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Die Erfindung betrifft einen ELISA (Enzyme-iinked immunosorbend assay) -Kit zum
Nachweis zumindest eines oxidierten Biomakromoleküls, aus einer biologischen Probe umfassend einen festen Träger zur Adhäsion des Antigens, gegebenenfalls 2,4-Dinitro- phenylhydrazin (DNP) zur Zugabe zur biologischen Probe, DNP-Antikörper zum indirekten
Nachweis von Carbonyl-Verbindungen des oxidierten Biomakromoleküls und zumindest einen Standard zur semiquantitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Carbonyl- verbindungen des oxidierten Biomakromoleküls und ein ELISA-Verfahren zum Nachweis zumindest eines oxidierten Biomakromoleküls, aus einer biologischen Probe umfassend die
Schritte Adsorption des Antigens durch unspezifische Bindung an einen festen Träger,
Adsorption zumindest eines Standards an den festen Träger, Zugabe von 2,4-Dinitro- phenylhydrazin (DNP)
zur biologischen Probe bzw. zum Standard, Zugabe von DNP- Antikörper zur spezifischen und sensitiven Bindung an DNP, Zugabe eines Substrats zur Detektion des Antigen-Antikörper-Komplexes und Detektion mittels eines Photometers zur Auswertung von ELISA-Platten und die Verwendung des ELISA-Kits.
An dieser Stelle sei vorab bemerkt, dass die Abkürzungen DNP für 2,4-Dinitro- phenylhydrazin, SBS für Society of Biomolecular Screnning, BSA für Rinderserum- albumin, OPD für o-Phenylendiamin Dihydrochlorid, ABTS für 2,2'-Azino-bis-3- ethylbenzthiazoIin-6-sulfonsäure, TMB für 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und PBS für Phosphat-gepufferte, physiologische Kochsalzlösung verwendet werden.
Ein Immunoassay ist eine Technik, bei der mittels einer immunologischen Reaktion der qualitative und quantitative Nachweis einer Substanz durchgeführt wird. Immunoassays basieren auf dem Prinzip der Antigen- Antikörperreaktion, d. h. auf der Fähigkeit eines
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Antikörpers spezifisch Antigene zu erkennen und mit diesen eine Bindung einzugehen.
Dadurch ist es möglich entweder das Antigen oder den Antikörper in-vitro zu bestimmen.
Der ELISA (Enzyme-Iinked immunosorbent assay) -Assay gehört zu den Enzym-Immuno- assays, welche Methoden zur qualitativen und quantitativen Erfassung von Antigenen,
Haptenen oder Antikörpern sind, bei denen das Ausmass der immunologischen Reaktion durch den Substratumsatz eines Markerenzyms angezeigt wird. Das Enzym ermöglicht einen empfindlichen Nachweis des primären Antigen-Antikörper-Komplexes durch die
Sichtbarmachung über gefärbte Produkte mit photometrischer Detektion. Die Sensitivität des ELISAs ist von verschiedenen Faktoren abhängig, wie z.B. die Affinität des
Antikörpers, die Eigenschaften und das Molekulargewicht der zu bestimmenden
Komponente, die Reinheit der enzymmarkierten Immunreaktanten, Testbedingungen usw..
Bei der Festphasenadsorption (solid-face-Technik) kann je nach verwendeter Technik das
Antigen oder aber auch der spezifische Antikörper direkt an Zellulose oder eine
Plastikoberfläche adsorbiert werden. Die Isolierung des an das Trägermaterial gebundenen
Antigen-Antikörper-Komplexes erfolgt je nach beschichtetem Material entweder durch
Zentrifugation oder durch einfaches Dekantieren der Lösungen und anschliessendes
Waschen.
Der wichtigste Einsatzbereich für ELISA ist in der Labormedizin die medizinische in-vitro Diagnostik. Mit dieser Technologie können unter anderem Markerproteine für bestimmte Krankheiten in Körperflüssigkeiten von Patienten bestimmt werden. Weiterführend können nicht nur Markerproteine per se detektiert werden, sondern auch deren Metabolisierungszustand wie beispielsweise deren Oxidationszustand. Aber auch in der Umweltanalytik, wie z. B. zur Pestizidbestimmung in Boden- und Wasserproben, und der Lebensmittelanalytik werden diese Testsysteme verstärkt eingesetzt.
Bei vielen pathologischen Prozessen spielt der Oxidationszustand von Proteinen eine entscheidende Rolle. Oxidativer Stress kann eine Steigerung der Proteincarbonylierung bzw. einen Anstieg der Protein-Carbonylderivate verursachen. Dies kann durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen, wie z.B. Fragmentierung und Aminooxidation, verursacht durch Metallkatalyse oder durch Hypochlorsäure entstehen. Untersuchungen zu oxidativen Modifikationen von Proteinen, vor allem im Zusammenhang mit reaktiven
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Sauerstoffspezies, haben in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Die
Bildung der Carbonylgruppen wird neben weiteren oxidativen Veränderungen der
Aminosäuren als ein früher Marker der Proteinoxidation angesehen.
Es ist bewiesen, dass oxidative Effekte eine grosse Rolle bei verschiedenen pathophysiolgischen Prozessen spielen. Carbonylspiegel steigen sowohl bei verschiedenen
Krankheiten als auch mit dem Alter und beschleunigen bzw. begünstigen die Entstehung von beispielsweise Alterungsprozesse, Lungenerkrankungen, Morbus Alzheimer, Morbus
Parkinson, Nierenerkrankungen, Ischämie-Reperfusions-Syndrom, Diabetes mellitus und
Mukoviszidose.
Carbonyl-Verbindungen entstehen beispielsweise direkt durch Proteinoxidation und sind sekundäre Konjugate von Aldehyden, welche z. B. durch Fettperoxidation gebildet werden.
Es gibt aber zur Zeit keine Methode, die zwischen den Quellen der Carbonyl-Verbindungen unterscheiden kann.
Ein konventioneller Assay um Carbonyl-Verbindungen bei Proteinen nachzuweisen, ist ein colorimetrisches Verfahren, das die Bindung von Dinitrophenylhydrazin an Carbonyl- Verbindungen misst. Eine colorimetrische Messung erfordert eine grosse Menge an Protein, welche meist von einer klinischen Probe nicht vorhanden ist. Ausserdem sind die Schwankungen bei den Ergebnissen sehr hoch.
Weitere zur Zeit zur Verfügung stehende Messmethoden sind die HPLC (high performance liquid chromatography), wodurch einige dieser Nachteile beseitigt werden können, allerdings kein hoher Probendurchsatz erzielt werden kann.
Eine Westernblotanalyse steigert zwar die Sensitivität und Selektivität gegenüber colorimetrischer Verfahren ist aber für den Durchsatz grosser Probenmengen ebenfalls ungeeignet und des weiteren kann dieses Verfahren nicht als quantitativer Assay eingesetzt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Möglichkeit zum Nachweis von oxidierten Biomakromolekülen zur Verfügung zu stellen. Eine Teilaufgabe der Erfindung ist die
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oxidierten Biomakromoleküle aufgrund der Gegenwart von Carbonyl-Verbindungen zu detektieren.
Diese Aufgabe der Erfindung wird jeweils eigenständig durch einen eingangs erwähnten
ELISA (Enzyme-linked immunosorbend assay) -Kit zum Nachweis zumindest eines oxidierten Biomakromoleküls, aus einer biologischen Probe umfassend einen festen Träger zur Adhäsion des Antigens, gegebenenfalls 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNP) zur Zugabe zur biologischen Probe, DNP-Antikörper zum indirekten Nachweis von Carbonyl-
Verbindungen des oxidierten Biomakromoleküls und zumindest einen Standard zur semiquantitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Carbonylverbindungen des oxidierten Biomakromoleküls sowie durch ein ELISA- Verfahren zum Nachweis zumindest eines oxidierten Biomakromoleküls, aus einer biologischen Probe umfassend die Schritte
Adsorption des Antigens durch unspezifische Bindung an einen festen Träger, Adsorption zumindest eines Standards an den festen Träger,
gegebenenfalls 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNP) zur Zugabe zur biologischen Probe, Zugabe von 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNP) zur biologischen Probe bzw. zum Standard, Zugabe von DNP-Antikörper zur spezifischen und sensitiven Bindung an DNP, Zugabe eines Substrats zur Detektion des Antigen-
Antikörper-Komplexes und Detektion mittels eines Photometers zur Auswertung von ELISA-Platten sowie durch die Verwendung des ELISA-Kits, wodurch eine biologische Probe, insbesondere eine oxidierte biologische Probe, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Körperflüssigkeiten, wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, etc., und/oder Gewebe und/oder aus Zellkulturen bzw. Zellkulturüberständen nachgewiesen wird, gelöst.
