AT517831A4 - Process for the production of secondary metabolites - Google Patents
Process for the production of secondary metabolites Download PDFInfo
- Publication number
- AT517831A4 AT517831A4 ATA51115/2015A AT511152015A AT517831A4 AT 517831 A4 AT517831 A4 AT 517831A4 AT 511152015 A AT511152015 A AT 511152015A AT 517831 A4 AT517831 A4 AT 517831A4
- Authority
- AT
- Austria
- Prior art keywords
- seq
- fungal cell
- amino acid
- polypeptide
- xaa
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines Sekundärmetaboliten in einer genetisch modifizierten Pilzzelle, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das Kultivieren einer genetisch modifizierten Pilzzelle umfasst, die in der Lage ist, den mindestens einen Sekundärmetaboliten zu produzieren, wobei die unmodifizierte Pilzzelle mindestens ein Gen kodierend für mindestens ein Polypeptid umfasst, das mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst, wobei X1 V oder I, X2 D oder V, X3 V oder I, X4 T oder A, X5 V oder I, X6 eine beliebige Aminosäure und X7 R oder K ist, und die Expression dieses Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich mit der unmodifizierten Pilzzelle reduziert ist und/oder das Polypeptid in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle mindestens eine Mutation umfasst, wodurch die Bildung des mindestens einen Sekundärmetaboliten in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle erhöht ist.The present invention relates to a method of producing at least one secondary metabolite in a genetically modified fungal cell, characterized in that the method comprises cultivating a genetically modified fungal cell capable of producing the at least one secondary metabolite, wherein the unmodified fungal cell comprises at least one Gene encoding at least one polypeptide comprising at least two motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID NO: 4), RX7LQAF (SEQ ID NO: 5), LFDPRGFC (SEQ ID No. 6) and variants thereof having an identity of at least 60%, wherein X1 is V or I, X2 is D or V, X3 is V or I, X4 is T or A, X5 is V or I, X6 is any amino acid and X7 is R or K, and the expression of this polypeptide in the genetically modified fungal cell is reduced compared to the unmodified fungal cell and / or the polyp eptid in the genetically modified fungal cell compared to the unmodified fungal cell comprises at least one mutation, whereby the formation of the at least one secondary metabolite is increased in the genetically modified fungal cell compared to the unmodified fungal cell.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung mindestens eines Sekundärmetaboliten.The present invention relates to methods for producing at least one secondary metabolite.
Pilze stellen eine große Menge an chemischen Verbindungen her. Diese Verbindungen sind höchst unterschiedlich in puncto Struktur und Wirkungen, teilen sich aber eine grundlegende Eigenschaft. Sie werden alle im sekundären Stoffwechsel der Pilze synthetisiert. Der sekundäre Stoffwechsel ergänzt den primären Stoffwechsel, welcher alle biologischen Prozesse umfasst, die für das Wachstum der Pilze notwendig sind. Pilze bedienen sich des sekundären Metabolismus zu unterschiedlichen Zwecken, wie zum Bespiel Kommunikation, Konkurrenzkampf, Toxizität, Pathogenität und Mykoparasitismus. Einige Produkte des sekundären Metabolismus werden zur Bekämpfung von infektiösen Krankheiten (als Antibiotika) und Krebs (als Immunsupressiva) eingesetzt. Zudem stellen sie eine ergiebige Quelle für neue Therapeutika dar und bieten Ansatzmöglichkeiten für die pharmazeutische Forschung. Zahlreiche Verbindungen wurden in den letzten Jahrzehnten identifiziert und werden in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie genutzt. Zahlreiche weitere Verbindungen können potentiell entdeckt werden. Ein Hindernis dabei ist die Tatsache, dass der Großteil der Gene des sekundären Metabolismus unter Laborbedingungen nicht aktiv ist. Eine Strategie, dem zu begegnen, ist der Einsatz von pleiotropischen Regulatoren des sekundären Metabolismus. Ein gut untersuchtes Beispiel dafür ist der Regulator LaeA (siehe zum Bespiel WO 2011/161063). Er findet sich in einigen Pilzen wieder. Wird LaeA dort deletiert, kommt es zu einer Herabregulierung des sekundären Stoffwechsels (siehe WO 2011/161063).Mushrooms produce a large amount of chemical compounds. These compounds are very different in structure and effects, but share a fundamental characteristic. They are all synthesized in the secondary metabolism of fungi. The secondary metabolism complements the primary metabolism, which includes all biological processes necessary for the growth of the fungi. Fungi use secondary metabolism for various purposes, such as communication, competition, toxicity, pathogenicity and mycoparasitism. Some secondary metabolism products are used to fight infectious diseases (as antibiotics) and cancer (as immunosuppressants). In addition, they provide a rich source of new therapeutics and provide opportunities for pharmaceutical research. Numerous compounds have been identified in recent decades and are used in the biotechnology and pharmaceutical industries. Many other compounds can potentially be discovered. One obstacle is the fact that most of the genes of secondary metabolism are not active under laboratory conditions. One strategy to address this is the use of pleiotropic regulators of secondary metabolism. A well-studied example of this is the regulator LaeA (see, for example, WO 2011/161063). He finds himself in some mushrooms again. If LaeA is deleted there, a downregulation of the secondary metabolism occurs (see WO 2011/161063).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel und Verfahren bereitzustellen, um die Produktion von Sekundärmetaboliten in Pilzen zu regulieren, insbesondere zu erhöhen.It is an object of the present invention to provide means and methods to regulate, in particular increase, the production of secondary metabolites in fungi.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines Sekundärmetaboliten in einer genetisch modifizierten Pilzzelle, welches das Kultivieren einer genetisch modifizierten Pilzzelle umfasst, die in der Lage ist, den mindestens einen Sekundärmetaboliten zu produzieren, wobei die unmodifizierte Pilzzelle ein Gen kodierend für ein Polypeptid umfasst, das mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDXiERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst, wobei Χχ V oder I, X2 D oder V, X3 V oder I, X4 T oder A, X5 V oder I, X6 eine beliebige Aminosäure und X7 R oder K ist, und die Expression dieses Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich mit der unmo-difizierten Pilzzelle reduziert ist und/oder das Polypeptid in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifi-zierten Pilzzelle mindestens eine Mutation umfasst, wodurch die Bildung des mindestens einen Sekundärmetaboliten in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle erhöht ist.The present invention therefore relates to a method of producing at least one secondary metabolite in a genetically modified fungal cell which comprises cultivating a genetically modified fungal cell capable of producing the at least one secondary metabolite, wherein the unmodified fungal cell comprises a gene encoding a polypeptide comprising at least two motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDXiERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID NO: 4), RX7LQAF (SEQ ID NO: 5), LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6) and Variants thereof having an identity of at least 60%, wherein Χχ V or I, X2 is D or V, X3 is V or I, X4 is T or A, X5 is V or I, X6 is any amino acid and X7 is R or K, and Expression of this polypeptide is reduced in the genetically modified fungal cell as compared to the unmotivated fungal cell and / or the polypeptide in the genetically modified fungal cell i m comprises at least one mutation compared to the unmodified fungal cell, whereby the formation of the at least one secondary metabolite in the genetically modified fungal cell is increased in comparison to the unmodified fungal cell.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass in Pilzzellen Polypeptide, welche mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureseguenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfassen, für die Regulierung des Sekundärmetabolismus und somit für die Herstellung von Sekundärmetaboliten verantwortlich bzw. mitverantwortlich sind. Wird die Aktivität bzw. die Expressionsrate dieses Polypeptids innerhalb der Pilzzelle reduziert, erhöht sich die Menge an durch die Pilzzelle gebildeten Sekundärmetaboliten. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine genetisch modifizierte Pilzzelle eingesetzt, die im Vergleich zur unmodi-fizierten Pilzzelle eine reduzierte Expressionsrate des zuvor genannten Polypeptids aufweist. Alternativ dazu kann das Polypeptid auch eine oder mehrere Mutationen aufweisen, wodurch sich dessen biologische Funktion in der Pilzzelle derart ändert, dass die Produktion mindestens eines Sekundärmetaboliten in der Pilzzelle erhöht wird. Vorzugsweise beträgt die Erhöhung der hergestellten Menge an Sekundärmetaboliten mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 100%, noch mehr bevorzugt mindestens 150%, noch mehr bevorzugt mindestens 200%, verglichen mit unmodifizierten Pilzzellen.It has surprisingly been found that in fungal cells polypeptides which contain at least two motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID No. 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID No. 4), RX7LQAF (SEQ ID No. 5), LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6) and variants thereof having an identity of at least 60%, are responsible for the regulation of secondary metabolism and thus for the production of secondary metabolites. If the activity or rate of expression of this polypeptide within the fungal cell is reduced, the amount of secondary metabolite formed by the fungal cell increases. Therefore, in the method according to the invention a genetically modified fungal cell is used, which has a reduced expression rate of the aforementioned polypeptide compared to the unmodified fungal cell. Alternatively, the polypeptide may also have one or more mutations, thereby altering its biological function in the fungal cell such that production of at least one secondary metabolite in the fungal cell is increased. Preferably, the increase in the amount of secondary metabolite produced is at least 10%, preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, even more preferably at least 60%, even more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 100%, even more preferably at least 150%, even more preferably at least 200%, compared to unmodified fungal cells.
Die unmodifizierte Pilzzelle umfasst mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, insbesondere vier, Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60%, wobei Χχ V oder I, X2 D oder V, X3 V oder I, X4 T oder A, X5 V oder I, X6 eine beliebige Aminosäure und X7 R oder K ist. Umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid alle vier Motive, sind diese im Polypeptid vorzugsweise in der Reihenfolge AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5) und LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) angeordnet. Auch bei Vorhandensein von weniger als vier dieser Motive können diese in dieser Reihenfolge im Polypeptid Vorkommen. Umfasst das Peptid zusätzlich das Motiv GSX8X9IDX10SX11 (SEQ ID Nr. 7), wobei X8 F oder Y,The unmodified fungal cell comprises at least two, preferably at least three, in particular four, motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID No. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID No. 4), RX7LQAF (SEQ ID No. 5), LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6) and variants thereof having an identity of at least 60%, wherein Χχ V or I, X2 is D or V, X3 is V or I, X4 is T or A, X5 is V or I, X6 is any amino acid and X7 is R or K. If the polypeptide according to the invention comprises all four motifs, these are preferably present in the polypeptide in the order AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID No. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID No. 4), RX7LQAF (SEQ ID No. 5) and LFDPRGFC (SEQ ID No. 6) ) arranged. Even in the presence of less than four of these motifs, they may occur in this order in the polypeptide. If the peptide additionally comprises the motif GSX8X9IDX10SX11 (SEQ ID No. 7), where X8 is F or Y,
Xg D oder E, Χχο F oder Y und Χχχ R oder K ist, kann das Polypeptid die Motive in der Reihenfolge GSX8X9IDX10SXxx (SEQ ID Nr. 7), AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5) und LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) umfassen .Xg D or E, Χχo is F or Y and Χχχ R or K, the polypeptide may have the motifs in the order GSX8X9IDX10SXxx (SEQ ID NO: 7), AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID NO: 4) , RX7LQAF (SEQ ID NO: 5) and LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das mindestens eine Polypeptid mindestens ein, vorzugsweise mindestens zwei, noch mehr bevorzugt mindestens drei, weitere Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen GSX8X9IDXx0SXxx (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXieQQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEK-MAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60%, wobei Xs F oder Y, X9 D oder E, X10 F oder Y, Χχχ R oder K, X12 S oder T, Χχ3 V, I oder L, X14 R oder K, Χχ5 I oder L, X16 eine beliebige Aminosäure, X17 R oder K, X18 S oder T, X19 A oder P, X2o L oder M und X2X eine beliebige Aminosäure ist. Das im erfindungsgemäßen Verfahren zu regulierende Polypeptid kann neben den zuvor genannten Motiven weitere Motive umfassen.According to a preferred embodiment of the present invention, the at least one polypeptide comprises at least one, preferably at least two, more preferably at least three, further motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences GSX8X9IDXx0SXxx (SEQ ID NO. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID NO. 8), REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID NO: 9), GRAPQLSQQQXieQQQQQQ (SEQ ID NO: 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID NO: 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID NO: 12), TKAKPGEK-MAQLESISTSQQPLD (SEQ ID NO: 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID NO: 14) and variants thereof having an identity of at least 60%, wherein Xs is F or Y, X9 is D or E, X10 is F or Y, Χχχ R or K, X12 S or T, Χχ3 V, I or L, X14 R or K, Χχ5 I or L, X16 is any amino acid, X17 R or K, X18 S or T, X19 A or P, X2o L or M and X2X is any amino acid. The polypeptide to be regulated in the method according to the invention may comprise further motifs in addition to the aforementioned motifs.
