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Dispositif d'essai pour la détermination d'analytes dans un produit laitier liquide.
La présente invention se rapporte à un dispositif d'essai pour la détermination d'analytes dans un produit laitier liquide tel que le lait. Elle concerne également un procédé permettant la détection et la quantification d'analytes dans le lait grâce à ce dispositif d'essai ainsi qu'une trousse d'essai comprenant ce dispositif d'essai.
A l'heure actuelle, les exigences sanitaires de nombreux pays imposent de contrôler régulièrement la présence de diverses substances dans les produits laitiers, tels que médicaments vétérinaires et hormones, couramment utilisés dans l'élevage du bétail. Pour des raisons médicales évidentes, ces substances doivent être évitées dans les produits laitiers destinés à la consommation humaine.
Dans d'autres cas, il est souhaitable de disposer de tests permettant de détecter la présence de substances endogènes dans le lait afin d'optimiser les pratiques d'élevage du bétail. En particulier, la détermination rapide du taux d'hormones dans le lait permet d'identifier facilement les périodes propices à la reproduction.
Dans d'autres cas encore, on recherche des méthodes pratiques et fiables pour contrôler l'origine des produits laitiers dérivés des laits de diverses espèces animales.
On recherche alors des méthodes qui permettraient d'identifier la présence de protéines caractéristiques du lait de certaines espèces par rapport à d'autres.
Par ailleurs, divers tests sont connus dans la littérature pour la détection d'analytes dans des liquides biologiques. Ces tests utilisent généralement des méthodes de détection faisant appel à un agent de reconnaissance (récepteur ou anticorps) qui reconnaît spécifiquement l'analyte ou un analogue de cet analyte, et à un agent de marquage (radioélément, enzyme, agent fluorescent, etc. ) ci-après dénommés réactifs de détection. En fonction des éléments choisis, on parlera de radioimmunoessai (RIA), de radiorécepteuressai (RRA), d'enzymeimmunoessai (EIA) etc. Dans leur principe général, ces tests font appel à la combinaison minimale des deux éléments précités (réactifs de détection) qui permettra d'obtenir un résultat dont la valeur est une indication de la quantité d'analyte présent.
Il convient de remarquer qu'en fonction de la méthode de détection choisie, l'agent de marquage peut être couplé soit à l'agent de reconnaissance soit à l'analyte ou à une substance analogue de l'analyte du point de vue de sa reconnaissance par l'agent de reconnaissance. Il existe également des procédés dans lesquels l'agent de reconnaissance ou l'analyte ou la substance analogue de l'analyte contient intrinsèquement l'agent de marquage (par exemple un analyte marqué radioactivement).
Pour les produits laitiers, les tests de détection d'analytes les plus couramment décrits concernent la détection d'antibiotiques.
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Le brevet US 4. 239. 852 décrit un procédé microbiologique pour la détection d'antibiotiques à noyau p-lactame dans le lait. Selon ce procédé, l'échantillon de lait est incubé, d'une part, en présence de parties de cellules d'un micro-organisme très sensible aux antibiotiques, en particulier Bacillus stearothermophilus, et, d'autre part, en présence d'un antibiotique marqué par un élément radioactif ou par une enzyme.
L'incubation est menée dans des conditions permettant aux antibiotiques éventuellement présents dans l'échantillon et à l'antibiotique marqué de se lier aux parties de cellules.
Après incubation, les parties de cellules sont séparées du mélange, puis lavées.
Ensuite, la quantité d'antibiotique marqué lié aux parties de cellules est déterminée et comparée à un standard. La quantité d'antibiotique marqué lié aux parties de cellules est inversement proportionnelle à la concentration d'antibiotique présent dans l'échantillon de lait analysé.
Ce procédé requiert des manipulations relativement délicates, notamment lors de la séparation des parties de cellules du mélange. En outre, dans sa version la plus sensible, ce procédé utilise un antibiotique marqué par un élément radioactif (14C ou 1251). Dans ce cas, la détermination de la quantité d'antibiotique éventuellement présent dans le lait nécessite d'avoir recours à un appareil spécial, comme par exemple un compteur à scintillation. De plus, la manipulation de produits radioactifs, même en très faibles quantités n'est pas totalement exempte de danger pour la personne qui effectue l'analyse.
La demande de brevet européen 593.112 décrit une autre méthode permettant la détection d'antibiotiques dans le lait. Cette méthode utilise une protéine isolée à partir d'un microorganisme sensible aux antibiotiques, tel que Bacillus stearothermophilus.
Cette protéine est en outre marquée par une enzyme telle qu'une peroxydase.
Le test procède de la manière suivante : un échantillon de lait est incubé dans un tube en présence de la protéine marquée ; après incubation, le lait est transféré dans un second tube sur les parois duquel un antibiotique de référence a été immobilisé ; on procède à une seconde incubation, puis le contenu du tube est éliminé ; les parois de ce second tube sont lavées trois fois au moyen d'une solution de lavage, qui est ellemême éliminée, puis les résidus présents dans le second tube sont transférés sur un papier absorbant ; on ajoute alors un substrat colorant dans le second tube qui est incubé une nouvelle fois, puis on ajoute une solution arrêtant le développement de la couleur ; la coloration du tube est comparée à la coloration d'un test identique effectué parallèlement sur un échantillon standard d'antibiotique.
La quantité de protéine marquée immobilisée sur le support, et donc, l'intensité de la coloration, est inversement proportionnelle à la quantité d'antibiotique présent dans l'échantillon de lait analysé.
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Selon l'exemple 1 de cette demande de brevet, ce test permet de détecter la pénicilline G jusqu'à des concentrations de l'ordre de 5 ppb et permet la détection de l'amoxicilline (5 ppb), de l'ampicilline (10 ppb), de la cephapirine (5 ppb) et du ceftiofur (5 ppb).
Toutefois, le test est assez fastidieux à mettre en oeuvre, en particulier par du personnel non qualifié. En effet, ce test comporte de nombreuses étapes, y compris des étapes de transvasement de liquide et de résidus et plusieurs étapes de rinçage.
Etant donné le nombre et le type d'étapes requises dans ce test, l'obtention d'un résultat fiable dépend fortement du savoir-faire expérimental de l'exécutant.
En outre, l'interprétation du résultat nécessite de faire deux tests en parallèle, ce qui multiplie et complique encore les opérations.
On connaît également d'autres types de procédés enzymatiques permettant de déterminer de faibles concentrations d'antibiotiques dans le lait (J. M. FRERE et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18 (4), 506-510 (1980) ainsi que les brevets
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EP 85. 667 et EP 468. 946) qui sont basés sur l'utilisation d'une enzyme spécifique, en l'occurrence, la D-alanyl-D-alanine-carboxypeptidase exocellulaire soluble, qui est produite par Actinomadura R39 (ci-après désignée enzyme R39"). L'enzyme R39 possède une activité spécifique d'hydrolyse des groupements D-alanyl-D-alanine de divers peptides et est également capable d'hydrolyser des thioester particuliers.
En outre, l'enzyme R39 réagit avec les antibiotiques à noyau P-Iactame pour former très rapidement un complexe enzyme-antibiotique équimolaire, inactif et sensiblement irréversible.
Dans la version la plus récente de ce test (EP 468.946), un volume déterminé d'un échantillon du liquide à examiner est incubé avec une quantité prédéterminée de l'enzyme R39 dans des conditions permettant à l'antibiotique-lactame éventuellement présent dans l'échantillon de réagir avec l'enzyme pour former un complexe enzyme-antibiotique équimolaire, inactif et sensiblement irréversible.
Ensuite, une quantité déterminée de substrat de type thioester est incubée avec le produit obtenu au premier stade dans des conditions permettant l'hydrolyse du substrat par l'enzyme R39 résiduelle qui n'a pas été complexée avec l'antibiotique lors de la première incubation. La quantité d'acide mercaptoalcanoïque ainsi formée est alors déterminée par dosage colorimétrique à l'aide d'un réactif capable de produire une coloration par réaction avec le groupe SH libre de l'acide mercaptoalcanoïque.
L'intensité de la coloration est comparée à un étalon, préalablement établi à partir d'échantillons contenant des quantités connues d'antibiotiques. La détermination quantitative peut se faire par mesure au spectrophotomètre ; dans le cas du lait, la clarification préalable de l'échantillon peut s'avérer nécessaire.
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Clairement, ce test comporte moins d'étapes et est plus simple à mettre en oeuvre que le test décrit dans la demande de brevet EP 593.112. Toutefois, il est limité à la détection d'antibiotiques à noyau ss-lactame, et ce, jusqu'aux seuils limites de détection accessibles avec l'enzyme R39. Tel quel, ce test ne peut pas être utilisé avec d'autres récepteurs d'antibiotiques, et ne peut pas directement servir de base pour la détection d'autres analytes dans le lait.
Puisque les tests actuels présentent encore divers inconvénients, la demanderesse s'est fixé comme objectif de rechercher de nouvelles méthodes pour la détection d'analytes dans les produits laitiers liquides, les méthodes recherchées devant permettre la détermination fiable de différents types d'analytes, de préférence au moment de la collecte à la ferme. La demanderesse a donc recherché une méthode qui permette très rapidement d'obtenir un résultat fiable en un nombre limité d'étapes simples, ne requérant pas de savoir-faire expérimental particulier. En outre, la demanderesse a recherché une méthode fournissant un résultat facilement détectable visuellement et pouvant en outre faire l'objet d'une quantification par mesure instrumentale.