Von Vorteil ist dabei, dass durch die Zugabe von DNP-Antikörper Carbonyl-Verbindungen der Biomakromoleküle indirekt charakterisiert werden können, welche einen Hinweis auf pathologische Schädigungen von biologischem Gewebe geben. Es hat sich nämlich gezeigt, dass beispielsweise oxidativer Stress einen Anstieg von Carbonyl-Verbindungen in biolo- gischen Proben verursacht. Durch den gezielten Nachweis der Carbonyl-Verbindungen und deren Derivate ist es möglich, bereits sehr früh einen pathologischen Zustand zu diagnostizieren und kurativ tätig zu werden. Des weiteren erweist sich von Vorteil, dass für das erfindungsgemässe ELISA-Verfahren nur eine geringe Menge Protein erforderlich ist, welche vergleichbar ist mit jener Menge an Protein, welche für die HPLC-Methode
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notwendig ist.
Im Gegensatz dazu wird für im Stand der Technik verwendete colorimetrische Bestimmungen eine grössere Menge an Protein benötigt. Vorteilhafterweise ist vorgesehen, dass ein Standard zur semiquantitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Carbonyl-Verbindungen des oxidierten Biomakromoleküls enthalten ist, wodurch eine exakte Konzentrationsbestimmung der Carbonyl-Verbindungen möglich ist.
Gemäss einer Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass der feste Träger eine Mikrotiterplatte nach SBS-Standard ist, wodurch eine grosse Probenanzahl gleichzeitig bearbeitet werden kann und eine Vielzahl von verschiedenen Proben gleichzeitig analysiert werden kann und dadurch die Möglichkeit zur Verwendung des ELISA-Kits und-Verfahrens in High-
Throughput-Screening-Verfahren unterstützt wird. Des weiteren zeichnen sich
Mikrotiterplatten durch leichte manuelle als auch automatisierbare Bearbeitungsmöglichkeiten aus und sind für das Ablesen der Testergebnisse in Plattenphotometer geeignet. Vorteilhaft erweist sich auch, dass sowohl für die automatische Bearbeitung der Mikrotiterplatten als auch fiir das Ablesen der Testergebnisse in den Mikrotiterplatten standardisierte sich aufdem Markt befindliche Pipettierautomaten bzw.
Roboter eingesetzt werden können.
Die DNP-Antikörper können sowohl monoklonal und/oder polyklonal sein, wonach durch das Vorliegen von monoklonalen Antikörper sowohl das Ausmass für Kreuzreaktivität als auch für unspezifische Bindungen herabgesetzt werden kann. Allerdings geht dies auf Kosten der Sensitivität. Polyklonale Antikörper steigern zwar die Sensitivität, allerdings sind häufiger Kreuzreaktionen möglich und somit sinkt die Spezifität.
Nach einer Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass die DNP-Antikörper markiert sind, wodurch ein direkter Nachweis der Antikörper möglich ist, ohne ein Konjugat einsetzen zu müssen und dadurch der Aufwand für zusätzliche Reagenzien eingespart werden kann. Des weiteren erweist sich dadurch von Vorteil, dass der Arbeitsschritt, welcher die Reaktion des Antikörpers mit dem Konjugat erfordert, hinfällig wird.
Nach einer weiteren Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass die DNP-Antikörper mit einem Enzym wie z.B. Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, #-Galaktosidase, Glucose-Oxidase, etc., markiert sind, wonach durch ein
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photometrisches Analyseverfahren die Oxidation bzw. das Ausmass der Oxidation der biologischen Probe nachgewiesen werden kann.
Es ist auch möglich, dass als Standard ein Protein, wie z. B. Albumin, insbesondere
Rinderserumalbumin (BSA), enthalten ist, wodurch einerseits unspezifische Bindungsstellen aufdem festen Träger abgesättigt werden können und andererseits ein Protein in unterschiedlichen Konzentrationen bzw. in Verdünnungsreihen zur Erstellung von
Standardkurven zur Verfügung stehen und dadurch eine quantitative Auswertung möglich ist.
Von Vorteil ist auch, dass das Protein, insbesondere BSA, oxidiert und/oder reduziert ist, wodurch mittels einer Standardkurve die Anzahl der Carbonyl-Verbindungen quantitativ bestimmt werden kann, wobei beispielsweise durch Verwendung von reduziertem BSA eine genau definierte Menge von Carbonyl-Verbindungen pro Milligramm Protein nachgewiesen werden kann.
In einer Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass das Protein in Lösung, in einem
Konzentrat in fester oder flüssiger Form, lyophilisiert, etc., enthalten ist, wodurch die
Lagerbedingungen und die Lagerungsdauer und somit die Haltbarkeit verlängert werden kann und weiters eine Aufbewahrung bei Raumtemperatur möglich ist.
Möglich ist weiters, dass 2,4-Dinitrophenylhydrazin umkristallisiert ist, wodurch ein hö- herer Reinheitsgrad erzielt wird und dadurch keine Störungen bzw. Verunreinigungen der
Reaktion der biologischen Probe mit DNP hervorgerufen werden können.
In einer Weiterbildung des ELISA-Kits erweist sich von Vorteil, dass 2,4- Dinitrophenylhydrazin (DNP) zur Zugabe zur biologischen Probe enthalten ist, wodurch die Sensitivität des Assays erhöht werden kann.
In einer weiteren Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass ein DNP-Puffer enthalten ist, mit welchem optimale Reaktionsbedingungen geschaffen werden können.
Möglich ist des weiteren, dass ein DNP-Puffer, welcher aus Guanidiniumhydrochlorid und KH2P04 hergestellt ist, enthalten ist, wobei optimale Reaktionsbedingungen für die Reaktion von DNP mit einem Biomakromolekül gegeben sind.
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Nach einer Ausführungsvariante ist vorgesehen, ein Substrat aus einer Gruppe umfassend o-
Phenylendiamin Dihydrochlorid (OPD), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), 2,2'-Azino- bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS), p-Nitrophenylphosphat, auszuwählen, wodurch eine Reaktion des Enzyms mit dem Substrat stattfindet und dadurch beispielsweise eine radioaktive Detektion, die sich einerseits bei der Entsorgung sehr problematisch zeigt bzw. andererseits auch bereits bei der Verarbeitung zusätzliche Schutzmassnahmen bzw.
Sicherheitseinrichtungen erfordert, eingespart werden kann.
Vorteilhaft ist weiters, dass eine Blockierungslösung enthalten ist, wodurch einerseits die biologische Probe verdünnt werden kann und andererseits Bereiche aufdem festen Träger blockiert werden können und dadurch unspezifische Bindungen des Biomakromoleküls bzw. des Antikörpers während des Analyseverfahrens verhindert werden.
Möglich ist weiters, dass ein Konjugat zur Bindung an DNP-Antikörper enthalten ist, wodurch eine indirekte Markierung des DNP-Antikörpers ermöglicht wird und dadurch der
Antikörper nicht direkt markiert werden muss. Damit kann sowohl ein aufwendiges
Produktionsverfahren als auch sterische Hemmnisse bei der Anbindung des DNP-
Antikörpers an DNP bzw. das Biomakromolekül verhindert werden.
Nach einer Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass das Konjugat ein Anti-Kaninchen-IgG ist, wodurch dieses Konjugat mit einem Standardverfahren, nämlich durch Immunisierung eines Kaninchens, in grossen Mengen gewonnen werden kann.
Von Vorteil ist auch, dass das Anti-Kaninchen-IgG mit Peroxidase, z. B. Meerrettich- Peroxidase, alkalische Phosphatase, #-Galaktosidase, Glucose-Oxidase,-etc., markiert ist, wodurch durch die Verwendung dieser Markierungen Standard-Detektionsverfahren eingesetzt werden können, wie z.B. eine photometrische Detektion.
Es ist noch vorgesehen, dass eine Gebrauchsanweisung zur Durchführung der Nachweismethode enthalten ist, wonach der ELISA-Kit einfach von allen Laborangestellten bzw. in Arztordinationen angewendet werden kann.