Die Motive sind im Polypeptid durch Peptide getrennt, welche vorzugsweise zwischen 15 und 300, noch mehr bevorzugt zwischen 16 und 280, noch mehr bevorzugt zwischen 18 und 260, Aminosäu rereste umfassen. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz GSX8X9IDX10SX11 (SEQ ID Nr. 7) und dem Motiv mit der Aminosäuresequenz AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3) kann sich ein Peptid mit 200 bis 300, vorzugsweise mit 220 bis 280, noch mehr bevorzugt mit 230 bis 260, noch mehr bevorzugt mit 238 bis 252, Aminosäureresten befinden. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3) und dem Motiv mit der Aminosäuresequenz KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID Nr. 4) kann sich ein Peptid mit 20 bis 40, vorzugsweise mit 22 bis 35, noch mehr bevorzugt mit 25 bis 31, Aminosäureresten befinden. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4) und dem Motiv mit der Aminosäuresequenz RRLQAF kann sich ein Peptid mit 15 bis 20, vorzugsweise mit 17 bis 19, noch mehr bevorzugt mit 18, Aminosäureresten befinden. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz RRLQAF und dem Motiv mit der Aminosäuresequenz LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) kann sich ein Peptid mit 15 bis 25, vorzugsweise mit 17 bis 23, noch mehr bevorzugt mit 19 bis 21, Aminosäureresten befinden.The motifs are separated in the polypeptide by peptides which preferably comprise between 15 and 300, more preferably between 16 and 280, even more preferably between 18 and 260, amino acid residues. Between the motif with the amino acid sequence GSX8X9IDX10SX11 (SEQ ID NO: 7) and the motif with the amino acid sequence AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), a peptide having 200 to 300, preferably 220 to 280, more preferably 230 to 260 more preferably having 238 to 252 amino acid residues. Between the motif with the amino acid sequence AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3) and the motif with the amino acid sequence KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID NO: 4), a peptide with 20 to 40, preferably 22 to 35, more preferably 25 to 31 , Amino acid residues are located. Between the motif with the amino acid sequence KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID NO: 4) and the motif with the amino acid sequence RRLQAF there may be a peptide having 15 to 20, preferably 17 to 19, more preferably 18, amino acid residues. Between the motif having the amino acid sequence RRLQAF and the motif having the amino acid sequence LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6), there may be a peptide having from 15 to 25, preferably from 17 to 23, more preferably from 19 to 21, amino acid residues.
Umfasst eine Pilzzelle ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit den vier bzw. fünf Motiven, können diese die folgenden allgemeinen Sequenzen umfassen: AHNDXiERKYRTNLKX2KIX22KX3SKGX4X5LX6KATEYIX23RX7LQAFX24LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 15) und GSX8X9lDXioSXiiX25AHNDXiERKYRTNLKX2KIX22KX3SKGX4X5LX6KATEYIX23RX 7LQAFX24LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 16) wobei X22 ein Peptid mit 20 bis 40, vorzugsweise mit 22 bis 35, noch mehr bevorzugt mit 25 bis 31, Aminosäureresten, X23 ein Peptid mit 15 bis 20, vorzugsweise mit 17 bis 19, noch mehr bevorzugt mit 18, Aminosäureresten, X24 ein Peptid mit 15 bis 25, vorzugsweise mit 17 bis 23, noch mehr bevorzugt mit 19 bis 21, Aminosäureresten und X25 ein Peptid mit 200 bis 300, vorzugsweise mit 220 bis 280, noch mehr bevorzugt mit 230 bis 260, noch mehr bevorzugt mit 238 bis 252, Aminosäureresten ist. Am N-Terminus kann sich ein Peptid mit bis zu 150 Aminosäureresten befinden.Includes a fungal cell, a polypeptide of the invention with four or five designs, this may include the following general sequences include: (SEQ ID NO. 15) AHNDXiERKYRTNLKX2KIX22KX3SKGX4X5LX6KATEYIX23RX7LQAFX24LFDPRGFC and GSX8X9lDXioSXiiX25AHNDXiERKYRTNLKX2KIX22KX3SKGX4X5LX6KATEYIX23RX 7LQAFX24LFDPRGFC (SEQ ID NO. 16) wherein X22 is a peptide having from 20 to 40, preferably with 22 to 35, more preferably with 25 to 31, amino acid residues, X23 a peptide with 15 to 20, preferably with 17 to 19, even more preferably with 18, amino acid residues, X24 a peptide with 15 to 25, preferably with 17 to 23 , even more preferably having 19 to 21, amino acid residues, and X25 is a peptide of 200 to 300, preferably 220 to 280, more preferably 230 to 260, even more preferably 238 to 252, amino acid residues. At the N-terminus there may be a peptide of up to 150 amino acid residues.
Das Polypeptid der erfindungsgemäß verwendeten Zelle kann auch Motive bzw. Varianten von Motiven umfassen, die mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 85%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, ident mit den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFD-PRGFC (SEQ ID Nr. 6), GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXigQQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLX18WE (SEQ ID Nr. 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEK-MAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13) und ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) sind. „Identität" bezeichnet den Grad der Übereinstimmung zwischen zwei oder mehr Nuklein- bzw. Aminosäuresequenzen, der durch den Vergleich der Sequenzen bestimmt werden kann. Der Prozentsatz der „Identität" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten (d.h. % Identität ist die Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen x 100). Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Identität ist das BLAST X Programm des National Centre for Biotechnology Information (NCBI) (siehe u.a. Altschul S et al. J Mol Biol 215(1990) :403-410) . Dabei wird bevorzugter Weise der BLOSUM62 Algorithmus mit den Parametern „Gap" „Existence":11 und „Extension":1 verwendet.The polypeptide of the cell used according to the invention may also comprise motifs or variants of motifs which comprise at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% identical to the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID NO: 4), RX7LQAF (SEQ ID NO: 5), LFD-PRGFC (SEQ ID NO: 6), GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID No. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID NO: 8), REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID NO: 9), GRAPQLSQQQigQQQQQQ (SEQ ID NO: 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLX18WE (SEQ ID NO: 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID NO: 12), TKAKPGEK-MAQLESISTSQQPLD (SEQ ID NO: 13) and ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID NO: 14). "Identity" refers to the degree of correspondence between two or more nucleic acid or amino acid sequences that can be determined by comparing the sequences The percentage of "identity" results from the percentage of identical regions in two or more sequences, taking into account gaps or other sequence peculiarities (ie% identity is the number of identical positions / total number of positions x 100). A particularly preferred method for determining identity is the BLAST X program of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (see, inter alia, Altschul S et al., J Mol Biol 215 (1990): 403-410). In this case, the BLOSUM62 algorithm with the parameters "Gap" "Existence": 11 and "Extension": 1 is preferably used.
Je nach Pilzzelle bzw. je nach Anzahl der Biossynthesewege für Sekundärmetaboliten in der Pilzzelle, kann eine unterschiedliche Anzahl von Sekundärmetaboliten hergestellt werden. Vorzugsweise wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mindestens ein, vorzugsweise mindestens zwei, noch mehr bevorzugt mindestens drei, noch mehr bevorzugt mindestens vier, noch mehr bevorzugt mindestens fünf, noch mehr bevorzugt mindestens zehn, Sekundärmetabolite hergestellt. „Genetisch modifizierte Pilzzelle", wie hier verwendet, bezieht sich auf Pilzzellen, die genetisch bzw. gentechnisch so verändert wurden, dass das Gen kodierend für das erfindungsgemäße und beanspruchte Polypeptid mit den mindestens zwei Motiven im Vergleich zu einer unmodifizierten Pilzzelle desselben Stammes eine andere Nukleinsäuresequenz aufweist. Um eine genetisch modifizierte Pilzzelle zu erhalten wird das Gen im Genom ausgehend von einer unmodifizierten Pilzzelle mutiert.Depending on the fungal cell or depending on the number of biosynthetic pathways for secondary metabolites in the fungal cell, a different number of secondary metabolites can be produced. Preferably, at least one, preferably at least two, more preferably at least three, even more preferably at least four, even more preferably at least five, even more preferably at least ten, secondary metabolites are produced by the method according to the invention. "Genetically modified fungal cell" as used herein refers to fungal cells that have been genetically engineered so that the gene encoding the inventive and claimed polypeptide having the at least two motifs has a different nucleic acid sequence compared to an unmodified fungal cell of the same strain To obtain a genetically modified fungal cell, the gene in the genome is mutated starting from an unmodified fungal cell.
Eine „unmodifizierte Pilzzelle" bzw. eine „nicht modifizierte Pilzzelle", wie hier verwendet, bildet den Ausgangspunkt für die Herstellung einer erfindungsgemäßen modifizierten Pilzzelle. Die unmodifizierte Pilzzelle umfasst mindestens ein Gen kodierend für das erfindungsgemäße und beanspruchte Polypeptid und weist eine bestimmte Herstellungsrate an Sekundärmetaboliten auf. Eine unmodifizierte Pilzzelle kann eine Pilzzelle sein, die in der Natur natürlicherweise vorkommt. Eine unmodifizierte Pilzzelle kann jedoch auch eine Pilzzelle sein, welche bereits genetisch bzw. gentechnisch an einer beliebigen Stelle des Genoms verändert wurde bzw. extrachromosomale Nukleinsäuremoleküle umfasst, die natürlicherweise nicht in der Pilzzelle Vorkommen. Die Mutationen im Genom der Pilzzelle können auch das Gen kodierend das erfindungsgemäße Polypeptid betreffen. Diese Pilzzelle wird als Ausgangszeile für weitere Modifikationen, wie hierin beschrieben, verwendet und stellt somit ebenfalls eine „unmodi-fizierte Pilzzelle" dar.An "unmodified fungal cell" or "unmodified fungal cell" as used herein forms the starting point for the production of a modified fungal cell according to the invention. The unmodified fungal cell comprises at least one gene coding for the polypeptide according to the invention and claimed and has a certain production rate of secondary metabolites. An unmodified fungal cell can be a fungal cell that occurs naturally in nature. However, an unmodified fungal cell can also be a fungal cell which has already been genetically or genetically engineered at any point in the genome or comprises extra-chromosomal nucleic acid molecules that naturally do not occur in the fungal cell. The mutations in the fungal cell genome may also relate to the gene encoding the polypeptide of the invention. This fungal cell is used as a starting line for further modifications as described herein and thus also constitutes an "unmodified fungal cell".
Der Begriff „Sekundärmetabolit" umfasst nicht nur ein Endprodukt eines Sekundärstoffwechselweges sondern auch Zwischenprodukte .The term "secondary metabolite" includes not only an end product of a secondary metabolism but also intermediates.
Das Merkmal, dass die Expression eines Polypeptids in einer genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zu einer unmodi-fizierten Pilzzelle reduziert ist, bedeutet, dass eine Pilzzelle bei einer genetischen Modifikation eine geringere Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids mit den hierin erwähnten Motiven synthetisiert als eine Pilzzelle derselben Art, die unmodifi-ziert bzw. nicht modifiziert ist. Die Reduktion der Expressionsrate bzw. der produzierten Polypeptidmenge beträgt mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 100%. Die Expressionsrate dieses Polypeptids kann beispielsweise mittels einer mRNA Bestimmung (z.B. mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) ) oder einer Polypeptidbestimmung unter Zuhilfenahme von Polypeptid-spezifischen Antikörpern (z.B. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) bestimmt werden. Selbstverständlich kann die Expressionsrate auch indirekt bestimmt werden, indem die Menge einer oder mehrere von der Pilzzelle produzierte Sekundärmetaboliten bestimmt wird. Erhöht sich die Menge an in der modifizierten Pilzzelle hergestellten Sekundärmetaboliten im Vergleich zu unmodifizierten Pilzzellen, ist die Einführung einer Mutation in das Gen kodierend für das Polypeptids erfolgreich.The feature that the expression of a polypeptide in a genetically modified fungal cell is reduced compared to an unmodified fungal cell means that a fungal cell in a genetic modification synthesizes a smaller amount of the polypeptide of the invention having the motifs mentioned herein than a fungal cell of the same kind that is unmodified or unmodified. The reduction of the expression rate or the amount of polypeptide produced is at least 10%, preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, even more preferably at least 60%, even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, in particular 100%. The expression rate of this polypeptide can be determined, for example, by means of an mRNA determination (for example by means of PCR (polymerase chain reaction)) or polypeptide determination with the aid of polypeptide-specific antibodies (eg ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).) The expression rate can of course also be determined indirectly by: the amount of one or more fungal cell derived secondary metabolites is determined If the amount of secondary metabolites produced in the modified fungal cell increases compared to unmodified fungal cells, the introduction of a mutation into the gene encoding the polypeptide is successful.
Der hier verwendete Einbuchstabencode für Aminosäurereste bei Aminosäuresequenzen entspricht dem üblicherweise verwendeten :The one-letter code for amino acid residues at amino acid sequences used herein corresponds to the commonly used:
Das Polypeptid, welches mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst, und in Trichoderma reesei die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, ist aus Trichoderma reesei als Xppl (Xylanase promoterbinding protein 1; Xylanase Promoter-bindendes Protein 1) bekannt (siehe Derntl C et al. Biotechnol Biofuels 8(2015):112). Bisher war nur bekannt, dass Xppl für die Regulation der Expression von Xylanasen in Pilzzellen verantwortlich ist, nicht jedoch für die Regulation von Biosynthesewegen von Sekundärmetaboliten. Da Xppl als sehr spezifischer Regulator der Expression von Xylanasen beschrieben wurde - Zellulasen werden durch Xppl nicht reguliert - ist es überraschend, dass Herabregulierung von Xppl zu einer erhöhten Produktion von Sekundärmetaboliten führt. Daher kann das Polypeptid mit den mindestens zwei Motiven auch als „Xppl" bezeichnet werden.The polypeptide comprising at least two motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID NO: 4), RX7LQAF (SEQ ID NO: 5), LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6) and variants thereof having an identity of at least 60%, and Trichoderma reesei has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, is known from Trichoderma reesei as Xppl (xylanase promoter binding protein 1) (see Derntl C et Biotechnol Biofuels 8 (2015): 112). So far, it was only known that Xppl is responsible for the regulation of the expression of xylanases in fungal cells, but not for the regulation of biosynthetic pathways of secondary metabolites. Since Xppl has been described as a very specific regulator of xylanase expression - cellulases are not regulated by Xppl - it is surprising that down-regulation of Xppl leads to increased production of secondary metabolites. Therefore, the polypeptide having the at least two motifs may also be referred to as "Xppl".
