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UTILISATION DE COMPOSES DE LA SERIE DE LA RETULINE ET DE L'ISORETULINE A TITRE DE COMPOSES A ACTIVITE PHARMACEU-
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,, TIQUE, EN PARTICULIER DE MEDICAMENTS ANALGESIQUES.ANTISPASMODIQUES ET ANTIINpLAMMATOIRES Objet de l'invention
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La presente invention porte sur l'utilisation pharmacologique de composes de la série de la retuline et de l'isoretuline en exploitant leurs effets antinociceptifs et antispasmodiques.
Résumé de l'art antérieur
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On sait que la retuline et l'isoretuline constituent des alcaloïdes indoliniques, qui peuvent être extraits de différentes Loganiacees du genre Strychnos, où ils sont presents a la place d'autres alcaloïdes tels que la strychnine, dont la toxicité est bien connue.
L'isorétuline (16-épirétuline) est la forme deri- vant habituellement de la strychnine dans les voies d'hemisynthese et répond à la formule
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tandis que la rétuline correspond à la formule
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La littérature mentionne plusieurs voies d'hémisynthese de ces composes qui ont été mises au point es-
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0 sentiellement pour élucidez la structure de ces composes et de leurs dérivés.
On peut citer notamment : E. WENKERT et K. SKLAR, Synthesis of Retuline, J. Org. ehem. (1966), 31, pp. 2689-2691, (qui concerne aussi 1'isorétuline) ; J. R. HYMON et al., Die Chemie des WIELAND-GUMLICH Aldehyds und seine Derivaten, He1v. ehim. Aeta (1969), 52, pp. 1564-1602 ; J. R. HYMON et al., Synthese des Retulins, Helv. chim. Ac-
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ta. (1966), 49, pp. 2067-2071.
D'autres composés analogues de la série de la rétuline et de l'isoretuline ont été également décrits par M. TITS, L. ANGENOT et D. TAVERNIER dans les publications suivantes : Phytochemistry, 1979, Vol. 18, pp. 515-516 Phytochemistry, 1980, Vol. 19, pp. 1531-1534 Tetrahedron Letters, 1980, Vol. 21, pp. 2439-2442 Planta Medica, 1981, Vol. 41, pp. 240-243 Journal of Natural Products, 1983, Vol. 46, No. 5, pp.
630-645 J. Pharm. Belg., 1983, Vol. 38, No. 5, pp. 241-245 Phytochemistry, 1985, Vol. 24, No. 1, pp. 205-207
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principe de l'invention -----------------------
La presente invention est basée sur l'observation que la rétuline et l'isorétuline ainsi qu'un grand nombre de dérivés de ces composés presentent un effet antiinflammatoire, un effet analgésique et un effet antispasmodique.
On sait qu'il n'existe en fait que peu de types différents de composés anti-inflammatoires non stéroï- diens et que ceux-ci sont parmi les médicaments les plus prescrits. Les composés les plus couramment utilisés comportent tous une fonction acide ou pseudo-acide et une relation de causalité a ete établi entre l'usage de ces composes et notamment le risque d'ulcère gastro-intestinal hémorragique.
Des composés a effet antiinflammatoire exerçant peu d'effet secondaires indésirables présentent donc un intérêt considérable.
Selon la présente invention, il est proposé a ti-
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tre de medicaments des composés selon la formule générale
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dans laquelle en position 16, soit Rl, soit R2 doit re- presenter l'hydrogène tandis que celui des substituants Rl ou R2 qui ne représente pas l'hydrogène représente
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- CHOH-ou-CHOH de préférence acétylé ou une acyle,fonction aldehyde ; R3 en position 1 représente un reste alkyle ou un reste
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acyle, de preference un reste acétyle; A R4 en position 18 représente une chaîne alkyle, de pré- ference méthyle, un groue -CH2OH- ou -CH2OH acylé de préférence acetylé;
R5 représente l'hydrogène ou un substituant sur l'anneau benzénique qui peut etre hydroxyle ou méthoxy ainsi que les composés substitues sur l'azote en position 4 et les dérivés dans lesquels la double liaison C19-C20 est hy- drogenee.
Un grand nombre de ces composés sont connus en tant que tel et leur synthese a été décrite dans la littérature. Les composés peuvent tous être obtenus facilement par voie d'hemisynthese au départ de la strychnine ou de dérivés ou d'homologues de la strychnine.
L'hémisynthèse de l'isoretuline par exemple a été décrite a partir de la strychnine dont les sources naturelles sont abondantes (S. nux-vomica, S. ignatii, S. icaja). Le rendement final est d'environ 15% d'isoré- tuline.
Deux autres alcaloïdes peuvent aussi servir avantageusement a cette hemisynthese, en ce sens que le nombre réduit d'étapes, permet d'obtenir un meilleur rende-
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ment final (40 a 45% d'isorétuline). 11 s'agit de la diaboline (rencontree initialement dans la S. diabolo d'Amérique du Sud) et son derive désacétyle, generalement connu sous le nom d'aldéhyde de WIELAND et GUMLICH plutôt que sous la denomination de caracurine VII qui lui avait été attribué après son extraction a partir de plusieurs Strychnos sud-américains, notamment S. toxifern, S. cordata. Quoique la diaboline et son derive aient ensuite été retrouvées dans d'autres espèces ame- ricaines et africaines, ces substances ne sont pas disponibles actuellement sur le marché des produits chimiques.
La série rétu1ine est moins facilement accessible a partir de la strychnine qui possède une configuration
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inverse au niveau du carbone en position 16.
Par contre, la rétuline est synthétisée avec un rendement de 50% a partir de l'akuammicine (alcaloïde des graines de Picralima nitida) disponible sur le marché mais à des prix sensiblement plus élévés de l'ordre de 200 fois celui de la strychnine.
On peut également obtenir la retuline et l'isoretuline par transformation des alcaloides dimeres du type strychnobiline, majoritaires dans les écorces de racines du S. variabilis (Kinshasa). Enfin rappelons que la rétuline est présente en quantité appreciable dans les tiges du S. henningsii du Zaire.
A titre d'illustration des voies de synthèse possibles on peut se référer aux Tableau I et II annexés qui indiquent de manière schématique la préparation de l'isoretuline et de la retuline au départ de la strychnine. Des illustrations spécifiques d'exécution des différentes étapes opératoires seront décrites dans les exemples qui suivent.
On notera que la fonction amido en position 1 de I'isorétu1ine peut subir une hydrolyse permettant d'obtenir des produits indiqués pour le substituant R3 cidessus.
De même, la fonction -CH2OH en position 16 peut être facilement esterifiée ou oxydée en aldéhyde.
Partant du compose V on peut préserver la fonc- tion-CHOAc en position 18, l'hydrolyser en fonction -CH2OH ou encore la réduire (comme dans l'isoretuline) en groupe méthyle.
Les techniques classiques de réduction permettent de réduire la fonction éthylidène en position Cig-Co.
De meme les atomes d'azote en position 4 et particulierement en position 1 peuvent être substitues a l'aide de réactifs appropriés.
Au départ de l'aldéhyde de Wieland-Gumlich représenté par la formule III dans le Tableau I, on peut réaliser l'epimere ss de l'isoretuline a savoir la
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rétuline et réaliser les substitutions ou modifications décrites pour l'isorétuline.
11 convient de noter que les composes comportant le reste formaldéhyde tout en étant pharmacologiquement actifs peuvent presenter une toxicité en particulier une cytotoxicite qui peut rendre leur utilisation therapeutique peu indiquée. Ils conservent dans ce cas leur interet au moins comme produits intermédiaires dans la synthèse.
Propriétés pharmacologiques
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Les observations les plus intéressantes sont les suivantes :
Certains des composés réduisent des oedèmes expé- rimentaux chez le rat. Ils ne semblent pas inhiber la synthèse des prostaglandines. Les memes composes inhibent la stimulation de muscles lisses. Ils s'averent de plus inhibiteurs de la stimulation nociceptive chez la souris. Chez cette espèce, l'isoretuline possède un index thérapeutique egal a 15.
Activité spécifique et toxicité
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------------------------------- a ) ¯ Toxicité aiguë Ear voie intra-veineuse chez la souris.
Les alcaloïdes des series retuline et isoretuline sont beaucoup moins toxiques que le strychnine dont la LD50 est de 0, 5 mg/Kg et que les alcaloïdes diquaternaires curarisants dont la LD50 est voisine de 50g/Kg.
L'isorétuline ayant une LD50 de 70 mg/Kg, est cent quarante fois moins toxique que la strychnine. Les autres alcaloïdes testes ont une toxicité voisine ; seuls les dimeres du type strychnobiline et l'isoretulinal sont un peu plus toxiques (environ 30 mg/Kg), ce qui represente encore une toxicité soixante fois moindre que celle de la strychnine.
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Toxicité par voie orale.
En administration intragastrique chez la souris, l'isorétuline possède une LD50 de 300 mg/Kg. Les animaux ayant reçu des doses inférieures ne présentent aucune lésion, en particulier au niveau gastro-intestinal. b) Effets généraux sur le système nerveux. Action anal- gésique.
Les expériences réalisés sur la souris par voie intragastrique à la dose unique de 20 mg/kg montrent que les molecules n'exercent pas, a cette dose, d'effets significatifs sur le temps de sommeil, la curiosité, la motilité et les facultés d'agrippement.
Cependant, l'isoretuline et l'isoretulinal possedent une activité analgésique non négligeable vis a vis de l'action nociceptive de la phénylparabenzoquinone.
Dans ce test classique de l'activité analgésique, la ED50 de l'isorétuline est de 20 mg/kg). L'isorétuline est donc nettement plus active que l'aspirine (182 mg/kg).
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A c) Effets sur le cardiovasculaire.
La rétuline et l'isoretuline en injection intraveineuse chez le rat aux doses de 7 à 49 mg/Kg ne modifient pas la pression arterielle générale. d) Effets anti-mitotiques (cytotoxicité).
Les activités cytotoxiques potentielles de la rétuline et de ses analogues ont été testées sur differentes souches de milieux de cultures de cellules normales (souche 2002) ou cancéreuses (mélanome Buzz ascite L1210, carcinome HeLa).