Schliesslich ist noch von Vorteil, dass die Komponenten separat verpackt sind, wodurch beispielsweise keine zufällige Reaktion der unterschiedlichen Komponenten untereinander
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stattfinden kann und die einzelnen Komponenten auch unabhängig voneinander geöffnet werden können.
Als biologische Probe kann eine Körperflüssigkeit, wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma,
Speichel, Urin, Gewebe, etc., wobei der ELISA-Kit Assay fiir die Analyse von Proben unterschiedlichsten Ursprungs verwendet werden. Vorteilhaft dabei erweist sich weiters, dass für die Proben unterschiedlichsten Ursprungs der gleiche Kit und das gleiche
Verfahren verwendet werden können.
Als biologische Probe kann auch eine Zellkultur oder ein Zellkultur-Überstand eingesetzt werden, wobei wiederum der gleiche ELISA-Kit und das gleiche Verfahren eingesetzt werden können.
Im ELISA-Verfahren ist vorgesehen, dass die Absorption der Biomakromoleküle an den festen Träger unspezifisch erfolgt, wodurch ein weiterer Antikörper, welche für die
Anlagerung an den festen Träger und zur spezifischen Bindung des Biomakromoleküls dienen würde, eingespart werden kann und dadurch die Kosten für die Reagenzien reduziert werden.
Weiters erweist sich von Vorteil, dass die Detektion photometrisch erfolgt, weil durch die enzymatische Markierung radioaktive Markierungen obsolet werden und somit
Sicherheitsvorkehrungen, welche durch Arbeiten mit radioaktiven Material notwendig sind, verhindert werden können bzw. eingespart werden können und weiters ein mühsames Entsorgeverfahren erspart bleibt.
Gemäss einer Weiterbildung des ELISA-Verfahrens ist vorgesehen, dass die biologische Probe mit einem Photometer zur Auswertung von ELISA-Platten bei einer Wellenlänge ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 390 nm, vorzugsweise 410 nm, insbesondere 425 nm und einer oberen Grenze von 470 nm, vorzugsweise 492 nm, insbesondere 498 nm, bestimmt wird, wodurch eine Quantifizierung der Carbonyl- Verbindungen und somit der oxidierten Biomakromoleküle möglich ist.
Schliesslich hat sich gezeigt, dass der ELISA-Kit zum Nachweis von Carbonyl- Verbindungen aus einer biologischen Probe ausgewählt aus einer Gruppe umfassend
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Körperflüssigkeiten, wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, etc., und/oder
Gewebe bzw. eine Zellkultur oder ein Zellkultur-Überstand verwendet werden kann, wobei wiederum der gleiche ELISA-Kit und das gleiche Verfahren für unterschiedliche Quellen eingesetzt werden können.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden Ergebnisse und Standardkurven anhand der nachfolgenden Figuren näher erläutert.
Es zeigen jeweils:
Fig. 1 ein Diagramm mit einer Eichkurve aus oxidiertem und reduziertem BSA;
Fig. 2 ein Diagramm mit dem Effekt verschiedener Behandlungen auf die
Proteinoxidation.
Einführend sei festgehalten, dass in den unterschiedlich beschriebenen Ausführungsformen gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen bzw. gleichen Bauteilbezeichnungen versehen werden, wobei die in der gesamten Beschreibung enthaltenen Offenbarungen sinngemäss auf gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen bzw. gleichen Bauteilbezeichnungen übertragen werden können. Auch sind die in der Beschreibung gewählten Lageangaben, wie z.B. oben, unten, seitlich usw. aufdie unmittelbar beschriebene sowie dargestellte Figur bezogen und sind bei einer Lageänderung sinngemäss aufdie neue Lage zu übertragen. Weiters können auch Einzelmerkmale oder Merkmalskombinationen aus den gezeigten und beschriebenen unterschiedlichen Ausführungsbeispielen für sich eigenständige, erfinderische oder erfindungsgemässe Lösungen darstellen.
Um eine optimal sensitive Detektionsmöglichkeit für Carbonyl-Verbindungen in biologischen Proben zu erreichen, muss sowohl ein geeignetes Verfahren als auch eine geeignete Kombination von verwendetem Träger, wie z. B. Plattenmaterial, spezifischem Antikörper, der eingesetzten Proteinkonzentration, den Inkubationsbedingungen, der Blockierungslösung, wie z.B. pH-Wert, Ionenstärke, etc., gefunden werden.
Der feste Träger ist gemäss einer Standardgrösse einer Mikrotiterplatte ausgebildet und besitzt Abmessungen gemäss den Empfehlungen der'SBS (Society ofBiomolecular Screnning ; www.SBSonline.org).
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Es werden Mikrotiterplatten mit 96, 384 bzw. 1536 Vertiefungen verschiedener Hersteller, wie z.B. Nunc bzw. Greiner, verwendet. Es können beispielsweise Nunc-Immunoplatten
MaxiSorb oder Greiner High-Bind Mikrotiterplatten verwendet werden. Greiner-
Mikrotiterplatten zeigen die besten Ergebnisse, weil die Interassay-Unterschiede am geringsten sind und sich eine höhere Bindungskapazität für die BSA-Standardkurve zeigt.
Biomakromoleküle, insbesondere oxidierte Antigene, werden aus einer biologischen Probe, z. B. Vollblut, Plasma, Serum, Harn, Speichel, Sperma, Tränenflüssigkeit,
Gelenksflüssigkeit, etc., aus Geweben oder aus Zellkulturen bzw. Zellkulturüberständen gewonnen. Die Biomakromoleküle werden entweder direkt aus der biologischen Probe, eventuell nach erfolgter Aufkonzentrierung, oder entsprechend dem Fachmann bekannten
Standardmethoden isoliert bzw. deren Konzentration bestimmt, z. B. unter Verwendung eines BioRad-Assays. Die isolierten Proteine werden anschliessend mit einem Puffer, z.B.
PBS (Phosphat-gepufferte, physiologische Kochsalzlösung) bis zu einer Endkonzentration, ausgewählt aus einem Bereich mit einer oberen Grenze von 20 mg/ml, vorzugsweise 10 mg/ml, insbesondere 5 mg/ml, und einer unteren Grenze von 0,1 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml, insbesondere 4 mg/ml, verdünnt. Die biologische Probe kann allerdings auch in den bereits erwähnten Konzentrationen in einem Puffer mit reduzierendem Agens, wie z.B.
Dithiothreitol oder Mercaptoethanol, etc., vorliegen.
Die benötigte Menge der biologischen Probe für das erfindungsgemässe ELISA-Verfahren wird aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 g, vorzugsweise 1 g, insbesondere 10 g, und einer oberen Grenze von 1 mg, vorzugsweise 500 g, insbesondere
100 g, ausgewählt. Besonderes vorteilhaft hat sich eine Probenmenge von 60 g erwiesen.
Für aus dem Stand der Technik bekannte colorimetrische Bestimmungen wird eine Probenmenge von ca. 10 mg benötigt.
Die für den ELISA benötigten isolierten Proteine werden in einer DNP (Dinitrophenylhydrazin)-Lösung, bestehend aus DNP, vorzugsweise umkristallisiertem DNP, Guanidiniumhydrochlorid und Kaliumphosphatpuffer derivatisiert. Zur Derivatisierung soll eine Endkonzentration des Proteins von 10 mg/ml, vorzugsweise 5 mg/ml, insbesondere 0,5 mg/ml, erzielt werden. Besonders vorteilhaft hat sich eine Konzentration von 4 mg/ml erwiesen. Es folgt eine Inkubation des Reaktionsansatzes bei
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Raumtemperatur oder bei 4 C. Die Dauer der Inkubation erstreckt sich über einen
Zeitraum mit einer unteren Grenze von 5 Minuten, vorzugsweise 15Minuten, insbesondere
30 Minuten und einer oberen Grenze von 45 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, insbesondere 90 Minuten.
Vorzugsweise erfolgt die Inkubation im Dunkeln und in regelmässigen Intervallen wird die Probe ordentlich durchmischt bzw. gevortext.
Der Inkubationsansatz wird in einen Natriumphosphatpuffer in einer Verdünnung von 1 :
1000, vorzugsweise 1:500, insbesondere 1:400, überführt. Besonders vorteilhaft hat sich eine Verdünnung von 1:200 erwiesen.