La demanderesse vient maintenant de découvrir que ces objectifs peuvent être atteints grâce à l'utilisation d'un nouveau dispositif d'essai permettant de déterminer aisément la présence d'analytes dans les produits laitiers liquides, en particulier, le lait.
C'est pourquoi la présente invention concerne un dispositif d'essai permettant de détecter la présence d'analytes dans un produit laitier liquide par migration capillaire dudit produit laitier. Le dispositif d'essai selon l'invention comprend un support solide (1) qui possède une première et une seconde extrémité, sur lequel sont fixées, successivement, en partant de la première extrémité, une membrane (2) permettant la purification du liquide analysé, une membrane (3) sur laquelle une ou plusieurs substances de capture sont immobilisées, et - une membrane (4) absorbante.
Selon un mode d'implémentation particulier de l'invention, le dispositif d'essai selon la présente invention possède en outre une membrane (5) sur laquelle au moins un réactif de détection a été déposé, ce réactif de détection étant capable de se solubiliser rapidement en présence dudit produit laitier. Selon ce mode d'implémentation particulier, la membrane (5) doit être située avant la membrane (3).
Elle peut être située, par exemple, soit avant la membrane (2) à la première extrémité du dispositif, soit entre la membrane (2) et la membrane (3) ou encore en dessous ou au dessus de la membrane (2).
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Les différentes membranes présentes dans le dispositif d'essai selon la présente invention se superposent à leurs extrémités de manière à assurer la migration continue du produit laitier d'une zone à l'autre. De préférence, la membrane (3) est placée de manière à ce que son extrémité proximale soit placée en dessous de la membrane (2) et son extrémité distale en dessous de la membrane (4). Les membranes peuvent éventuellement être maintenues en contact les unes avec les autres grâce à un film plastique adhésif (6). Dans ce cas, le film plastique adhésif est choisi de manière à ne pas affecter la migration du liquide sur le dispositif d'essai.
L'option de couvrir le dispositif d'essai par un film plastique adhésif présente deux avantages : il assure un contact parfait à la superposition des membranes et constitue un film protecteur. Le film plastique adhésif (6) peut soit recouvrir complètement les membranes (2), (3), (4) et (5), soit recouvrir partiellement les membranes individuelles. De préférence, le film plastique adhésif (6) ne recouvre pas les premiers millimètres de la première extrémité de manière à permettre une migration plus rapide du liquide sur la membrane (2) du dispositif d'essai.
Les Figures 1 à 3 illustrent des exemples de dispositifs d'essai selon la présente invention. Les Figures la, 2 et 3 présentent des vues frontales et la Figure 1 b présente une vue en section longitudinale.
Le support solide (1) présent dans le dispositif d'essai selon la présente invention est en verre ou en matière plastique, de préférence, en matière plastique.
Dans le cas d'un support en matière plastique, son épaisseur est généralement comprise entre 0,05 et l mm, de préférence entre 0,1 et 0,6 mm. Les membranes sont fixées sur le support solide (1) grâce à un adhésif.
La membrane (2) peut être de différents types, pour autant qu'elle soit capable de retenir les substances présentes dans le produit laitier qui empêchent la migration sur le dispositif d'essai des analytes éventuellement présents dans le produit laitier et des réactifs de détection utilisés selon la méthode pratiquée. Toutefois, la membrane (2) ne doit pas empêcher la migration des analytes et réactifs de détection, et doit préserver leurs activités lors de cette migration. Des exemples non limitatifs de membranes permettant d'obtenir ce résultat selon l'invention sont : Cytosep, Leukosorb ou Loprosorb (disponibles chez Pall Gelman Sciences), Primecare (disponible chez Primecare, n. v) ou Rayon Non-woven 5S (disponible chez Schleicher & Schuell), de préférence, Leukosorb.
Quant à sa dimension, la membrane (2) doit être suffisamment longue pour permettre l'élimination de toutes les substances présentes dans le produit laitier qui empêchent la migration des analytes et réactifs de détection sur le dispositif d'essai.
La membrane (3) doit permettre d'immobiliser une ou plusieurs substances de capture et doit permettre la migration d'un flux de liquide approprié pour le type
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d'application visé ici.. De préférence, la membrane (3) est consolidée sur un support non poreux de type polyester.
Des exemples non limitatifs de membranes convenant selon la présente invention sont : les membranes en nitrocellulose à haute porosité telles que les membranes Hi-Flow (disponibles chez Millipore), les membranes en nitrocellulose de type AE100-12m, AE99-8m, AE-S110 (disponibles chez Scleicher & Schuell), les membranes de nitrocellulose de 5,0 j. lm et 8,0 j. lm (disponibles chez Whatman), les membranes Biodyne, immunodyne, loprodyne (disponibles chez Pall Gelman Sciences), les membranes Immunopore Lateral Flow (disponibles chez Coming Costar Corporation), la membrane de nitrocellulose CNPF 10 (disponible chez Adanced Micro Devices) ou encore la membrane en nylon LPNPG CG 3R (disponible chez Pall Gelman Sciences). De préférence, on utilise une membrane Hi-Flow (Millipore).
Une ou plusieurs substances de capture sont immobilisées sur la membrane (3). Le type de substance de capture immobilisée dépend bien entendu de la méthode pratiquée pour la détection des analytes ; les substances de capture sont capables d'immobiliser sélectivement au moins un des constituants présents dans le liquide migrant sur le dispositif d'essai, tel que l'un des réactifs de détection ou le produit résultant de la formation d'un complexe entre l'analyte ou une substance analogue de cet analyte et au moins un réactif de détection ou encore, le produit résultant de la formation d'un complexe entre plusieurs réactifs de détection. La substance de capture peut aussi être un des réactifs de détection.
Les substances de capture sont placées de manière concentrée sur une portion ou plusieurs portions bien délimitées de la membrane (3), telles que des disques ou des bandes minces, ou tout autre motif approprié pour l'application. Quel que soit le motif choisi, il doit permettre d'obtenir une lecture claire du résultat.
Quant à sa dimension, la membrane (3) doit être d'une longueur suffisante pour contenir toutes les substances de capture utilisées, et ce, dans l'ordre et dans les quantités requises selon la méthode de détection pratiquée.
Le type de membrane utilisé pour la membrane (4) importe peu, pour autant que celle-ci soit capable d'absorber et stocker le liquide après son passage sur les membranes précédentes. La membrane (4) est de dimension suffisamment grande pour permettre d'absorber le liquide après son passage sur la membrane (3), mais aussi, d'un point de vue pratique, pour permettre une prise manuelle plus aisée du dispositif d'essai.
Eventuellement, le dispositif d'essai selon la présente invention peut comprendre une membrane (5) sur laquelle au moins un réactif de détection a été déposé. La membrane (5) doit permettre la migration du produit laitier, tout en permettant la solubilisation et le relargage du (ou des) réactif (s) de détection lors du passage du flux de produit laitier.
Des exemples non limitatifs de membranes pouvant
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convenir à cet effet sont : les membranes à base de résines en fibre de verre telles que les membranes T5NM (disponibles chez Millipore), les membranes F075-14 ou F075-17 ou GF/C (disponibles chez Whatman) la membrane Cytosep 1663 (disponible chez Pall
Gelman Sciences), les membranes à base de résines en fibres de polyester telles que les membranes Accuwick (disponible ches Pall Gelman Sciences) ou encore le papier cellulosique 3 mm (disponibles chez Whatman). De préférence, on utilise une membrane à base de résines en fibres de polyester telle que les membranes Accuwick.
La membrane (5) a une longueur suffisante pour supporter la quantité de réactif de détection désirée.
Les dispositifs d'essai selon la présente invention sont fabriqués par les méthodes connues de l'homme du métier. On peut par exemple préparer des cartes grâce a des laminateurs disponibles dans le commerce. Les substances de capture utilisées sont déposées sur la membrane (3) sous la forme de solutions, avant ou après l'assemblage des cartes. Le dépôt de ces solutions peut être réalisé de manière très précise grâce à des appareillages disponibles dans le commerce, tel que le Dispenser XY Platform Biojet Quanti-3000 de Bio Dot, Inc. Ces solutions déposées sont aussitôt évaporées, par exemple, en plaçant la carte sous un flux d'air chaud. Pour la production à grande échelle, on peut également préparer des rouleaux.
Ensuite, les cartes et rouleaux portant les substances de capture désirées sont découpées en lamelles, chacune de ces lamelles constituant un dispositif d'essai selon l'invention.
Lorsque le dispositif d'essai comprend une membrane (5), le (s) réactif (s) de détection peut (vent) y être déposé (s) avant l'assemblage des cartes ou rouleaux, par simple immersion de la membrane (5) dans une solution contenant lets) réactif (s) de détection. Alternativement, il peut (vent) être déposé (s) après assemblage des cartes ou rouleaux par une technique analogue à celle utilisée pour le dépôt des substances de capture sur la membrane (3).
Dans une variante de l'invention, le dispositif est placé dans un boîtier plastique qui présente deux ouvertures : la première, en forme de cuvette, est placée juste au-dessus de la membrane (2), et permet de recevoir le liquide à analyser ; la seconde est une fenêtre d'ouverture permettant de visualiser le résultat sur la membrane (3). Dans ce cas, le dispositif d'essai ne comprend pas de film plastique adhésif (6).