Aux doses de 1 et 10) ^-9 d'alcaloïde par ml de culture, aucun effet ne fut décelé pour les alcaloïdes, a l'exception de l'isoretulinal qui exerçait un effet anti-mitotique faible mais interessant. C'est ainsi qu'à l'encontre du mélanôm B 16, l'isorétulinal réduit les mitoses d'un facteur huit a la concentration de 10
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/g/ml, et d 1 un facteur vingt a la concentration de 50 -g/ml. A cette dernière concentration, une nécrose des cellules est cependant manifeste. Nous supposons que
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l'activité de l'isorétulinal pourrait être due a la fonction aldéhyde. e) Action antiinflammatoire.
L'isorétuline inhibe l'oedème à la carragenine chez le rat (ED50 : 40 mg/Kg).
Elle réduit également l'oedème au zymosan chez le rat.
La rétuline est également inhibitrice dans ces deux tests.
Par contre, brucine, holstiine, o-acétylisorétuline sont inactives dans les tests précités.
Cet effet antiinflammatoire ne depend pas de l'inhibition de la synthèse des prostaglandines : la rétuline et l'isoretuline ne modifient pas l'action hypotensive de l'acide arachidonique chez le rat.
11 en résulte que le mécanisme d'action de l'effet antiinflammatoire est tout a fait original. f) Effet antispasmodique.
L'isoretuline réduit la stimulation de l'ileon
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de rat par l'histamine et la bradykinine. Les concentrations inhibitrices sont de l'ordre de 10-6 a 10-4 M.
L'invention sera décrite plus en détail à l'aide d'exemples illustratifs des voies d'hemisynthese étudiées et d'études des propriétés pharmacologiques.
Les voies de synthese explorées sont celles sche- matisées au Tableau I annexé, décrivant l'hémisynthèse de l'isorétuline à partir de la strychnine.
Cette hemisynthese se déroute en six étapes, les deux premières aboutissant à l'aldéhyde de WIELAND-GUMLICH.
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Exemple 1 : PRÉPARATION DE LA 23-ISONITROSOSTRYCHNINE (formule II) A? PARTIR DE LA STRYCHNINE
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(formule I) (formule
25 g de strychnine (formule I) sont solubilisees dans 150 ml d'ethanol absolu et placés dans un ballon à trois tubulures équipé d'un entonnoir, d'un. condensa-
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teur reflux et d'un agitateur. On ajoute, sous agitation, 45 ml de nitrite d'isoamyl puis goutte a goutte pendant une heure une solution préparée a l'aide de 6, g de sodium dans 188 ml d'alcool absolu. La température du melange augmente graduellement de 60*C à 90 C et est maintenue à 90 C pendant 4 heures. Le mélange est évaporé sous pression réduite à siccité, pour éliminer l'excès de nitrite d'isoamyle.
Au résidu, on ajoute 37 ml d'eau que l'on évapore à sec et on recommence une fois cette opération. Finalement, on ajoute au résidu 225 ml d'eau, 40 ml d'acide acétique et 1, 5 g de charbon actif. On filtre et on ajoute à nouveau 1, 5 g de charbon actif au filtrat. Après une nouvelle filtration et addition de 18, 5 ml d'acide chlorhydrique concentre, on maintient le filtrat à 0"C pendant 24 heures. Le précipité qui s'y forme est le chlorhydrate de 23-isonoitrosostrychnine (formule II). Le rendement est de 80%.
Exemple 2 : TRANSFORMATION DE LA 23-ISONITROSOSTRYCHNI-
NE (formule II) EN ALDEHYDE DE WIELAND-GUM-
LICH (formule III)
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A? 5 g de chlorhydrate de 23-isonitrosostrychnine, on ajoute par petites portions, sous agitation pendant 5 minutes, 75 ml de chlorure de thionyle a la température de OOC. La température est ensuite augmentée jusqu'à 200C et après 5 heures, le mélange est evapore à sec. On ajoute 50 ml d'ether, on agite le mélange et la solution est a nouveau évaporée a sec. Cette opération est répé-
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tee 3 fois.
Finalement, le residu est solubilisé dans 125 ml d'acide chlorhydrique IN et chauffe à 100"C pendant 3 heures. Après refroidissement, la solution est alcalinisée par l'ammoniaque et extraite 5 fois avec un régal volume d'éther puis épuisée par le chloroforme à l'aide d'un extracteur liquide/liquide. Les extraits sont rassemblés, évaporés à sec et le residu est cristallisé dans le benzène : il s'agit de l'aldéhyde de WIELAND-GUMLICH (formule III).
Exemple 3 : REDUCTION DE L'ALDEHYDE DE WIELAND-GUMLICH
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500 mg du résidu obtenu au stade precedent sont solubilisés dans 25 ml du melange méthanol : eau/8 : 2. On y ajoute un exces de borohydrure de sodium et on laisse en contact pendant 1, 5 heure sous agitation à température ordinaire. Ensuite, on dilue par 10 ml d'eau et on évapore le méthanol sous pression réduite à l'évaporateur rotatif. Le mélange alcalin est extrait per le chloroforme a l'aide d'un extracteur liquide/liquide pendant 5 heures. La solution chloroformique, séchée sur sulfate de sodium anhydre, est évaporée a sec. Le résidu sec constitue l'aldehyde de WIELAND-GUMLICH réduit (formule IV).
Exemple 4:ACÉTYLATION DE L'ALCALOïDE RÉDUIT OBTENU À
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L'RXEMPLE PRµDENT L'EXEMPLE
PRECEDENTOn chauffe a reflux pendant 1, 5 heure au bain-marie, une solution composée de l'alcaloïde obtenu a l'exemple 3 (formule IV), de 2 ml d'anhydride acétique et de 5 ml de pyridine. Après ce laps de temps, la solution est évaporée sous pression réduite et additionnée d'ether. La solution éthérée du résidu huileux est filtree sur une courte colonne d'alumine basique Brockmann. On obtient après evaporation de l'éther, l'alcaloide triacetyle brut sous l'aspect d'une gomme incolo-
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re (formule V).
Exemple 5 DE L'ALCALOIDE (formule V) : ACETYLISORETULINE (formule VI) VI) : HYDROGÉNATIONA? environ 300 mg de l'alcaloïde triacetyle obtenu a l'exemple 4, on additionne 50 ml d'eau, 30 ml d'acide acétique glacial, 0, 5 ml d'acide chlorhydrique concentre et 135 mg de charbon palladié a 10%. On procéde ensuite a l'hydrogénation sous pression normale et a temperature ordinaire jusqu'à ce que la quantité d'hydrogène nécessaire à la formation de la chaîne éthylidénique soit adsorbée. Le catalyseur est filtre et la solution aqueuse acide est alcalinisée par l'ammoniaque. La solution alcaline est extraite par le chloroforme (4 x 50 ml).
Après évaporation du chloroforme desséché sur. sulfate de sodium anhydre, on abtient un résidu d'acetylisorétuline (formule VI).
Exemple 6 : SAPONIFICATION DE L'ACÉTYLISORÉTULINE (for- mule VI) : ISORETULINE (formule VII)
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L'acetylisoretuline est solubilisée dans 10 ml D'éTHANOL et cette solution est alcalinisée par de l'hy- droxyde de sodium a 10% dans l'eau. On concentre cette solution a l'évaporateur rotatif, jusqu'à ce qu'un précipité commence a se former puis on extrait le melange par le chloroforme. Les extrais chloroformiques, déshydrates sur sulfate de sodium anhydre, sont évaporés et le residu obtenu est critallisé dans l'acétate d'ethyle. 11 s'agit de l'isorétuline (formule VII).
Les spectres UV et IR des alcaloïdes obtenus lors de ces diverses reactions sont conformes aux données de la littérature. Pour l'alcaloïde obtenu au dernier stade, l'isorétuline, le spectre de masse indique que l'ion moleculaire et la fragmentation sont également confor-
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mes.
Des essais complémentaires portant qur la formation de dérivés de la retuline et de l'isorétuline ont également été effectués.
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Exemple 7 : RÉDUCTION DES ALDÉHYDES"RETULINAL -=== ISORETULINAL" : RETULINE ET ISORETULINE -------------------------------------------------------
Pour cette réduction, on a opéré de la même façon que l'exemple 3.
50 mg de la paire aldéhydrique sont dissous dans 10 ml du mélange méthanol/8 : 2. À cette solution, on ajoute un exces de borohydrure de sodium. On laisse en contact pendant 1,5 heure à température ordinaire et sous agitation. Après ce laps de temps, le melange est dilué par de l'eau et le méthanol est évaporé sous pression réduite. La solution alcaline est extraite au chloroforme et les solutions chlroformiques séchées sur le sulfate de sodium anhydre sont distillées sous pression réduite jusqu'a siccité.
Après chromatographie couche mince sur silicagel on observe bien 2 spots correspondants d'une part à la retuline, d'autre part à l'isoretuline. Sur le spectre IR, on note la disparition de la bande aldehydique à 1735 cm-1.
Le même mode opératoire permet de réduire le 16 #-hydroxyisorétulinal en 16#-hydroxyisorétuline.
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0 Exemple 8 s DE5ACETYLATION DE LA RETULINE (OU DE L'ISORETULINE) : DESACETYLRETULINE (OU DESACETYLISORÉTULlNE) TYLISORETULINE)
50 mg de rétuline (ou d'isorétuline) sont dissous dans 50 ml d'acide chlorhydrique N et chauffes pendant 4 heures a reflux sous atmosphere d'azote. La solution est alors alcalinisée par la soude IN jusque pH 11 puis extraite par le chloroforme. Les extraits chloroformiques
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séchés sur sulfate de sodium anhydre, sont distillés sous pression réduite jusqu'a siccité.
Le résidu Chromatographie sur couche mince de silicagel montre la presence d'un seul produit se colorant directement en orangé avec le sulfate cérique et le chlorure ferrique.
Le spectre UV max (log #) : 212 (4. 52), 248
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(4. et 300 (3. nm et le spectre IR où l'on observe la disparition de la bande a 1660 cm-l, indiquent la présence d'un chromophore N-H indolinique.
Suivant le produit de départ, on forme la désacétylretuline ou la desacétylisorétuline.
Exemple 9 : ACETYLATION DE LA DÉSACÉTYLRÉTULINE (OU DE
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LA DESACETYLISORETULINE) : ACETYLRETULINE (OU ACFTYLISORETULINE) (DU ACETYLISORETULINE) (OU
ACETYLISORETULINE)On a procédé comme a l'exemple 4.