Aus diesem Puffer-Proben-Gemisch werden Aliquots in Wells von Mikrotiterplatten pipettiert. Vorzugsweise werden zweimal 150 l Aliquots, insbesondere dreimal 200 l
Aliquots in die Wells verteilt, wodurch eine Duplicate- bzw. Triplicateanordnung entsteht.
Die Mikrotiterplatten werden mit einem Deckel oder einer Folie verschlossen und zwei
Stunden oder vorzugsweise über Nacht bei Raumtemperatur bzw. bei 4 C inkubiert.
Während dieser Zeit erfolgt die Proteinadsorption an den Kunststoff der Mikrotiterplatten.
Die direkte Beschichtung der Mikrotiterplatten beruht auf einer unspezifischen hydrophoben
Wechselwirkung zwischen dem Trägermaterial und dem Proteinmolekül. Diese Interaktion stellt eine Proteinadsorption durch nicht kovalente Bindung dar.
Optional können nach der Inkubation die Wells der Mikrotiterplatte beispielsweise mit PBS-
Puffer gewaschen werden. Der Puffer wird durch Abpipettieren, Absaugen oder Auskippen entfernt.
Nach der direkten Beschichtung des festen Trägers mit dem Proteinmolekül kann eine Nachbeschichtung erfolgen, welche zur Absättigung von unbeschichteten Flächen in den Wells, um spätere unerwünschte Adsorptionen aus den verwendeten Reagenzien zu vermeiden, dient. Dazu werden nach den Waschschritten die Wells mit reduziertem BSA (bovine serum albumin), vorzugsweise mit 0,1 % reduzierter BSA-Lösung, für einen Zeitraum von 3 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, insbesondere 1,5 Stunden, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation erfolgt vorzugsweise im Dunklen.
Nach der Inkubation wird die BSA-Lösung entfernt und in die Wells wird Anti-DNP- Anitkörperlösung pipettiert. Der Antikörper, welcher z. B. aus Kaninchen isoliert wird, wird
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vorzugsweise in einer Konzentration von 1: 100.000, vorzugsweise von 1:10,000, insbesondere von 1:1000, in 0,1% reduzierter BSA-Lösung mit 0,1% Tween-20 aufgebracht. Die Inkubation erfolgt 1 Stunde bei 37 C. Nach der einstündigen Inkubation bei 37 C folgen Waschschritte. Diese besteht aus drei Waschstufen mit PBS.
In jedes Well der Mikrotiterplatte wird Konjugat zugegeben, wobei sich in Verbindung mit photometrischer Detektion Peroxidase (aus Meerrettich) bzw. alkalische Phosphatase (Kälberdarm) konjugierte Antikörper am besten eignen. Als Konjugat wird z.B. anti-
Kaninchen IgG Peroxidase (Meerrettich) oder alkalische Phosphatase, markierter
Antikörper in einer Konzentration von 1:30.000, vorzugsweise 1:10.000, insbesondere 1:3.000, in 0,1 % reduzierter BSA-Lösung mit 0,1 % Tween-20 zugegeben. Der Anti-DNP-
Antikörper kann beispielsweise auch biotinyliert sein.
Es erfolgt eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Die Inkubation findet vorzugsweise im Dunklen statt. Es folgt wiederum ein dreistufiger Waschschritt mit PBS und nach den Waschschritten wird eine Entwicklerlösung mit Substrat in die Wells zugegeben.
Als Substrate bzw. Cosubstrate eignen sich am besten o-Phenylendiamin (OPD) oder 3,3'- ,5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) sowie 2,2'-Azino- bis(3-Ethylbenzthiazolin-6-
Sulfonsäure (ABTS). Mit homogenen Substraten zeigt die Peroxidase mit fluorogenen
Substraten die alkalische Phosphatase die höchsten molaren Umsatzraten.
Die Entwicklerlösung bestehend aus 50 mM NH2HPO4 und 24 mM Zitronensäure mit o- Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid wird für zumindest 20 Minuten, vorzugsweise 25 Minuten, insbesondere 30 Minuten bei 37 C inkubiert und die Reaktion wird durch Zugabe von 2,5 M H2S04 gestoppt. Falls die Farbreaktion nach einer halben Stunde noch nicht eingetreten ist, können die Proben bis zu einer Stunde bei 37 C inkubiert werden.
Die Extinktion wird bei einer Wellenlänge ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 390 nm, vorzugsweise 410 nm, insbesondere 425 nm und einer oberen Grenze von 470 nm, vorzugsweise 492 nm, insbesondere 498 nm in einem Photometer zur Auswertung von ELISA-Platten gemessen. Eine Standardkurve mit reduziertem und oxidiertem BSA wird parallel aufjeder Platte mitgemessen. Auf der Platte ist weiters ein
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Leerwert für die DNP-Lösung ohne Protein vorhanden. Der Messwert dieses Leerwerts wird von den anderen gemessenen Werten subtrahiert.
In Fig. 1 wird eine Eichkurve, hergestellt aus reduziertem und oxidiertem BSA, sowohl auf
Greiner High-Bind als auch auf Nunc MaxiSorb Mikrotiterplatten gezeigt.
BSA besitzt bereits im unbehandelten Zustand Carbonylgruppen. Zusätzlich kann es weiters mit Natriumborhydrid reduziert werden. Vollständig reduziertes BSA wird durch die Zu- gabe von 1 g BSA zu 100 ml PBS-Puffer mit 2 g Natriumborhydrid gewonnen.
Anschliessend wird der Reaktionsansatz 90 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, insbesondere 30 Minuten inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von Salzsäure neutralisiert.
Nach einer Übemachtdialyse der biologischen Probe gegen PBS wird die
Proteinkonzentration durch Messung mit einer Wellenlänge von 280 nm auf4 g/l für die
Verwendung in einer Standardkurve oder auf 0,1 % für die Verwendung als
Blockierungslösung eingestellt.
Oxidiertes BSA, welches zusätzliche Carbonylgruppen umfasst, kann als Referenz verwendet werden. Oxidiertes BSA wird durch eine Reaktion von 50 mg BSA pro ml PBS mit Hypochlorsäure mit einer Endkonzentration von 5 mM hergestellt. BSA mit einer Konzentration von 40 mg/ml kann auch mit 25 mM Ascorbinsäure und 0,1 mM Eisenammoniumsulfat in PBS beinhaltend 1 mM EDTA oxidiert werden.
Die BSA-Lösungen können bei - 80 C über einen längeren Zeitraum oder bei 4 C für eine Woche aufbewahrt werden, wobei keine Veränderung im Carbonylgehalt beobachtet wird.
Validierung des ELISA: Die Standardkurven werden durch Zusammenführung von unterschiedlichen Anteilen (von 0 bis 100 %) von mit Hypochlorsäure oxidiertem BSA und vollständig reduziertem BSA hergestellt, wobei die Gesamtproteinkonzentration konstant gehalten wird. Der Carbonylgehalt von oxidiertem BSA kann in einem Colorimetrischen Assay bei einer Wellenlänge von 375 nm bestimmt werden. Der Carbonylgehalt des vollständig reduzierten BSA kann ebenfalls bei einer Wellenlänge von 375 nm bestimmt werden. Die Messung
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ergibt standardmässig eine Extinktion von 0,13Units pro 10 mg, was einem Äquivalenzwert von 0,6 nmol Carbonylgruppen pro mg BSA entspricht.
Die Schlüsselerfordernis für die Sensitivität ist ein niedriger Reagens-Leerwert, welcher aus der DNP-Lösung ohne Protein resultiert. Dies wird erreicht, indem die Mikrotiterplatte mit
Borhydrid reduziertem BSA blockiert wird, welches im Durchschnitt eine Absorption für den Leerwert von 0,03 bis 0,04 Units über dem der Blockierungslösung ergibt. Nicht derivatisiertes Protein und derivatisiertes Protein ohne Anti-DNP-Behandlung weisen die gleiche Absorption wie die Blockierungslösung alleine auf.
Wenn die Menge der derivatisierten Proteine, welche als Coatingantigene in die Wells zugegeben wird, steigt, zeigt sich ein linearer Anstieg in der Adsorption bis zu 2 nmol/mg
Gesamtprotein. Oberhalb dieser Konzentration ist der Anstieg nur gering.
DNA und RNA verfälschen das Messergebnis, indem ein höherer Wert als tatsächlich für die Carbonyl-Verbindungen angezeigt wird. Nukleinsäuren von Gewebeextrakten werden daher mit einem Fachmann dieses Gebiets bekannten Methoden, wie z. B. DNAse bzw.