Le dispositif d'essai selon la présente invention permet de détecter la présence d'analytes dans un produit laitier liquide, en particulier le lait.
C'est pourquoi la présente invention concerne également un procédé pour la détection d'analytes dans un produit laitier liquide, utilisant un dispositif d'essai selon la présente invention ainsi que des réactifs de détection, comprenant les étapes suivantes :
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a) la mise en contact d'un volume déterminé de produit laitier avec le dispositif d'essai selon la présente invention, cette mise en contact ayant lieu à la première extrémité du dispositif d'essai, b) la migration par capillarité du produit laitier sur le dispositif d'essai de manière à ce que les analytes et les réactifs de détection éventuellement présents dans le produit laitier passent progressivement sur la membrane (2), puis la membrane (3), et de manière à ce que les constituants du produit laitier qui ne sont pas arrêtés par les membranes (2) et (3)
aboutissent dans la membrane (4), et c) la détermination d'une fixation sur la membrane (3).
Le procédé selon la présente invention permet de détecter des analytes dans un produit laitier liquide, par exemple du lait, du petit lait, du lait battu,... La présente invention s'adresse plus particulièrement à la détection d'analytes tels que médicaments vétérinaires, hormones ou protéines susceptibles d'être présents dans le lait.
Les réactifs de détection utilisés selon le procédé de l'invention peuvent varier en nombre et en nature en fonction du mode d'implémentation de l'invention, luimême basé sur la méthode de détection pratiquée. Le procédé selon l'invention utilise au moins deux réactifs de détection. Le premier réactif de détection est un agent de reconnaissance capable de reconnaître spécifiquement l'analyte, et sera ci-après dénommé "Identifiant". Le second réactif de détection est un agent de marquage, et sera ci-après dénommé "Marqueur". Il convient de remarquer qu'en fonction du mode d'implémentation choisi, certains réactifs de détection peuvent être présents sur la membrane (3) ou sur la membrane (5).
En fonction de l'analyte à détecter et des réactifs de détection utilisés, il peut s'avérer nécessaire d'ajouter un ou plusieurs réactifs de détection avant l'étape de mise en contact du produit laitier avec le dispositif d'essai selon l'invention et de maintenir ce mélange dans des conditions d'incubation permettant la formation d'un complexe entre des réactifs de détection et l'analyte ou une substance analogue de l'analyte. En fonction de la méthode choisie, l'Identifiant et le Marqueur peuvent être couplés entre eux ou peuvent n'être qu'une seule et même substance. D'autre part, il peut y avoir plusieurs Identifiants et/ou Marqueurs.
L'Identifiant permet de détecter la présence du type d'analyte recherché grâce à sa capacité à reconnaître spécifiquement cet analyte ou une substance analogue de cet analyte. Il peut s'agir d'un récepteur capable de former sélectivement un complexe stable et essentiellement irréversible avec l'analyte ou une substance analogue de
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l'analyte ou d'un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique de l'analyte ou d'une substance analogue de l'analyte.
Pour la détection d'antibiotiques, l'identifiant peut être choisi parmi des anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques ou parmi les
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récepteurs obtenus à partir de microorganismes sensibles aux antibiotiques, tels que les récepteurs obtenus à partir des espèces Bacillus (Bacillus stearothermophilus, Bacillussubtilis. BaciIIus licheniformis....) Streptococcus (Streptococcus thermophilus,...), Actinomycètes (Actinomadura R39,...).
Le second type de réactif de détection utilisé est un Marqueur qui permet de visualiser et de quantifier directement ou indirectement la présence des analytes dans le produit laitier. Les Marqueurs utilisables selon l'invention peuvent être particulaires, fluorescents, radioactifs, luminescents ou enzymatiques. On choisit de préférence un Marqueur particulaire qui fournit un signal visuel aisément détectable, même lorsque celui-ci est présent en faible quantité. A titre d'exemples non limitatifs, on citera les particules colloïdales métalliques (platine, or, argent, etc. ), les particules colloïdales de sélénium, carbone, soufre, tellure ou encore les particules colloïdales de latex synthétiques colorés.
Les particules d'or colloïdal ayant un diamètre particulaire compris entre 1 et 60 nm sont particulièrement préférées : elles fournissent une coloration rose-rouge intense aisément détectable.
Le Marqueur permet de déterminer la présence de l'analyte dans l'échantillon de produit laitier grâce à son couplage à un ou plusieurs réactifs de détection, à l'analyte ou à une substance analogue de l'analyte.
Le couplage entre le Marqueur et le réactif de détection peut être réalisé selon les méthodes connues de l'homme du métier. Lorsqu'on utilise un Marqueur particulaire, le marquage peut avoir lieu soit par adsorption directe sur les particules, soit indirectement, par le biais d'un bras d'ancrage chimique, tel qu'un complexe biotine/anti-biotine, par exemple. Ce couplage peut avoir lieu, soit avant l'étape de mise en contact du produit laitier avec le dispositif d'essai selon l'invention, soit pendant la migration du produit laitier sur le dispositif d'essai selon l'invention.
Selon un mode d'implémentation particulier de l'invention, on utilise un troisième type de réactif de détection, ci-après dénommé "Référence". Il s'agit d'une substance ajoutée en quantité connue à l'échantillon analysé, et qui se fixe sur une substance de capture spécifique immobilisée sur la membrane (3). La Référence fournit une bande dont l'intensité sert de référence pour la quantification de l'analyte.
En ce qui concerne la mise en contact du produit laitier avec le dispositif d'essai selon l'invention (étape a) du procédé), elle est réalisée en plaçant le dispositif d'essai selon la présente invention dans un récipient au fond duquel se trouve l'échantillon à analyser. Le dispositif d'essai est placé essentiellement verticalement dans le récipient, de manière à ce que la première extrémité du dispositif soit en contact avec le mélange.
Dans la variante de l'invention utilisant un dispositif d'essai placé dans un boîtier plastique, celui-ci est disposé horizontalement et la mise en contact s'effectue
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en déposant un aliquot d'échantillon à analyser dans l'ouverture en forme de cuvette placée au-dessus de la membrane (2).
Pour l'étape de migration b), on laisse migrer le liquide par capillarité sur le dispositif d'essai selon l'invention. Le liquide qui migre par capillarité sur le dispositif d'essai selon l'invention rencontre tout d'abord la membrane (2) qui permet de retenir les substances présentes dans le produit laitier qui empêchent la migration des analytes éventuellement présents dans le produit laitier et réactifs de détection sur le dispositif d'essai. Les analytes et les réactifs de détection migrent ensuite sur la membrane (3) sur laquelle une ou plusieurs substances de capture ont été immobilisées. Les substances de capture immobilisent sélectivement au moins un des constituants présents dans le liquide analysé.
Selon un mode d'implémentation particulier de l'invention, on utilise une substance de capture placée en fin de parcours de migration du liquide sur la membrane (3) qui est capable de fixer tous les Marqueurs qui n'ont pas été arrêtés par les substances de capture précédentes. Cette substance de capture permet de compléter les informations quantitatives fournies par les substances de capture précédentes.
La détermination d'une fixation sur la membrane (3) (étape c) du procédé) s'effectue simplement en déterminant la présence de Marqueurs dans cette zone.
Cette détermination est possible simplement visuellement. Toutefois, si l'on désire avoir une mesure précise de l'intensité des signaux observés, on peut avoir recours à un appareil capable de mesurer l'intensité du signal observé. Lorsqu'on utilise une Référence, elle est fixée par une substance de capture spécifique qui fournit une référence interne pour la mesure de l'intensité des signaux observés.
L'interprétation du résultat obtenu dépend de la méthode de détection pratiquée, à savoir, des réactifs de détection et substances de capture utilisées.
Par rapport aux procédés de détection d'analytes dans le lait précédemment décrits dans la littérature, le procédé selon la présente invention présente les avantages suivants. En premier lieu, ce procédé est très rapide et extrêmement simple à mettre en oeuvre : il comporte essentiellement deux étapes de manipulation aisée, ne requérant pas de savoir-faire expérimental particulier. Ensuite, l'appréciation qualitative et quantitative du résultat est immédiate et ne nécessite pas d'opérations supplémentaires particulières, telles que celles requises lorsque la détection est effectuée par des colorants et/ou marqueurs enzymatiques. En outre, ce procédé est directement applicable pour la détection de différents types d'analytes.
Enfin, dans le mode d'implémentation utilisant une Référence, le résultat est directement interprétable et quantifiable, sans qu'il soit nécessaire d'avoir recours à un ou plusieurs tests de référence.
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La présente invention concerne aussi une trousse d'essai pour la détection d'analytes dans un produit laitier comprenant un dispositif d'essai selon la présente invention. Le cas échéant, la trousse d'essai selon la présente invention peut également contenir les réactifs de détection à ajouter à l'échantillon avant la mise en contact du produit laitier avec le dispositif d'essai.
Les exemples qui suivent illustrent différents aspects et modes d'implémentation de la présente invention sans toutefois en limiter sa portée.
Exemple 1. Fabrication des dispositifs d'essai. Modes opératoires généraux.
