"Procédé d'obtention d'objets végétaux génétiquement transformés".
La présente invention se rapporte au domaine du
génie génétique des plantes, et plus précisément, elle
a trait à un procédé d'obtention d'objets végétaux génétiquement transformés qui trouve son application
pour l'obtention de nouvelles variétés (formes)'de
plantes, y compris de plantes agricoles, se caractérisant par des propriétés déterminées, telles que la résistance spécifique à l'égard des herbicides, la résistance spécifique envers les virus et microorganismes pathogènes, une composition modifiée en amino-acides, l'accroissement de la biomasse utile, une.stabilité accrue à l'égard de facteurs défavorables du milieu ambiant et autres.
Il existe différents procédés, permettant de transformer les protoplastes des plantes supérieures
et d'obtenir par la suite, par sélection, des lignées cellulaires et des plantes ayant de nouvelles propriétés héréditaires. Ainsi, par exemple, on connaît un
procédé consistant à ajouter, à la suspension de pro-
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sur le mélange obtenu par des facteurs physiques et chimiques, ce qui entraîne la pénétration d'ADN dans
les protoplastes (Potrykus J., Shillito R.D., Saul
M.W., Paszkowski J. "Direct Gene Transfer. State of
the Art and Future Potential". Plant Mol.Biol.Reporter,
v.3, N[deg.]4, 1985, 117-128).
On connaît également un procédé dans lequel on additionne, aux protoplastes un matériel génétique
consistant en des vésicules lipidiques (liposomes) en présence d'agglutinateur, ce qui entraîne la conjonction des protoplastes et liposomes avec pénétration du matériel génétique dans le protoplaste (Nagata T. "Liposomes as a Carrier of Tiplasmid into Protoplasts". In Molecular Genetics of the bacteria-Plant Interaction. Ed. Pühler, Springer-Verlag, Berlin e,a.
1983, 268-273).
Les procédés connus susmentionnées se caractérisent par une application restreinte, compte tenu de ce qu'ils ne peuvent être utilisés que pour un nombre restreint de variétés de plantes, et plus précisément uniquement pour les plantes et les cultures cellulaires pour lesquelles sont élaborées des méthodes d'obtention et de culture des protoplastes avec régénération ultérieure, à partir de ces protoplastes, des plantes. Par ailleurs, les procédés connus susmentionnés se caractérisent par une faible effica-
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d'importantes dépenses du facteur de transformation.
On connaît un procédé d'obtention d'objets végétaux génétiquement transformés dans lequel on utilise, à titre d'objet-récipient, les protoplastes de Nicotiana tabacum. On introduit, dans les protoplastes, le plasmide pCGN 561 par micro-injection
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following micro-injection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol.Gen.Genet., 1986, v.202, 179-185).
Dans le procédé susmentionné, on n'a pas obtenu de lignées cellulaires ni de plantes avec de nouvelles propriétés héréditaires et, il ne montre pas l'expression du matériel génétique inoculé. Ledit procédé n'est exclusivement utilisable que pour les protoplastes, n'est réalisable que dans des conditions de laboratoire et ne peut trouver d'application pratique.
Le problème posé à la base de la présente invention consiste, par élargissement de l'éventail des objets-récipients et des facteurs de transformation, à obtenir un procédé permettant d'augmenter l'efficacité de la transformation, de réduire la consommation du facteur de transformation et d'augmenter le nombre d'espèces végétales, engagées dans des manipulations génétiques avec des plantes supérieures.
Ce problème se voit résolu par le fait que dans le procédé d'obtention d'objets végétaux génétiquement transformés par la voie de l'introduction du facteur transformant, dans l'objet-récipient, avec sélection ultérieure, à partir de ce dernier, de lignées cellulaires et de plantes présentant de nouvelles propriétés héréditaires, selon l'invention, on utilise, à titre de facteur transformant, la molécule d'ADN ou l'organelle cellulaire à réplication autonome, et à titre d'objet-récipient le protoplaste, la cellule isolée ou la cellule en structure, l'introduction du facteur transformant dans l'objet -récipient se réalisant par micro-injection. Les micro-injections peuvent être réalisées par n'importe quel procédé approprié. Il est avantageux de réaliser les microinjections sous l'action de la pression ou sous l'action du champ électrique.