RNAse Behandlung, entfernt.
Fig. 2 zeigt den Effekt verschiedener Behandlungen auf die Proteinoxidation. Es wird die Konzentration der Carbonyl-Verbindungen in unbehandelten Zellen (Kontrolle), wie in Balken 1 dargestellt, und in Zellen, welche oxidativen Stress, z. B. durch Bestrahlung mit UV-Licht, wie in Balken 2 dargestellt, ausgesetzt sind und von Zellen, welche mit Antioxidantien, wie z. B. Vitamine inkubiert wurden, gezeigt. Aus dieser Grafik lässt sich der günstige Effekt von Antioxidantien, wie in Balken 3 durch die Behandlung der "gestressten" Zellen mit Vitamin C und in Balken 4 durch die Behandlung mit Vitamin E dargestellt, aufdie Konzentration der Carbonyl-Verbindungen ablesen.
Ausführungsbeispiel: Aus mit Zitrat, EDTA oder Heparin behandeltem Vollblut wird die Proteinkonzentration mit dem Biorad-Assay -Kit bestimmt. Die Proteinkonzentration wird mit PBS auf 4 mg/ml eingestellt.
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In einem Reaktionsgefäss wird ein Volumen von 15 l der Proteinlösung bzw. der Leerwert oder der Standards mit 45 l einer frisch zubereiteten DNP-Lösung in einer Konzentration von 2 mg/ml versetzt und durch Vortexen gut gemischt. Es folgt eine 45minütige Inkubation bei Raumtemperatur im Dunklen. Zwischenzeitlich wird die Probe gelegentlich gevortext.
Je 5 l der oben genannten Inkubationsansätze werden in 1 ml Coating(Blockierungs)lösung pipettiert und gut gemischt. Aus diesen Coating (Blockierungs)lösung bzw.
Leerwert- bzw. Standardgemisch werden jeweils dreimal 200 l Aliquots in die Wells der
Mikrotiterpatten überführt. Die Mikrotiterplatten werden abgedeckt und über Nacht bei 4 C inkubiert.
Nach der Inkubation wird die Coating(Blockierungs)lösung ausgekippt und die restliche
Flüssigkeit wird mittels Zellstoff abgesaugt. In jedes Well werden 250 l 0,1 % reduziertes
BSA pipettiert. Es folgt eine eineinhalbstündige Inkubation bei Raumtemperatur im
Dunklen.
Anschliessend wird die Lösung ausgekippt und in jedes Well 200 l Anit-DNP-
Antikörperlösung pipettiert. Es erfolgt eine einstündige Inkubation bei 37 C. Nach der Inkubation wird dreimal mit PBS gewaschen.
Nach dem Waschschritt wird in jedes Well 200 l Konjugat, ein Anti-Kaninchen IgG- Peroxidase markierter Antikörper, welcher y-Kette spezifisch ist, pipettiert und die Probe wird wiederum eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. Es folgt ein dreimaliges Waschen mit PBS. Im nächsten Schritt wird in jedes Well 200 l Entwicklerlösung pipettiert, wobei die Entwicklerlösung aus o-Phenylendiamin Dihydrochlorid (OPD), 50 mM Na2HP04 und 24 mM Zitronensäure besteht. Die Platte wird anschliessend mindestens 25 Minuten bei 37 C inkubiert bis sich eine Farbreaktion zeigt.
Diese Reaktion wird durch Zugabe von jeweils 100 ul 2,5 M H2S04 gestoppt. Die Extinktion wird bei 492 nm im ELISA-Plattenreader gemessen, wobei der Referenzfilter eine Wellenlänge von 750 nm aufweist. Für die Standardkurven werden oxidiertes und reduziertes BSA verwendet.
Umkristallisation von 2,4-Dinitrophenylhydrazin
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Zur Herstellung von umkristallisiertem DNP werden ca. 250 ml n-Butanol in einem 500 ml
Rundkolben erhitzt (Siedesteine). Parallel dazu werden ca. 2,5 g DNP in einem 2 Liter
Rundkolben eingewogen und so lange heisses n-Butanol dazugeben, bis es sich gerade löst.
Das Gemisch wird einige Stunden am Rückflusskühler gekocht und anschliessend auf
Raumtemperatur bzw. 4 C langsam, lichtgeschützt abgekühlt danach abgenutscht und mit n-Hexan mehrmals gewaschen. Die Kristalle werden zuletzt in einer kleinen Petrischale im
Exsikkator über Calciumoxid oder einem anderen Trocknungsmittel getrocknet und vor
Licht geschützt.
Herstellung von oxidiertem BSA
Es werden 50 mg BSA pro ml PBS in Gegenwart von 50 mM Hypochlorsäure für zwei
Stunden bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler liegend inkubieren. Anschliessend wird die Probe aliquotiert und bei - 80 C gelagert.
Herstellung von reduziertem BSA
2,5 g BSA werden in 150 ml PBS-Puffer gelöst. Sobald die BSA-Lösung auf 0 C bis 4 C temperiert ist, wird portionsweise NaBH4 direkt in die leicht rührende Lösung zugeben (die
Konzentration beträgt 0,5 g NaBH4 pro ml PBS-Puffer). Der Reaktionsansatz wird noch mindestens eine Stunde auf Eis stehend gerührt. Danach wird 5 ml Salzsäure zugegeben.
Der Reaktionsansatz wird in Dialyseschläuche gefüllt und über Nacht gegen kaltes PBS bei 4 C dialysiert. Gegebenenfalls wird der Puffer nach 1,5 bis zwei Stunden gewechselt. Nach der Dialyse wird der pH-Wert auf 7,4 eingestellt. Die Blockierungslösung wird aliquotieren und bei - 80 C aufbewahrt. Reduziertes BSA weist ca. 0,6 nmol Carbonyl-Verbindungen pro mg Protein auf.
Die Ausführungsbeispiele zeigen mögliche Ausführungsvarianten des ELISA-Kit, wobei an dieser Stelle bemerkt sei, dass die Erfindung nicht auf die speziell dargestellten Ausführungsvarianten derselben eingeschränkt ist, sondern vielmehr auch diverse Kombinationen der einzelnen Ausführungsvarianten untereinander möglich sind und diese Variationsmöglichkeit aufgrund der Lehre zum technischen Handeln durch gegenständliche Erfindung im Können des aufdiesem technischen Gebiet tätigen Fachmannes liegt. Es sind also auch sämtliche denkbaren Ausführungsvarianten, die durch Kombinationen einzelner
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Details der dargestellten und beschriebenen Ausführungsvariante möglich sind, vom Schutzumfang mitumfasst und daher diese nicht mehrfach beschrieben.
Die den eigenständigen erfinderischen Lösungen zugrundeliegende Aufgabe kann der Beschreibung entnommen werden.
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The invention relates to an ELISA (enzyme-linked immunosorbing assay) kit for
Detection of at least one oxidized biomacromolecule, from a biological sample comprising a solid carrier for the adhesion of the antigen, optionally 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP) for addition to the biological sample, DNP antibody for indirect
Detection of carbonyl compounds of the oxidized biomacromolecule and at least one standard for the semi-quantitative and / or quantitative determination of the carbonyl compounds of the oxidized biomacromolecule and an ELISA method for the detection of at least one oxidized biomacromolecule from a biological sample comprising the
Steps adsorption of the antigen by non-specific binding to a solid support,
Adsorption of at least one standard on the solid support, addition of 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP)
to the biological sample or to the standard, addition of DNP antibody for specific and sensitive binding to DNP, addition of a substrate for detection of the antigen-antibody complex and detection by means of a photometer for evaluation of ELISA plates and the use of the ELISA kit ,
At this point it should be noted in advance that the abbreviations DNP for 2,4-dinitrophenylhydrazine, SBS for Society of Biomolecular Screnning, BSA for bovine serum albumin, OPD for o-phenylenediamine dihydrochloride, ABTS for 2,2'-azino-bis -3-ethylbenzthiazoIin-6-sulfonic acid, TMB for 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine and PBS for phosphate-buffered, physiological saline can be used.
An immunoassay is a technique in which the qualitative and quantitative detection of a substance is carried out by means of an immunological reaction. Immunoassays are based on the principle of the antigen-antibody reaction, i. H. on the ability of one
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Antibody specifically to recognize antigens and to bind with them.