1.1. Assemblage de cartes membranaires.
Des cartes ayant une taille de 300 x 76,2 mm sont d'abord assemblées au moyen d'un laminateur de type Chlamshell Laminator (disponible chez Bio Dot, Inc. ) selon la méthode suivante :
On découpe un rectangle de support plastique de type ArCare 8565 (disponible chez Adhesive Research) de dimension 300 x 76,2 mm (support solide (1)). On découpe ensuite un rectangle de membrane Leukosorb LK4 (disponible chez Pall Gelman Sciences) de dimension 300 x 20 mm (membrane (2)), un rectangle de membrane Hi-Flow SX (disponible chez Millipore) de dimension 300 x 25 mm (membrane (3)), un rectangle de membrane de cellulose 3 mm (disponible chez Whatmann) de dimension 300 x 40 mm (membrane (4)) et un rectangle de membrane Accuwick (disponible chez Pall Gelman Sciences) de dimension 300 x 0,8 mm (membrane (5)).
On loge successivement les membranes (2) et (4), puis (5), puis (3) dans un emplacement spécifique du moule inférieur du laminateur. Le support solide (1) recouvert d'adhésif est quant à lui maintenu dans le couvercle de l'appareil, le côté adhésif étant exposé à l'air. Les membranes logées dans le moule inférieur sont mises en contact avec le support adhésif en refermant le laminateur ; les membranes sont maintenues exactement en place au moyen d'une succion d'air réalisée par une pompe à vide. Lorsque le vide est rompu, on récupère une carte constituée du support solide (1) sur lequel les membranes (2), (3), (4) et (5) sont fixées.
1.2. Dépôt des substances de capture sur la membrane (3).
Le dépôt des substances de capture sur la membrane (3) est effectué avant ou après l'assemblage selon l'exemple 1.1.
On prépare une solution aqueuse contenant la substance de capture. Elle est déposée sur la membrane (3) de la carte membranaire préparée à l'exemple 1.1. au moyen d'un"Dispenser"de type X-Y Platform Biojet Quanti-3000 de Bio Dot, Inc.
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Les solutions déposées sont immédiatement évaporées en plaçant l'ensemble de la carte pendant une minute sous un air pulsé chaud à 60 C.
1.3. Dépôt de la substance de marquage sur la membrane (5). a) Avant l'assemblage selon l'exemple 1.1.
On prépare une solution aqueuse contenant la substance de marquage. La membrane (5) est immergée dans cette solution. Elle est ensuite égouttée, puis séchée une nuit à température ambiante sous un vide de 0,5 bar. b) Après l'assemblage selon l'exemple 1.1.
On procède selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1.2. pour le dépôt des substances de capture.
1.4. Dépôt du film plastique adhésif (6).
On découpe un rectangle de film adhésif du type ArCare 7759 (disponible chez Adhesive Research) de dimension 300 x 20 mm pour un recouvrement partiel, et 300 x 71,2 mm pour un recouvrement de toutes les membranes.
La carte obtenue selon l'exemple 1.1. est placée dans le moule inférieur d'un laminateur et le film adhésif est placé dans le couvercle du laminateur, le côté adhésif étant exposé à l'air. Le film plastique adhésif est mis en contact avec la carte membranaire lors de la fermeture de l'appareil.
1.5. Découpe en lamelles.
Les cartes obtenues après assemblage sont découpés en lamelles à l'aide d'un appareil de type guillotine ou à l'aide d'un appareil rotatif (disponible chez Bio Dot, Kinematic ou Akzo). Les lamelles des extrémités sont écartées, les autres lamelles étant prêtes à l'emploi.
Pour leur conservation, les dispositifs d'essai sont placés dans un récipient opaque et hermétique en présence d'un agent dessicant (Silgelac, France).
1.6. Présentation dans un carter plastique.
On place le dispositif d'essai dans un boîtier plastique qui présente deux ouvertures : la première, en forme de cuvette, est placée juste au-dessus de la membrane (2), et permet de recevoir le liquide à analyser ; la seconde est une fenêtre d'ouverture permettant de visualiser le résultat sur la membrane (3).
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Exemple 2. Détection d'antibiotiques dans le lait.
2.1. Identifiant.
L'identifiant utilisé dans cet exemple est La D-alanyl-D-alanine-carboxypeptidase exocellulaire soluble produite par Actinomadura R39 obtenue selon le mode opératoire décrit dans J.-M. FRERE et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18 (4), 506- 510 (1980).
2.2. Couplage de l'Identifiant au Marqueur.
2.2. 1. Biotinylation de Ildentifiant.
250 pl d'une solution aqueuse d'enzyme R39 à 1 mg/ml sont dialysés pendant 24 heures contre 500 ml de tampon HNM (Hepes 10 mM, pH 8, NaCI 10 mM, MgC12 5 mM). On ajoute alors à cette solution d'enzyme R39 dialysée, 2 ml de tampon bicarbonate (0,1 M en bicarbonate de sodium, pH 9) et 250 pl d'une solution d'ester 6- (biotinamido) caproïque de N-hydroxy-succinimide à 5 mg/ml dans de la DMF anhydre.
Cette solution est agitée doucement sur agitateur pour tubes sur axe rotatif de type LABINCO (disponible chez VEL, Belgique) à une vitesse de 2 tours/minute pendant 3 heures à température ambiante et à l'abri de la lumière. La solution ainsi obtenue est dialysée contre du tampon HNM (Hepes 100 mM ; pH 8, NaCI 100 mM, MgCl2 50 mM) pendant 24 heures. De cette manière, on obtient une solution d'enzyme R39 biotinylée que l'on dilue dans du tampon HNM-BSA (Hepes 500 mM ; pH 8, NaCI 500 mM, MgC12 250 mM, BSA 10 mg/ml) jusqu'à une concentration de 100 pg d'enzyme R39 par ml de tampon. Cette solution est stockée à-20 C.
2.2. 2. Marqueur.
Comme Marqueur, on utilise des particules d'or ayant un diamètre de 40 nm, sur lesquelles un anticorps de chèvre anti-biotine a été déposé sous la forme de suspensions dans une solution aqueuse de tétraborate de sodium à 2 mM à pH 7,2, stabilisée par de l'azoture de sodium à 0, 1% (disponible chez BRITISH BIOCELL (Réf.
GAB40). La densité optique de ces suspensions à 520 nm est d'environ 10 et la concentration en protéine est d'environ 24 J. 1g/ml.
2.2. 3. Couplage de l'Identifiant biotinylé au Marqueur.
Solution A pour test rapide
La solution d'enzyme R39 biotinylée préparée à l'exemple 2.2. 1. est diluée 25 fois par du tampon HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaC1500 mM, MgC12 250 mM, BSA 10 mg/ml). On mélange à température ambiante 17,5 parties en volume de cette solution diluée d'enzyme R39 biotinylée, 9,27 parties en volume de suspension de
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particules d'or servant à marquer l'enzyme R39 et 6 parties en volume de suspension de particules d'or de référence (voir exemple 2.3).
Solution B pour test sensible
La solution d'enzyme R39 biotinylée préparée à l'exemple 2.2. 1. est diluée 50 fois par du tampon HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCI 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA
10 mg/ml). On mélange à température ambiante 17,5 parties en volume de cette solution diluée d'enzyme R39 biotinylée, 9,27 parties en volume de suspension de particules d'or servant à marquer l'enzyme R39 et 6 parties en volume de suspension de particules d'or de référence (voir exemple 2.3).
2.3. Référence
Comme Référence, on utilise des particules d'or de 40 nm sur lesquelles un anticorps de chèvre anti-Immunoglobuline de lapin a été déposé. Ces particules sont disponibles chez BRITISH BIOCELL (Réf. GAR40), sous la forme de suspensions dans une solution aqueuse de tétraborate de sodium à 2 mM à pH 7,2, stabilisée par de l'azoture de sodium à 0, 1%. La densité optique de ces suspensions à 520 nm est d'environ 3 et la concentration en protéine est d'environ 6 pg/ml.
2.4. Substances de capture.
2.4. 1. Première substance de capture.
8 ml d'une solution contenant 213 mg de Gamma Globuline Humaine (G4386, Sigma) et 8,6 mg de chlorhydrate de 2-lminothiolane (Aldrich, 33056-6) dans du tampon carbonate de sodium (100 mM, pH9) sont incubés pendant une heure à 25 C.
Par ailleurs, 20 ml d'une solution contenant 119,8 mg de céphalosporine-C et 54 mg de sulfosuccinimidyl 4- (N-maléimidométhyl) cyclohexane-l-carboxylate (sSMCC, 22322 Pierce) dans du tampon carbonate de sodium (100 mM, pH9) sont incubés pendant une heure à 25 C.
Les deux solutions préparées précédemment sont ensuite mélangées. On ajuste le pH de la solution résultante à 7,1 par ajout de 3 ml NaHPO. 500 mM et l'on incube pendant deux heures à 25 C. Le mélange obtenu après incubation est dialysé trois fois contre 1 litre de tampon phosphate de sodium (10 mM, pH 7,5). La solution résultante est filtrée sur un filtre à 0, 22 pm, puis elle est aliquote et congelée à-20 C jusqu'à utilisation.
Lors de l'utilisation, les aliquots sont décongelés, et on y ajoute un colorant alimentaire avant d'effectuer le dépôt sur la membrane afin d'apprécier à tout moment la position exacte du dépôt et la qualité du trait.
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La première substance de capture permet de fixer les Identifiants couplés aux
Marqueurs libres excédentaires par rapport à la quantité d'antibiotique présent dans l'échantillon.
2.4. 2. Deuxième substance de capture.