Le procédé selon l'invention permet d'augmenter l'efficacité de la transformation à 40%, ce qui excède de 10 à 20 fois l'efficacité de transformation des procédés connus, la consommation du facteur transformant se voyant nettement réduite.
Le procédé selon l'invention permet d'utiliser à titre d'objets-récipients, aussi bien le protoplaste que la cellule isolée ou la cellule en structure et, à titre de facteur transformant, soit la molécule d'ADN, soit l'organite cellulaire à réplication autonome. Cela permet d'élargir le nombre d'espèces végétales engagées dans des manipulations génétiques,
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par exemple, les graminées.
Le procédé selon l'invention se réalise comme suit.
On place 1'objet-récipient, au titre duquel on utilise le protoplaste, la cellule isolée ou la cellule en structure (microcalus, calus embryonnaire, embryoîde) en solution nutritive appropriée dans une mi'crochambre, montée sur la table du microscope, et on les fixe au moyen d'une ventouse, ou par coulée d'agar ou mécaniquement. La micro-pipette en verre remplie de facteur transformant (plasmide, cosmide, chloroplaste) en milieu approprié, est introduite à l'aide du micromanipulateur dans l'objet-récipient sous contrôle visuel au microscope. La micro-injection se réalise sous l'action d'une pression pneumatique ou hydraulique, ou sous l'action du champ électrique. Le volume de la solution injectée est de 1 à 10 picolitres. Toutes les manipulations s'effectuent en conditions stériles. On transfère les objets-récipients injectés sur un milieu nutritif sélectif.
Le choix du milieu nutritif sélectif dépend du facteur transformant. On réalise la sélection des transformants et l'accumulation de leur biomasse par plusieurs passages des objets-récipients sur les milieux sélectifs.. On régénère-, à partir des lignées cellulaires transformées et des structures cellulaires transformées, les plantes sur les milieux sélectifs.
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l'inclusion et l'expression du matériel génétique inoculé par les méthodes biologiques connues.
De toute façon, l'invention sera bien comprise à .1'aidé des exemples concrets de réalisation qui suivent :
Exemple 1
On introduit, dans le protoplaste isolé du calus de Nicotiana debneyi, une micropipette dont le diamètre du bout atteint 1 micron et on exprime, par le système hydraulique, 1-2 picolitres de solution tampon (10 millimoles de Tris, pH 7,2, 1 millimole
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de KC1) contenant le plasmide pSV2Neo à raison-d'environ 100 copies par picolitre de solution tampon.
Au moment de la micro-injection et jusqu'aux premières divisions, le protoplaste se trouve dans le milieu nutritif de Caboche auquel on ajoute 0,1%' en masse d'agarose. On transfère les microcolonies qui se forment à partir des protoplastes injectés sur le milieu de Gamborg auquel on ajoute 60 mg/dm <3> de l'antibiotique sulfate de kanamycine. On a obtenu, sur 53 protoplastes injectés, 8 lignées cellulaires présentant une capacité de croissance sur un milieu contenant jusqu'à 120 mg/dm d'antibiotique. L'efficacité de transformation est égale à 15%. A partir de 3 lignées stables sur le milieu de Gamborg et sans addition de phyto-hormones, on a régénéré des plantes capables de croître et de s'enraciner dans le milieu contenant la kanamycine.
Exemple 2
On réalise le procédé de la même façon qu'à l'exemple 1. On utilise, à titre d'objet-récipient,
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titre de facteur transformant, le plasmide pLGV23Neo.
La micro-injection est effectuée par un système pneumatique. Trois lignées cellulaires ont été sélectionnées dans 20 cellules injectées, ces trois lignées présentant la capacité de croissance sur un milieu de Gamborg contenant 120 mg/dm de sulfate de kanamycine.