Im erfindungsgemäßen Verfahren können einerseits Pilzzellen eingesetzt werden, deren Expression des hierin beschriebenen Polypeptids reduziert ist (z.B. durch Modifikation oder Austausch des entsprechenden Promoters, durch Deletion des Gens, welches für das Polypeptid kodiert, bzw. Teilen davon). Andererseits ist es auch möglich, die Aktivität des Polypeptids zu reduzieren, in dem dieses z.B. durch Mutationen modifiziert wird. Das Polypeptid, welches die oben beschriebenen Motive umfasst, ist ein Transkriptionsfaktor. D.h. das Polypeptid steuert die Transkription verschiedenster Gene des Sekundär- und evtl, des Primärmetabolismus. Durch gezielte Mutationen ist es beispielsweise möglich, die Aktivität des Polypeptids so zu verändern, dass sich die Biosynthese der Sekundärmetaboliten im Vergleich zu Pilzzellen, welche ein unverändertes Polypeptid exprimieren, erhöht. Durch die Bestimmung der Mengen an in den Pilzzellen hergestellten Sekundärmetaboliten ist es möglich zu testen, ob eine Mutation des Polypeptids zu dem gewünschten Effekt führt.In the method according to the invention, on the one hand, fungal cells can be used whose expression of the polypeptide described herein is reduced (for example by modification or replacement of the corresponding promoter, by deletion of the gene which codes for the polypeptide or parts thereof). On the other hand, it is also possible to reduce the activity of the polypeptide in that this e.g. modified by mutations. The polypeptide comprising the above-described motifs is a transcription factor. That the polypeptide controls the transcription of various genes of the secondary and possibly, the primary metabolism. Targeted mutations make it possible, for example, to alter the activity of the polypeptide in such a way that the biosynthesis of the secondary metabolites increases in comparison to fungal cells which express an unchanged polypeptide. By determining the levels of secondary metabolites produced in the fungal cells, it is possible to test whether a mutation of the polypeptide leads to the desired effect.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Polypeptid einen Bereich auf, der mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100%, ident mit den Aminosäureresten 118 bis 157 und/oder 394 bis 494 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 ist. SEQ ID Nr. 1 stammt von Trichoderma reesei und weist folgende Aminosäuresequenz auf:According to a preferred embodiment of the present invention, the polypeptide has a range which is at least 60%, preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, especially 100% with amino acid residues 118 to 157 and / or 394 to 494 of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 is derived from Trichoderma reesei and has the following amino acid sequence:
MAQALDISSSSGPGPLVALPERTLGPPASAITPPSTVQRSAWTSSPRAPAMDMFNFTTAASASA VASYAPAGGSNSNSNSNSGGNSGGLGDMNFSQMPQYSGRNPLQSMLSQTKEGPDAKRIKVESPH SALDSIDSWLQFDEDADKFGSFEIDFSKQYNTANQPRASTNMTPGLGSGLYANPTAPFREEDFL DDSAFDHSLSEDDEMFDNININDQLSKLGTLPSTEAQSSRSLFSTPSMGWEKPQQGVQPSAVMG DEIPRRMT SD SWDPIPQGTNYTLTPDERRRLLEIAMGPGRLASYVNP SRFNMGFGSTMQP SISQ EFGGFGAPKQGLSHMGMYQRNNSADTSASPLSQSRELKHKQPKVETPPKTVPTKRPSTLSETSS IGKEKVKSADRMAHNDVERKYRTNLKDKITELRNAVPALQQVAEGEPDAAQGIAKVSKGTVLTK ATEYIHQLEQRNKDIMTEHKQLMRRLQAFEALLNNSMRVDIMPSHSMTLFDPRGFCMAQALDISSSSGPGPLVALPERTLGPPASAITPPSTVQRSAWTSSPRAPAMDMFNFTTAASASA VASYAPAGGSNSNSNSNSGGNSGGLGDMNFSQMPQYSGRNPLQSMLSQTKEGPDAKRIKVESPH SALDSIDSWLQFDEDADKFGSFEIDFSKQYNTANQPRASTNMTPGLGSGLYANPTAPFREEDFL DDSAFDHSLSEDDEMFDNININDQLSKLGTLPSTEAQSSRSLFSTPSMGWEKPQQGVQPSAVMG DEIPRRMT SD SWDPIPQGTNYTLTPDERRRLLEIAMGPGRLASYVNP SRFNMGFGSTMQP SISQ EFGGFGAPKQGLSHMGMYQRNNSADTSASPLSQSRELKHKQPKVETPPKTVPTKRPSTLSETSS IGKEKVKSADRMAHNDVERKYRTNLKDKITELRNAVPALQQVAEGEPDAAQGIAKVSKGTVLTK ATEYIHQLEQRNKDIMTEHKQLMRRLQAFEALLNNSMRVDIMPSHSMTLFDPRGFC
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100%, ident mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1.According to a further preferred embodiment of the present invention, the polypeptide is at least 60%, preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, in particular 100%, identical to the amino acid sequence SEQ ID No. 1.
Die mindestens eine Mutation des Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle ist vorzugsweise eine Deletion, Substitution oder Insertion mindestens eines Aminosäurerests. Verfahren zur Herstellung mutierter Polypeptide durch Einführen von Mutationen in der korrespondierenden Nukleinsäuresequenz sind dem Fachmann hinreichend bekannt.The at least one mutation of the polypeptide in the genetically modified fungal cell is preferably a deletion, substitution or insertion of at least one amino acid residue. Methods of producing mutated polypeptides by introducing mutations in the corresponding nucleic acid sequence are well known to those skilled in the art.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid mindestens eine Mutation in mindestens einem Motiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60%.According to a preferred embodiment, the polypeptide comprises at least one mutation in at least one motif selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX5KATEYI (SEQ ID NO: 4), RX7LQAF (SEQ ID NO: 5), LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6) and variants thereof having an identity of at least 60%.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid mindestens eine Mutation in mindestens einem Motiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen GSXsXglDXioSXn (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLY-STPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXieQQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11),According to a preferred embodiment, the polypeptide comprises at least one mutation in at least one motif selected from the group consisting of the amino acid sequences GSXsXglDXioSXn (SEQ ID No. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID No. 8), REGLY-STPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID No. 9) , GRAPQLSQQQieQQQQQQ (SEQ ID NO: 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID NO: 11),
PSTEXi9QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX2iDKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60%.PSTEXi9QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID NO: 12), TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID NO: 13), ALENSAQGX2iDKFQPG (SEQ ID NO: 14) and variants thereof having an identity of at least 60%.
Das Polypeptid, welches durch die genetisch modifizierte Pilzzelle hergestellt werden kann, weist im Vergleich zum Polypeptid der unmodifizierten Pilzzelle vorzugsweise eine oder mehrere Mutationen in einem oder mehreren der oben genannten Motive auf. Dabei können einzelne Aminosäuren substituiert oder das gesamte Motiv oder Teile davon (umfassend mindestens eine, zwei, fünf oder zehn Aminosäurereste) deletiert sein. Diese Mutationen sollen zu einer Erhöhung der Bildung von Sekundärmetaboliten oder entsprechenden Vorläufermolekülen davon in der modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle führen.The polypeptide which can be produced by the genetically modified fungal cell preferably has one or more mutations in one or more of the above-mentioned motifs as compared with the polypeptide of the unmodified fungal cell. In this case, individual amino acids may be substituted or the entire motif or parts thereof (comprising at least one, two, five or ten amino acid residues) may be deleted. These mutations should lead to an increase in the formation of secondary metabolites or corresponding precursor molecules thereof in the modified fungal cell compared to the unmodified fungal cell.
Die Reduktion der Expression des Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle wird vorzugsweise durch Modifikation des Gens oder Teilen davon erzielt.The reduction of the expression of the polypeptide in the genetically modified fungal cell is preferably achieved by modification of the gene or parts thereof.
Vorzugsweise ist der Promoter des Gens oder der das Polypeptid kodierende Bereich des Gens mutiert. Die Mutation am Promoter kann eine Deletion, Insertion oder Substitution mindestens eines Nukleotids umfassen. Der natürlich im Gen vorkommende Promoter kann auch durch einen anderen Promoter ersetzt werden. Dieser Promoter kann aus derselben Pilzzelle oder von einem anderen Organismus, vorzugsweise ebenfalls einer Pilzzelle, stammen .Preferably, the promoter of the gene or the polypeptide coding region of the gene is mutated. The mutation at the promoter may include a deletion, insertion or substitution of at least one nucleotide. The naturally occurring in the gene promoter can also be replaced by another promoter. This promoter may be from the same fungal cell or from another organism, preferably also a fungal cell.
Durch Modifikationen in der Nukleinsäuresequenz des Gens, welches für das Polypeptid mit den mindestens zwei Motiven wie hierin definiert kodiert, ist es möglich, dessen Transkriptionsrate zu reduzieren, wodurch auch weniger Polypeptid aus der entsprechenden RNA translatiert wird. Vorzugsweise wird mit geeigneter Modifikation die Menge an Polypeptid um mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100% im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle reduziert. Die Menge an transkribierter RNA kodierend für das Polypeptid kann mit bekannten Verfahren zur RNA Bestimmung bestimmt werden.By modifications in the nucleic acid sequence of the gene encoding the polypeptide having the at least two motifs as defined herein, it is possible to reduce its transcription rate, thereby also less polypeptide is translated from the corresponding RNA. Preferably, with appropriate modification, the amount of polypeptide is at least 10%, preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, even more preferably at least 60%, even more preferred at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, especially 100% reduced in comparison to the unmodified fungal cell. The amount of transcribed RNA encoding the polypeptide can be determined by known methods for RNA determination.
Die Expression des Polypeptids kann beispielsweise dadurch reduziert oder unterbunden werden, wenn vorzugsweise mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100% der kodierenden Region für das Polypeptid deletiert oder substituiert werden.The expression of the polypeptide can be reduced or prevented, for example, if preferably at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, even more preferably at least 60%. even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, especially 100% of the coding region for the polypeptide are deleted or substituted.
Um die Expression des Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle zu reduzieren bzw. zur Gänze zu unterbinden, kann beispielsweise die Promotorregion oder Teile davon durch beispielsweise Deletion oder Substitution modifiziert werden. Durch Modifikationen in der Promotorregion kann die Transkriptionsrate reduziert bzw. die Transkription zur Gänze unterbunden werden. Dabei kann mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100% des Promotors deletiert oder substituiert werden. Vorzugsweise werden stromaufwärts vom Startcodon mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, noch mehr bevorzugt mindestens 100, noch mehr bevorzugt mindestens 200, Nukleotide deletiert oder substituiert, wobei die Modifikation des Promotors unmittelbar ab dem Startcodon der für das Polypeptid kodierenden Region erfolgen kann.For example, to reduce or completely inhibit expression of the polypeptide in the genetically modified fungal cell, the promoter region or portions thereof may be modified by, for example, deletion or substitution. By modifications in the promoter region, the transcription rate can be reduced or the transcription can be completely suppressed. In this case, at least 10%, preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, even more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, especially 100% of the promoter are deleted or substituted. Preferably, at least 10, preferably at least 20, more preferably at least 50, even more preferably at least 100, even more preferably at least 200, nucleotides are deleted or substituted upstream of the start codon, wherein the modification of the promoter is directly from the start codon of the polypeptide coding region can be done.