25 mg de desacetylretuline (ou desacetylisoretuline) sont dissous dans 5 ml de pyridine : on y ajoute 2 ml d'anhydride acétique. La solution est chauffée a reflux pendant 1, 5 h au bain-marie. On l'évapore ensuite
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k a l'évaporateur rotatif sous pression réduite et on reprend fréquemment le residu huileux par quelques ml de méthanol pour faciliter l'élimination de la pyridine.
Sur le spectre UV du résidu, on retrouve le chromopore N-acylindolinique et sur le spectre IR les deux bandes caractérisant la fonction ester a # 1240 et 1740 cm-1 et la bande amide a # 1655 cm-l.
Dans chaque cas, l'alcaloïde forme n'est pas ré- vele par le sulfate cerique et devient orange avec le chlorure ferrique après chauffage de 5 minutes a 100 C.
Suivant l'alcaloide de depart, il se forme l'acetylrétuline (ou l'acétylisorétuline).
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Exemple 10 : ACÉTYLATION DE LA RETULINE (OU DE L'ISORE- TULINE) : ACÉTYLRÉTULINE (OU ACETYLISORE-
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TULINE} TULINE)
10 mg de rétuline (ou d'isorétuline) sont dissous dans 1 ml de pyridine auquel on ajoute 4 ml d'anhydride acétique Le contact est maintenu pendant 24 heures à la temperature du labratoire. Ensuite, on évapore la solution a l'évaporateur rotatif jusqu'a siccité en reprenant fréquemment le résidu par quelques ml de méthanol, comme dans le cas précédent, jusqu'ä elimination complè- te de la pyridine.
Enfin, on solubilise le résidu dans quelques ml de chloroforme et on lave cette solution par quelques ml d'ammoniaque à 2, 5 % puis par l'eau. On eva- pore le chloroforme après l'avoir déshydraté sur le sulfate de sodium anhydre. Le résidu obtenu en partant de la retuline migre au même Rf que celui de l'alcaloïde forme à l'exemple 9 à partir de la désacétylrétuline
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(ceci est aussi applicable à la série Dans les deux cas, l'alcaloïde forme ne se colore pas avec le sulfate cerique et devient orangE avec le chlorure ferrique a 100 C. Les spectres UV et IR sont similaires ci ceux des alcaloïdes obtenus a l'exemple 9. 11 s'agit done de l'acétylrétuling (ou de l'acétyl- isorétuline).
Exemple 11 : FORMYLATION DE LA DESACETYLRETULINE ET SA-
PONIFICATION DU PRODUIT OBTENU : Na-FOR-
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KYL-DLPSACGTYLIZP. TULIKE MYL-DESACETYLRETULINE
0, 11 moles d'anhydride acétique et 0, 11 moles d'acide formique sont chauffés pendant deux heures sous agitation à 50 C.
10 mg de désacétylrétuline sont dissous dans 1 ml
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0 1 de pyridine et 3 ml de la solution préparée ci-dessus. On abandonne cette solution au moins 48 heures à la température du laboratoire puis on évapore le mélange a sec
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comme décrit aux exemples 9 et 10. Le résidu est dissous dans 2 ml d'ethanol auquel on additionne 2 ml d'hydroxyde de sodium à 10% dans l'eau. On concentre la solution sous pression réduite a l'évaporateur rotatif jusqu'au moment où un précipité commence a se former puis on extrait l'alcaloïde par le chloroforme qui, après déshydratation sur sulfate de sodium anhydre, est
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evapore a sec.
Le produit forme ne se colore que très faiblement à froid avec le sulfate cérique et devient rouge-orangé après chauffage de 5 minutes a 100"C avec le chlorure ferrique.
Sur son spectre UV, on retrouve le chromophore N-acylindolinique et sur son spectre IR, une bande N-acyle a 1665 cm-1. Son spectre de masse indique un ion moleculaire a m/z 324 et d'autres fragments caracteristiques du N-formyle, notamment m/z 172.
L'alcaloïde obtenu est la Na-formyl-désacétylrétuline.
Exemple 12 : CONDENSATION DE LA DÉSACÉTYLRÉTULINE (OU
DE LA DESACETYLISORETULINE) AVEC LE FOR- MALDEHYDE : ROSIBILINE (OU ISOROSIBILINE)
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11 mg de désacétylrétuline (ou de desacetylisore-" tuline) sont dissous dans 1, 5 ml d'acide acétique à 10%. On ajoute 0, 1 ml de formol. La solution est maintenue à la temperature du laboratoire pendant 48 heures.
Au bout de ce temps, elle est alcalinisée par l'ammoniaque puis extraite par le chloroforme (3 x 10 ml). La solution chloroformique séchée sur sulfate de sodium anhydre est distillée sous pression réduite jusqu'a siccité. Le résidu chromatographie montre une tache majoritaire se colorant - en rose intense avec le chlorure ferrique et en rouge virant au jaune puis au vert avec le sulfate cérique, lorsque l'alcaloïde de depart est la désacétylisorétu-
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line - en rose avec le chlorure ferrique et en rouge virant a l'orange avec le sulfate cerique lorsque l'alcaloïde de départ est la desacetylisoretuline.
Leur spectre UV indique un chromophore N-H indolinique et leur spectre de masse un ion moleculaire a m/z 308.
La rosibiline (ou l'isorosibiline) ont donc bien
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pp été formee.
Exemple 13 : HYDROLYSE ACIDE DE LA ROSIBILINE (OU DE L'ISOROSIBILINE) : (OU DB5ACiTYLISORETUtINE) DBSACETYLISORETULIME)
DESACETYLRETULINE15 mg de rosibiline (ou d'isorosibiline) sont dissous dans 4 ml d'un melange méthanol : acide chlorhydrique 2 N/l : l. La solution est maintenue quelques heures à la température de laboratoire puis est alcalinisée jusque pH 11 par l'hydroxyde de sodium a 10%. Elle est ensuite extraite par le chloroforme (3 x 10 ml) qui est
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A évaporé a sec après passage sur sulfate de sodium anhy- dre.
Les produits d'hydrolyse obtenus sont la desace- tylrétuline (ou la désacétylisorétuline).
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Exemple 14 ACIDE DES ALCALOÏDES BISINDOLIOUES TYPE"STRYCHNOBILINE" TULINE , ------------------------------------------------------- : HYDROLYSE50 mg d'alcaloïde bisindolique (strychnobiline, isostrychnobiline ou 12'hydroxyisostrychnobiline) sont dissous dans 2 ml d'acide chlorhydrique 2 N. On laisse en contact pendant 15 minutes a la température du laboratoire puis on ajoute 4 ml d'eau. Après 1, 5 heure, on alcalinise par hydroxyde de sodium 2 N jusqu'a pH 11 et on extrait les alcaloïdes par le chloroforme. Les solutions chloroformiques séchées sur sulfate de sodium an-
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hydre sont évaporées à sec.
Le résidu est chromatographie sur silicagel dans différentes phases.
Lorsqu'on hydrolyse les alcaloïdes bisindoliques de PM 614 tels la strychnobiline et l'isostrychnobiline, on observe sur les chromatogrammes plusieurs spots
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dont un en rouge-orange avec le sulfate cerique et le chlorure ferrique et correspond à la desacetylretuline et deux autres ne se colorent pas avec le sulfate cerique mais deviennent orangés avec le chlorure ferrique après chauffage de 5 minutes ci 100"C7 ces spots (dont un est plus intense que l'autre) sont identiques a ceux de "l'isorétulinal, rétulinal".
Lorsqu'on hydrolyse les alcaloïdes bisindoliques de PM 630 tels la 12'-hydroxyisostrychnobiline, on observe sur les chromatogrammes, plusieurs spots dont un se colore également en rouge-orangé avec le sulfate cérique et le chlorure ferrique et correspond aussi cl la désacétylrétuline, tandis que les deux autres
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qui ne sont pas révélés par le sulfate crique deviennent brun-violet avec le chlorure ferrique, après chauffage de 5 minutes a 100*C ces spots correspondent aux alcaloides 12-hydroxyisorétulinal et 12-hydroxyrétulinal en équilibre.
Le cycle oxazinique s'ouvre très facilement en milieu chrlohydrique. Pour imiter le milieu physiologique, on a laissé ces alcaloïdes pendant 3 heures a 370C en milieu HCI 0, 1 N et constate qu'après ce laps de temps, les alcaloïdes bisindoliques asymétriques étaient complètement hydrolyses.
Le tableau ii ci-annexe reprend l'hémisynthèse de la rétuline à partir de la strychnine.
Les premieres étapes sont identiques à celles de la série "isorétuline" (voir exemples 1 et 2).
<Desc/Clms Page number 18>
Exemple 15 : TRANSFORMATION DE L'ALDEHYDE DE WIELAND- GUMLICH EN LACTAME HEXACYCLIQUE
EMI18.1
(FORMULE IX) (FORMULE
IX)3. 1 g de W. G. A. et 1. 95 g de KCN sont solubilisés dans 100 ml d'H20 et 1.2 g d'HAc. La solution est agitée pendant 6 h a 78 C. Apres refroidissement, le melange réactionnel est extrait plusieurs heures par du chloroforme au moyen d'un extracteur liquide/liquide. Les solutions chloroformiques sont maintenues une nuit a 4 C, la lactame hexacyclique y précipite.
Exemple 16 : HYDROGENATION DE LA LACTAME HEXACYCLIQUE
EMI18.2
----------------------------------------------------On solubilise 1. de lactame hexacyclique dans 50 ml d'H20, 30 ml d'HAc et 0. 5 ml d'HCl On y a- joute 300 mg de charbonpalladie a 10% et on procède z 1'hydrogénation sous pression normale et a temperature ordinaire. Le catalyseur est filtre et la solution aqueuse acide est alcalinisée par l'ammoniaque avant d'e- tre extraite par le chloroforme. Après evaporation du solvant desséché sur Na2S04 anhydre, on obtient le produit hydrogéné (formule X).