Exemple 3
On réalise le procédé de la même façon qu'à l'exemple 1. On utilise, à titre d'objet-récipient, les cellules en microcalus (de 8 à 30 cellules) de . Lycopersicon esculentum dans le milieu de Sachin avec 0,3% en masse d'agarose. On utilise, en tant que facteur transformant, le plasmide pGV0319. Conformément aux signes codés par le plasmide, la sélection des transformants s'effectue sur le milieu de Sachin ne contenant pas d'hormones. A la suite de l'introduction du plasmide dans 95 cellules, 19 lignées cellulaires ont été sélectionnées, ces lignées présentant une aptitude à la croissance en milieu sans hormones.
Efficacité de transformation 19%.
Exemple 4
On réalise le procédé de la même façon qu'à l'exemple 1. On utilise, à titre d'objet-récipient, les cellules isolées de Nicotiana tabacum, et, à titre de facteur transformant, le cosmide pYA 471. L'injection est réalisée sous l'action d'un champ électrique de 5 à 10 V, par quelques impulsions de 0,5 s, intensité du courant - 0,1 mA. A partir de 23 cellules transformées de telle sorte, on a obtenu 6 lignées cellulaires aptes à la croissance en milieu contenant 120 mg/dm3 de sulfate de kanamycine. Efficacité de transformation de près de 25%. De deux lignées cellulaires on a régénéré des plantes aptes à la croissance et à l'enracinement dans le milieu à kanamycine.
Exemple 5
Le procédé est réalisé comme à l'exemple 4. On utilise, à titre de récipient, les cellules du calus
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Mironovskaya précoce, fixées mécaniquement. On utilise 8 calus, dans chacun desquels on injecte 20 à
100 cellules. On fait passer les calus dans un milieu de Murashige-Skoog avec 2 mg/dm<3> d'acide 2,4dichlorophénoxyacétique et 60 mg/dm <3> de sulfate de kanamycine. On a obtenu 6 lignées cellulaires aptes
à la croissance dans un milieu contenant du sulfate de kanamycine,
Exemple 6
On réalise un procédé, identique à l'exemple 1. On utilise, à titre d'objet-récipient, les cellules blanches isolées du mutant plastidome de Nicotiana tabacum de lignée IP, et à tire d'organite à réplication autonome, les chloroplastes, isolés dans des feuilles de Nicotiana tabacum de lignée SR2, qui se 'caractérise par sa résistance envers la streptomycine, codée par les chloroplastes. On remplit la micropipette d'une suspension de chloroplastes en milieu de Jensen et Basshem, le diamètre du bout de la pipette atteignant 8 microns et on exprime 5-10 chloroplastes dans la cellule. Après les premières divisions, on transfère les cellules injectées dans un milieu de Gamborg contenant 1 mg/cm des sulfate de streptomycine.
Parmi 16 cellules injectées de telle sorte, on a retenu 3 lignées cellulaires se caractérisant par une couleur verte et une aptitude à la croissance en
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REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'objets végétaux génétiquement transformés par introduction du facteur transformant dans l'objet-récipient suivie d'une sélection, de ce dernier, de lignées cellulaires et de plantes présentant de nouvelles propriétés héréditaires, caractérisé en ce que l'on utilise à titre de facteur transformant, une molécule d'ADN ou un organite cellulaire à réplication autonome, et' à titre d'objet-récipient, une cellule isolée ou une cellule en structure, l'introduction du facteur transformant dans l'objet-récipient se réalisant par une micro-injection.
"Process for obtaining genetically transformed plant objects".
The present invention relates to the field of
plant genetic engineering, and more specifically, it
relates to a process for obtaining genetically transformed plant objects which finds its application
for obtaining new varieties (forms) 'of
plants, including agricultural plants, characterized by specific properties, such as specific resistance to herbicides, specific resistance to pathogenic viruses and microorganisms, a modified amino acid composition, increased useful biomass, increased stability with regard to unfavorable factors of the ambient environment and others.