Das Gen kodierend das Polypeptid Xppl in Trichoderma reesei umfasst die folgende Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 2):The gene encoding the polypeptide Xppl in Trichoderma reesei comprises the following nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2):
CAGATGGTGAAGACGGGCAGAAAGGGGAGCGAAAGCTGAAAAATACTTAAGCAGCAGCTGTTCCCAGATGGTGAAGACGGGCAGAAAGGGGAGCGAAAGCTGAAAAATACTTAAGCAGCAGCTGTTCC
CCGTACGTTCGTGGAGATGGCAAGAGCAGCCGGCCGCGGGGAGTCTGGAGCAGGAGCCGCAGCTCCGTACGTTCGTGGAGATGGCAAGAGCAGCCGGCCGCGGGGAGTCTGGAGCAGGAGCCGCAGCT
GCGTAGCTGCCGGTTGCTGCTGCCCATCTGCCCAGGTTCGTTTGCGCCGGATCCGTCCAAATATGCGTAGCTGCCGGTTGCTGCTGCCCATCTGCCCAGGTTCGTTTGCGCCGGATCCGTCCAAATAT
CTCCTGATAAATGCGGCCACTTTTCCCTCATGCTCGTCCTTTTTTATTCCCCGAAGCGCAGCAACTCCTGATAAATGCGGCCACTTTTCCCTCATGCTCGTCCTTTTTTATTCCCCGAAGCGCAGCAA
ACGAGCAGCAAGAGCAAAGAGCAGAGCAGAAAGTCGCCTCATCTCGGGCGCCGCCTTGCCTAACACGAGCAGCAAGAGCAAAGAGCAGAGCAGAAAGTCGCCTCATCTCGGGCGCCGCCTTGCCTAAC
GGGGTAGCAATAAGCCCATCGACACCGACGGCGGGCGGCGGGCTGGCCAATCAGCGGCGCGCGGGGGGTAGCAATAAGCCCATCGACACCGACGGCGGGCGGCGGGCTGGCCAATCAGCGGCGCGCGG
TGCTGTTCCTTTGGCCCTTGGAGCCTTGGGGAATCATACGATGTCTGAGCAGCCAATTCTTGCATGCTGTTCCTTTGGCCCTTGGAGCCTTGGGGAATCATACGATGTCTGAGCAGCCAATTCTTGCA
TTCTTCCCACATGCATGGCATCCCATGGCGCAGGGTCCCCCCCCCTTCTCCCCTCTCCGCTCTCTTCTTCCCACATGCATGGCATCCCATGGCGCAGGGTCCCCCCCCCTTCTCCCCTCTCCGCTCTC
TTCTCCTCTCTTCTTGGCTGAGGTGCTCTGCTCCCTCTGCTCGGCCAGCTAAGACAACCAGCGCTTCTCCTCTCTTCTTGGCTGAGGTGCTCTGCTCCCTCTGCTCGGCCAGCTAAGACAACCAGCGC
TGTGGCCCGGCAAGACAGCCACTCTTGTCATTCGCCAGGGGGGTTGGAGGAGGGCGCCACGGCTTGTGGCCCGGCAAGACAGCCACTCTTGTCATTCGCCAGGGGGGTTGGAGGAGGGCGCCACGGCT
CCGCGGAAAGTCAGGCCATTTTCATCAACAGCCGCAGACACTGGCCCAGAGAACTATCCTTATCCCGCGGAAAGTCAGGCCATTTTCATCAACAGCCGCAGACACTGGCCCAGAGAACTATCCTTATC
CTGGACGCGCGCACGTCGAAAATTTTCATTTTTGCTCGCCCAGGCGCGCCTGCAATTCGCCATGCTGGACGCGCGCACGTCGAAAATTTTCATTTTTGCTCGCCCAGGCGCGCCTGCAATTCGCCATG
CGGGCTGCTCGATACCCACGCAGACGGCAAATGACAGGCCATTCTGGCTCACAGACGCCGCCGTCGGGCTGCTCGATACCCACGCAGACGGCAAATGACAGGCCATTCTGGCTCACAGACGCCGCCGT
CCCGGCTCTCGCCGAGGTGGAAAAGGGTCATCTGGGTTCGTTGCGCTGAGCTCTAGCTAGGCCACCCGGCTCTCGCCGAGGTGGAAAAGGGTCATCTGGGTTCGTTGCGCTGAGCTCTAGCTAGGCCA
GAAGACACAGCCGAGACATGCCTATTCGACGTGCCTACGGGGCGGAGGCAGAGGGCAGAGGACAGAAGACACAGCCGAGACATGCCTATTCGACGTGCCTACGGGGCGGAGGCAGAGGGCAGAGGACA
GGAGGGCAGGAGGACATCCCAACAAAGGCTCCCCATGCCGGAAACGCAAAGAGAAGCATCGGAGGGAGGGCAGGAGGACATCCCAACAAAGGCTCCCCATGCCGGAAACGCAAAGAGAAGCATCGGAG
AGCTGCGAAGCACCCGCCGAAACAGCCACTACCTTACCCAGCAAGAGCAGCAGCTCTCTTGAATAGCTGCGAAGCACCCGCCGAAACAGCCACTACCTTACCCAGCAAGAGCAGCAGCTCTCTTGAAT
GGCCTGACTGGCGACACCGCGGGTCCCTAGCGCCGGGGCCTTGCCTGGATGGCACCGGTCCCTGGGCCTGACTGGCGACACCGCGGGTCCCTAGCGCCGGGGCCTTGCCTGGATGGCACCGGTCCCTG
GAGCGGGATCCTCGTCGCTGGTGCTCGACGGGCTGTGGTGCTGCTGTGCGTCTTGCGCTGCCGGGAGCGGGATCCTCGTCGCTGGTGCTCGACGGGCTGTGGTGCTGCTGTGCGTCTTGCGCTGCCGG
CTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGATCTGAGCTGCTTGCAGCGCCGTTCCCTCAGGCTTCGGAACTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGATCTGAGCTGCTTGCAGCGCCGTTCCCTCAGGCTTCGGAA
TCGCAGCCGTCGCGGCGTTGCCCGAACAGCCACCCGGAGCTTGGCCTGCCTCTGCGAGGTGCTATCGCAGCCGTCGCGGCGTTGCCCGAACAGCCACCCGGAGCTTGGCCTGCCTCTGCGAGGTGCTA
ATGCTGAAACTGGTCGACCCTGTATATTACCCGTGATGCTCTGGCACCGCAGCTCCAGACCCAGATGCTGAAACTGGTCGACCCTGTATATTACCCGTGATGCTCTGGCACCGCAGCTCCAGACCCAG
ACCCGGGTCTAGGTTCCCAATATCGATCCTGTAGCATTGATATCGAACGGTACTTGCTGGGTACACCCGGGTCTAGGTTCCCAATATCGATCCTGTAGCATTGATATCGAACGGTACTTGCTGGGTAC
TACCTCCCACTCTTGCTGCTCGGTACCCTGCCCTGTCTCACCTGTGCATGCACAGAAGCACCATTACCTCCCACTCTTGCTGCTCGGTACCCTGCCCTGTCTCACCTGTGCATGCACAGAAGCACCAT
CACTATCCATTGACTTCCAATTTTGCATCTGCATCCGTCGGCCTATCTTGCCGGCATCTACTTCCACTATCCATTGACTTCCAATTTTGCATCTGCATCCGTCGGCCTATCTTGCCGGCATCTACTTC
TACTTCTACTTCTACGTCTCCGCCTGCACTCGCATTGACCTCTTTTTGCATCTACATCTGCGGCTACTTCTACTTCTACGTCTCCGCCTGCACTCGCATTGACCTCTTTTTGCATCTACATCTGCGGC
AGAGCTGTGCGCTATCTACCTTACCTCGTCTTGAACCCCCCTGATCCGAGCATCGTATCCCTCCAGAGCTGTGCGCTATCTACCTTACCTCGTCTTGAACCCCCCTGATCCGAGCATCGTATCCCTCC
ATAACCACCTCGGCTCGCTACCTCACCTCCTTCGTGATAGGTATTCAATCGTGGTGTCTCTTGCATAACCACCTCGGCTCGCTACCTCACCTCCTTCGTGATAGGTATTCAATCGTGGTGTCTCTTGC
TCATCTGCATCTGGAATTCTTCCCTTTCTCCTCTTGACATCTTCTACCTATTATCGCGCTCTTCTCATCTGCATCTGGAATTCTTCCCTTTCTCCTCTTGACATCTTCTACCTATTATCGCGCTCTTC
CTCCTCCGTCTGCAACCCCCCAGACGCCGCCGAACCCGATCTGTGGCTGCCATTAGCCTTTCGGCTCCTCCGTCTGCAACCCCCCAGACGCCGCCGAACCCGATCTGTGGCTGCCATTAGCCTTTCGG
CGCGCATTCCTCTACGCCACCCGGTTTGGGTCCCCCTTCACCCCCAGCACATATTCCGACAACCCGCGCATTCCTCTACGCCACCCGGTTTGGGTCCCCCTTCACCCCCAGCACATATTCCGACAACC
CTGTGTCTGCAGCCGCATGGCACAAGCCCTCGACATTTCCTCGTCGTCAGGACCCGGACCCCTCCTGTGTCTGCAGCCGCATGGCACAAGCCCTCGACATTTCCTCGTCGTCAGGACCCGGACCCCTC
GTCGCCCTGCCCGAGCGAACTCTCGGCCCCCCAGCCTCGGCCATCACGCCTCCCTCGACCGTCCGTCGCCCTGCCCGAGCGAACTCTCGGCCCCCCAGCCTCGGCCATCACGCCTCCCTCGACCGTCC
AGCGCTCGGCCTGGACGTCGTCGCCTCGCGCGCCCGCCATGGACATGTTCAACTTCACAACCGCAGCGCTCGGCCTGGACGTCGTCGCCTCGCGCGCCCGCCATGGACATGTTCAACTTCACAACCGC
TGCCTCGGCATCCGCAGTCGCCTCGTATGCCCCCGCCGGCGGCAGCAATAGCAATAGCAATAGCTGCCTCGGCATCCGCAGTCGCCTCGTATGCCCCCGCCGGCGGCAGCAATAGCAATAGCAATAGC
AATAGCGGCGGCAACAGCGGCGGCCTGGGCGACATGAACTTCTCTCAGATGCCGCAGTACTCTGAATAGCGGCGGCAACAGCGGCGGCCTGGGCGACATGAACTTCTCTCAGATGCCGCAGTACTCTG
GCCGCAATCCCCTGCAGTCGATGCTCTCCCAGACCAAGGAGGGCCCCGATGCCAAGCGGATAAAGCCGCAATCCCCTGCAGTCGATGCTCTCCCAGACCAAGGAGGGCCCCGATGCCAAGCGGATAAA
GGTCGAGTCGCCGCACTCGGCGCTGGATTCGATCGATTCATGGCTTCAGTTTGACGAGGATGCCGGTCGAGTCGCCGCACTCGGCGCTGGATTCGATCGATTCATGGCTTCAGTTTGACGAGGATGCC
GACAAGTTTGGCAGCTTCGAGATTGACTTTTCCAAACAGTACAACACGGCCAACCAGCCAAGGTGACAAGTTTGGCAGCTTCGAGATTGACTTTTCCAAACAGTACAACACGGCCAACCAGCCAAGGT
GAGCTGCGCTCCTGAACCGCCAATCTGGTGTTTCCCGCTCTCTAACA.CATTGCGA.CA.TTAAGA.GGAGCTGCGCTCCTGAACCGCCAATCTGGTGTTTCCCGCTCTCTAACA.CATTGCGA.CA.TTAAGA.G
CTTCCACAAACATGACGCCGGGACTGGGCAGCGGTCTCTACGCCAATCCCACCGCCCCCTTCAGCTTCCACAAACATGACGCCGGGACTGGGCAGCGGTCTCTACGCCAATCCCACCGCCCCCTTCAG
AGAAGAAGACTTTCTCGACGACAGCGCCTTTGACCACTCTCTGTCCGAAGACGACGAGATGTTCAGAAGAAGACTTTCTCGACGACAGCGCCTTTGACCACTCTCTGTCCGAAGACGACGAGATGTTC
GACAACATCAACATCAATGACCAGCTGTCCAAGCTTGGCACGCTGCCCTCGACCGAAGCTCAGTGACAACATCAACATCAATGACCAGCTGTCCAAGCTTGGCACGCTGCCCTCGACCGAAGCTCAGT
CATCCAGGAGTCTCTTCTCCACGCCGTCGATGGGCTGGGAGAAGCCTCAGCAAGGCGTCCAGCCCATCCAGGAGTCTCTTCTCCACGCCGTCGATGGGCTGGGAGAAGCCTCAGCAAGGCGTCCAGCC
CAGCGCCGTCATGGGCGACGAGATCCCGAGGCGCATGACTAGCGATTCCTGGGACCCGATTCCGCAGCGCCGTCATGGGCGACGAGATCCCGAGGCGCATGACTAGCGATTCCTGGGACCCGATTCCG
CAGGGCACCAATTACACCCTCACGCCGGACGAGCGCCGCCGACTGCTCGAAATCGCCATGGGCCCAGGGCACCAATTACACCCTCACGCCGGACGAGCGCCGCCGACTGCTCGAAATCGCCATGGGCC
CCGGCAGATTGGCGTCCTACGTCAACCCCAGCCGGTTCAACATGGGCTTCGGATCTACGATGCACCGGCAGATTGGCGTCCTACGTCAACCCCAGCCGGTTCAACATGGGCTTCGGATCTACGATGCA
GCCCAGCATAAGCCAGGAGTTTGGCTTCGGCTTCGGCGCTCCGAAACAGGGGCTGAGCCATATGGCCCAGCATAAGCCAGGAGTTTGGCTTCGGCTTCGGCGCTCCGAAACAGGGGCTGAGCCATATG
GGCATGTACCAGAGGAACAACTCGGCCGACACGAGCGCATCCCCCCTCTCGCAGAGTCGGGAATGGCATGTACCAGAGGAACAACTCGGCCGACACGAGCGCATCCCCCCTCTCGCAGAGTCGGGAAT
TGAAACACAAGCAGCCCAAGGTCGAGACGCCGCCGAAGACGGTGCCCACAAAGCGGCCCAGCACTGAAACACAAGCAGCCCAAGGTCGAGACGCCGCCGAAGACGGTGCCCACAAAGCGGCCCAGCAC
GCTTTCGGAGACGAGCAGCATCGGCAAAGAAAAGGTCAAGTCCGCCGACCGCATGGCGCACAACGCTTTCGGAGACGAGCAGCATCGGCAAAGAAAAGGTCAAGTCCGCCGACCGCATGGCGCACAAC
GACGTTGAGCGCAAGTATCGAACCAATCTCAAGGACAAGATTACCGAGCTGCGAAATGCGGTGCGACGTTGAGCGCAAGTATCGAACCAATCTCAAGGACAAGATTACCGAGCTGCGAAATGCGGTGC
CGGCGCTGCAGCAGGTGGCTGAAGGGGAGCCGGACGCTGCGCAGGGCATTGCCAAAGTGAGCAACGGCGCTGCAGCAGGTGGCTGAAGGGGAGCCGGACGCTGCGCAGGGCATTGCCAAAGTGAGCAA
GGTGAGTTGGAAAACAGCATGCCCCATCTTGTCAGTGACTCGTGAAGACGGCATCACTGACTCTGGTGAGTTGGAAAACAGCATGCCCCATCTTGTCAGTGACTCGTGAAGACGGCATCACTGACTCT
GATCCTATAGGGCACCGTATTGACAAAAGCGACTGAATACATTCATCAGCTCGAGCAACGCAACGATCCTATAGGGCACCGTATTGACAAAAGCGACTGAATACATTCATCAGCTCGAGCAACGCAAC
AAGGATATCATGACGGAGCATAAGCAGCTTATGCGACGACTGCAAGCCTTCGAAGCACTTCTCAAAGGATATCATGACGGAGCATAAGCAGCTTATGCGACGACTGCAAGCCTTCGAAGCACTTCTCA
ACAACTCGATGAGAGTCGACATCATGCCCAGCCATAGCATGACGCTCTTCGACCCGAGAGGATT CTGTTGA, wobei der Promoterbereich unterstrichen, die Exons fett und die Introns kursiv und unterstrichen zwischen den Exons gedruckt sind.ACAACTCGATGAGAGTCGACATCATGCCCAGCCATAGCATGACGCTCTTCGACCCGAGAGGATT CTGTTGA, with the promoter region underlined, the exons in bold, and the introns in italics and underlined printed between the exons.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pilzzelle eine Pilzzelle der Klasse der Sordariomycetes, insbesondere der Familie Hypocreaceae, Clavici-pitaceae, Glomerellaceae oder Nectriaceae.According to another preferred embodiment of the present invention, the fungal cell is a fungal cell of the class Sordariomycetes, in particular of the family Hypocreaceae, Clavici-pitaceae, Glomerellaceae or Nectriaceae.