EMI18.3
Exemple 17 : REDUCTION DE LA FONCTION LACTAME -------------------------------------------On solubilise 1 g d'alcaloïde 16 (formule dans 45 ml de tetrahydrofurane. On y ad- ditionne 640 mg de LiAlH4 on laisse en contact 10 minutes à temperature ordinaire puis on chauffe a reflux le melange pendant 30 minutes. Ensuite, on ajoute sous refroidissement 15 ml d'acétate d'éthyle et on concentre cette solution à l'évaporateur rotatif. Enfin, on addi- tionne 30 ml d'une solution saturée de tartrate sodicopotassique et on extrait cette solution aqueuse par du chloroforme. Après évaporation du solvant, on obtient le produit reduit (formule XI) qui donne une coloration
<Desc/Clms Page number 19>
rouge cerise avec Ce(SO4)2/H2SO4.
Exemple18 :FORMATIONDEN-FORMYL-DÉSACÉTYLRÉTULINE
EMI19.1
(FORMULE XII) (FORMULE XII)À 1 g D'ALCALOïde obtenu a l'exemple 17 (fig.
XI), on ajoute 15 ml d'HAc à 10%, 975 mg de KI04 et 250 ml d'HO. On laisse en contact 12 minutes puis on additionne 3 g de NaBH4 et on abandonne le tout 14 h à 4OC.
Enfin, cette solution aqueuse est extraite par le chloroforme. Après évaporation du solvant, on récupère la N-formyl-désacétylrétuline.
De la N-formyl-désacétylrétuline. on passe faci-
EMI19.2
lement à la desaeetylretuline par hydrolyse acide (cf. exemple 8) puis a la rétuline (cf. exemple 9).
Exemple 19 : OXYDATION DE L'ISORÉTULINE (OU RETULINE)
EN ISORÉTULINAL#RÉTULINAL)
EMI19.3
------------------------------------------------------
La reaction d'oxydation de la fonction alcoolique de l'isoretuline presente un double intérêt primordial lors des hejnisyntheses, car elle permet d'obtenir des diastéréoisomères en équilibre, isoretulinal et retuli- nal, qui authorisent non seulement l'hemisynthese de nombreux alcaloïdes dimeres symétriques ou non, mais egalement, par réduction, de passer de la série isoretuline a la serie retuline, moins facilement accessible.
50 mg d'isoretuline (ou de rétuline) sont solubilises dans 2 ml de dichloromethane. On met en suspension 400 mg de pyridinium chlorochromate (PCC) et 500 mg d'acétate sodique anhydre dans 4 ml de dichlorométhane. On ajoute sous agitation, la solution d'isoretuline et on laisse en contact, toujours sous agitation, pendant trois heures. A la fin de la réaction, on ajoute a la suspension une solution ammoniacale diluee et on extrait l'aldéhyde forme par cinq fois 25 ml de chloroforme. Le rendement est quantitatif.
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Les propriétés pharmacologiques de l'isoretuline et de la retuline ont fait objet des observations suivantes.
Exemple 20 s OEDÈME A LA CARRAGENINE LAMBDA
EMI20.1
-------------------------------------------
Les substances a tester sont administrées par voie intraperitoneale une demi-heure avant l'injection de carragénine lambda dans la sole plantaire. Le volume de la patte est mesure par pléthysmométrie, avant, puis une, deux, trois et quatre heures après l'injection de
EMI20.2
carragenine (1 mg/patte). - Les premiers essais d'orientation ont porte sur l'isoretuline utilisée aux doses de 8, 16, 32 et 64 mg/Kg. Les résultats reprennent l'augmentation du volume de la patte, exprimée en pourcentage du volume normal.
EMI20.3
<tb>
<tb>
1 <SEP> heure <SEP> 2 <SEP> heures <SEP> 4 <SEP> heures <SEP>
<tb> Témoin <SEP> 24. <SEP> 8 <SEP> : <SEP> i <SEP> : <SEP> 2. <SEP> 7 <SEP> 52. <SEP> 3 <SEP> * <SEP> 5 <SEP> 78. <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 5. <SEP> 9 <SEP> (8)
<tb> 8 <SEP> mg/Kg <SEP> 20.2 <SEP> ¯ <SEP> 6.5 <SEP> 56.6 <SEP> ¯ <SEP> 7.3 <SEP> 82.4 <SEP> + <SEP> 8. <SEP> 3 <SEP> (5)
<tb> 16 <SEP> mg/Kg <SEP> 16 <SEP> 2. <SEP> 3 <SEP> 36 <SEP> ¯ <SEP> 6.2 <SEP> 68 <SEP> + <SEP> 7. <SEP> 9 <SEP> (5)
<tb> 32 <SEP> mg/Kg <SEP> 19.7 <SEP> ¯ <SEP> 4.1 <SEP> 35.2 <SEP> ¯ <SEP> 6.1 <SEP> 57.7 <SEP> ¯ <SEP> 5.7 <SEP> (8)
<tb> 64 <SEP> mg/Kg <SEP> 12. <SEP> 4 <SEP> 1.4 <SEP> 33 <SEP> ¯3.4 <SEP> 69.6 <SEP> ¯ <SEP> 6.9 <SEP> (6)
<tb>
EMI20.4
L'isoretuline est nettement inhibitrice a partir de 32 mg/Kg, elle n'est pas active a 8 mg/Kg et l'effet est moindre après 4 heures pour la dose, de 16 mg/Kg.
- Essais avec la retuline.
EMI20.5
<tb>
<tb>
1 <SEP> heure <SEP> 2 <SEP> heures <SEP> 4 <SEP> heures
<tb> Témoin <SEP> 24. <SEP> 2 <SEP> = <SEP> 3 <SEP> 68. <SEP> 8 <SEP> + <SEP> 7 <SEP> 93. <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 9 <SEP> (5)
<tb> 45 <SEP> mg/Kg <SEP> 30. <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 11. <SEP> 6 <SEP> 51. <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 11. <SEP> 5 <SEP> 63. <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 6. <SEP> 1 <SEP> (5)
<tb>
EMI20.6
0 La retuline est active pour 45 mg/Kg. Son activité est proche de celle de l'isoretuline deux heu-
<Desc/Clms Page number 21>
(apresres).
Deux essais supplémentaires ont été effectues en injectant la retuline et d'isoretuline aux doses de 50 fg et zeg dans la patte, en meme temps que la carragénine. A ces doses, ces deux substances ne modifient pas l'oedème et elles n'agissent donc pas par un effet contre-irritant.
- Essais avec d'autres substances proches.
Les résultats reprennent l'augmentation du volume de la patte exprimée en pourcentage de l'accroissement mesure chez les animaux témoins après 4 heures.
EMI21.1
<tb>
<tb>
Isoretuline <SEP> 32 <SEP> mg/Kg <SEP> 74 <SEP> + <SEP> 7. <SEP> 3% <SEP> ; <SEP> p <SEP> (0. <SEP> 05 <SEP>
<tb> 40 <SEP> mg/Kg <SEP> 65 <SEP> + <SEP> 8. <SEP> 4% <SEP> ; <SEP> p < <SEP> 0. <SEP> 05 <SEP>
<tb> Retuline <SEP> 45 <SEP> mg/Kg <SEP> 68 <SEP> + <SEP> 6. <SEP> 5% <SEP> ; <SEP> p < <SEP> (0. <SEP> 01 <SEP>
<tb> O-acéty1isorétu1ine <SEP> 25 <SEP> mg/Kg <SEP> 114 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 5%
<tb> 50 <SEP> mg/Kg <SEP> 90. <SEP> 3 <SEP> + <SEP> 16. <SEP> 4% <SEP>
<tb> Holstiine <SEP> 25 <SEP> mg/Kg <SEP> 90 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 6% <SEP>
<tb> 50 <SEP> mg/Kg <SEP> 105 <SEP> + <SEP> 9. <SEP> 2% <SEP>
<tb> Brucine <SEP> 50 <SEP> mg/Kg <SEP> 98.
<SEP> 7 <SEP> + <SEP> 7%
<tb> 100 <SEP> mg/Kg <SEP> 60% <SEP> des <SEP> animaux <SEP> meurent
<tb> en <SEP> convulsions.
<tb>
Seuls de la série citée, le retuline et l'isoretuline présentent une activité anti-inflammatoire.
EMI21.2
L'oedème a la carragénine depend de l'interven- tion des kinines et des leucocytes avec leurs facteurs pro-inflammatoires dont les prostaglandines (PG). Cet oedème est inhibe par l'aspirine et l'indomethacine.
Exemple 21 : OEDEME AU ZYMOSAN
EMI21.3
------------------------------
On a étudié ensuite l'effet de l'isoretuline sur l'oedème au zymosan. Celui-ci se développe très rapidement grace a la liberation immediate des amines mastocytai-
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
"" res. Pour minimiser cette influence, tous les rats sont traités par mepyramine et methysergide une demi-heure avant l'injection de zymosan (1 mg/patte).
L'isorétuline a été administrée par voie intraperitoneale (40 mg/Kg) en même temps que les anti-amines.
EMI22.2
<tb>
<tb> l <SEP> heure <SEP> 3 <SEP> heures <SEP> 5 <SEP> heures
<tb> Témoins <SEP> 28.3 <SEP> + <SEP> 2.9 <SEP> 44.8 <SEP> + <SEP> 5.7 <SEP> 47.8 <SEP> + <SEP> 6. <SEP> 9
<tb> 40 <SEP> mg/Kg <SEP> 12.5 <SEP> + <SEP> 2.8 <SEP> 29.3 <SEP> + <SEP> 3.8 <SEP> 34.4 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 6
<tb>
L'isoretuline par voie intraperitoneale exerce un effet inhibiteur statistiquement significatif sur l'oedème au zymosan dans sa phase précoce. Cet oedème dépend de l'intervention du complement avec mise en jeu des amines mastocytaires (cette participation est réduite dans nos conditions expérimentales) et de la stimulation des polynucleaires.
Cet oedème est inhibé par l'aspirine et l'indométacine surtout lorsque les effets des amines mastocytaires a été supprimé.
Ces résultats indiquent que dans ces deux modèles de reaction inflammatoire la retuline et l'isoretuline possèdent un pouvoir anti-inflammatoire.
EMI22.3
Exemple 22 : ACTION HYPOTENSIVE DE L'ACIDE ARACHIDONIQUE QUE L'action hypotensive de l'acide arachidonique depend de sa conversion en substances de type PG, la PGI2 principalement. Elle est donc un témoin d'une synthese de PG se réalisant dans le système cardiovasculaire de rat et est supprimée par tous les inhibiteurs de la formation des PG, dont l'aspirine et l'indomethacine. La rétuline a été utilisée à des doses allant de 40 49 mg/Kg. Elle ne modifie pas l'action de l'acide arachidonique chez les 6 animaux testés. Elle ne peut donc pas se ranger dans les inhibiteurs de la synthèse des PG.