This makes it possible to determine either the antigen or the antibody in vitro.
The ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) assay belongs to the enzyme immunoassays, which methods for the qualitative and quantitative detection of antigens,
Are haptens or antibodies in which the extent of the immunological reaction is indicated by the substrate turnover of a marker enzyme. The enzyme enables sensitive detection of the primary antigen-antibody complex by the
Visualization of colored products with photometric detection. The sensitivity of the ELISA depends on various factors, e.g. the affinity of
Antibody, the properties and the molecular weight of the to be determined
Component, the purity of the enzyme-labeled immunoreactants, test conditions, etc.
With solid-phase adsorption (solid-face technology) this can, depending on the technology used
Antigen or the specific antibody directly on cellulose or a
Plastic surface to be adsorbed. The isolation of the bonded to the carrier material
Depending on the coated material, the antigen-antibody complex either occurs through
Centrifugation or by simply decanting the solutions and then
To wash.
The most important area of application for ELISA in laboratory medicine is medical in-vitro diagnostics. Among other things, this technology can be used to determine marker proteins for certain diseases in the body fluids of patients. In addition, it is not only possible to detect marker proteins per se, but also their metabolization state, such as their oxidation state. But also in environmental analysis, such as B. for pesticide determination in soil and water samples, and food analysis, these test systems are increasingly used.
The oxidation state of proteins plays a decisive role in many pathological processes. Oxidative stress can cause an increase in protein carbonylation or an increase in protein carbonyl derivatives. This can be done by a variety of different mechanisms, e.g. Fragmentation and amino oxidation caused by metal catalysis or by hypochlorous acid. Studies on oxidative modifications of proteins, especially in connection with reactive ones
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Oxygen species have become increasingly important in recent years. The
The formation of the carbonyl groups is one of the other oxidative changes in the
Amino acids viewed as an early marker of protein oxidation.
It has been proven that oxidative effects play a major role in various pathophysiological processes. Carbonyl levels rise both at different
Diseases as well as with age and accelerate or favor the development of, for example, aging processes, lung diseases, Alzheimer's disease, disease
Parkinson's, kidney disease, ischemia-reperfusion syndrome, and diabetes mellitus
Cystic fibrosis.
Carbonyl compounds are formed, for example, directly by protein oxidation and are secondary conjugates of aldehydes, which, for. B. formed by fat peroxidation.
However, there is currently no method that can distinguish between the sources of the carbonyl compounds.
A conventional assay to detect carbonyl compounds in proteins is a colorimetric method that measures the binding of dinitrophenylhydrazine to carbonyl compounds. A colorimetric measurement requires a large amount of protein, which is usually not available from a clinical sample. In addition, the fluctuations in the results are very high.
Other measurement methods currently available are HPLC (high performance liquid chromatography), which eliminates some of these disadvantages but does not result in high sample throughput.
A Western blot analysis increases the sensitivity and selectivity compared to colorimetric methods, but is also unsuitable for the throughput of large sample quantities and, furthermore, this method cannot be used as a quantitative assay.
The object of the invention is to provide a possibility for the detection of oxidized biomacromolecules. A part of the invention is
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to detect oxidized biomacromolecules due to the presence of carbonyl compounds.
This object of the invention is each independently mentioned by one mentioned
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit for the detection of at least one oxidized biomacromolecule, from a biological sample comprising a solid carrier for the adhesion of the antigen, optionally 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP) for addition to the biological sample, DNP antibody for indirect Detection of carbonyl
Compounds of the oxidized biomacromolecule and at least one standard for the semi-quantitative and / or quantitative determination of the carbonyl compounds of the oxidized biomacromolecule and by an ELISA method for the detection of at least one oxidized biomacromolecule, comprising the steps from a biological sample
Adsorption of the antigen by non-specific binding to a solid support, adsorption of at least one standard on the solid support,
optionally 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP) for addition to the biological sample, addition of 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP) to the biological sample or standard, addition of DNP antibody for specific and sensitive binding to DNP, addition of a substrate for Detection of antigen
Antibody complex and detection by means of a photometer for evaluating ELISA plates and by using the ELISA kit, whereby a biological sample, in particular an oxidized biological sample, selected from a group comprising body fluids, such as. B. whole blood, serum, plasma, saliva, urine, etc., and / or tissue and / or from cell cultures or cell culture supernatants is detected.
The advantage here is that the addition of DNP antibody can indirectly characterize carbonyl compounds of the biomacromolecules which give an indication of pathological damage to biological tissue. It has been shown that, for example, oxidative stress causes an increase in carbonyl compounds in biological samples. Through the targeted detection of the carbonyl compounds and their derivatives, it is possible to diagnose a pathological condition very early on and take action as a cure. Furthermore, it proves advantageous that only a small amount of protein is required for the ELISA method according to the invention, which is comparable to the amount of protein required for the HPLC method
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necessary is.
In contrast, a larger amount of protein is required for colorimetric determinations used in the prior art. It is advantageously provided that a standard is included for the semi-quantitative and / or quantitative determination of the carbonyl compounds of the oxidized biomacromolecule, whereby an exact determination of the concentration of the carbonyl compounds is possible.
According to an embodiment variant, it is provided that the solid support is a microtiter plate according to the SBS standard, whereby a large number of samples can be processed at the same time and a large number of different samples can be analyzed at the same time, and thus the possibility of using the ELISA kit and method in High-
Throughput screening process is supported. Furthermore stand out
Microtiter plates are characterized by easy manual and automatable processing options and are suitable for reading test results in plate photometers. It has also proven to be advantageous that both automatic processing of the microtiter plates and reading of the test results in the microtiter plates are standardized pipetting machines or
Robots can be used.
The DNP antibodies can be both monoclonal and / or polyclonal, after which the presence of monoclonal antibodies can reduce both the extent of cross-reactivity and of non-specific binding. However, this is at the expense of sensitivity. Polyclonal antibodies increase the sensitivity, but cross-reactions are possible more often and thus the specificity decreases.
According to an embodiment variant, it is provided that the DNP antibodies are labeled, which enables a direct detection of the antibodies without having to use a conjugate and thus the effort for additional reagents can be saved. Furthermore, it proves advantageous that the step which requires the reaction of the antibody with the conjugate is not necessary.
According to a further embodiment variant, it is provided that the DNP antibodies with an enzyme such as Peroxidase, in particular horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, -G -galactosidase, glucose oxidase, etc., are marked, after which by a
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photometric analysis method the oxidation or the extent of the oxidation of the biological sample can be detected.
It is also possible that a protein such as e.g. B. albumin, in particular
Bovine serum albumin (BSA) is contained, whereby on the one hand unspecific binding sites can be saturated on the solid support and on the other hand a protein in different concentrations or in dilution series for the preparation of
Standard curves are available and a quantitative evaluation is possible.
It is also advantageous that the protein, in particular BSA, is oxidized and / or reduced, as a result of which the number of carbonyl compounds can be determined quantitatively using a standard curve, for example by using reduced BSA a precisely defined amount of carbonyl compounds per Milligrams of protein can be detected.
In one embodiment variant it is provided that the protein in solution, in a
Concentrate in solid or liquid form, lyophilized, etc., is contained, whereby the
Storage conditions and the storage period and thus the shelf life can be extended and further storage at room temperature is possible.
It is also possible for 2,4-dinitrophenylhydrazine to be recrystallized, as a result of which a higher degree of purity is achieved and therefore no disruption or contamination of the
Reaction of the biological sample with DNP can be caused.
In a further development of the ELISA kit, it proves advantageous that 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP) is included for addition to the biological sample, which can increase the sensitivity of the assay.
In a further embodiment variant, it is provided that a DNP buffer is contained, with which optimal reaction conditions can be created.
It is also possible that a DNP buffer, which is made from guanidinium hydrochloride and KH2P04, is contained, with optimal reaction conditions for the reaction of DNP with a biomacromolecule.
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According to an embodiment variant, a substrate from a group comprising o
Phenylenediamine dihydrochloride (OPD), 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), p-nitrophenylphosphate, select, causing a reaction of the enzyme with the substrate takes place and thereby, for example, radioactive detection, which is very problematic on the one hand when it is disposed of or on the other hand additional protective measures or
Safety devices required, can be saved.