Die Pilzzelle ist vorzugsweise eine Pilzzelle der Gattung Trichoderma, Claviceps, Colletotrichum oder Fusarium.The fungal cell is preferably a fungal cell of the genus Trichoderma, Claviceps, Colletotrichum or Fusarium.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pilzzelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, Trichoderma atroviride, Tolypocladium ophio-glossoides, Ophiocordyceps unilateralis, Hirsutella minnesoten-sis, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Neonectria ditissima, Nectria haematococca, Villosiclava virens, Colletotrichum suhlineola, Colletotrichum fioriniae, Colletotrichum graminicola, Claviceps purpurea, Stachybotrys chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Fusarium avenaceum, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium langsethiae, Fusarium pseudograminearum, Fusarium graminearum, Fusarium fujikuroi, Fusarium oxysporum, Verticillium longisporum, Fusarium verticil-lioides, Colletotrichum orbiculare, Thielaviopsis punctulata, Madurella mycetomatis, Verticillium dahlia, Phaeoacremonium minimum, Thielavia terrestris, Magnaporthe oryzae, Neurospora tet-rasperma, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Metarhizium acridum, Magnaporthiopsis poae, Sordaria macrospora, Po-dospora anserine, Metarhizium guizhouense, Chaetomium globosum, Metarhizium brunneum, Gaeumannomyces graminis, Sporothrix schenckii, Sporothrix brasiliensis, Ophiostoma piceae, Colletotrichum higginsianum, Metarhizium album und Diaporthe ampeli-na, vorzugsweise Trichoderma reesei, Trichoderma atroviride, Claviceps purpurea und Fusarium graminearum, besonders bevorzugt Trichoderma reesei. Sämtliche dieser Pilzarten verfügen in ihrer unmodifizierten Form über ein Gen kodierend für mindestens ein Polypeptid, das mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFD-PRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% und gegebenenfalls ein weiteres Motiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen GSX8X9IDX10SX11 (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REG-LYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXieQQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst. Alle oben genannten unmodifizierten Pilzarten sind in der Lage ein Polypeptid mit den Motiven AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5) und LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) zu exprimieren. Die Motive GSXsXglDXioSXn (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLYSTPLS-WEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXieQQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% kommen in Polypeptiden verschiedener Pilzfamilien, Pilzgattungen bzw. Pilzarten vor.According to a particularly preferred embodiment of the present invention, the fungal cell is selected from the group consisting of Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, Trichoderma atroviride, Tolypocladium ophio-glossoides, Ophiocordyceps unilateralis, Hirsutella minnesoten-sis, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus , Neonectria ditissima, Nectria haematococca, Villosiclava virens, Colletotrichum suhlineola, Colletotrichum fioriniae, Colletotrichum graminicola Claviceps purpurea, Stachybotrys chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Fusarium avenaceum, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium langsethiae, Fusarium pseudograminearum, Fusarium graminearum, fujikuroi, Fusarium oxysporum, Verticillium longisporum, Fusarium verticillioides, Colletotrichum orbiculare, Thielaviopsis punctulata, Madurella mycetomatis, Verticillium dahlia, Phaeoacremonium minimum, Thielavia terrestris, Magnaporthe oryzae, Neurospora tet-raspe rma, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Metarhizium acridum, Magnaporthiopsis poae, Sordaria macrospora, Po-dospora anserine, Metarhizium guizhouense, Chaetomium globosum, Metarhizium brunneum, Gaeumannomyces graminis, Sporothrix schenckii, Sporothrix brasiliensis, Ophiostoma piceae, Colletotrichum higginsianum, Metarhizium album and Diaporthe ampeli-na, preferably Trichoderma reesei, Trichoderma atroviride, Claviceps purpurea and Fusarium graminearum, more preferably Trichoderma reesei. All of these fungi have in their unmodified form a gene encoding at least one polypeptide comprising at least two motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID NO: 4), RX7LQAF (SEQ ID No. 5), LFD-PRGFC (SEQ ID No. 6) and variants thereof having an identity of at least 60% and optionally a further motif selected from the group consisting of the amino acid sequences GSX8X9IDX10SX11 (SEQ ID No. 7), PGLGX12GX13Y ( SEQ ID NO: 8), REG-LYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID NO: 9), GRAPQLSQQQXieQQQQQQ (SEQ ID NO: 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID NO: 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID NO: 12), TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID NO: 11) 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID NO: 14) and variants thereof having an identity of at least 60%. All of the above-mentioned unmodified fungal species are capable of a polypeptide having the motifs AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID NO: 4), RX7LQAF (SEQ ID NO: 5) and LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6) express. The motifs GSXsXglDXioSXn (SEQ ID NO: 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID NO: 8), REGLYSTPLS-WEX14PQPGX15RMD (SEQ ID NO: 9), GRAPQLSQQQXieQQQQQQ (SEQ ID NO: 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID NO: 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID NO: 12), TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID NO: 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID NO: 14) and variants thereof having an identity of at least 60% are present in polypeptides of various fungal families, fungal genera and fungal species, respectively.
Die Motive GSX8X9IDX10SXii (SEQ ID Nr. 7) und PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8) sind vorzugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilzzellen Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, Trichoderma atroviride, Claviceps purpurea, Metarhizium album, Villosiclava virens, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Metarhizium brunneum, Metarhizium guizhouense, Metarhizium acridum, Toly-pocladium ophioglossoides, Hirsutella minnesotensis, Ophiocordy- ceps unilateralism Stachybotrys chlorohalonata, Stachybotrys chartarum, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium langsethiae, Fusarium verticillioides, Fusarium fuji-kuroi, Fusarium oxysporum, Fusarium favenaceum, Nectaria hae-matococca, Neonectria ditissima, Thielaviopsis punctulata, Ver-ticillium dahlia, Verticillium logisporum, Colletotrichum orbi-culare, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum higginsi-anum, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum sublineola und Colletotrichum fioriniae vorhanden.The motifs GSX8X9IDX10SXii (SEQ ID NO: 7) and PGLGX12GX13Y (SEQ ID NO: 8) are preferably in polypeptides of the fungal cells defined herein Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, Trichoderma atroviride, Claviceps purpurea, Metarhizium album, Villosiclava virens, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Metarhizium brunneum, Metarhizium guizhouense, acridum Metarhizium, Toly-pocladium ophioglossoides, Hirsutella minnesotensis, Ophiocordy- ceps unilateralism Stachybotrys chlorohalonata, Stachybotrys chartarum, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium langsethiae, verticillioides, Fusarium fuji -kuroi, Fusarium oxysporum, Fusarium favenaceum, Nectaria hae-matococca, Neonectria ditissima, Thielaviopsis punctulata, Vericotium dahlia, Verticillium logisporum, Colletotrichum orbi-culare, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum higginsi-anum, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum sublineola and Colletotrichum fioriniae present.
Das Motiv REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9) ist vorzugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilzzellen Ophiostoma piceae, Sporothrix brasiliensis, Sporothrix schenckii, Gaeumannomyces graminis, Magnaporthiopsis poae, Mag-naporthe oryzae, Diaporthe ampelina, Phaeoacremonium minimum, Madurella mycetomatis, Podospora anserine, Thielavia terrestris, Myceliophthora thermophila und Chaetomium globosum vorhanden.The motif REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID NO: 9) is preferably in polypeptides of the fungal Ophiostoma piceae, Sporothrix brasiliensis, Sporothrix schenckii, Gaeumannomyces graminis, Magnaporthiopsis poae, Magnaporthe oryzae, Diaporthe ampelina, Phaeoacremonium minimum, Madurella mycetomatis, Podospora anserine, Thielavia terrestris, Myceliophthora thermophila and Chaetomium globosum.
Das Motiv GRAPQLSQQQXisQQQQQQ (SEQ ID Nr. 10) ist vorzugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilzzellen Sordaria macrospora, Neurospora crassa und Neurospora tetrasper-ma vorhanden.The motif GRAPQLSQQQisQQQQQQQ (SEQ ID NO: 10) is preferably present in polypeptides of the type of fungal cells Sordaria macrospora, Neurospora crassa and Neurospora tetrasperma defined herein.
Das Motiv PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11) ist vorzugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilzzellen Stachybotrys chlorohalonata, Stachybotrys chartarum, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium langsethiae, Fusarium verticillioides, Fusarium fujikuroi, Fusarium oxysporum, Fusarium favenaceum, Nectaria haematococca, Neonectria ditissima, Thielaviopsis punctulata, Verticillium dahlia, Verticillium logisporum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum fioriniae, Sordaria macrospora, Neurospora crassa und Neurospora tetrasperma vorhanden.The motif PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID NO: 11) is preferably in polypeptides of the type of fungal cells Stachybotrys chlorohalonata, Stachybotrys chartarum, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium slowethiae, Fusarium verticillioides, Fusarium fujikuroi, Fusarium oxysporum, Fusarium favenaceum, Nectaria haematococca, Neonectria ditissima, Thielaviopsis punctulata, Verticillium dahlia, Verticillium logisporum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum fioriniae, Sordaria macrospora, Neurospora crassa and Neurospora tetrasperma.
Das Motiv PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12) ist vorzugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilzzellen der Gattung Trichoderma, vorzugsweise Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens und Trichoderma atro-viride, vorhanden.The motif PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID NO: 12) is preferably present in polypeptides of the type of fungal cells of the genus Trichoderma defined herein, preferably Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens and Trichoderma atro-viride.
Das Motiv TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13) ist vorzugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilz zellen Metarhizium album, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Metarhizium brunneum, Metarhizium guizhouense und Metarhizium acridum vorhanden.The motif TKAKPGEKMAQLESISTSQQPLD (SEQ ID NO: 13) is preferably present in polypeptides of the type of the fungal cells defined herein Metarhizium album, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Metarhizium brunneum, Metarhizium guizhouense and Metarhizium acridum.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können unter Verwendung geeigneter modifizierter Pilzzellen wie hierin beschrieben verschiedene Sekundärmetabolite hergestellt werden. Der mindestens eine Sekundärmetabolit ist daher vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyketiden, Alkaloiden, Terpenen, Melaninen, Pteridinen, Phenylpropanoiden, Flavonoiden, und nichtriboso-malen Peptiden, wobei besonders bevorzugt Polyketide hergestellt werden.Various secondary metabolites can be produced by the method of the invention using suitable modified fungal cells as described herein. The at least one secondary metabolite is therefore preferably selected from the group consisting of polyketides, alkaloids, terpenes, melanines, pteridines, phenylpropanoids, flavonoids, and non-ribosomal peptides, polyketides being particularly preferably prepared.
