited to "STS" ("sequenced-tagged site") or "SCAR" ("sequencecharacterized-amplified-region") markers using standard technology as described inter alia. by Meksem et al., 2001 (Mol. Gen. Genomics 265 (2): 207-214) or Xu et al, 2001 (Genome 44 (1) According to the invention described herein, the presence of a genetic factor encoding male sterility in the genome of a cultivated vegetable
<Desc / Clms Page number 8>
Cichorium plant can be demonstrated using molecular markers. Preferably, these markers are co-dominant AFLP markers, or sequence-specific markers derived therefrom.
The term male sterility marker as used herein refers to a marker that is linked to the MS locus. Such a marker may be linked to the fertility allele (F-linked) or to the sterility allele (f-linked) or both (in the case of co-dominant markers or STS markers). The "link" as mentioned herein refers to a genetic distance between the marker and the MS locus. Preferably, the marker is less than 20 cM from the MS locus. Even more preferably, the marker is less than 5 cM, and if possible, preference is given to markers less than 3 cM from the locus.
A specific embodiment of this invention relates to a DNA region comprising a male sterility allele characterized by markers flanking the genetic factor present in the genetic material of the NCIMB 41116 deposit.
Preferably according to the invention described herein, the MS locus can be followed in the breeding of cultivated Cichorium vegetable using molecular markers linked to the MS locus, preferably to the sterility allele of this locus.
The term introgression as used herein refers to the transfer of an allele from one plant line to another plant line, preferably from one cultivar to another. Various methods can be used by plant breeders to introduce the desired allele into a preferred cultivar. When from the intersection of a plant of the desired cultivar with a plant of this invention containing a genetic factor encoding male sterility, a plant is obtained with the genetic factor encoding male sterility, it is usually necessary to perform backcrosses and / or perform self-crossings with this plant to remove the unwanted genetic material and to obtain a uniform line.
A population referred to as "BC" followed by a number refers to the number of backcrosses that were performed to obtain this population.
<Desc / Clms Page number 9>
EXAMPLES 1. Development of a cultivated vegetable Cichorium plant A wild chicory plant (Cichorium intybus L. var. Sativus) that was male sterile was identified by F. Desprez and called "Edith". Cultivated male sterile chicory was developed by crossing this plant, which is maintained as a line by vegetative propagation, with a cultivated chicory variety, followed by repeated backcrosses over several years, and self-pollination and selection on the male sterile phenotype.
Seeds from a cultivated chicory plant, which contain the genetic factor encoding male sterility in the genome, were deposited at the NCIMB (23 St. Marchar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, UK), on October 2, 2001 and became the depot number NCIMB 41116 assigned.
It was confirmed that the male sterility phenotype was encoded by a genetic factor that inherits as a monogenic recessive trait (ff) and that it exhibits suitable traits in a cultivated chicory background. To speed up and simplify the breeding program in chicory, molecular markers were identified that are linked to the MS locus, and more specifically to the male sterility allele.
2. Coupling of the markers to the male sterility allele Bulked segregant analysis (BSA) was performed as described by Michelmore (Michelmore et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9828-9832).
AFLP was performed according to the Keygene protocol (Kuiper and Zabeau 1995, Nucl. Acids Res. 23: 4407-4414). were analyzed for denaturing 6% polyacrylamide gels (FMC-LC-6) using the 100bp standard from Research Genetics Inc. AFLP detection was performed on a 'LI-cor sequence gel system' (Westburg, the Netherlands).
<Desc / Clms Page number 10>
Consecutive screenings were performed with 213 AFLP primer combinations on 2 pools of male fertile (8 individuals per pool) and 2 pools of male sterile individuals (4 individuals per pool) to identify candidate markers for the MS locus. 16 candidate markers linked to the fertility allele (F) were detected.
Due to the presence of heterozygous individuals (Ff) in the fertile pool, no markers could be detected that are linked to the sterility allele (f).