De plus, les résultats montrent que cette sub-
<Desc/Clms Page number 23>
stance n'a par elle-même aucun effet vasomoteur. Son action anti-inflammatoire ne peut donc s'expliquer par un collapsus cardiovasculaire qui compromettrait les echan- ges au niveau capillaire.
Exemple 23 : EFFET ANTISPASMODIQUE : INHIBITION DE
L'ACTION MYOSTIMULANTE DE L'HISTAMINE ET DE LA BRADYKDtENE SUR L'ILION DE COBAYE
EMI23.1
-------------------------------------------------------
Des lambeaux d'iléon de Cobaye sont superfusés en serie par du liquide de Tyrode additionne ou non d'iso- retuline. Celle-ci, à partir de 10-6 M (0. 4 g/ml) ré- duit l'action myostimulante de l'histamine sur l'iléon.
Cet antagonisme est de type non compétitif : la courbe dose-réponse à l'histamine est déplacée vers la droite mais n'atteint plus la réponse maximale, l'effet antispasmodique s'accroit avec les augmentations de la con-
EMI23.2
centration en isoretuline (10-6 a 10-4 M soit de 0. 4 a35g/ml). pour la concentration, la plus élevée, la réponse a l'histamine est réduite de 20 fois et la reponse maximale n'atteint plus que 50% de la réponse maximale initiale. Cet antagonisme est non spécifique puisqu'il s'exerce également vis-a-vis de l'effet myostimulant de la bradykinihe. La 0-acetylisoretuline (10-6 et 10-5 M), est dans ce test inactive.
Cet effet antispasmodique de l'isoretuline rapproche cette substance de la papavérine. Néanmoins l'isoretuline est dépourvue de l'effet vasodilatateur de la papavérine.
Indications thérapeutiques
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--------------------------
On peut conclure des exemples qui précèdent que le produit possède des propriétés remarquables lui conferant un large spectre d'applications.
Les indications thérapeutiques suivantes peuvent tout particulièrement être retenues.
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- Douleurs aiguës et chroniques de toute origine, en particulier a) douleurs d'origine spastique au niveau du tractus gastro-intestinal, des voies biliaires, et du sys- teme uro-genital, dysménorrhées d'origine spasmodi- que, crampes utérines, coliques néphrétiques, coli- ques biliaires et colites spasmodiques b) rhumatismes inflammatoires et affections péri-arti- culaires, bursites, synovites, tendinites, tenosy- novites, goutte, affections musculo-squelettiques, arthrose - Traitement des oedèmes inflammatoires de toute origi- ne, atteignant les tissus mous.
Les résultats obtenus chez 1'animal suggèrent que
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les doses utiles a administrer chez l'homme par voie orale sont de l'ordre de 25 a 50 mg par prise, de preference à raison de 1 a 3 prises par jour.
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EMI25.1
t-- , EX H J H H I Oi 0 0 tio n t"T) 1 am ALDEHYDE STRYCHNINE N IV t L J J M" *fTj'"n r) IV H I H H Ott OAt)] OAt) CH-.
ISORETULINE Tableau I Hémisynthèse de l'isorétuline à partir de la strycnnine
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
-------) A ""4'Y NJ 1 H N oH Hi H H HO H 0 CH2OH x ALDCHYDEDE HICLANIJ-GUt1LICH IX 111 1 7 H H N CD N ;-OH 1 E OH - CHOH]} 0" \H c"o C c tioi H N-FOnHYLOESACEIYLR XII Tableau II Hémisynthèse des alcaloïdes de série rétuline à partir de W. G. A.
<Desc / Clms Page number 1>
USE OF RETULIN AND ISORETULIN SERIES COMPOUNDS AS PHARMACEUTICALLY ACTIVE COMPOUNDS
EMI1.1
OBJECT OF THE INVENTION Subject of the invention, tick, in particular of analgesic, anti-spasmodic and anti-inflammatory drugs
EMI1.2
--------------------
The present invention relates to the pharmacological use of compounds of the retulin and isoretulin series by exploiting their antinociceptive and antispasmodic effects.
Summary of prior art
EMI1.3
-------------------------
It is known that retulin and isoretulin constitute indolinic alkaloids, which can be extracted from different Loganiacees of the genus Strychnos, where they are present in place of other alkaloids such as strychnine, the toxicity of which is well known.
Isoretulin (16-epiretulin) is the form usually derived from strychnine in the hemisynthetic pathways and has the formula
EMI1.4
i
EMI1.5
EMI1.6
while retulin corresponds to the formula
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
The literature mentions several hemisynthesis pathways for these compounds which have been developed
EMI2.2
0 sentiently to elucidate the structure of these compounds and their derivatives.
These include: E. WENKERT and K. SKLAR, Synthesis of Retuline, J. Org. ehem. (1966), 31, pp. 2689-2691, (which also relates to isoretulin); J. R. HYMON et al., Die Chemie des WIELAND-GUMLICH Aldehyds und seine Derivaten, He1v. ehim. Aeta (1969), 52, pp. 1564-1602; J. R. HYMON et al., Synthèse des Retulins, Helv. chem. Ac-
EMI2.3
your. (1966), 49, pp. 2067-2071.
Other analogous compounds of the retulin and isoretulin series have also been described by M. TITS, L. ANGENOT and D. TAVERNIER in the following publications: Phytochemistry, 1979, Vol. 18, pp. 515-516 Phytochemistry, 1980, Vol. 19, pp. 1531-1534 Tetrahedron Letters, 1980, Vol. 21, pp. 2439-2442 Planta Medica, 1981, Vol. 41, pp. 240-243 Journal of Natural Products, 1983, Vol. 46, No. 5, pp.
630-645 J. Pharm. Belg., 1983, Vol. 38, No. 5, pp. 241-245 Phytochemistry, 1985, Vol. 24, No. 1, pp. 205-207
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
principle of the invention -----------------------
The present invention is based on the observation that retulin and isoretulin as well as a large number of derivatives of these compounds exhibit an anti-inflammatory effect, an analgesic effect and an antispasmodic effect.
It is known that there are in fact only a few different types of non-steroidal anti-inflammatory compounds and that these are among the most prescribed drugs. The most commonly used compounds all have an acid or pseudo-acid function and a causal relationship has been established between the use of these compounds and in particular the risk of gastrointestinal ulcer hemorrhagic.
Compounds with an anti-inflammatory effect which exert few undesirable side effects are therefore of considerable interest.
According to the present invention, it is proposed to ti-
EMI3.2
be of drugs of the compounds according to the general formula
EMI3.3
EMI3.4
in which in position 16, either Rl or R2 must represent hydrogen while that of the substituents Rl or R2 which does not represent hydrogen represents
EMI3.5
- CHOH-or-CHOH preferably acetylated or an acyl, aldehyde function; R3 in position 1 represents an alkyl residue or a residue
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EMI4.1
acyl, preferably an acetyl residue; A R4 at position 18 represents an alkyl chain, preferably methyl, a group -CH2OH- or -CH2OH acylated, preferably acetylated;
R5 represents hydrogen or a substituent on the benzene ring which can be hydroxyl or methoxy as well as the substituted compounds on the nitrogen in position 4 and the derivatives in which the C19-C20 double bond is hydrogenated.
Many of these compounds are known as such and their synthesis has been described in the literature. The compounds can all be obtained easily by hemisynthesis starting from strychnine or from derivatives or homologs of strychnine.
The hemisynthesis of isoretulin for example has been described starting from strychnine whose natural sources are abundant (S. nux-vomica, S. ignatii, S. icaja). The final yield is approximately 15% isoretulin.
Two other alkaloids can also be used advantageously for this hemisynthesis, in the sense that the reduced number of steps makes it possible to obtain a better return.
EMI4.2
final ment (40 to 45% isoretulin). It is diaboline (initially encountered in S. diabolo from South America) and its deacetyl derivative, generally known as the aldehyde of WIELAND and GUMLICH rather than under the name of caracurine VII which had been attributed after its extraction from several South American Strychnos, in particular S. toxifern, S. cordata. Although diaboline and its derivative have subsequently been found in other American and African species, these substances are not currently available on the chemical market.
The retinine series is less easily accessible from strychnine which has a configuration
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reverse at the carbon level in position 16.
On the other hand, retulin is synthesized with a yield of 50% from akuammicine (alkaloid from the seeds of Picralima nitida) available on the market but at prices significantly higher of the order of 200 times that of strychnine.
Retulin and isoretulin can also be obtained by transformation of dimeric alkaloids of the strychnobilin type, which are predominant in the root bark of S. variabilis (Kinshasa). Finally, remember that retulin is present in appreciable quantities in the stems of S. henningsii from Zaire.
By way of illustration of the possible synthetic routes, reference may be made to the attached Tables I and II which schematically indicate the preparation of isoretulin and retulin starting from strychnine. Specific illustrations of execution of the various operating steps will be described in the examples which follow.
It will be noted that the amido function in position 1 of the isoretulin can undergo hydrolysis making it possible to obtain products indicated for the substituent R3 above.
Likewise, the -CH2OH function at position 16 can be easily esterified or oxidized to aldehyde.
Starting from compound V, the CHOAc function can be preserved in position 18, hydrolyzed according to -CH2OH or even reduced (as in isoretulin) to the methyl group.
Conventional reduction techniques make it possible to reduce the ethylidene function in the Cig-Co position.
Likewise, the nitrogen atoms in position 4 and in particular in position 1 can be substituted using suitable reagents.
From the Wieland-Gumlich aldehyde represented by the formula III in Table I, it is possible to carry out the episere ss of isoretulin, namely the
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retulin and make the substitutions or modifications described for isoretulin.
It should be noted that the compounds comprising the formaldehyde residue while being pharmacologically active may exhibit toxicity, in particular cytotoxicity, which may make their therapeutic use hardly indicated. In this case, they retain their interest at least as intermediate products in the synthesis.
Pharmacological properties
EMI6.1
---------------------------
The most interesting observations are as follows:
Some of the compounds reduce experimental edema in the rat. They do not seem to inhibit the synthesis of prostaglandins. The same compounds inhibit the stimulation of smooth muscles. They are found to be more inhibitors of nociceptive stimulation in mice. In this species, isoretulin has a therapeutic index equal to 15.