Pilzzellen sind bekannt dafür, dass diese in der Lage sind, Sekundärmetaboliten herzustellen. Dabei produzieren die Pilzzellen je nach Zelle unterschiedlichste Substanzen. Durch das Vorsehen der erfindungsgemäßen Modifikationen ist es möglich, dass die Menge der von den Pilzzellen hergestellten Sekundärmetaboliten erhöht werden kann. Es ist auch möglich, Pilzzellen so zu modifizieren, dass diese in der Lage sind, Sekundärmetabolite zu produzieren, die diese Zellen natürlicherweise nicht produzieren könnten. Dazu können zusätzliche Nukleinsäuremoleküle in die Pilzzelle eingebracht werden, die Polypeptide und Proteine kodieren, die diese neuen bzw. alternativen Biosynthesewege katalysieren. Daher ist es besonders bevorzugt, dass die genetisch modifizierte Pilzzelle mindestens ein Nukleinsäuremolekül kodierend für mindestens ein heterologes Protein umfasst. In Watanabe CM et al. (Chem Biol 3(2013):463-469), Abrar M, et al. (Crit Rev Food Sei Nutr 53(2013):862-874), Ortei I et al. (J Biol Chem 284(2009):6650-6660), Ozcengiz G et al. (Biotech Adv 31(2013):287-311), Ward TJ et al. (PNAS 99(2002):9278-9283), Ei-senman HC et al. (Appl Microbiol Biotech 93(2012):931-940) und Nesic K et al. (Rev Envir Contamin Toxicol 228(2014):101-120) werden Sekundärmetabolite und deren Stoffwechselwege geoffen-bart, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gesteuert werden können.Fungal cells are known to be capable of producing secondary metabolites. The fungal cells produce different substances depending on the cell. By providing the modifications of the invention, it is possible that the amount of secondary metabolites produced by the fungal cells can be increased. It is also possible to modify fungal cells so that they are able to produce secondary metabolites that these cells could not naturally produce. For this purpose, additional nucleic acid molecules can be introduced into the fungal cell which code polypeptides and proteins which catalyze these new or alternative biosynthetic pathways. Therefore, it is particularly preferred that the genetically modified fungal cell comprises at least one nucleic acid molecule coding for at least one heterologous protein. In Watanabe CM et al. (Chem Biol 3 (2013): 463-469), Abrar M, et al. (Crit Rev Food, Nutr 53 (2013): 862-874), Ortei I et al. (J Biol Chem 284 (2009): 6650-6660), Ozcengiz G et al. (Biotech Adv 31 (2013): 287-311), Ward TJ et al. (PNAS 99 (2002): 9278-9283), Ei-senman HC et al. (Appl Microbiol Biotech 93 (2012): 931-940) and Nesic K et al. (Rev Envir Contamin Toxicol 228 (2014): 101-120) disclose secondary metabolites and their metabolic pathways which can be controlled by the method of the present invention.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur Sekundärmetabolite hergestellt, sondern es kann auch zur Identifikation neuer Sekundärmetabolite und Biosynthesewegen verwendet werden. Dabei können mit den erfindungsgemäß modifizierten Pilzzellen hergestellten Sekundärmetabolite isoliert und derenNot only can secondary metabolites be produced by the method of the invention, but it can also be used to identify new secondary metabolites and biosynthetic pathways. In this case, secondary metabolites produced according to the invention modified fungus cells can be isolated and their
Struktur bestimmt werden (z.B. mittels MS/MS oder NMR). Die von den erfindungsgemäß modifizierten Pilzzellen hergestellten Sekundärmetabolite werden mit jenen Sekundärmetaboliten verglichen, die eine entsprechende unmodifizierte Pilzzelle produziert. Dadurch lässt sich feststellen, welcher Sekundärmetabolitsyntheseweg in der Pilzzelle durch Reduktion der Expression bzw. Aktivität des Polypeptids mit den mindestens zwei Motiven ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon hochreguliert wird. Die daran beteiligten Enzyme und sonstigen Proteine können mittels RNA Analysen zunächst indirekt bestimmt werden.Structure (e.g., by MS / MS or NMR). The secondary metabolites produced by the fungal cells modified according to the invention are compared with those secondary metabolites which produce a corresponding unmodified fungal cell. This can be used to determine which secondary metabolite synthesis pathway in the fungal cell by reducing the expression or activity of the polypeptide with the at least two motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID No. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID No. 4), RX7LQAF (SEQ ID NO: 5), LFDPRGFC (SEQ ID NO: 6) and variants thereof are up-regulated. The involved enzymes and other proteins can be determined indirectly by means of RNA analyzes.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispielen eingehender erläutert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.The present invention will be explained in more detail with reference to the following figures and examples, but without being limited thereto.
Fig. 1 zeigt den Verlauf der Gelbfärbung (Absorption bei 370 nm) in Kulturüberständen des Wildtypstammes (schwarze Quadrate, durchgehende Linien), des Xppl-Deletionsstammes (schwarze Rauten, gestrichelte Linien) und des Xppl-Überexpressionsstammes (weiße Quadrate, gepunktete Linien) auf Carboxymethylcellulose (CMC) (A), Laktose (B) und D-Glukose (C). Die Daten stammen aus drei unabhängigen biologischen Replikaten. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.Fig. 1 shows the course of yellowing (absorption at 370 nm) in culture supernatants of the wild-type strain (black squares, solid lines), the Xppl deletion strain (black diamonds, dashed lines) and the Xppl overexpression strain (white squares, dotted lines) Carboxymethylcellulose (CMC) (A), lactose (B) and D-glucose (C). The data comes from three independent biological replicates. The error bars indicate the standard deviation.
Fig. 2 zeigt die Qualität der Proben, die mittels RNASeq analysiert wurden. (A) Der Wildtypstamm (Ätmus53) und der Xppl-Deletionsstamm (Δχρρΐ) wurden in Triplikaten auf CMC kultiviert und das Myzel nach 48 h geerntet und gewogen. (B) Die einzelnen Proben wurden nach der RNASeq Analyse entsprechend den gemessenen Mengen der individuellen Transkripte geclustert.Fig. 2 shows the quality of the samples analyzed by RNASeq. (A) The wild-type strain (Etmus53) and the Xppl deletion strain (Δχρρΐ) were cultured in triplicates on CMC and the mycelium harvested after 48 hours and weighed. (B) The individual samples were clustered according to the RNASeq analysis according to the measured amounts of individual transcripts.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Anteile der unterschiedlich exprimierten Gene (UEG) und aller annotierten Gene pro KOG (Eu-Karyotic Orthologous Groups) beziehungsweise pro KOG-Klasse aus der jeweiligen Gesamtsumme. Das Verhältnis der prozentuellen Anteile wird als Logarithmus zur Basis 2 angegeben. KOG beziehungsweise KOG-Klassen mit einem Wert über 0,2 sind (als wahrscheinlich regulierte Gengruppen) fett gedruckt.FIG. 3 shows a comparison of the proportions of the differently expressed genes (UEG) and of all annotated genes per KOG (Eu-Karyotic Orthologous Groups) or per KOG class from the respective total. The ratio of percentages is given as a base 2 logarithm. KOG or KOG classes above 0.2 are bold (as likely to be regulated gene groups).
Fig. 4 zeigt sämtliche UEG aus der KOG „Kohlehydrattransport und -metabolismus" inklusive der Detailergebnisse aus der RNA-4 shows all LELs from the COG "carbohydrate transport and metabolism" including the detailed results from the RNA
Seq-Analyse (durchschnittliche Anzahl an der Transkripte pro Probe, Unterschied zwischen Wildtyp- und Xppl-Deletionsstamm als Logarithmus zur Basis 2, p-Wert nach Benjamini & Hochberg).Seq analysis (average number of transcripts per sample, difference between wild-type and Xppl deletion strain as logarithm base 2, p-value according to Benjamini & Hochberg).
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Biolog-Analyse. Der Xppl-Deletionsstamm und der Wildtypstamm wurden in Triplikaten auf 95 verschiedenen Kohlenstoffguellen kultivieren und das Wachstum durch Messung der Absorption bei 750 nm gemessen. (A) zeigt die durchschnittlichen Werte des Wildtypstammes (schwarze Balken) und des Xppl-Deletionsstammes (schraffierte Balken) auf einer repräsentativen Auswahl an Kohlenstoffguellen (in Bezug auf den Kohlenstoffguellentyp als auch auf die Wachstumsrate) nach 72 h. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. In (B) und (C) wurden die durchschnittlichen Werte auf allen Kohlenstoffguellen nach 72 h bzw. 96 h des Xppl-Deletionsstammes gegen den Wildtypstamm aufgetragen und eine Trendlinie eingefügt.Fig. 5 shows the results of the biolog analysis. The Xppl deletion strain and wild-type strain were cultured in triplicates on 95 different carbon sources and growth measured by measuring absorbance at 750 nm. (A) shows the average values of the wild type strain (black bars) and the Xppl deletion strain (hatched bars) on a representative selection of carbon sources (in terms of carbon source type as well as growth rate) after 72 hours. The error bars indicate the standard deviation. In (B) and (C), the average values on all carbon sources after 72 h and 96 h, respectively, of the Xppl deletion strain were plotted against the wild type strain and a trend line inserted.
Fig. 6 zeigt sämtliche Gene, die für Polyketidsynthasen (PKS) kodieren inklusive der Detailergebnissen aus der RNASeq-Analyse (durchschnittliche Anzahl an der Transkripte pro Probe, Unterschied zwischen Wildtyp- und Xppl-Deletionsstamm als Logarithmus zur Basis 2, p-Wert nach Benjamini & Hochberg). Fett gedruckte PKS-kodierende Gene wurden in der Auswertung der RNASeq-Analyse als unterschiedlich exprimiert gewertet.Fig. 6 shows all genes coding for polyketide synthases (PKS) including the detailed results from the RNASeq analysis (average number of transcripts per sample, difference between wild-type and Xppl deletion strain as base 2 logarithm, Benjamini p-value & Hochberg). Fat-printed PKS-encoding genes were considered differently expressed in the evaluation of the RNASeq analysis.
Fig. 7 zeigt die Expressionsraten der PKS-kodierenden Gene 73621 (A) , 73618 (B) , 65116 (C) , 65172 (D) , 60118 (E) und 81964 (F) im Wachstumsverlauf auf CMC des Xppl-Deletionsstammes (Rauten) und des Wildtypstammes (Quadrate). Die beiden Stämme wurden in Triplikaten kultiviert und die relativen Transkriptmengen mittels qPCR bestimmt, als Referenzwert dient dabei jeweils der Wert des Wildtypstammes nach 36 h. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.Fig. 7 shows the expression rates of the PKS-encoding genes 73621 (A), 73618 (B), 65116 (C), 65172 (D), 60118 (E) and 81964 (F) in the growth course on CMC of the Xppl deletion strain (Rauten ) and wild-type strain (squares). The two strains were cultured in triplicates and the relative transcript levels were determined by means of qPCR, the reference value used being in each case the value of the wild-type strain after 36 h. The error bars indicate the standard deviation.
Fig. 8 zeigt die Eckdaten der Anzucht in modifiziertem Medium (kein Citrat) mit D-Glukose. Der Wildtypstamm (schwarze Quadrate), der Xppl-Deletionsstamm (schwarze Rauten) und der Xppl-Überexpressionsstamm (weiße Quadrate) wurden in „24-well-plates" kultiviert. Der Verlauf der Biomasse (A), der Gelbfärbung des Überstands(B) und die Expressionsraten der PKS-kodierenden Gene 73621 (C) und 65172 (D) sind angegeben. Die Werte stammen aus drei biologischen Replikaten, die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Die relativen Transkriptmengen wurden mittels qPCR bestimmt, als Referenzwert dient dabei jeweils der Wert des Wildtypstammes nach 48 h.Fig. 8 shows the basic data of cultivation in modified medium (no citrate) with D-glucose. The wild-type strain (black squares), the Xppl deletion strain (black diamonds) and the Xppl overexpression strain (white squares) were cultured in "24-well-plates." The course of the biomass (A), the yellowing of the supernatant (B) and the expression rates of the PKS coding genes 73621 (C) and 65172 (D) are given, the values are from three biological replicates, the error bars indicate the standard deviation, the relative transcript amounts were determined by qPCR, the reference value being used in each case of the wild-type strain after 48 h.
Fig. 9 zeigt die Anzahl der niedermolekularen Substanzen, die von T. reesei gebildet wurden, in den Kulturüberständen nach 72 h bzw. 96 h in modifiziertem Medium (kein Citrat) mit D-Glukose im Wildtypstamm (Ätmus53), dem Xppl-Deletion-Stamm (Δχρρΐ) und dem Xppl-Überexpressionsstamm (OExppl).9 shows the number of low-molecular substances which were formed by T. reesei in the culture supernatants after 72 h and 96 h, respectively, in modified medium (no citrate) with D-glucose in the wild-type strain (Etmus53), the Xppl deletion Strain (Δχρρΐ) and the Xppl overexpression strain (OExppl).