Pour la deuxième substance de capture, on utilise une solution d'immunoglobuline de lapin (Sigma 15006) à une concentration de 0,5 mg/ml en immunoglobuline dans du tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,5, gamma globuline humaine 5 mg/ml. Cette seconde substance de capture arrête la Référence lors de la migration du liquide sur le dispositif d'essai.
2.5. Dispositif d'essai.
On utilise des dispositifs d'essai contenant les membranes (2), (3) et (4), assemblés selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1.1. La membrane (3) de ces dispositifs porte du côté proximal la substance de capture décrite à l'exemple 2.4. 1. et du côté distal la substance de capture décrite à l'exemple 2.4. 2. Les substances de capture ont été déposées selon le procédé décrit à l'exemple 1.2.
2.5. 1. Test 1-Test rapide
On prépare sept échantillons de lait contenant respectivement 0 ; 2 ; 4 ; 5 ; 6 ; 8 et 10 ppb de pénicilline G. Chacune de ces solutions est alors analysée de la manière suivante.
On prélève un aliquot de 200 pl d'échantillon de lait et 32,8 gel de solution A préparée à l'exemple 2.2. 3. que l'on place dans un tube Eppendorf. Ce mélange est incubé pendant 3 minutes à 47 C. On place ensuite un dispositif d'essai verticalement dans le tube Eppendorf de manière à ce que la première extrémité du dispositif d'essai soit en contact avec le mélange. On laisse migrer le mélange sur le dispositif d'essai tout en incubant l'ensemble pendant 2 minutes à 47OC.
Le Tableau 1 ci-dessous reprend les résultats obtenus pour les 7 échantillons testés. Une valeur d'intensité allant de 0 à 10 est attribuée aux bandes détectées, la valeur 10 étant donnée pour la bande la plus intense et la valeur 0 étant donnée pour la bande la moins intense. Selon cette échelle, on attribue une valeur 6 à la bande de référence. L'intensité du signal observé dans la première bande de détection est inversement proportionnelle à la quantité de pénicilline G présente dans l'échantillon.
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Tableau 1
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<tb>
<tb> Pénicilline <SEP> G <SEP> Intensité
<tb> (ppb) <SEP> lère <SEP> bande <SEP> 2ème <SEP> bande
<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> 6
<tb> 2 <SEP> 8 <SEP> 6
<tb> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 5 <SEP> 3 <SEP> 6
<tb> 6 <SEP> 2 <SEP> 6
<tb> 8 <SEP> 1 <SEP> 6
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 6
<tb>
Dans cet exemple, lorsque la première bande a une intensité inférieure à celle de la bande de référence, le test est considéré comme positif. Les résultats présentés dans le Tableau 1 montrent que ce test permet de détecter en 5 minutes jusqu'à 4 ppb de pénicilline G dans un échantillon de lait.
2.5. 2. Test 2-Test sensible.
On prépare six échantillons de lait contenant respectivement 0 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 4 et 5 ppb de pénicilline G. Chacune de ces solutions est alors analysée de la manière suivante.
On prélève un aliquot de 200 Pl d'échantillon de lait et 32,8 cl de solution B préparée à l'exemple 2.2. 3. que l'on place dans un tube Eppendorf. Ce mélange est incubé pendant 5 minutes à 47 C. On place ensuite un dispositif d'essai verticalement dans le tube Eppendorf de manière à ce que la première extrémité du dispositif d'essai soit en contact avec le mélange. On laisse migrer le mélange sur le dispositif d'essai tout en incubant l'ensemble pendant 2 minutes à 47 C.
Le Tableau 2 ci-dessous reprend les résultats obtenus pour les 7 échantillons testés. Une valeur d'intensité allant de 0 à 10 est attribuée aux bandes détectées, la valeur 10 étant donnée pour la bande la plus intense et la valeur 0 étant donnée pour la bande la moins intense. Selon cette échelle, on attribue une valeur 6 à la bande de référence. L'intensité du signal observé dans la première bande de détection est inversement proportionnelle à la quantité de pénicilline G présente dans l'échantillon.
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Tableau 2
EMI17.1
<tb>
<tb> Pénicilline <SEP> G <SEP> Intensité
<tb> (ppb) <SEP> 1 <SEP> ère <SEP> bande <SEP> 2ème <SEP> bande
<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> 6
<tb> 2 <SEP> 7 <SEP> 6
<tb> 2,5 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 3 <SEP> 4 <SEP> 6
<tb> 4 <SEP> 1 <SEP> 6
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 6
<tb>
Dans cet exemple, lorsque la première bande a une intensité inférieure à celle de la bande de référence, le test est considéré comme positif. Les résultats présentés dans le Tableau 2 montrent que ce test permet de détecter en 7 minutes jusqu'à 2,5 ppb de pénicilline G dans un échantillon de lait.
Exemple 3. Utilisation d'un dispositif d'essai dans un carter plastique.
On utilise un dispositif d'essai tel que décrit à l'exemple 1.6. Dans ce cas, la mise en contact de l'échantillon avec le dispositif d'essai s'effectue en déposant le mélange incubé dans l'ouverture en forme de cuvette prévue à cet effet.
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Test device for the determination of analytes in a liquid dairy product.
The present invention relates to a test device for the determination of analytes in a liquid dairy product such as milk. It also relates to a method for detecting and quantifying analytes in milk using this test device as well as a test kit comprising this test device.
At present, the health requirements of many countries require regular monitoring of the presence of various substances in dairy products, such as veterinary drugs and hormones, commonly used in livestock farming. For obvious medical reasons, these substances should be avoided in dairy products intended for human consumption.
In other cases, it is desirable to have tests that can detect the presence of endogenous substances in milk in order to optimize livestock farming practices. In particular, the rapid determination of the level of hormones in milk makes it easy to identify the periods favorable for reproduction.
In still other cases, practical and reliable methods are sought to control the origin of dairy products derived from milks of various animal species.
We are therefore looking for methods that would make it possible to identify the presence of proteins characteristic of the milk of certain species compared to others.
Furthermore, various tests are known in the literature for the detection of analytes in biological fluids. These tests generally use detection methods using a recognition agent (receptor or antibody) which specifically recognizes the analyte or an analogue of this analyte, and a labeling agent (radioelement, enzyme, fluorescent agent, etc.) hereinafter called detection reagents. Depending on the elements chosen, we will speak of radioimmunoassay (RIA), radio receptor test (RRA), enzymeimmunoassay (EIA) etc. In their general principle, these tests use the minimum combination of the two aforementioned elements (detection reagents) which will make it possible to obtain a result whose value is an indication of the quantity of analyte present.
It should be noted that, depending on the detection method chosen, the labeling agent can be coupled either to the recognition agent or to the analyte or to a substance analogous to the analyte from the point of view of its recognition by the recognition officer. There are also methods in which the recognition agent or the analyte or analogous substance of the analyte intrinsically contains the labeling agent (for example a radioactively labeled analyte).
For dairy products, the most commonly described analyte detection tests relate to the detection of antibiotics.
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US Patent 4,239,852 describes a microbiological method for the detection of p-lactam-based antibiotics in milk. According to this process, the milk sample is incubated, on the one hand, in the presence of parts of cells of a microorganism very sensitive to antibiotics, in particular Bacillus stearothermophilus, and, on the other hand, in the presence of an antibiotic labeled with a radioactive element or an enzyme.
The incubation is carried out under conditions allowing the antibiotics possibly present in the sample and the labeled antibiotic to bind to the parts of cells.
After incubation, the cell parts are separated from the mixture and then washed.
Then, the amount of labeled antibiotic bound to the cell parts is determined and compared to a standard. The quantity of labeled antibiotic linked to the parts of cells is inversely proportional to the concentration of antibiotic present in the sample of milk analyzed.
This process requires relatively delicate handling, in particular during the separation of the parts of cells from the mixture. In addition, in its most sensitive version, this process uses an antibiotic labeled with a radioactive element (14C or 1251). In this case, the determination of the quantity of antibiotic possibly present in milk requires the use of a special device, such as for example a scintillation counter. In addition, the handling of radioactive products, even in very small quantities, is not entirely without danger for the person carrying out the analysis.
European patent application 593.112 describes another method allowing the detection of antibiotics in milk. This method uses a protein isolated from a microorganism sensitive to antibiotics, such as Bacillus stearothermophilus.
This protein is also labeled with an enzyme such as a peroxidase.
The test proceeds as follows: a sample of milk is incubated in a tube in the presence of the labeled protein; after incubation, the milk is transferred into a second tube on the walls of which a reference antibiotic has been immobilized; a second incubation is carried out, then the contents of the tube are eliminated; the walls of this second tube are washed three times with a washing solution, which is itself removed, then the residues present in the second tube are transferred to absorbent paper; a coloring substrate is then added to the second tube which is incubated again, then a solution is added which stops color development; the coloration of the tube is compared to the coloration of an identical test carried out in parallel on a standard sample of antibiotic.
The quantity of labeled protein immobilized on the support, and therefore, the intensity of the coloration, is inversely proportional to the quantity of antibiotic present in the milk sample analyzed.
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According to Example 1 of this patent application, this test makes it possible to detect penicillin G up to concentrations of the order of 5 ppb and allows the detection of amoxicillin (5 ppb), of ampicillin (10 ppb), cephapirin (5 ppb) and ceftiofur (5 ppb).