Specific activity and toxicity
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------------------------------- a) ¯ Acute toxicity Ear intravenous route in mice.
The retulin and isoretulin alkaloids are much less toxic than strychnine whose LD50 is 0.5 mg / Kg and than the curating diquaternary alkaloids whose LD50 is close to 50g / Kg.
Isoretulin, having an LD50 of 70 mg / kg, is 140 times less toxic than strychnine. The other alkaloids tested have a similar toxicity; only dimers of the strychnobilin type and isoretulin are slightly more toxic (around 30 mg / Kg), which still represents a toxicity sixty times less than that of strychnine.
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Oral toxicity.
In intragastric administration in mice, isoretulin has an LD50 of 300 mg / Kg. Animals that have received lower doses show no lesions, particularly in the gastrointestinal tract. b) General effects on the nervous system. Analgesic action.
The experiments carried out on the mouse by the intragastric route at the single dose of 20 mg / kg show that the molecules do not exert, at this dose, significant effects on sleep time, curiosity, motility and the faculties of grip.
However, isoretulin and isoretulin have significant analgesic activity with regard to the nociceptive action of phenylparabenzoquinone.
In this classic test of analgesic activity, the ED50 of isoretulin is 20 mg / kg). Isoretulin is therefore clearly more active than aspirin (182 mg / kg).
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A c) Effects on the cardiovascular.
Retulin and isoretulin intravenous injection in rats at doses of 7 to 49 mg / Kg do not modify the general blood pressure. d) Anti-mitotic effects (cytotoxicity).
The potential cytotoxic activities of retulin and its analogues have been tested on different strains of normal cell culture media (2002 strain) or cancer cells (Buzz ascites L1210 melanoma, HeLa carcinoma).
At doses of 1 and 10) ^ -9 of alkaloid per ml of culture, no effect was detected for the alkaloids, with the exception of the isoretulinum which exerted a weak but interesting anti-mitotic effect. In contrast to melanom B 16, isoretulinal reduces mitosis by a factor of eight to the concentration of 10
<Desc / Clms Page number 8>
/ g / ml, and by a factor of twenty at the concentration of 50 -g / ml. At this latter concentration, however, cell necrosis is evident. We suppose that
EMI8.1
the activity of isoretulinal could be due to the aldehyde function. e) Anti-inflammatory action.
Isoretulin inhibits carrageenan edema in rats (ED50: 40 mg / Kg).
It also reduces edema with zymosan in rats.
Retulin is also an inhibitor in these two tests.
By cons, brucine, holstiine, o-acetylisoretulin are inactive in the above tests.
This anti-inflammatory effect does not depend on the inhibition of prostaglandin synthesis: retulin and isoretulin do not modify the hypotensive action of arachidonic acid in rats.
It follows that the mechanism of action of the anti-inflammatory effect is completely original. f) Antispasmodic effect.
Isoretulin reduces stimulation of the ileum
EMI8.2
rat with histamine and bradykinin. The inhibitory concentrations are of the order of 10-6 to 10-4 M.
The invention will be described in more detail using illustrative examples of the hemisynthesis pathways studied and studies of pharmacological properties.
The synthetic routes explored are those shown in Table I annexed, describing the hemisynthesis of isoretulin from strychnine.
This hemisynthesis takes place in six stages, the first two leading to the aldehyde of WIELAND-GUMLICH.
<Desc / Clms Page number 9>
Example 1: PREPARATION OF 23-ISONITROSOSTRYCHNINE (formula II) A? FROM STRYCHNINE
EMI9.1
(formula I) (formula
25 g of strychnine (formula I) are solubilized in 150 ml of absolute ethanol and placed in a three-tube flask equipped with a funnel, one. condensa-
EMI9.2
reflux tor and an agitator. 45 ml of isoamyl nitrite are added, with stirring, then a solution prepared with the aid of 6 g of sodium in 188 ml of absolute alcohol is added dropwise for one hour. The temperature of the mixture gradually increases from 60 * C to 90 C and is maintained at 90 C for 4 hours. The mixture is evaporated under reduced pressure to dryness, to remove the excess isoamyl nitrite.
37 ml of water are added to the residue, which is evaporated to dryness and this operation is repeated once. Finally, 225 ml of water, 40 ml of acetic acid and 1.5 g of activated carbon are added to the residue. It is filtered and 1.5 g of activated carbon are again added to the filtrate. After further filtration and addition of 18.5 ml of concentrated hydrochloric acid, the filtrate is kept at 0 ° C. for 24 hours. The precipitate which forms therein is 23-isonoitrosostrytrychnine hydrochloride (formula II). The yield is 80%.
Example 2: TRANSFORMATION OF 23-ISONITROSOSTRYCHNI-
NE (formula II) IN ALDEHYDE DE WIELAND-GUM-
LICH (formula III)
EMI9.3
---------------------------------------------------------- -----
AT? 5 g of 23-isonitrosostrychnine hydrochloride, 75 ml of thionyl chloride at OOC temperature are added in small portions, with stirring for 5 minutes. The temperature is then increased to 200C and after 5 hours, the mixture is evaporated to dryness. 50 ml of ether are added, the mixture is stirred and the solution is again evaporated to dryness. This operation is repeated
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tee 3 times.
Finally, the residue is dissolved in 125 ml of IN hydrochloric acid and heated to 100 ° C. for 3 hours. After cooling, the solution is made alkaline with ammonia and extracted 5 times with a delicious volume of ether then exhausted by chloroform using a liquid / liquid extractor The extracts are combined, evaporated to dryness and the residue is crystallized from benzene: this is the aldehyde of WIELAND-GUMLICH (formula III).
EXAMPLE 3 REDUCTION OF THE WIELAND-GUMLICH ALDEHYDE
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---------------------------------------------------------- ----
500 mg of the residue obtained in the preceding stage are dissolved in 25 ml of the methanol: water / 8: 2 mixture. An excess of sodium borohydride is added thereto and the mixture is left in contact for 1.5 hours with stirring at ordinary temperature. Then diluted with 10 ml of water and the methanol is evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator. The alkaline mixture is extracted with chloroform using a liquid / liquid extractor for 5 hours. The chloroform solution, dried over anhydrous sodium sulfate, is evaporated to dryness. The dry residue constitutes the reduced WIELAND-GUMLICH aldehyde (formula IV).
Example 4: ACETYLATION OF THE REDUCED ALKALOID OBTAINED AT
EMI10.2
THE EXAMPLE TAKE THE EXAMPLE
PRECEDENTOne heated at reflux for 1.5 hours in a water bath, a solution composed of the alkaloid obtained in Example 3 (formula IV), 2 ml of acetic anhydride and 5 ml of pyridine. After this time, the solution is evaporated under reduced pressure and added with ether. The ethereal solution of the oily residue is filtered through a short column of Brockmann basic alumina. After evaporation of the ether, the crude triacetyl alkaloid is obtained in the appearance of a colorless gum
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re (formula V).
EXAMPLE 5 OF THE ALKALOIDE (formula V): ACETYLISORETULINE (formula VI) VI): HYDROGENATIONA? about 300 mg of the triacetyl alkaloid obtained in Example 4, 50 ml of water, 30 ml of glacial acetic acid, 0.5 ml of concentrated hydrochloric acid and 135 mg of 10% palladium on carbon are added. The hydrogenation is then carried out under normal pressure and at ordinary temperature until the quantity of hydrogen necessary for the formation of the ethylidenic chain is adsorbed. The catalyst is filtered and the acidic aqueous solution is made alkaline by ammonia. The alkaline solution is extracted with chloroform (4 x 50 ml).
After evaporation of the dried chloroform on. anhydrous sodium sulfate, an acetylisoretulin residue is obtained (formula VI).
Example 6: SAPONIFICATION OF ACETYLISORETULIN (formula VI): ISORETULINE (formula VII)
EMI11.2
---------------------------------------------------------- -----
The acetylisoretulin is dissolved in 10 ml of ETHANOL and this solution is made alkaline with 10% sodium hydroxide in water. This solution is concentrated on a rotary evaporator until a precipitate begins to form and then the mixture is extracted with chloroform. The chloroform extracts, dehydrated over anhydrous sodium sulfate, are evaporated and the residue obtained is crystallized from ethyl acetate. It is isoretulin (formula VII).
The UV and IR spectra of the alkaloids obtained during these various reactions are in accordance with data from the literature. For the alkaloid obtained in the last stage, isoretulin, the mass spectrum indicates that the molecular ion and the fragmentation are also
<Desc / Clms Page number 12>
my.
Additional tests relating to the formation of retulin and isoretulin derivatives have also been carried out.
EMI12.1
Example 7: REDUCTION OF "RETULINAL - === ISORETULINAL" ALDEHYDES: RETULIN AND ISORETULIN -------------------------------- -----------------------
For this reduction, the procedure was the same as in Example 3.
50 mg of the aldehyde pair are dissolved in 10 ml of the methanol / 8: 2 mixture. To this solution is added an excess of sodium borohydride. It is left in contact for 1.5 hours at ordinary temperature and with stirring. After this time, the mixture is diluted with water and the methanol is evaporated under reduced pressure. The alkaline solution is extracted with chloroform and the hydrochloric solutions dried over anhydrous sodium sulfate are distilled under reduced pressure until dry.
After thin layer chromatography on silica gel, two spots corresponding to retulin, on the other hand to isoretulin, are observed. On the IR spectrum, we note the disappearance of the aldehydic band at 1735 cm-1.
The same procedure makes it possible to reduce the 16 # -hydroxyisoretulinum to 16 # -hydroxyisoretulin.
EMI12.2
0 Example 8 s DE5ACETYLATION OF RETULIN (OR ISORETULIN): DESACETYLRETULINE (OR DESACETYLISORETULIN) TYLISORETULINE)
50 mg of retulin (or isoretulin) are dissolved in 50 ml of N hydrochloric acid and heated for 4 hours under reflux under a nitrogen atmosphere. The solution is then made alkaline with IN sodium hydroxide until pH 11 and then extracted with chloroform. Chloroform extracts
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dried over anhydrous sodium sulfate, are distilled under reduced pressure until dry.
The residue chromatography on thin layer of silica gel shows the presence of a single product coloring directly in orange with ceric sulfate and ferric chloride.