It is furthermore advantageous that a blocking solution is contained, whereby on the one hand the biological sample can be diluted and on the other hand areas on the solid support can be blocked and this prevents unspecific binding of the biomacromolecule or the antibody during the analysis process.
It is also possible that a conjugate for binding to DNP antibody is contained, which enables indirect labeling of the DNP antibody and thereby the
Antibody does not have to be labeled directly. This can be both a complex
Production processes as well as steric barriers when connecting the DNP
Antibody to DNP or the biomacromolecule can be prevented.
According to an embodiment variant, it is provided that the conjugate is an anti-rabbit IgG, as a result of which this conjugate can be obtained in large quantities using a standard method, namely by immunizing a rabbit.
It is also advantageous that the anti-rabbit IgG with peroxidase, e.g. B. horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, -G -galactosidase, glucose oxidase, -etc., Is marked, whereby by the use of these markings standard detection methods can be used, e.g. a photometric detection.
It is also envisaged that instructions for carrying out the detection method are included, according to which the ELISA kit can be used easily by all laboratory employees or in doctor's offices.
Finally, it is advantageous that the components are packaged separately, which means, for example, that there is no accidental reaction between the different components
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can take place and the individual components can also be opened independently of each other.
A body fluid, such as e.g. B. whole blood, serum, plasma,
Saliva, urine, tissue, etc., using the ELISA kit assay for the analysis of samples of various origins. It also proves advantageous that the same kit and the same for the samples of different origins
Procedures can be used.
A cell culture or a cell culture supernatant can also be used as the biological sample, in which case the same ELISA kit and the same method can be used.
In the ELISA method it is provided that the absorption of the biomacromolecules on the solid support takes place non-specifically, which means that another antibody which is responsible for
Addition to the solid support and for specific binding of the biomacromolecule would serve, can be saved and thereby the costs for the reagents are reduced.
Furthermore, it proves advantageous that the detection is carried out photometrically, because the enzymatic labeling makes radioactive labels obsolete and thus
Safety precautions which are necessary due to working with radioactive material can be prevented or saved and furthermore a tedious disposal procedure is spared.
According to a development of the ELISA method, it is provided that the biological sample with a photometer for evaluating ELISA plates at a wavelength selected from a range with a lower limit of 390 nm, preferably 410 nm, in particular 425 nm and an upper limit of 470 nm, preferably 492 nm, in particular 498 nm, is determined, whereby a quantification of the carbonyl compounds and thus the oxidized biomacromolecules is possible.
Finally, it has been shown that the ELISA kit for the detection of carbonyl compounds from a biological sample selected from a group comprising
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Body fluids such as B. whole blood, serum, plasma, saliva, urine, etc., and / or
Tissue or a cell culture or a cell culture supernatant can be used, again using the same ELISA kit and the same method for different sources.
For a better understanding of the invention, results and standard curves are explained in more detail using the following figures.
Each show:
1 shows a diagram with a calibration curve of oxidized and reduced BSA;
Fig. 2 is a diagram with the effect of different treatments on the
Protein oxidation.
In the introduction, it should be noted that in the differently described embodiments, the same parts are provided with the same reference numerals or the same component names, and the disclosures contained in the entire description can be applied analogously to the same parts with the same reference numerals or the same component names. The location information selected in the description, e.g. above, below, to the side, etc., refer to the figure described and illustrated immediately and are to be transferred analogously to the new position when the position changes. Furthermore, individual features or combinations of features from the different exemplary embodiments shown and described can also represent independent, inventive or inventive solutions.
In order to achieve an optimally sensitive detection possibility for carbonyl compounds in biological samples, both a suitable method and a suitable combination of the carrier used, such as e.g. B. plate material, specific antibody, the protein concentration used, the incubation conditions, the blocking solution, e.g. pH value, ionic strength, etc. can be found.
The solid support is designed according to a standard size of a microtiter plate and has dimensions according to the recommendations of the'SBS (Society of Biomolecular Screnning; www.SBSonline.org).
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Microtiter plates with 96, 384 or 1536 wells from different manufacturers, e.g. Nunc or Greiner used. For example, Nunc immunoplates
MaxiSorb or Greiner High-Bind microtiter plates can be used. Greiner-
Microtiter plates show the best results because the interassay differences are the smallest and there is a higher binding capacity for the BSA standard curve.
Biomacromolecules, especially oxidized antigens, are made from a biological sample, e.g. B. whole blood, plasma, serum, urine, saliva, sperm, tear fluid,
Synovial fluid, etc., obtained from tissues or from cell cultures or cell culture supernatants. The biomacromolecules are either directly from the biological sample, possibly after concentration, or according to the person skilled in the art
Standard methods isolated or their concentration determined, e.g. B. using a BioRad assay. The isolated proteins are then treated with a buffer, e.g.
PBS (phosphate-buffered, physiological saline) up to a final concentration selected from a range with an upper limit of 20 mg / ml, preferably 10 mg / ml, in particular 5 mg / ml, and a lower limit of 0.1 mg / ml, preferably 1 mg / ml, in particular 4 mg / ml, diluted. However, the biological sample can also be used in the concentrations already mentioned in a buffer with a reducing agent, e.g.
Dithiothreitol or mercaptoethanol, etc., are present.
The required amount of the biological sample for the ELISA method according to the invention is determined from a range with a lower limit of 0.1 g, preferably 1 g, in particular 10 g, and an upper limit of 1 mg, preferably 500 g, in particular
100 g, selected. A sample amount of 60 g has proven to be particularly advantageous.
For colorimetric determinations known from the prior art, a sample amount of approximately 10 mg is required.
The isolated proteins required for the ELISA are derivatized in a DNP (dinitrophenylhydrazine) solution consisting of DNP, preferably recrystallized DNP, guanidinium hydrochloride and potassium phosphate buffer. For derivatization, a final concentration of the protein of 10 mg / ml, preferably 5 mg / ml, in particular 0.5 mg / ml, should be achieved. A concentration of 4 mg / ml has proven to be particularly advantageous. The reaction mixture is then incubated at
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Room temperature or at 4 C. The duration of the incubation extends over one
Period with a lower limit of 5 minutes, preferably 15 minutes, in particular
30 minutes and an upper limit of 45 minutes, preferably 60 minutes, particularly 90 minutes.
The incubation is preferably carried out in the dark and the sample is mixed thoroughly or vortexed at regular intervals.
The incubation batch is diluted in a sodium phosphate buffer at 1:
1000, preferably 1: 500, in particular 1: 400, transferred. A dilution of 1: 200 has proven to be particularly advantageous.
Aliquots are pipetted from this buffer-sample mixture into wells of microtiter plates. 150 l aliquots, in particular three 200 l aliquots, are preferred
Aliquots are distributed into the wells, creating a duplicate or triplicate arrangement.
The microtiter plates are closed with a lid or a film and two
Incubated for hours or preferably overnight at room temperature or at 4 C.
During this time, protein adsorption takes place on the plastic of the microtiter plates.
The direct coating of the microtiter plates is based on an unspecific hydrophobic
Interaction between the carrier material and the protein molecule. This interaction represents protein adsorption through non-covalent binding.
After the incubation, the wells of the microtiter plate can optionally, for example, be mixed with PBS
Buffer can be washed. The buffer is removed by pipetting, suctioning or dumping.
After the solid support has been coated directly with the protein molecule, a post-coating can be carried out which serves to saturate uncoated areas in the wells in order to avoid later undesired adsorption from the reagents used. For this purpose, after the washing steps, the wells are incubated with reduced BSA (bovine serum albumin), preferably with 0.1% reduced BSA solution, for a period of 3 hours, preferably 2 hours, in particular 1.5 hours, at room temperature. Incubation is preferably done in the dark.
After the incubation, the BSA solution is removed and anti-DNP antibody solution is pipetted into the wells. The antibody, which, for. B. is isolated from rabbits
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preferably applied in a concentration of 1: 100,000, preferably 1: 10,000, in particular 1: 1000, in 0.1% reduced BSA solution with 0.1% Tween-20. The incubation takes place for 1 hour at 37 C. After the one-hour incubation at 37 C, washing steps follow. This consists of three washing stages with PBS.
Conjugate is added to each well of the microtiter plate, whereby conjugated antibodies are best suited in combination with photometric detection peroxidase (from horseradish) or alkaline phosphatase (calf intestine). As a conjugate e.g. anti-
Rabbit IgG peroxidase (horseradish) or alkaline phosphatase, labeled
Antibodies in a concentration of 1: 30,000, preferably 1: 10,000, in particular 1: 3,000, in 0.1% reduced BSA solution with 0.1% Tween-20 were added. The anti-DNP
Antibody can also be biotinylated, for example.