Coupling of the 16 markers was determined on additional pools (4 sterile individuals per pool) from 10 populations that segregated for male sterility. The individuals of the pools that showed recombination between the markers and the MS locus were also tested. A table of the score of 3 closely coupled AFLP markers on 1 fertile and 19 sterile pools is shown in Figure 1. Individuals in the recombinant pools were tested; results of this are shown in Figure 2. Co-dominant AFLP markers were identified as preferred markers. The co-dominant marker E33 / M48-272F, 273f was located at approximately 4.5cM of the male sterility allele.
To identify markers that are located even closer to the sterility allele, a second BSA screening was performed. Pools were made from fertile and sterile individuals who showed recombination between the MS locus and the most closely linked markers as described above. 256 new primer combinations were tested and candidate markers that were found to be linked to the MSlocus were checked for additional pools. A selection of these was checked again at around 4000 individuals. A co-dominant marker E44 / M76-303F, 297f located at 1.6cM was identified.
Further identification of a marker linked to the male sterility allele Candidate markers linked to the male sterile phenotype were obtained from a BSA screening with two FF pools, an ff pool and a recombination between two markers flanking the MS locus. 13 f-linked candidate markers were tested on different backgrounds in the chicory breeding program and on additional pools of fertile (FF) individuals. The AFLP markers E46 / M75-260f
<Desc / Clms Page number 11>
located at 2.5cM and E36 / M78-255f located at 3.0cM of the MS locus were found to have good predictive value.
A genetic map was drawn up based on the results of the different screenings for F and f linked markers (Figure 3). The co-dominant marker
E44 / M76 and the f-linked marker E46 / M75 spanning the MS locus were converted to STS markers to facilitate routine screenings.
3. Confirmation of the absence of the molecular marker in commercial chicory varieties. To be sure that the molecular markers would also be useful for detecting the male sterility allele in the chicory breeding, it was first investigated that they could be used in different genetic backgrounds. , that is, no false positive responses were observed in commercial chicory varieties.
For this, 29 different commercial chicory varieties from different sources were checked for the presence of the f-linked AFLP marker E44 / M76 and the co-dominant E46 / M75 AFLP marker. The results are presented in Table 1. Two varieties in which the male sterility allele had already been introduced were used as positive controls.
Table 1: presence of the AFLP markers with commercial chicory varieties
EMI11.1
<tb>
<tb> E44 / M76 <SEP> AFLP <SEP> E46 / M75 <SEP> AFLP
<tb> Percentage <SEP> negative <SEP> scores <SEP> 93% <SEP> 93%
<tb> Percentage <SEP> positive <SEP> scores <SEP> 0% <SEP> 7%
<tb> Uncertain <SEP> scores <SEP> 7% <SEP> 0%
<tb>
Using the STS markers derived from the E44 / M76 and E46 / M75 AFLP markers, it was shown that the uncertain scores (for E44 / M76) as well as the positive scores (for E46 / M75) were caused by tires that happened to be at the same level. migrated. However, the absence of an STS PCR product showed that there was no relationship between these bands and the male sterile allele
<Desc / Clms Page number 12>
4. Reliability of the markers in different genetic backgrounds.
To check the reliability of the markers in different genetic backgrounds, FFxFf crosses were performed for 24 different chicory backgrounds, and the AFLP markers E44 / M76 and E46 / M75 were checked on the offspring. The E44 / M76 marker was found to be useful in 18 out of 24 backgrounds and the
E46 / M75 marker was found to be useful in all 24 backgrounds that were checked.
From this it can be deduced that for most backgrounds these markers can be used for the detection of the male sterility allele.
5. Introduction of the male sterility characteristic in other cultivated vegetables
Cichorium species
To introduce the male sterility trait into endive and radicchio, cultivated chicory containing the male sterility trait in the genome was crossed with an endive and radicchio variety, respectively, and the molecular markers coupled to the male sterility allele were used to repeat the sterility phenotype during repeated follow back crossings with own parent plants.
6. Isolation of the DNA region coding for the male sterile phenotype in cultivated Cichorium vegetable.