The max UV spectrum (log #): 212 (4.52), 248
EMI13.1
(4. and 300 (3. nm and the IR spectrum where we observe the disappearance of the band at 1660 cm-l, indicate the presence of an indolinic N-H chromophore.
Depending on the starting material, deacetylretulin or desacetylisoretulin is formed.
Example 9 ACETYLATION OF DEACETYLRETULIN (OR OF
EMI13.2
DESACETYLISORETULINE): ACETYLRETULINE (OR ACFTYLISORETULINE) (ACETYLISORETULINE) (OR
ACETYLISORETULINE) The procedure was as in Example 4.
25 mg of desacetylretulin (or desacetylisoretulin) are dissolved in 5 ml of pyridine: 2 ml of acetic anhydride are added thereto. The solution is heated at reflux for 1.5 hours in a water bath. We then evaporate it
EMI13.3
k on a rotary evaporator under reduced pressure and the oily residue is frequently taken up in a few ml of methanol to facilitate the removal of the pyridine.
On the UV spectrum of the residue, we find the N-acylindolinic chromopore and on the IR spectrum the two bands characterizing the ester function at # 1240 and 1740 cm-1 and the amide band at # 1655 cm-l.
In each case, the alkaloid formed is not revealed by the ceric sulfate and becomes orange with the ferric chloride after heating for 5 minutes at 100 C.
Depending on the starting alkaloid, acetylretulin (or acetylisoretulin) is formed.
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EXAMPLE 10 ACETYLATION OF RETULIN (OR ISORE-TULIN): ACETYLRETULIN (OR ACETYLISOR)
EMI14.1
TULINE} TULINE)
10 mg of retulin (or isoretulin) are dissolved in 1 ml of pyridine to which 4 ml of acetic anhydride are added. Contact is maintained for 24 hours at the temperature of the laboratory. The solution is then evaporated on a rotary evaporator to dryness, frequently taking up the residue in a few ml of methanol, as in the preceding case, until the pyridine is completely eliminated.
Finally, the residue is dissolved in a few ml of chloroform and this solution is washed with a few ml of 2.5% ammonia and then with water. The chloroform is evaporated after having dried it over anhydrous sodium sulfate. The residue obtained starting from retulin migrates to the same Rf as that of the alkaloid formed in Example 9 from deacetylretulin
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(this is also applicable to the series In both cases, the alkaloid formed does not color with ceric sulfate and becomes orange with ferric chloride at 100 C. The UV and IR spectra are similar to those of the alkaloids obtained at l Example 9. It is therefore acetylretuling (or acetylisoretulin).
Example 11: FORMYLATION OF DESACETYLRETULINE AND SA-
PONIFICATION OF THE PRODUCT OBTAINED: Na-FOR-
EMI14.3
KYL-DLPSACGTYLIZP. TULIKE MYL-DESACETYLRETULINE
0.11 moles of acetic anhydride and 0.11 moles of formic acid are heated for two hours with stirring at 50 C.
10 mg deacetylretulin is dissolved in 1 ml
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0 1 of pyridine and 3 ml of the solution prepared above. This solution is left at least 48 hours at laboratory temperature and then the mixture is evaporated to dryness
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as described in Examples 9 and 10. The residue is dissolved in 2 ml of ethanol to which 2 ml of 10% sodium hydroxide in water are added. The solution is concentrated under reduced pressure on a rotary evaporator until a precipitate begins to form and then the alkaloid is extracted with chloroform which, after dehydration over anhydrous sodium sulfate, is
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evaporates to dryness.
The product formed only colors very slightly when cold with ceric sulphate and becomes red-orange after heating for 5 minutes at 100 ° C. with ferric chloride.
On its UV spectrum, we find the N-acylindolinic chromophore and on its IR spectrum, an N-acyl band at 1665 cm-1. Its mass spectrum indicates a molecular ion at m / z 324 and other characteristic fragments of N-formyl, in particular m / z 172.
The alkaloid obtained is Na-formyl-deacetylretulin.
Example 12: CONDENSATION OF DEACETYLRETULIN (OR
DESACETYLISORETULINE) WITH FOR-MALDEHYDE: ROSIBILINE (OR ISOROSIBILINE)
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---------------------------------------------------------- -----
11 mg of deacetylretulin (or desacetylisore-tulin) are dissolved in 1.5 ml of 10% acetic acid. 0.1 ml of formalin is added. The solution is kept at laboratory temperature for 48 hours.
At the end of this time, it is basified with ammonia and then extracted with chloroform (3 x 10 ml). The chloroform solution dried over anhydrous sodium sulfate is distilled under reduced pressure until dry. The chromatography residue shows a majority stain staining - in intense pink with ferric chloride and in red turning to yellow then to green with ceric sulphate, when the starting alkaloid is deacetylisoretu-
<Desc / Clms Page number 16>
line - in pink with ferric chloride and in red turning orange with ceric sulfate when the starting alkaloid is desacetylisoretulin.
Their UV spectrum indicates an indolinic N-H chromophore and their mass spectrum a molecular ion at m / z 308.
Rosibilin (or isorosibilin) therefore have good
EMI16.1
pp been formed.
EXAMPLE 13 ACID HYDROLYSIS OF ROSIBILIN (OR ISOROSIBILINE): (OR DB5ACiTYLISORETUtINE) DBSACETYLISORETULIME)
DESACETYLRETULINE 15 mg of rosibiline (or isorosibiline) are dissolved in 4 ml of a methanol mixture: hydrochloric acid 2 N / l: l. The solution is kept for a few hours at laboratory temperature and is then basified to pH 11 with 10% sodium hydroxide. It is then extracted with chloroform (3 x 10 ml) which is
EMI16.2
Evaporated to dryness after passage over anhydrous sodium sulfate.
The hydrolysis products obtained are desacetylretulin (or deacetylisoretulin).
EMI16.3
Example 14 ACID OF BISINDOLIOUS ALKALOIDS TYPE "STRYCHNOBILINE" TULINE, -------------------------------------- -----------------: HYDROLYSE 50 mg of bisindolic alkaloid (strychnobilin, isostrychnobilin or 12 hydroxyisostrychnobilin) are dissolved in 2 ml of 2N hydrochloric acid. 15 minutes at laboratory temperature then 4 ml of water are added. After 1.5 hours, the mixture is made basic with 2 N sodium hydroxide to pH 11 and the alkaloids are extracted with chloroform. The chloroform solutions dried over sodium sulfate an-
<Desc / Clms Page number 17>
hydra are evaporated to dryness.
The residue is chromatographed on silica gel in different phases.
When the bisindolic alkaloids of PM 614, such as strychnobilin and isostrychnobilin, are hydrolyzed, several spots are observed on the chromatograms.
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one of which in red-orange with ceric sulfate and ferric chloride and corresponds to desacetylretulin and two others do not color with ceric sulfate but become orange with ferric chloride after heating for 5 minutes at 100 "C7 these spots (including one is more intense than the other) are identical to those of "isoretulinal, retulinal".
When the bisindolic alkaloids of PM 630 such as 12'-hydroxyisostrychnobilin are hydrolyzed, there are several spots on the chromatograms, one of which also turns orange-red with ceric sulfate and ferric chloride and also corresponds to deacetylretulin, while than the other two
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which are not revealed by the cric sulfate become brownish-purple with the ferric chloride, after heating for 5 minutes at 100 ° C. these spots correspond to the 12-hydroxyisoretulinal and 12-hydroxyretulinal alkaloids in equilibrium.
The oxazine cycle opens very easily in a hydrochloric medium. To imitate the physiological medium, these alkaloids were left for 3 hours at 370C in 0.1 N HCl medium and found that after this period of time, the asymmetric bisindolic alkaloids were completely hydrolyzed.
Table ii appended shows the hemisynthesis of retulin from strychnine.
The first steps are identical to those of the "isoretulin" series (see examples 1 and 2).
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EXAMPLE 15 TRANSFORMATION OF WIELAND-GUMLICH ALDEHYDE INTO HEXACYCLIC LACTAM
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(FORM IX) (FORM
IX) 3. 1 g of W. G. A. and 1. 95 g of KCN are dissolved in 100 ml of H20 and 1.2 g of HAc. The solution is stirred for 6 h at 78 C. After cooling, the reaction mixture is extracted for several hours with chloroform using a liquid / liquid extractor. The chloroform solutions are kept overnight at 4 ° C., the hexacyclic lactam precipitates there.
EXAMPLE 16 HYDROGENATION OF HEXACYCLIC LACTAM
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---------------------------------------------------------- - 1. hexacyclic lactam is dissolved in 50 ml of H20, 30 ml of HC and 0.5 ml of HCl 300 mg of 10% pallet charcoal is added thereto and the hydrogenation is carried out under pressure normal and at ordinary temperature. The catalyst is filtered and the acidic aqueous solution is made alkaline with ammonia before being extracted with chloroform. After evaporation of the dried solvent over anhydrous Na2SO4, the hydrogenated product is obtained (formula X).
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Example 17: REDUCTION OF THE LACTAME FUNCTION ------------------------------------------ -One solubilizes 1 g of alkaloid 16 (formula in 45 ml of tetrahydrofuran. To this is added 640 mg of LiAlH4 is left in contact for 10 minutes at ordinary temperature and then the mixture is refluxed for 30 minutes. Then added 15 ml of ethyl acetate are cooled and this solution is concentrated on a rotary evaporator Finally, 30 ml of a saturated sodium tarotate solution are added and this aqueous solution is extracted with chloroform. solvent, the reduced product is obtained (formula XI) which gives a coloration
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cherry red with Ce (SO4) 2 / H2SO4.
Example 18: FORMATIONDEN-FORMYL-DEACETYLRETULIN
EMI19.1
(FORMULA XII) (FORMULA XII) TO 1 g OF ALKALOID obtained in Example 17 (fig.
XI), 15 ml of 10% HAc, 975 mg of KI04 and 250 ml of HO are added. It is left in contact for 12 minutes, then 3 g of NaBH4 are added and the whole is left for 14 h at 4OC.
Finally, this aqueous solution is extracted with chloroform. After evaporation of the solvent, the N-formyl-deacetylretulin is recovered.
N-formyl-deacetylretulin. we pass easily
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Lately with desaeetylretulin by acid hydrolysis (cf. example 8) then with retulin (cf. example 9).