There are different processes for transforming the protoplasts of higher plants
and subsequently obtain, by selection, cell lines and plants with new hereditary properties. So, for example, we know a
process of adding to the suspension of
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on the mixture obtained by physical and chemical factors, which leads to the penetration of DNA into
protoplasts (Potrykus J., Shillito R.D., Saul
M.W., Paszkowski J. "Direct Gene Transfer. State of
the Art and Future Potential ". Plant Mol.Biol.Reporter,
v.3, N [deg.] 4, 1985, 117-128).
A process is also known in which a genetic material is added to the protoplasts
consisting of lipid vesicles (liposomes) in the presence of agglutinator, which leads to the conjunction of protoplasts and liposomes with penetration of genetic material into the protoplast (Nagata T. "Liposomes as a Carrier of Tiplasmid into Protoplasts". In Molecular Genetics of the bacteria-Plant Interaction. Ed. Pühler, Springer-Verlag, Berlin e, a.
1983, 268-273).
The aforementioned known methods are characterized by a limited application, taking into account that they can only be used for a limited number of plant varieties, and more precisely only for plants and cell cultures for which methods are developed. obtaining and culturing of protoplasts with subsequent regeneration, from these protoplasts, of plants. Furthermore, the aforementioned known methods are characterized by a low efficiency.
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significant processing factor expenses.
A process for obtaining genetically transformed plant objects is known, in which the protoplasts of Nicotiana tabacum are used as container object. Plasmid pCGN 561 is introduced into the protoplasts by microinjection
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following micro-injection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol.Gen.Genet., 1986, v. 202, 179-185).
In the above-mentioned method, no cell lines or plants were obtained with new hereditary properties and it does not show the expression of the inoculated genetic material. Said method can only be used for protoplasts, can only be carried out under laboratory conditions and cannot be applied in practice.
The problem posed at the basis of the present invention consists, by widening the range of container objects and processing factors, in obtaining a process which makes it possible to increase the efficiency of processing, to reduce the consumption of the processing factor. transformation and increase the number of plant species, engaged in genetic manipulation with higher plants.
This problem is solved by the fact that in the process for obtaining genetically transformed plant objects by means of the introduction of the transforming factor, into the object-container, with subsequent selection, from the latter, of cell lines and plants having new hereditary properties, according to the invention, the DNA molecule or the cellular organelle with autonomous replication is used as transforming factor, and the protoplast as container object, the isolated cell or the structured cell, the introduction of the transforming factor into the object-receptacle being carried out by micro-injection. Micro-injections can be performed by any suitable method. It is advantageous to carry out microinjections under the action of pressure or under the action of the electric field.
The method according to the invention makes it possible to increase the efficiency of the transformation to 40%, which exceeds by 10 to 20 times the transformation efficiency of the known methods, the consumption of the transforming factor being significantly reduced.
The method according to the invention makes it possible to use, as container objects, both the protoplast and the isolated cell or the structured cell and, as transforming factor, either the DNA molecule or the organelle cell with autonomous replication. This allows the number of plant species involved in genetic manipulation to be enlarged,
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for example, grasses.
The process according to the invention is carried out as follows.
The container object is placed, under which the protoplast, the isolated cell or the structured cell (microcalus, embryonic callus, embryoid) is used in an appropriate nutritive solution in a semi-chamber, mounted on the microscope table, and they are fixed by means of a suction cup, or by agar casting or mechanically. The glass micro-pipette filled with transforming factor (plasmid, cosmid, chloroplast) in an appropriate medium, is introduced using the micromanipulator into the container object under visual control under the microscope. Micro-injection is carried out under the action of pneumatic or hydraulic pressure, or under the action of the electric field. The volume of the solution injected is from 1 to 10 picoliters. All manipulations are carried out under sterile conditions. The injected container objects are transferred to a selective nutritive medium.
The choice of the selective nutritive medium depends on the transforming factor. The selection of the transformants and the accumulation of their biomass are carried out by several passages of the container objects on the selective media. The plants are transformed on the selective media from transformed cell lines and transformed cell structures.
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the inclusion and expression of genetic material inoculated by known biological methods.