However, the test is fairly tedious to carry out, in particular by unqualified personnel. In fact, this test includes many steps, including steps for transferring liquid and residues and several rinsing steps.
Given the number and type of steps required in this test, obtaining a reliable result strongly depends on the experimental know-how of the performer.
In addition, the interpretation of the result requires two tests to be carried out in parallel, which further increases and complicates operations.
Other types of enzymatic methods are also known for determining low concentrations of antibiotics in milk (J. M. FRERE et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18 (4), 506-510 (1980) as well as patents
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EP 85, 667 and EP 468. 946) which are based on the use of a specific enzyme, in this case, soluble exocellular D-alanyl-D-alanine-carboxypeptidase, which is produced by Actinomadura R39 (ci- after designated enzyme R39 "). The enzyme R39 has a specific activity of hydrolysis of the D-alanyl-D-alanine groups of various peptides and is also capable of hydrolyzing particular thioester.
In addition, the enzyme R39 reacts with antibiotics with a P-lactam nucleus to very quickly form an enzyme-antibiotic equimolar complex, inactive and substantially irreversible.
In the most recent version of this test (EP 468.946), a determined volume of a sample of the liquid to be examined is incubated with a predetermined quantity of the enzyme R39 under conditions allowing the antibiotic-lactam possibly present in the The sample reacts with the enzyme to form an equimolar, inactive and substantially irreversible enzyme-antibiotic complex.
Then, a determined quantity of thioester-type substrate is incubated with the product obtained at the first stage under conditions allowing the hydrolysis of the substrate by the residual enzyme R39 which was not complexed with the antibiotic during the first incubation. . The amount of mercaptoalkanoic acid thus formed is then determined by colorimetric determination using a reagent capable of producing a coloration by reaction with the free SH group of mercaptoalkanoic acid.
The intensity of the coloration is compared to a standard, previously established from samples containing known amounts of antibiotics. The quantitative determination can be made by measurement with a spectrophotometer; in the case of milk, prior clarification of the sample may be necessary.
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Clearly, this test has fewer steps and is simpler to carry out than the test described in patent application EP 593,112. However, it is limited to the detection of antibiotics with an ss-lactam nucleus, up to the limit of detection limits accessible with the enzyme R39. As it stands, this test cannot be used with other antibiotic receptors, and cannot directly serve as a basis for the detection of other analytes in milk.
Since the current tests still have various drawbacks, the applicant has set itself the objective of seeking new methods for detecting analytes in liquid dairy products, the methods sought being intended to allow the reliable determination of different types of analytes, preferably at the time of collection at the farm. The Applicant has therefore sought a method which very quickly makes it possible to obtain a reliable result in a limited number of simple steps, not requiring any particular experimental know-how. In addition, the applicant has sought a method providing a result that is easily detectable visually and which can also be the subject of quantification by instrumental measurement.
The Applicant has now discovered that these objectives can be achieved through the use of a new test device making it possible to easily determine the presence of analytes in liquid dairy products, in particular milk.
This is why the present invention relates to a test device for detecting the presence of analytes in a liquid dairy product by capillary migration of said dairy product. The test device according to the invention comprises a solid support (1) which has a first and a second end, on which are successively fixed, starting from the first end, a membrane (2) allowing the purification of the liquid analyzed , a membrane (3) on which one or more capture substances are immobilized, and - an absorbent membrane (4).
According to a particular embodiment of the invention, the test device according to the present invention also has a membrane (5) on which at least one detection reagent has been deposited, this detection reagent being capable of dissolving quickly in the presence of said dairy product. According to this particular mode of implementation, the membrane (5) must be located before the membrane (3).
It can be located, for example, either before the membrane (2) at the first end of the device, or between the membrane (2) and the membrane (3) or even below or above the membrane (2).
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The various membranes present in the test device according to the present invention are superimposed at their ends so as to ensure the continuous migration of the dairy product from one zone to another. Preferably, the membrane (3) is placed so that its proximal end is placed below the membrane (2) and its distal end is below the membrane (4). The membranes can optionally be kept in contact with each other by means of an adhesive plastic film (6). In this case, the adhesive plastic film is chosen so as not to affect the migration of the liquid on the test device.
The option of covering the test device with an adhesive plastic film has two advantages: it ensures perfect contact with the overlapping of the membranes and constitutes a protective film. The adhesive plastic film (6) can either completely cover the membranes (2), (3), (4) and (5), or partially cover the individual membranes. Preferably, the adhesive plastic film (6) does not cover the first millimeters of the first end so as to allow faster migration of the liquid on the membrane (2) of the test device.
Figures 1 to 3 illustrate examples of test devices according to the present invention. Figures 1a, 2 and 3 show front views and Figure 1b shows a view in longitudinal section.
The solid support (1) present in the test device according to the present invention is made of glass or plastic, preferably plastic.
In the case of a plastic support, its thickness is generally between 0.05 and 1 mm, preferably between 0.1 and 0.6 mm. The membranes are fixed to the solid support (1) using an adhesive.
The membrane (2) can be of different types, provided that it is capable of retaining the substances present in the dairy product which prevent the migration onto the test device of the analytes possibly present in the dairy product and of the detection reagents. used according to the method practiced. However, the membrane (2) must not prevent the migration of the analytes and detection reagents, and must preserve their activities during this migration. Non-limiting examples of membranes making it possible to obtain this result according to the invention are: Cytosep, Leukosorb or Loprosorb (available from Pall Gelman Sciences), Primecare (available from Primecare, n. V) or Rayon Non-woven 5S (available from Schleicher & Schuell), preferably Leukosorb.
As for its dimension, the membrane (2) must be long enough to allow the elimination of all the substances present in the dairy product which prevent the migration of the analytes and detection reagents on the test device.
The membrane (3) must allow one or more capture substances to be immobilized and must allow the migration of a flow of liquid suitable for the type
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application referred to here. Preferably, the membrane (3) is consolidated on a non-porous support of polyester type.
Non-limiting examples of membranes suitable according to the present invention are: high porosity nitrocellulose membranes such as Hi-Flow membranes (available from Millipore), nitrocellulose membranes of type AE100-12m, AE99-8m, AE-S110 (available from Scleicher & Schuell), the 5.0-day nitrocellulose membranes. lm and 8.0 d. lm (available from Whatman), Biodyne, immunodyne, loprodyne membranes (available from Pall Gelman Sciences), Immunopore Lateral Flow membranes (available from Coming Costar Corporation), nitrocellulose membrane CNPF 10 (available from Adanced Micro Devices) or even the LPNPG CG 3R nylon membrane (available from Pall Gelman Sciences). Preferably, a Hi-Flow membrane (Millipore) is used.
One or more capture substances are immobilized on the membrane (3). The type of immobilized capture substance depends of course on the method used for the detection of the analytes; the capture substances are capable of selectively immobilizing at least one of the constituents present in the migrating liquid on the test device, such as one of the detection reagents or the product resulting from the formation of a complex between the analyte or a substance analogous to this analyte and at least one detection reagent or alternatively, the product resulting from the formation of a complex between several detection reagents. The capture substance can also be one of the detection reagents.
The capture substances are placed in a concentrated manner on a portion or several well-defined portions of the membrane (3), such as discs or thin strips, or any other motif suitable for the application. Whatever the reason chosen, it must allow a clear reading of the result.
As for its dimension, the membrane (3) must be of sufficient length to contain all the capture substances used, and this, in the order and in the quantities required according to the detection method practiced.
The type of membrane used for the membrane (4) does not matter, provided that the latter is capable of absorbing and storing the liquid after it has passed over the preceding membranes. The membrane (4) is sufficiently large to allow the liquid to be absorbed after it has passed over the membrane (3), but also, from a practical point of view, to allow easier manual gripping of the test device. .
Optionally, the test device according to the present invention may comprise a membrane (5) on which at least one detection reagent has been deposited. The membrane (5) must allow the migration of the dairy product, while allowing the solubilization and the salting out of the detection reagent (s) during the passage of the dairy product flow.
Non-limiting examples of membranes which can
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suitable for this purpose are: membranes based on fiberglass resins such as T5NM membranes (available from Millipore), F075-14 or F075-17 or GF / C membranes (available from Whatman) Cytosep 1663 membrane ( available at Pall
Gelman Sciences), membranes based on polyester fiber resins such as Accuwick membranes (available from Pall Gelman Sciences) or 3 mm cellulose paper (available from Whatman). Preferably, a membrane based on polyester fiber resins such as Accuwick membranes is used.
The membrane (5) has a length sufficient to support the desired amount of detection reagent.
The test devices according to the present invention are manufactured by methods known to those skilled in the art. For example, cards can be prepared using commercially available laminators. The capture substances used are deposited on the membrane (3) in the form of solutions, before or after the assembly of the cards. These solutions can be deposited very precisely using commercially available devices, such as the Dispenser XY Platform Biojet Quanti-3000 from Bio Dot, Inc. These deposited solutions are immediately evaporated, for example by placing the card under a flow of hot air. Rollers can also be prepared for large-scale production.
Next, the cards and rolls carrying the desired capture substances are cut into strips, each of these strips constituting a test device according to the invention.
When the test device comprises a membrane (5), the detection reagent (s) can (be) deposited thereon (s) before assembling the cards or rolls, by simple immersion of the membrane (5 ) in a solution containing lets) detection reagent (s). Alternatively, it can (wind) be deposited after assembly of the cards or rolls by a technique analogous to that used for depositing the capture substances on the membrane (3).