EXAMPLE 19 OXIDATION OF ISORETULIN (OR RETULIN)
IN ISORETULINAL # RETULINAL)
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---------------------------------------------------------- ----
The reaction of oxidation of the alcoholic function of isoretulin presents a double essential interest during hejnisyntheses, because it makes it possible to obtain diastereoisomers in balance, isoretulinal and retulinal, which authorize not only the hemisynthesis of many dimeric alkaloids symmetrical or not, but also, by reduction, to pass from the isoretulin series to the retulin series, less easily accessible.
50 mg of isoretulin (or retulin) are dissolved in 2 ml of dichloromethane. 400 mg of pyridinium chlorochromate (PCC) and 500 mg of anhydrous sodium acetate are suspended in 4 ml of dichloromethane. The isoretulin solution is added with stirring and left in contact, still with stirring, for three hours. At the end of the reaction, a dilute ammonia solution is added to the suspension and the aldehyde formed is extracted with five times 25 ml of chloroform. The yield is quantitative.
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The pharmacological properties of isoretulin and retulin were discussed below.
Example 20 s LAMBDA CARRAGENINEDEMA
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-------------------------------------------
The test substances are administered intraperitoneally half an hour before the injection of lambda carrageenan into the sole of the plantar. The volume of the paw is measured by plethysmometry, before, then one, two, three and four hours after the injection of
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carragenin (1 mg / leg). - The first orientation tests focused on isoretulin used at doses of 8, 16, 32 and 64 mg / Kg. The results show the increase in the volume of the paw, expressed as a percentage of the normal volume.
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<tb>
<tb>
1 <SEP> hour <SEP> 2 <SEP> hours <SEP> 4 <SEP> hours <SEP>
<tb> Witness <SEP> 24. <SEP> 8 <SEP>: <SEP> i <SEP>: <SEP> 2. <SEP> 7 <SEP> 52. <SEP> 3 <SEP> * <SEP> 5 <SEP> 78. <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 5. <SEP> 9 <SEP> (8)
<tb> 8 <SEP> mg / Kg <SEP> 20.2 <SEP> ¯ <SEP> 6.5 <SEP> 56.6 <SEP> ¯ <SEP> 7.3 <SEP> 82.4 <SEP> + <SEP> 8. <SEP> 3 <SEP> (5)
<tb> 16 <SEP> mg / Kg <SEP> 16 <SEP> 2. <SEP> 3 <SEP> 36 <SEP> ¯ <SEP> 6.2 <SEP> 68 <SEP> + <SEP> 7. <SEP> 9 <SEP> (5)
<tb> 32 <SEP> mg / Kg <SEP> 19.7 <SEP> ¯ <SEP> 4.1 <SEP> 35.2 <SEP> ¯ <SEP> 6.1 <SEP> 57.7 <SEP> ¯ <SEP> 5.7 <SEP> (8)
<tb> 64 <SEP> mg / Kg <SEP> 12. <SEP> 4 <SEP> 1.4 <SEP> 33 <SEP> ¯3.4 <SEP> 69.6 <SEP> ¯ <SEP> 6.9 <SEP> (6)
<tb>
EMI20.4
Isoretulin is clearly inhibiting from 32 mg / kg, it is not active at 8 mg / kg and the effect is less after 4 hours for the dose, from 16 mg / kg.
- Tests with retulin.
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<tb>
<tb>
1 <SEP> hour <SEP> 2 <SEP> hours <SEP> 4 <SEP> hours
<tb> Witness <SEP> 24. <SEP> 2 <SEP> = <SEP> 3 <SEP> 68. <SEP> 8 <SEP> + <SEP> 7 <SEP> 93. <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 9 <SEP> (5)
<tb> 45 <SEP> mg / Kg <SEP> 30. <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 11. <SEP> 6 <SEP> 51. <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 11. <SEP> 5 <SEP> 63. <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 6. <SEP> 1 <SEP> (5)
<tb>
EMI20.6
0 Retulin is active for 45 mg / Kg. Its activity is close to that of isoretulin two er-
<Desc / Clms Page number 21>
(after).
Two additional tests were carried out by injecting retulin and isoretulin at doses of 50 fg and zeg into the paw, at the same time as carrageenan. At these doses, these two substances do not modify the edema and therefore do not act by a counter-irritant effect.
- Tests with other similar substances.
The results show the increase in the volume of the paw expressed as a percentage of the increase measured in the control animals after 4 hours.
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<tb>
<tb>
Isoretulin <SEP> 32 <SEP> mg / Kg <SEP> 74 <SEP> + <SEP> 7. <SEP> 3% <SEP>; <SEP> p <SEP> (0. <SEP> 05 <SEP>
<tb> 40 <SEP> mg / Kg <SEP> 65 <SEP> + <SEP> 8. <SEP> 4% <SEP>; <SEP> p < <SEP> 0. <SEP> 05 <SEP>
<tb> Retulin <SEP> 45 <SEP> mg / Kg <SEP> 68 <SEP> + <SEP> 6. <SEP> 5% <SEP>; <SEP> p < <SEP> (0. <SEP> 01 <SEP>
<tb> O-acetylisoretuin <SEP> 25 <SEP> mg / Kg <SEP> 114 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 5%
<tb> 50 <SEP> mg / Kg <SEP> 90. <SEP> 3 <SEP> + <SEP> 16. <SEP> 4% <SEP>
<tb> Holstiine <SEP> 25 <SEP> mg / Kg <SEP> 90 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 6% <SEP>
<tb> 50 <SEP> mg / Kg <SEP> 105 <SEP> + <SEP> 9. <SEP> 2% <SEP>
<tb> Brucine <SEP> 50 <SEP> mg / Kg <SEP> 98.
<SEP> 7 <SEP> + <SEP> 7%
<tb> 100 <SEP> mg / Kg <SEP> 60% <SEP> of <SEP> animals <SEP> die
<tb> in <SEP> convulsions.
<tb>
Only of the series cited, retulin and isoretulin exhibit anti-inflammatory activity.
EMI21.2
Carrageenan edema depends on the intervention of kinins and leukocytes with their pro-inflammatory factors including prostaglandins (PG). This edema is inhibited by aspirin and indomethacin.
Example 21: OEDEMA IN ZYMOSAN
EMI21.3
------------------------------
The effect of isoretulin on zymosan edema was then studied. It develops very quickly thanks to the immediate release of mastocytic amines.
<Desc / Clms Page number 22>
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"" res. To minimize this influence, all the rats are treated with mepyramine and methysergide half an hour before the injection of zymosan (1 mg / paw).
Isoretulin was administered intraperitoneally (40 mg / Kg) at the same time as the anti-amines.
EMI22.2
<tb>
<tb> l <SEP> hour <SEP> 3 <SEP> hours <SEP> 5 <SEP> hours
<tb> Witnesses <SEP> 28.3 <SEP> + <SEP> 2.9 <SEP> 44.8 <SEP> + <SEP> 5.7 <SEP> 47.8 <SEP> + <SEP> 6. <SEP> 9
<tb> 40 <SEP> mg / Kg <SEP> 12.5 <SEP> + <SEP> 2.8 <SEP> 29.3 <SEP> + <SEP> 3.8 <SEP> 34.4 <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 6
<tb>
Isoretulin intraperitoneally exerts a statistically significant inhibitory effect on edema with zymosan in its early phase. This edema depends on the intervention of the complement with the involvement of mast cell amines (this participation is reduced in our experimental conditions) and on the stimulation of polymorphonuclear cells.
This edema is inhibited by aspirin and indomethacin especially when the effects of mast cell amines have been suppressed.
These results indicate that in these two models of inflammatory reaction retulin and isoretulin have an anti-inflammatory power.
EMI22.3
Example 22: HYPOTENSIVE ACTION OF ARACHIDONIC ACID THAT The hypotensive action of arachidonic acid depends on its conversion into PG type substances, mainly PGI2. It is therefore a witness to a synthesis of PG carried out in the rat cardiovascular system and is suppressed by all inhibitors of PG formation, including aspirin and indomethacin. Retulin has been used in doses ranging from 40 to 49 mg / kg. It does not modify the action of arachidonic acid in the 6 animals tested. It cannot therefore be classified as inhibitors of PG synthesis.
In addition, the results show that this sub-
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stance by itself has no vasomotor effect. Its anti-inflammatory action cannot therefore be explained by a cardiovascular collapse which would compromise exchanges at the capillary level.
Example 23: ANTI-SPASMODIC EFFECT: INHIBITION OF
MYOSTIMULATING ACTION OF HISTAMINE AND BRADYKDtENE ON THE COBAYE ILION
EMI23.1
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Scraps of guinea pig ileum are superfused in series with Tyrode's liquid, whether or not with isotulinum added. This, from 10-6 M (0.4 g / ml) reduces the myostimulatory action of histamine on the ileum.
This antagonism is of a non-competitive type: the dose-response curve for histamine is shifted to the right but no longer reaches the maximum response, the antispasmodic effect increases with increases in con-
EMI23.2
isoretulin concentration (10-6 to 10-4 M or 0.4-435g / ml). for the highest concentration, the response to histamine is reduced by 20 times and the maximum response only reaches 50% of the initial maximum response. This antagonism is non-specific since it is also exerted vis-à-vis the myostimulant effect of bradykinihe. 0-acetylisoretulin (10-6 and 10-5 M) is inactive in this test.
This antispasmodic effect of isoretulin brings this substance closer to papaverine. However, isoretulin is devoid of the vasodilating effect of papaverine.
Therapeutic indications
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We can conclude from the above examples that the product has remarkable properties giving it a wide spectrum of applications.
The following therapeutic indications can be particularly retained.
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- Acute and chronic pain of all origins, in particular a) pain of spastic origin in the gastrointestinal tract, biliary tract, and urogenital system, dysmenorrhea of spasmodic origin, uterine cramps, renal colic, biliary colic and spasmodic colitis b) inflammatory rheumatism and periarticular diseases, bursitis, synovitis, tendonitis, tenosyvitis, gout, musculoskeletal diseases, arthritis - Treatment of inflammatory edemas of all origins , reaching the soft tissue.
The results obtained in animals suggest that
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the doses useful to be administered to humans by the oral route are of the order of 25 to 50 mg per dose, preferably at a rate of 1 to 3 doses per day.
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ISORETULIN Table I Hemisynthesis of isoretulin from strycnnine
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