Fig. 10 zeigt einen Stammbaum der Orthologe von Xppl. BEISPIELE:Fig. 10 shows a pedigree of the orthologist of Xppl. EXAMPLES:
Material und Methodenmaterial and methods
Pilzstämme und KultivierungsbedigungenMushroom trunks and cultivation conditions
Die T. reesei Stämme QM6aAtmus53 (Steiger M et al., Appl Environ Microbiol. 77(2011):114), der Xppl-Deletionsstamm QM6aÄtmus53Äxppl (QMöaÄxppl) (Derntl C et al., Biotechnol Biofuels 8(2015):112) und der Xppl-Überexpressionsstamm (QMöaOExppl) (Derntl C et al., Biotechnol Biofuels 8(2015):112) wurden auf Malzextrakt (MEX) Agar-Platten bei 30°C kultiviert. Hygromycin B wurde nach Bedarf in einer finalen Konzentration von 113 U/ml zugesetzt. Für die Wachstumsvergleiche wurde T. reesei auf Platten mit Mandels-Andreotti Medium (MAM) mit 1% Glycerol bei 30°C vorkultiviert. Vergleichbar große Stücke des überwachsenen Agars wurden als Inokulum auf MAM Platten mit 1% D-Glukose gesetzt und bei 30°C inkubiert. Fotos wurden von der Unterseite der Platten aufgenommen. Für die Kultivierung in Carboxymethylcellulose (CMC) wurde T. reesei in 60 mL MAM mit 1% CMC (Carl Roth GmbH, Deutschland) in 1-L-Erlenmeyer Kolben ohne Schütteln bei 30°C inkubiert. Für die Kultivierung in D-Glukose und Laktose wurde T. reesei in 60 mL MAM mit 1% D-Glukose beziehungsweise Laktose in 250-ml-Erlenmeyer Kolben bei 30°C bei 180 rpm geschüttelt. Myzelium und Kulturüberstände wurden durch Filtration über Miracloth (EMD Millipore, Deutschland) getrennt. Die Myzelien wurden in flüssigem Stickstoff gelagert. Für Kultivierungen in kleinem Maßstab wurde T. reesei in 1,5 ml modifiziertem MAM mit 1% U-12C- oder U-13C-markierter D-Glukose in 24-well-plates ohne Schütteln bei 30°C inkubiert. Das MAM wurde insofern modifiziert, als dass es anstatt eines Phos-phat-Citrat-Puffers durch einen Natrium-Phosphat-Puffer gepuf- fert wurde. Der Kulturüberstand wurde mit 30% (v/v) Azetonitil gestoppt.The T. reesei strains QM6aAtmus53 (Steiger M et al., Appl Environ Microbiol. 77 (2011): 114), the Xppl deletion strain QM6aEtmus53Axppl (QMoAxppl) (Derntl C et al., Biotechnol Biofuels 8 (2015): 112) and the Xppl overexpression strain (QMaoOppl) (Derntl C et al., Biotechnol Biofuels 8 (2015): 112) was cultured on malt extract (MEX) agar plates at 30 ° C. Hygromycin B was added as needed at a final concentration of 113 U / ml. For comparative growth T. reesei was pre-cultured on plates with Mandels-Andreotti medium (MAM) with 1% glycerol at 30 ° C. Comparably large pieces of overgrown agar were placed as inoculum on MAM plates containing 1% D-glucose and incubated at 30 ° C. Photos were taken from the bottom of the plates. For the cultivation in carboxymethyl cellulose (CMC) T. reesei was incubated in 60 ml MAM with 1% CMC (Carl Roth GmbH, Germany) in 1 L Erlenmeyer flask without shaking at 30 ° C. For the cultivation in D-glucose and lactose, T. reesei was shaken in 60 ml MAM with 1% D-glucose or lactose in 250 ml Erlenmeyer flasks at 180 ° C. at 180 rpm. Mycelium and culture supernatants were separated by filtration over Miracloth (EMD Millipore, Germany). The mycelia were stored in liquid nitrogen. For small scale culture, T. reesei was incubated in 1.5 ml of modified MAM with 1% U-12C or U-13C-labeled D-glucose in 24 well plates without shaking at 30 ° C. The MAM was modified to be buffered by a sodium phosphate buffer instead of a phosphate-citrate buffer. The culture supernatant was stopped with 30% (v / v) acetonitrile.
Transkriptanalyse mittels RNAseq RNA wurde mit Hilfe des RNeasy Plant Mini Kits (Qiagen) isoliert und die Qualität der Proben auf einem Agilent 2100 Bioana-lyzer überprüft. Die RNA Bibliothek wurde mittels eines TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit und Poly(A) Anreicherung (Illumina, Switzerland) erzeugt und mit einem Illumina Library Quantification Kit (ΚΑΡΑ Biosystems) quantifiziert. Die gemischten Bibliotheken wurden auf einem NextSeq500 Instrument (Illumina) ausgelesen mit Sequenzlängen von 75 nt. Für die bioinformatische Auswertung wurden die Sequenzierergebnisse mittels TopHat und Bowtie 2 Software mit dem Referenzgenom von T. reesei abgeglichen (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) und schließlich mit HTSeq quantifiziert. Die ausgezählten Transkrip-te wurden statistisch mit Hilfe des DESeq2 Software Paketes ausgewertet. Beide getesteten Stämme wurden für diese Analyse in drei biologischen Replikaten angezüchtet.RNAseq RNA transcript analysis was isolated using the RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) and the quality of the samples checked on an Agilent 2100 Bioana-lyzer. The RNA library was generated using a TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit and Poly (A) Enrichment (Illumina, Switzerland) and quantitated using an Illumina Library Quantification Kit (ΚΑΡΑ Biosystems). The mixed libraries were read on a NextSeq500 instrument (Illumina) with sequence lengths of 75 nt. For the bioinformatic evaluation, the sequencing results were compared with the reference genome of T. reesei using TopHat and Bowtie 2 software (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) and finally quantified with HTSeq. The counted transcripts were statistically evaluated using the DESeq2 software package. Both strains tested were grown for this analysis in three biological replicates.
Biolog Microarray TechnikBiolog microarray technique
Das globale Kohlenstoffassimilationprofil wurde mittels Biolog FF MicroPlate (Biolog, Inc., USA) untersucht. Dabei wurde das Protokoll, das in Druzhinina IS et al. (Appl. Environ. Microbiol. 72(2006):2126-2133) beschrieben ist, mit folgenden Ausnahmen verwendet: Das Inokulum wurde auf MEX-Platten angezüchtet und die Assayplatten bei 30°C inkubiert. Das Pilzwachstum wurde nach 18, 24, 30, 36, 42, 48, 66, 72, und 90 Stunden in biologischen Triplikaten gemessen.The global carbon assimilation profile was investigated using Biolog FF MicroPlate (Biolog, Inc., USA). The protocol described in Druzhinina IS et al. (Appl. Environ. Microbiol. 72 (2006): 2126-2133), with the following exceptions: The inoculum was grown on MEX plates and the assay plates were incubated at 30 ° C. Fungal growth was measured at 18, 24, 30, 36, 42, 48, 66, 72, and 90 hours in biological triplicates.
Transkriptanalyse mittels quantitativer PCR (qPCR) 0.01 - 0.03 g Myzel wurden mittels eines FastPrep FP120 BIO101 ThermoSavant Aufschlußgeräts (Qbiogene, USA) in 1 mL peqGOLD TriFast DNA/RNA/protein purification system Reagens (PEQLAB Biotechnologie, Deutschland) homogenisiert. Die RNA wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers isoliert und schließlich die Konzentration auf einem NanoDrop 1000 System (Thermo Scientific) gemessen. Synthese der cDNA von der mRNA wurde mittels dem RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) durchgeführt.Transcript analysis by quantitative PCR (qPCR) 0.01 - 0.03 g mycelium were homogenized using a FastPrep FP120 BIO101 ThermoSavant digestion apparatus (Qbiogene, USA) in 1 mL peqGOLD TriFast DNA / RNA / protein purification system reagent (PEQLAB Biotechnologie, Germany). The RNA was isolated according to the manufacturer's instructions and finally the concentration was measured on a NanoDrop 1000 system (Thermo Scientific). Synthesis of the cDNA from the mRNA was performed by the RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific).
Die qPCRs wurden auf einem Mastercycler ep realplex 2.2 System (Eppendorf, Deutschland) in Triplikaten durchgeführt. Die 25-μ1 PCR-Ansätze beinhalteten 12,5 pL 2χiQ SYBR Green Mix (Bio-Rad Laboratories, USA), 100 nM forward und reverse Primer und 2,5 pL 1:100 verdünnte cDNA. Die PCR und die Berechnungen der relativen Transkriptraten bezogen auf die Referenzgene actl und sarl wurden wie in Steiger MG et al. (J Biotechnol 145(2010):30-37) beschrieben durchgeführt. Folgende Primer wurden benutzt:The qPCRs were performed on a Mastercycler ep realplex 2.2 system (Eppendorf, Germany) in triplicates. The 25 μL PCR assays included 12.5 μL 2χIQ SYBR Green Mix (Bio-Rad Laboratories, USA), 100 nM forward and reverse primers, and 2.5 μL 1: 100 diluted cDNA. PCR and relative transcript rate calculations based on the reference genes actl and sarl were performed as described in Steiger MG et al. (J Biotechnol 145 (2010): 30-37). The following primers were used:
MetabolitmessungenMetabolitmessungen
Gleiche Volumen aller gestoppten, U-13C-markierten Überstände wurden gemischt. Die gestoppten, U-12C-markierten Überstände wurden individuell 1:1 mit dem U-13C-Pool gemischt. Diese Proben wurden, wie in Kluger B et al. Anal Bioanal Chem 405(2013):5031-5036 beschrieben, auf einem UHPLC System (Accela, Thermo Fisher Scientific, USA) aufgetrennt und mittels einem nachgeschaltetem LTQ Orbitrap XL System (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Ionisierung (positiv) erfolgte an einer Elektrospray Übergangsstelle. Eine reversed-phase XBridge C18 analytische Säule (150x2.1 mm i.d., 3,5 pm particle size) (Waters, USA), nachgeschalten einer C18 4x3 mm Sicherungskartusche (Phenomenex, USA), wurde mit Methanol (im folgenden A) und Wasser (im folgenden B), jeweils mit 0,1% Ameisensäure, als Laufmittel betrieben. Die Durchflussrate wurde auf 250 pL/min eingestellt. Das Chromatographieprogramm umfaßte folgende Schritte: 2 Minuten konstant 10% B, Gradient auf 100% B in 30 Minuten, 5 Minuten 100% B. Die Säule wurde danach für 8 Minuten mit 10% B re-equilibriert. Das Orbitrap Massenspektrometer wurde in vollem Scanmdodus (m/z 100 - 1000) betrieben. Auswertung der MS-Daten erfolgte wie in Bue-schl et al. (Metabolomics 10(2014):754-69) beschrieben.Equal volumes of all stopped, U-13C labeled supernatants were mixed. The stopped, U-12C labeled supernatants were individually mixed 1: 1 with the U-13C pool. These samples were prepared as described in Kluger B et al. Anal Bioanal Chem 405 (2013): 5031-5036, separated on a UHPLC system (Accela, Thermo Fisher Scientific, USA) and measured using a downstream LTQ Orbitrap XL system (Thermo Fisher Scientific). Ionization (positive) occurred at an electrospray interface. A reversed-phase XBridge C18 analytical column (150x2.1 mm id, 3.5 pm particle size) (Waters, USA), connected downstream of a C18 4x3 mm security cartridge (Phenomenex, USA), was charged with methanol (hereinafter A) and water (hereinafter B), each with 0.1% formic acid, as the eluent. The flow rate was set to 250 pL / min. The chromatography program included the following steps: constant 10% B for 2 minutes, gradient to 100% B for 30 minutes, 5 minutes 100% B. The column was then re-equilibrated with 10% B for 8 minutes. The Orbitrap mass spectrometer was operated in full scan mode (m / z 100-1000). Evaluation of the MS data was carried out as described in Bue-schl et al. (Metabolomics 10 (2014): 754-69).
Beispiel 1: Deletion von Xppl führt zu einer frühzeitigen und erhöhten Sekretion eines gelben PigmentsExample 1: Deletion of Xppl leads to an early and increased secretion of a yellow pigment
Der industriell eingesetzte Zellulase-produzierende Pilz T. reesei sekretiert während des Wachstums ein typisches, gelbes Pigment. Für eine frühere Publikation wurde ein Xppl-Deletionsstamm und der Wildtypstamm auf CMC kultiviert (Derntl C et al., Biotechnol Biofuels 8(2015):112). Dabei zeigte sich, dass die Kulturen des Xppl-Deletionsstammes früher und intensiver gelb wurden als die des Vergleichsstammes. In einer Wiederholung des Experiments wurden die beiden Stämme gemeinsam mit einem Xppl-Überexpressionsstamm auf CMC, Laktose und D-Glukose kultiviert. Die Abwesenheit von Xppl führte auf allen drei Kohlenstof f quellen zu einer früheren und intensiveren Gelbfärbung des Überstandes (Fig. 1A-C). Dazu passend, führte die Überexpression von Xppl zu einem späteren Auftreten der Gelbfärbung und einer weniger intensiven Färbung auf Laktose und D-Glukose(Fig. 1B und 1C).The industrially used cellulase-producing fungus T. reesei secretes a typical, yellow pigment during growth. For earlier publication, an Xppl deletion strain and the wild type strain were cultured on CMC (Derntl C et al., Biotechnol Biofuels 8 (2015): 112). It was found that the cultures of the Xppl deletion strain became yellow earlier and more intensely than those of the comparison strain. In a repeat of the experiment, the two strains were cultured together with an Xppl overexpression strain for CMC, lactose and D-glucose. The absence of Xppl resulted in earlier and more intense yellowing of the supernatant on all three sources of carbon (Figure 1A-C). In addition, overexpression of Xppl resulted in later yellowing and less intense staining on lactose and D-glucose (Figures 1B and 1C).