In a variant of the invention, the device is placed in a plastic case which has two openings: the first, in the form of a cuvette, is placed just above the membrane (2), and makes it possible to receive the liquid to be analyzed ; the second is an opening window for viewing the result on the membrane (3). In this case, the test device does not include an adhesive plastic film (6).
The test device according to the present invention makes it possible to detect the presence of analytes in a liquid dairy product, in particular milk.
This is why the present invention also relates to a method for the detection of analytes in a liquid dairy product, using a test device according to the present invention as well as detection reagents, comprising the following steps:
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a) bringing a determined volume of milk product into contact with the test device according to the present invention, this contact taking place at the first end of the test device, b) capillary migration of the milk product on the test device so that the analytes and the detection reagents possibly present in the dairy product pass progressively over the membrane (2), then the membrane (3), and so that the constituents of the product which are not stopped by the membranes (2) and (3)
end in the membrane (4), and c) the determination of a fixation on the membrane (3).
The method according to the present invention makes it possible to detect analytes in a liquid dairy product, for example milk, whey, beaten milk, etc. The present invention is more particularly intended for the detection of analytes such as medicaments veterinarians, hormones or proteins that may be present in milk.
The detection reagents used according to the method of the invention may vary in number and in kind depending on the mode of implementation of the invention, itself based on the detection method practiced. The method according to the invention uses at least two detection reagents. The first detection reagent is a recognition agent capable of specifically recognizing the analyte, and will hereinafter be called "Identifier". The second detection reagent is a labeling agent, and will hereinafter be referred to as "Marker". It should be noted that, depending on the mode of implementation chosen, certain detection reagents may be present on the membrane (3) or on the membrane (5).
Depending on the analyte to be detected and the detection reagents used, it may be necessary to add one or more detection reagents before the step of bringing the dairy product into contact with the test device according to the invention and to maintain this mixture under incubation conditions allowing the formation of a complex between detection reagents and the analyte or a substance similar to the analyte. Depending on the method chosen, the Identifier and the Marker can be linked together or can be only one and the same substance. On the other hand, there can be several Identifiers and / or Markers.
The Identifier makes it possible to detect the presence of the type of analyte sought thanks to its ability to specifically recognize this analyte or a substance analogous to this analyte. It may be a receptor capable of selectively forming a stable and essentially irreversible complex with the analyte or a similar substance.
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the analyte or a monoclonal or polyclonal antibody specific for the analyte or a similar substance for the analyte.
For the detection of antibiotics, the identifier can be chosen from specific monoclonal or polyclonal antibodies or from
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receptors obtained from microorganisms sensitive to antibiotics, such as receptors obtained from Bacillus species (Bacillus stearothermophilus, Bacillussubtilis. BaciIIus licheniformis ....) Streptococcus (Streptococcus thermophilus, ...), Actinomycetes (Actinomadura R39, .. .).
The second type of detection reagent used is a Marker which makes it possible to directly and indirectly visualize and quantify the presence of the analytes in the dairy product. The markers which can be used according to the invention can be particulate, fluorescent, radioactive, luminescent or enzymatic. A particle marker is preferably chosen which provides an easily detectable visual signal, even when this is present in small quantities. By way of nonlimiting examples, mention may be made of metallic colloidal particles (platinum, gold, silver, etc.), colloidal particles of selenium, carbon, sulfur, tellurium or else colloidal particles of colored synthetic latex.
Particles of colloidal gold having a particle diameter between 1 and 60 nm are particularly preferred: they provide an easily detectable intense pink-red coloration.
The marker makes it possible to determine the presence of the analyte in the sample of dairy product by virtue of its coupling to one or more detection reagents, to the analyte or to a substance analogous to the analyte.
The coupling between the marker and the detection reagent can be carried out according to methods known to those skilled in the art. When using a particulate marker, the labeling can take place either by direct adsorption on the particles, or indirectly, by means of a chemical anchoring arm, such as a biotin / anti-biotin complex, for example. This coupling can take place either before the step of bringing the dairy product into contact with the test device according to the invention, or during the migration of the dairy product onto the test device according to the invention.
According to a particular implementation mode of the invention, a third type of detection reagent is used, hereinafter called "Reference". It is a substance added in known quantity to the analyzed sample, and which is fixed on a specific capture substance immobilized on the membrane (3). The Reference provides a band whose intensity serves as a reference for the quantification of the analyte.
Regarding the contacting of the dairy product with the test device according to the invention (step a) of the process), this is carried out by placing the test device according to the present invention in a container at the bottom of which finds the sample to analyze. The test device is placed essentially vertically in the container, so that the first end of the device is in contact with the mixture.
In the variant of the invention using a test device placed in a plastic case, the latter is arranged horizontally and the contacting takes place
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by depositing an aliquot of sample to be analyzed in the cup-shaped opening placed above the membrane (2).
For the migration step b), the liquid is allowed to migrate by capillary action on the test device according to the invention. The liquid which migrates by capillarity on the test device according to the invention firstly meets the membrane (2) which makes it possible to retain the substances present in the milk product which prevent the migration of the analytes possibly present in the milk product and detection reagents on the test device. The analytes and the detection reagents then migrate onto the membrane (3) on which one or more capture substances have been immobilized. The capture substances selectively immobilize at least one of the constituents present in the liquid analyzed.
According to a particular implementation mode of the invention, a capture substance is used placed at the end of the migration path of the liquid on the membrane (3) which is capable of fixing all the markers which have not been stopped by the previous capture substances. This capture substance makes it possible to supplement the quantitative information provided by the preceding capture substances.
The determination of a fixation on the membrane (3) (step c) of the process) is carried out simply by determining the presence of markers in this area.
This determination is possible simply visually. However, if one wishes to have an accurate measurement of the intensity of the observed signals, one can have recourse to a device capable of measuring the intensity of the observed signal. When a Reference is used, it is fixed by a specific capture substance which provides an internal reference for measuring the intensity of the signals observed.
The interpretation of the result obtained depends on the detection method practiced, namely, the detection reagents and capture substances used.
Compared to the methods for detecting analytes in milk previously described in the literature, the method according to the present invention has the following advantages. First, this process is very quick and extremely simple to implement: it essentially comprises two easy handling steps, requiring no particular experimental know-how. Then, the qualitative and quantitative assessment of the result is immediate and does not require any particular additional operations, such as those required when the detection is carried out by dyes and / or enzymatic markers. In addition, this method is directly applicable for the detection of different types of analytes.
Finally, in the implementation mode using a Reference, the result is directly interpretable and quantifiable, without the need to have recourse to one or more reference tests.
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The present invention also relates to a test kit for the detection of analytes in a dairy product comprising a test device according to the present invention. If necessary, the test kit according to the present invention may also contain the detection reagents to be added to the sample before the dairy product is brought into contact with the test device.
The examples which follow illustrate various aspects and modes of implementation of the present invention without however limiting its scope.
Example 1. Manufacture of test devices. General operating procedures.
1.1. Assembly of membrane maps.
Cards having a size of 300 x 76.2 mm are first assembled by means of a laminator of the Chlamshell Laminator type (available from Bio Dot, Inc.) according to the following method:
We cut a rectangle of plastic support of the ArCare 8565 type (available from Adhesive Research) of dimension 300 x 76.2 mm (solid support (1)). We then cut a Leukosorb LK4 membrane rectangle (available from Pall Gelman Sciences) of dimension 300 x 20 mm (membrane (2)), a Hi-Flow SX membrane rectangle (available from Millipore) of dimension 300 x 25 mm (membrane (3)), a rectangle of cellulose membrane 3 mm (available from Whatmann) of dimension 300 x 40 mm (membrane (4)) and a rectangle of membrane Accuwick (available from Pall Gelman Sciences) of dimension 300 x 0.8 mm (membrane (5)).
The membranes (2) and (4) are successively housed, then (5), then (3) in a specific location in the lower mold of the laminator. The solid support (1) covered with adhesive is held in the cover of the device, the adhesive side being exposed to air. The membranes housed in the lower mold are brought into contact with the adhesive support by closing the laminator; the membranes are held exactly in place by means of air suction produced by a vacuum pump. When the vacuum is broken, a card consisting of the solid support (1) is recovered on which the membranes (2), (3), (4) and (5) are fixed.
1.2. Deposition of capture substances on the membrane (3).
The capture substances are deposited on the membrane (3) before or after assembly according to Example 1.1.
An aqueous solution containing the capture substance is prepared. It is deposited on the membrane (3) of the membrane map prepared in Example 1.1. using an X-Y Platform Biojet Quanti-3000 Dispenser from Bio Dot, Inc.
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The solutions deposited are immediately evaporated by placing the entire card for one minute under hot pulsed air at 60 C.
1.3. Deposit of the marking substance on the membrane (5). a) Before assembly according to example 1.1.
An aqueous solution containing the labeling substance is prepared. The membrane (5) is immersed in this solution. It is then drained, then dried overnight at room temperature under a vacuum of 0.5 bar. b) After assembly according to Example 1.1.
The procedure described in example 1.2 is carried out. for depositing capture substances.
1.4. Deposit of the adhesive plastic film (6).
A rectangle of adhesive film of the ArCare 7759 type (available from Adhesive Research) is cut, dimension 300 x 20 mm for partial covering, and 300 x 71.2 mm for covering all the membranes.