In any case, the invention will be clearly understood with the aid of the following concrete examples of embodiment:
Example 1
A micropipette with a tip diameter of 1 micron is introduced into the protoplast isolated from the callus Nicotiana debneyi, and 1-2 picoliters of buffer solution are expressed by the hydraulic system (10 millimoles of Tris, pH 7.2, 1 millimole
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of KC1) containing the plasmid pSV2Neo in an amount of approximately 100 copies per picoliter of buffer solution.
At the time of micro-injection and up to the first divisions, the protoplast is found in the Caboche nutrient medium to which 0.1% by mass of agarose is added. The microcolonies which form from the protoplasts injected are transferred onto the Gamborg medium to which 60 mg / dm <3> of the antibiotic kanamycin sulfate are added. Eight cell lines with growth capacity on a medium containing up to 120 mg / dm of antibiotic were obtained from 53 protoplasts injected. The transformation efficiency is equal to 15%. From 3 stable lines on Gamborg medium and without the addition of phyto-hormones, plants capable of growing and taking root in the medium containing kanamycin were regenerated.
Example 2
The process is carried out in the same way as in Example 1. As container object,
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as a transforming factor, the plasmid pLGV23Neo.
The micro-injection is carried out by a pneumatic system. Three cell lines were selected from 20 injected cells, these three lines having the capacity for growth on a Gamborg medium containing 120 mg / dm of kanamycin sulfate.
Example 3
The process is carried out in the same way as in Example 1. The microcalus cells (from 8 to 30 cells) of are used as container object. Lycopersicon esculentum in Sachin medium with 0.3% by mass of agarose. Plasmid pGV0319 is used as a transforming factor. In accordance with the signs encoded by the plasmid, the selection of transformants is carried out on Sachin medium which does not contain hormones. Following the introduction of the plasmid into 95 cells, 19 cell lines were selected, these lines having an ability to grow in a hormone-free medium.
Processing efficiency 19%.
Example 4
The process is carried out in the same way as in Example 1. The cells isolated from Nicotiana tabacum are used as object-container, and the cosmid pYA 471 as a transforming factor. is carried out under the action of an electric field of 5 to 10 V, with a few pulses of 0.5 s, current intensity - 0.1 mA. From 23 cells transformed in this way, 6 cell lines capable of growth in a medium containing 120 mg / dm3 of kanamycin sulfate were obtained. Processing efficiency of almost 25%. Plants capable of growth and rooting in kanamycin medium were regenerated from two cell lines.
Example 5
The process is carried out as in Example 4. The callus cells are used as a container.
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Early Mironovskaya, mechanically fixed. We use 8 calluses, in each of which we inject 20 to
100 cells. The calluses are passed through Murashige-Skoog medium with 2 mg / dm <3> of 2,4dichlorophenoxyacetic acid and 60 mg / dm <3> of kanamycin sulfate. We obtained 6 suitable cell lines
to growth in a medium containing kanamycin sulfate,
Example 6
A process is carried out, identical to Example 1. The white cells isolated from the plastidome mutant of Nicotiana tabacum of IP line, and derived from an autonomous replicating organelle, the chloroplasts, are used as container object. isolated in leaves of Nicotiana tabacum of line SR2, which is characterized by its resistance to streptomycin, coded by chloroplasts. The micropipette is filled with a suspension of chloroplasts in the middle of Jensen and Basshem, the diameter of the tip of the pipette reaching 8 microns and 5-10 chloroplasts are expressed in the cell. After the first divisions, the cells injected are transferred to Gamborg medium containing 1 mg / cm of streptomycin sulfate.
Among 16 cells injected in such a way, 3 cell lines were selected which are characterized by a green color and an aptitude for growth in
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CLAIMS
1. Method for obtaining genetically transformed plant objects by introducing the transforming factor into the container object followed by a selection, of the latter, of cell lines and plants having new hereditary properties, characterized in that l 'a transforming factor is used, a DNA molecule or a cellular organelle with autonomous replication, and' as a container object, an isolated cell or a structured cell, the introduction of the transforming factor into the container-object produced by micro-injection.