There is an incubation at room temperature for one hour. The incubation preferably takes place in the dark. There is again a three-stage washing step with PBS and after the washing steps a developer solution with substrate is added to the wells.
The best substrates or cosubstrates are o-phenylenediamine (OPD) or 3,3'-, 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-
Sulfonic acid (ABTS). With homogeneous substrates, the peroxidase shows with fluorogenic
Alkaline phosphatase substrates have the highest molar conversion rates.
The developer solution consisting of 50 mM NH2HPO4 and 24 mM citric acid with o-phenylenediamine and hydrogen peroxide is incubated for at least 20 minutes, preferably 25 minutes, in particular 30 minutes at 37 C and the reaction is stopped by adding 2.5 M H2S04. If the color reaction has not occurred after half an hour, the samples can be incubated at 37 C for up to one hour.
The absorbance is selected at a wavelength selected from a range with a lower limit of 390 nm, preferably 410 nm, in particular 425 nm and an upper limit of 470 nm, preferably 492 nm, in particular 498 nm in a photometer for evaluating ELISA plates , A standard curve with reduced and oxidized BSA is measured in parallel on each plate. There is also a on the plate
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Blank value for the DNP solution without protein available. The measured value of this blank value is subtracted from the other measured values.
In Fig. 1, a calibration curve made from reduced and oxidized BSA is both on
Greiner High-Bind as well as shown on Nunc MaxiSorb microtiter plates.
BSA already has carbonyl groups in the untreated state. In addition, it can also be reduced with sodium borohydride. Completely reduced BSA is obtained by adding 1 g BSA to 100 ml PBS buffer with 2 g sodium borohydride.
The reaction mixture is then incubated for 90 minutes, preferably 60 minutes, in particular 30 minutes, and the reaction is neutralized by adding hydrochloric acid.
After an overnight dialysis of the biological sample against PBS, the
Protein concentration by measurement with a wavelength of 280 nm to 4 g / l for the
Use in a standard curve or at 0.1% for use as
Blocking solution set.
Oxidized BSA, which includes additional carbonyl groups, can be used as a reference. Oxidized BSA is produced by reacting 50 mg BSA per ml PBS with hypochlorous acid to a final concentration of 5 mM. BSA at a concentration of 40 mg / ml can also be oxidized with 25 mM ascorbic acid and 0.1 mM iron ammonium sulfate in PBS containing 1 mM EDTA.
The BSA solutions can be stored at - 80 C for a longer period or at 4 C for a week, whereby no change in the carbonyl content is observed.
Validation of the ELISA: The standard curves are produced by combining different proportions (from 0 to 100%) of BSA oxidized with hypochlorous acid and completely reduced BSA, whereby the total protein concentration is kept constant. The carbonyl content of oxidized BSA can be determined in a colorimetric assay at a wavelength of 375 nm. The carbonyl content of the completely reduced BSA can also be determined at a wavelength of 375 nm. The measurement
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gives an absorbance of 0.13 units per 10 mg as standard, which corresponds to an equivalent value of 0.6 nmol carbonyl groups per mg BSA.
The key requirement for sensitivity is a low reagent blank, which results from the DNP solution without protein. This is achieved by using the microtiter plate
Borohydride-reduced BSA is blocked, which on average gives an absorption for the blank value of 0.03 to 0.04 units above that of the blocking solution. Non-derivatized protein and derivatized protein without anti-DNP treatment have the same absorption as the blocking solution alone.
As the amount of derivatized proteins added to the wells as coating antigens increases, there is a linear increase in adsorption up to 2 nmol / mg
Total protein. Above this concentration, the increase is only slight.
DNA and RNA falsify the measurement result by displaying a higher value than actually for the carbonyl compounds. Nucleic acids from tissue extracts are therefore known using methods known to a person skilled in the art, such as, for. B. DNAse or
RNAse treatment, removed.
Figure 2 shows the effect of various treatments on protein oxidation. The concentration of the carbonyl compounds in untreated cells (control), as shown in bar 1, and in cells which oxidative stress, z. B. by exposure to UV light, as shown in bar 2, and exposed to cells containing antioxidants such as. B. Vitamins were shown. This graphic shows the beneficial effect of antioxidants, as shown in bar 3 by treating the "stressed" cells with vitamin C and in bar 4 by treating with vitamin E, on the concentration of the carbonyl compounds.
Exemplary embodiment: The protein concentration is determined from whole blood treated with citrate, EDTA or heparin using the Biorad assay kit. The protein concentration is adjusted to 4 mg / ml with PBS.
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A volume of 15 l of the protein solution or the blank or the standards is mixed with 45 l of a freshly prepared DNP solution in a concentration of 2 mg / ml in a reaction vessel and mixed well by vortexing. This is followed by a 45 minute incubation at room temperature in the dark. In the meantime, the sample is occasionally vortexed.
5 l each of the above-mentioned incubation batches are pipetted into 1 ml of coating (blocking) solution and mixed well. From this coating (blocking) solution or
Blank or standard mixtures are placed three times in 200 l aliquots into the wells
Microtiter plates transferred. The microtiter plates are covered and incubated at 4 C overnight.
After the incubation, the coating (blocking) solution is poured out and the rest
Liquid is sucked off using cellulose. 250 l 0.1% reduced in each well
Pipetted BSA. A one and a half hour incubation at room temperature follows
Dark.
The solution is then poured out and 200 l of Anit-DNP-
Pipette antibody solution. There is an incubation at 37 C for one hour.
After the washing step, 200 l conjugate, an anti-rabbit IgG peroxidase-labeled antibody, which is specific to the y chain, is pipetted into each well and the sample is again incubated for one hour at room temperature in the dark. It is washed three times with PBS. In the next step, 200 l of developer solution is pipetted into each well, the developer solution consisting of o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD), 50 mM Na2HP04 and 24 mM citric acid. The plate is then incubated at 37 C for at least 25 minutes until a color reaction appears.
This reaction is stopped by adding 100 μl of 2.5 M H2S04 in each case. The absorbance is measured at 492 nm in the ELISA plate reader, the reference filter having a wavelength of 750 nm. Oxidized and reduced BSA are used for the standard curves.
Recrystallization of 2,4-dinitrophenylhydrazine
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To produce recrystallized DNP, approx. 250 ml of n-butanol in a 500 ml
Round bottom flask heated (boiling stones). At the same time, approx. 2.5 g DNP in a 2 liter
Weigh the round bottom flask and add hot n-butanol until it just dissolves.
The mixture is boiled for a few hours on a reflux condenser and then opened
Room temperature or 4 C slowly, protected from light, then suction filtered and washed several times with n-hexane. The crystals are finally placed in a small petri dish in the
Desiccator dried over calcium oxide or other desiccant and before
Protected from light.
Production of oxidized BSA
There are 50 mg BSA per ml PBS in the presence of 50 mM hypochlorous acid for two
Incubate for hours at room temperature on a rotary shaker. The sample is then aliquoted and stored at -80 ° C.
Production of reduced BSA
2.5 g BSA are dissolved in 150 ml PBS buffer. As soon as the BSA solution is at 0 C to 4 C, NaBH4 is added in portions directly into the lightly stirring solution (the
Concentration is 0.5 g NaBH4 per ml PBS buffer). The reaction mixture is stirred while standing on ice for at least one hour. Then 5 ml of hydrochloric acid is added.
The reaction mixture is filled into dialysis tubes and dialyzed against cold PBS at 4 C overnight. If necessary, the buffer is changed after 1.5 to two hours. After dialysis, the pH is adjusted to 7.4. The blocking solution is aliquoted and stored at -80 ° C. Reduced BSA has approximately 0.6 nmol carbonyl compounds per mg protein.
The exemplary embodiments show possible design variants of the ELISA kit, it being noted at this point that the invention is not restricted to the specially illustrated design variants of the same, but rather also various combinations of the individual design variants with one another are possible, and this variation possibility is based on the teaching of technical action through the subject invention lies in the ability of the person skilled in the art in this technical field. So there are also all conceivable design variants, by combinations of individual
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Details of the embodiment variant shown and described are possible, included in the scope of protection and therefore not described several times.
The object on which the independent inventive solutions are based can be found in the description.