The card obtained according to example 1.1. is placed in the lower mold of a laminator and the adhesive film is placed in the cover of the laminator, the adhesive side being exposed to air. The adhesive plastic film is brought into contact with the membrane card when the device is closed.
1.5. Cut into strips.
The cards obtained after assembly are cut into strips using a guillotine-type device or using a rotary device (available from Bio Dot, Kinematic or Akzo). The end strips are discarded, the other strips being ready for use.
For their storage, the test devices are placed in an opaque and airtight container in the presence of a desiccant (Silgelac, France).
1.6. Presentation in a plastic case.
The test device is placed in a plastic case which has two openings: the first, in the form of a cuvette, is placed just above the membrane (2), and makes it possible to receive the liquid to be analyzed; the second is an opening window for viewing the result on the membrane (3).
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Example 2. Detection of antibiotics in milk.
2.1. Identifier.
The identifier used in this example is the soluble exocellular D-alanyl-D-alanine-carboxypeptidase produced by Actinomadura R39 obtained according to the procedure described in J.-M. FRERE et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18 (4) , 506-510 (1980).
2.2. Coupling of the Identifier to the Marker.
2.2. 1. Biotinylation of Ildentifier.
250 μl of an aqueous solution of enzyme R39 at 1 mg / ml are dialyzed for 24 hours against 500 ml of HNM buffer (Hepes 10 mM, pH 8, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl 2). To this solution of dialyzed enzyme R39 is then added 2 ml of bicarbonate buffer (0.1 M sodium bicarbonate, pH 9) and 250 μl of a caproic N- hydroxy ester solution 6- (biotinamido). -succinimide at 5 mg / ml in anhydrous DMF.
This solution is gently agitated on a shaker for tubes on a rotary axis of the LABINCO type (available from VEL, Belgium) at a speed of 2 revolutions / minute for 3 hours at ambient temperature and protected from light. The solution thus obtained is dialyzed against HNM buffer (Hepes 100 mM; pH 8, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) for 24 hours. In this way, a solution of biotinylated enzyme R39 is obtained which is diluted in HNM-BSA buffer (Hepes 500 mM; pH 8, NaCI 500 mM, MgC12 250 mM, BSA 10 mg / ml) up to a concentration of 100 μg of enzyme R39 per ml of buffer. This solution is stored at -20 C.
2.2. 2. Marker.
As the marker, gold particles having a diameter of 40 nm are used, on which a goat anti-biotin antibody has been deposited in the form of suspensions in an aqueous solution of sodium tetraborate at 2 mM at pH 7.2 , stabilized with 0.1% sodium azide (available from BRITISH BIOCELL (Ref.
GAB40). The optical density of these suspensions at 520 nm is approximately 10 and the protein concentration is approximately 24 J. 1g / ml.
2.2. 3. Coupling of the biotinylated Identifier to the Marker.
Solution A for rapid test
The biotinylated enzyme solution R39 prepared in Example 2.2. 1. is diluted 25 times with HNM-BSA buffer (Hepes 500 mM, pH 8, NaC1500 mM, MgC12 250 mM, BSA 10 mg / ml). 17.5 parts by volume of this dilute solution of biotinylated enzyme R39 are mixed at room temperature, 9.27 parts by volume of suspension of
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gold particles used to mark the enzyme R39 and 6 parts by volume of suspension of reference gold particles (see example 2.3).
Solution B for sensitive test
The biotinylated enzyme solution R39 prepared in Example 2.2. 1. is diluted 50 times with HNM-BSA buffer (Hepes 500 mM, pH 8, NaCI 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA
10 mg / ml). 17.5 parts by volume of this diluted solution of biotinylated enzyme R39 are mixed at ambient temperature, 9.27 parts by volume of suspension of gold particles used to mark the enzyme R39 and 6 parts by volume of suspension of particles gold standard (see example 2.3).
2.3. Reference
As a reference, 40 nm gold particles are used on which a goat anti-rabbit immunoglobulin antibody has been deposited. These particles are available from BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40), in the form of suspensions in an aqueous solution of sodium tetraborate at 2 mM at pH 7.2, stabilized by sodium azide at 0.1%. The optical density of these suspensions at 520 nm is approximately 3 and the protein concentration is approximately 6 pg / ml.
2.4. Capture substances.
2.4. 1. First capture substance.
8 ml of a solution containing 213 mg of Gamma Globulin Human (G4386, Sigma) and 8.6 mg of 2-lminothiolane hydrochloride (Aldrich, 33056-6) in sodium carbonate buffer (100 mM, pH9) are incubated for one hour at 25 C.
In addition, 20 ml of a solution containing 119.8 mg of cephalosporin-C and 54 mg of sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sSMCC, 22322 Pierce) in sodium carbonate buffer (100 mM , pH9) are incubated for one hour at 25 C.
The two solutions previously prepared are then mixed. The pH of the resulting solution is adjusted to 7.1 by adding 3 ml NaHPO. 500 mM and incubated for two hours at 25 C. The mixture obtained after incubation is dialyzed three times against 1 liter of sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.5). The resulting solution is filtered through a 0.22 μm filter, then it is aliquoted and frozen at −20 ° C. until use.
During use, the aliquots are thawed, and a food coloring is added thereto before depositing on the membrane in order to assess at any time the exact position of the deposit and the quality of the line.
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The first capture substance makes it possible to fix the Identifiers coupled to
Free markers in excess of the amount of antibiotic present in the sample.
2.4. 2. Second capture substance.
For the second capture substance, a rabbit immunoglobulin solution (Sigma 15006) is used at a concentration of 0.5 mg / ml of immunoglobulin in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, human gamma globulin 5 mg / ml. This second capture substance stops the Reference during the migration of the liquid on the test device.
2.5. Test device.
Test devices containing the membranes (2), (3) and (4) are used, assembled according to the procedure described in Example 1.1. The membrane (3) of these devices carries on the proximal side the capture substance described in Example 2.4. 1. and on the distal side the capture substance described in Example 2.4. 2. The capture substances were deposited according to the method described in Example 1.2.
2.5. 1. Test 1-Rapid test
Seven milk samples are prepared containing 0 respectively; 2; 4; 5; 6; 8 and 10 ppb of penicillin G. Each of these solutions is then analyzed in the following manner.
Take a 200 μl aliquot of milk sample and 32.8 gel of solution A prepared in Example 2.2. 3. which are placed in an Eppendorf tube. This mixture is incubated for 3 minutes at 47 C. A test device is then placed vertically in the Eppendorf tube so that the first end of the test device is in contact with the mixture. The mixture is allowed to migrate on the test device while incubating the assembly for 2 minutes at 47 ° C.
Table 1 below shows the results obtained for the 7 samples tested. An intensity value ranging from 0 to 10 is assigned to the detected bands, the value 10 being given for the most intense band and the value 0 being given for the least intense band. According to this scale, a value of 6 is assigned to the reference band. The intensity of the signal observed in the first detection band is inversely proportional to the amount of penicillin G present in the sample.
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Table 1
EMI16.1
<tb>
<tb> Penicillin <SEP> G <SEP> Intensity
<tb> (ppb) <SEP> 1st <SEP> band <SEP> 2nd <SEP> band
<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> 6
<tb> 2 <SEP> 8 <SEP> 6
<tb> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 5 <SEP> 3 <SEP> 6
<tb> 6 <SEP> 2 <SEP> 6
<tb> 8 <SEP> 1 <SEP> 6
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 6
<tb>
In this example, when the first band has an intensity lower than that of the reference band, the test is considered to be positive. The results presented in Table 1 show that this test can detect in 5 minutes up to 4 ppb of penicillin G in a milk sample.
2.5. 2. Test 2-Sensitive test.
Six milk samples are prepared containing 0 respectively; 2; 2.5; 3; 4 and 5 ppb of penicillin G. Each of these solutions is then analyzed in the following manner.
An aliquot of 200 μl of milk sample and 32.8 cl of solution B prepared in Example 2.2 is taken. 3. which are placed in an Eppendorf tube. This mixture is incubated for 5 minutes at 47 C. A test device is then placed vertically in the Eppendorf tube so that the first end of the test device is in contact with the mixture. The mixture is allowed to migrate on the test device while incubating the assembly for 2 minutes at 47 C.
Table 2 below shows the results obtained for the 7 samples tested. An intensity value ranging from 0 to 10 is assigned to the detected bands, the value 10 being given for the most intense band and the value 0 being given for the least intense band. According to this scale, a value of 6 is assigned to the reference band. The intensity of the signal observed in the first detection band is inversely proportional to the amount of penicillin G present in the sample.
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Table 2
EMI17.1
<tb>
<tb> Penicillin <SEP> G <SEP> Intensity
<tb> (ppb) <SEP> 1 <SEP> era <SEP> band <SEP> 2nd <SEP> band
<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> 6
<tb> 2 <SEP> 7 <SEP> 6
<tb> 2.5 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 3 <SEP> 4 <SEP> 6
<tb> 4 <SEP> 1 <SEP> 6
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 6
<tb>
In this example, when the first band has an intensity lower than that of the reference band, the test is considered to be positive. The results presented in Table 2 show that this test can detect in 7 minutes up to 2.5 ppb of penicillin G in a milk sample.
Example 3. Use of a test device in a plastic housing.
A test device is used as described in Example 1.6. In this case, the sample is brought into contact with the test device by depositing the incubated mixture in the bowl-shaped opening provided for this purpose.