Beispiel 2: Xppl beeinflusst die Expression von Genen des primären und des sekundären StoffwechselsExample 2: Xppl influences the expression of genes of primary and secondary metabolism
Um die Einflüsse von Xppl auf das Transkriptom von T. reesei zu untersuchen, wurde eine RNAseq Analyse durchgeführt. Dafür wurden der Xppl-Deletionsstamm und der Wildtypstamm auf CMC 48 Stunden lang kultiviert. Die Stämme zeigten gleiches Wachstum auf dieser Kohlenstoffquelle (Fig. 2A). Die einzelnen Proben wurden vergleichbar gut prozessiert (jeweils 50.209.455 bis 57.345.532 individuelle Sequenzen ohne signifikanten Unterschied zwischen den Stämmen). Die erhaltenen Sequenzen wurden entsprechend dem Referenzgenom von Γ. reesei (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) einzelnen Transkripten zugeordnet (Zuordnungsquoten von 93.1% bis 93.7%). In Summe wurden 9129 verschiedene Transkripte identifiziert. Die sechs Proben wurden entsprechend der gemessenen Anzahl der einzelnen Transkripte geclustert. Dies spiegelt die beiden Stämme wider (Fig. 2B). Für eine genauere Analyse wurden die einzelnen Transkripte in Bezug auf unterschiedliche Menge in den beiden Stämmen verglichen und statistisch ausgewertet. Die zugehörigen Gene wurden als unterschiedlich exprimiert betrachtet, wenn der berechnete p-Wert (nach Benjamini & Hochberg) unter 0,05 lag. Mittels dieser Auswertung wurden 995 unterschiedlich exprimierte Gene (UEG) gefunden. Vergleichbar viele Gene wurden jeweils geringer beziehungsweise stärker im Xppl-Deletionsstamm exprimiert (genau genommen wurden 490 Gene hoch und 505 Gene herab reguliert).To study the effects of Xppl on the T. reesei transcriptome, an RNAseq analysis was performed. For this, the Xppl deletion strain and the wild type strain were cultured on CMC for 48 hours. The strains showed equal growth on this carbon source (Figure 2A). The individual samples were processed comparably well (in each case 50,209,455 to 57,345,532 individual sequences without significant difference between the strains). The sequences obtained were according to the reference genome of Γ. reesei (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) assigned to individual transcripts (assignment rates from 93.1% to 93.7%). In total, 9,129 different transcripts were identified. The six samples were clustered according to the measured number of individual transcripts. This reflects the two strains (Figure 2B). For a more detailed analysis, the individual transcripts were compared and statistically evaluated for different amounts in the two strains. The associated genes were considered differently expressed if the calculated p-value (according to Benjamini & Hochberg) was below 0.05. By means of this evaluation 995 differently expressed genes (UEG) were found. Comparably many genes were expressed less or more strongly in the Xppl deletion strain (in fact, 490 genes were upregulated and 505 genes downregulated).
Als nächstes wurden die UEG entsprechend ihrer zugewiesenen KOG klassifiziert. Da nicht alle Genen einer KOG zugeordnet werden konnten, ist diese Liste kürzer (nur 669 Einträge) als die UEG-Liste (995 Einträge). Um abzuschätzen, welche biologischen Funktionen von Xppl abhängig sind, wurde verglichen, welche KOGs in der RNASeq mit einem höheren Anteil vertreten sind, als statistisch zu erwarten wäre. Der relative Anteil der UEG einer bestimmten KOG an allen zugeordneten UEG wurde mit dem relativen Anteil aller Gene einer KOG an allen zugeordneten Genen verglichen. Diese Analyse zeigt, dass mehr Gene aus der KOG „Stoffwechsel” im Xppl-Deletionsstamm reguliert werden als statistisch zu erwarten wäre (Fig. 3). Genauer gesagt, sind sechs der neun KOG-Klassen betroffen - inklusiver der Klasse "Biosynthese, Transport und Abbau von Sekundärmetaboliten" (Fig. 3). Die weiteren fünf Klassen können als Primärstoffwechsel zusammengefasst werden. Besonders Gene der Klasse „Kohlehydrattransport und -metabolismus" zeigen ein auffälliges Bild: Fast alle Gene dieser Klasse, die hochreguliert werden, sind Transporter, während die restlichen Gene (kodierend für z.B. Hydrolasen und Enzyme aus der Glykolyse) herabreguliert werden (Fig. 4). Dieses Ergebnis lässt auf eine Abschwächung des Primärstoffwechsels im Xppl-Delet ionsstamm schließen.Next, the LELs were classified according to their assigned KOG. Since not all genes could be assigned to a KOG, this list is shorter (only 669 entries) than the LEL list (995 entries). In order to assess which biological functions depend on Xppl, it was compared which KOGs in the RNASeq are represented with a higher proportion than would be statistically expected. The relative proportion of LEL of a given KOG at all assigned LELs was compared with the relative proportion of all KOG genes in all the assigned genes. This analysis shows that more genes from the KOG "metabolism" in the Xppl deletion strain are regulated than would be statistically expected (Figure 3). More specifically, six of the nine KOG classes are affected, including the class "biosynthesis, transport and degradation of secondary metabolites" (Figure 3). The other five classes can be summarized as primary metabolism. Especially genes of the class "carbohydrate transport and metabolism" show a striking picture: Almost all genes of this class, which are upregulated, are transporters, while the remaining genes (coding for eg hydrolases and enzymes from glycolysis) are downregulated (FIG. 4) This result suggests an attenuation of the primary metabolism in the Xppl deletion strain.
Beispiel 3: Xppl unterstützt das PilzwachstumExample 3: Xppl Supports Fungal Growth
Die Ergebnisse der RNASeq Analyse lassen darauf schließen, dass Xppl den Primärstoffwechsel reguliert. Um dies weiter zu untersuchen wurde das Kohlenstoffassimilationsverhalten des Xppl-Deletionsstammes und des Wildtypstammes in einem „BiologThe results of the RNASeq analysis suggest that Xppl regulates the primary metabolism. To further investigate this, the carbon assimilation behavior of the Xppl deletion strain and the wild-type strain was determined in a "Biolog
Assay" verglichen. Dabei wird das Wachstum auf 95 verschiedenen Kohlenstoffquellen gemessen. Für die Auswertung wurden nur Kohlenstof fquellen, auf denen beiden Stämme besser gewachsen waren als auf Wasser (Kontrolle), berücksichtigt. Auf allen diesen Kohlenstoffquellen wuchs der Wildtypstamm besser als der Xppl-Deletionsstamm (Fig. 5A). Ein Wilcoxon-Test auf Datenpaare (Durchschnittswerte für beiden Stämmen) zeigte einen signifikanten Unterschied (p < 0,001) zwischen den beiden Stämmen für die zwei getesteten Zeitpunkte (48 und 72 Stunden). Daher wurden die einzelnen Datenpaare in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen (Fig. 5B und 5C). Der statistisch signifikante Wachstumsunterschied der beiden Stämme deutet darauf hin, dass die geringere Wachstumsrate des Xppl-Deletionsstammes eine inhärente Eigenschaft ist. Dies zeigt, dass Xppl das Wachstum in T. reesei unterstützt, was wiederum darauf hindeutet, dass Xppl den Primärstoffwechsel aktiviert.Growth was measured on 95 different carbon sources, and only carbon sources on which both strains grew better than on water (control) were considered for the analysis. Deletion strain (Figure 5A) A Wilcoxon test on data pairs (averages for both strains) showed a significant difference (p <0.001) between the two strains for the two time points tested (48 and 72 hours) The statistically significant growth differential of the two strains indicates that the lower growth rate of the Xppl deletion strain is an inherent property, demonstrating that Xppl supports T. reesei growth again suggesting that Xppl activates the primary metabolism.
Beispiel 4: Xppl reguliert die Genexpression von Polyketid-synthasenExample 4: Xppl Regulates Gene Expression of Polyketide Synthases
In Fig. 6 werden die Resultate aus der RNASeq Analyse für alle PKS aufgelistet. Um den regulatorischen Einfluss von Xppl auf die Expression der korrespondierenden Gene konkreter zu untersuchen, wurden die relativen Transkriptmengen jener PKS, die laut RNASeq am stärksten reguliert werden (-1 > Änderung Log2 > +1), mittels qPCR im Zeitverlauf bestimmt. Interessanterweise sind die am stärksten regulierten Gene kodierend für PKS (Protein ID 73621 und 73618, Fig. 7A und 7B) nicht in der Liste der UEG vertreten, da in der Auswertung der RNASeq keine p-Werte bestimmt werden konnten (Fig. 6). Für Protein ID 65116 konnte kein Unterschied zwischen den beiden Stämmen mit dieser Methode bestimmt werden (Fig. 7C). Protein ID 65172 scheint im Xppl-Delet ionsstamm früher exprimiert zu werden (Fig. 7D). Die Methode liefert für die Proteine ID 60118 und 81964 keine klaren Resultate (Fig. 7E und 7F).FIG. 6 lists the results from the RNASeq analysis for all PKSs. In order to investigate more closely the regulatory influence of Xppl on the expression of the corresponding genes, the relative transcript levels of those PKSs that are most heavily regulated by RNASeq (-1> change Log2> +1) were determined over time using qPCR. Interestingly, the most highly regulated genes encoding PKS (protein IDs 73621 and 73618, FIGS. 7A and 7B) are not represented in the LEL list because no p-values could be determined in the evaluation of RNASeq (FIG. 6). For protein ID 65116, no difference between the two strains could be determined by this method (Figure 7C). Protein ID 65172 appears to be expressed earlier in the Xppl deletion strain (Figure 7D). The method gives no clear results for the proteins ID 60118 and 81964 (FIGS. 7E and 7F).
Beispiel 5: Abwesenheit von Xppl fördert die Sekretion von niedermolekularen SubstanzenExample 5: Absence of Xppl Promotes the Secretion of Low Molecular Substances
Um den Einfluss von Xppl auf die globale Sekretion von nie-dermolekukaren Substanzen zu untersuchen, wurden der Xppl-Deletionsstamm, der Xppl-Überexpressionsstamm und der Wildtypstamm jeweils parallel auf U-12C- und U-13C-markierter D-Glukose kultiviert. Sämtliche niedermolekularen Substanzen aus den Überstände wurden dann, wie in Bueschl C et al. (Metabolomics 10(2014):754-69) beschrieben, gemessen. Diese Methode beruht darauf, dass die markierte D-Glukose als einzige Kohlenstoffquelle zur Verfügung steht. Für diesen Versuch musste das Medium dementsprechend modifiziert werden. In einem Vorversuch wurden die drei Stämme in dem modifizierten Medium kultiviert und dann das Wachstum, der Verlauf der Gelbfärbung und die Expressionsraten der Gene kodierend für die PKS 73621 und 65172 gemessen. Wie in den bisherigen Versuchen wuchs der Xppl-Deletionsstamm schlechter (Fig. 8A) und sekretierte mehr von dem gelben Pigment (Fig. 8B) als der Wildtypstamm. Der Überexpressionsstamm zeigte das erwartete gegenteilige Verhalten (Fig. 8A und 8B). Auch die Expressionsrate des Gens kodierend für die PKS 73621 entspricht den bisherigen Versuchen und Erwartungen (Fig. 8D). Für das Gen kodierend für die PKS 65172 konnte unter diesen Bedingungen eine erhöhte Expression im Xppl-Deletionsstamm festgestellt werden (Fig. 8D). Für den eigentlichen Versuch wurden die niedermolekularen Substanzen in den Kulturüberständen nach 72 und 96 Stunden mittels Flüssigkeitschromatographie aufgetrennt und in einem Massenspektrometer gemessen wie in Bueschl C et al. (Metabolomics 10(2014):754-69) beschrieben. Dabei wurden im Xppl-Delet ionsstamm zu beiden Zeitpunkten erheblich mehr Einzelsubstanzen als in den beiden anderen Stämmen gefunden (nämlich 31 nach 72 h und 91 nach 120 h, Fig. 9). Im Überexpressionsstamm wurden dazu passend erheblich weniger Substanzen als in den beiden anderen Stämmen gefunden (nämlich 43 nach 72 h und 127 nach 120 h, Fig. 9).To investigate the influence of Xppl on the global secretion of nondermolecular substances, the Xppl deletion strain, the Xppl overexpression strain, and the wild type strain were cultured in parallel on U-12C and U-13C labeled D-glucose, respectively. All low molecular weight substances from the supernatants were then purified as described in Bueschl C et al. (Metabolomics 10 (2014): 754-69). This method is based on the fact that the labeled D-glucose is the only carbon source available. For this experiment, the medium had to be modified accordingly. In a preliminary experiment, the three strains were cultured in the modified medium and then the growth, the course of yellowing and the expression rates of the genes coding for the PKS 73621 and 65172 were measured. As in previous experiments, the Xppl deletion strain grew worse (Figure 8A) and secreted more of the yellow pigment (Figure 8B) than the wild-type strain. The overexpression strain showed the expected opposite behavior (Figures 8A and 8B). The expression rate of the gene coding for the PKS 73621 also corresponds to the previous experiments and expectations (FIG. 8D). For the gene coding for the PKS 65172, increased expression in the Xppl deletion strain could be detected under these conditions (FIG. 8D). For the actual experiment, the low molecular weight substances were separated in the culture supernatants after 72 and 96 hours by liquid chromatography and measured in a mass spectrometer as in Bueschl C et al. (Metabolomics 10 (2014): 754-69). Significantly more individual substances were found in the Xppl deletion strain at both time points than in the two other strains (namely 31 after 72 h and 91 after 120 h, FIG. 9). Substantially fewer substances were found in the overexpression strain than in the two other strains (namely 43 after 72 h and 127 after 120 h, FIG. 9).
Beispiel 6: In einer Reihe von Ascomyceten finden sich Or-thologe von XpplExample 6: A number of ascomycetes contain ortologists from Xppl
Um Orthologe von Xppl zu identifizieren wurden eine BLAST Analyse durchgeführt. Die dabei gefundenen Proteine wurden in ein Cladogramm eingetragen (Fig. 10). Orthologe finden sich u.a. auch in dem biokontrollaktiven Pilz Trichoderma atroviride, dem Pflanzen-pathogen Fusarium graminearum, und dem pharmazeutisch interessantem Ergotpilz Claviceps purpurea mit E-Werten von 0.0, 2e-70 und 8e-71 beziehungsweise Sequenzähnlichkeiten von 86%, 60% und 55%. Ein „Multiple Alignment" ergibt zwei hoch konservierte Bereiche: einen C-terminal um die DNA-Bindungsdomäne (A394 - C505) und einen zweiten im Mittelteil (K120 - G337), ohne Funktionsvorhersage.To identify orthologs from Xppl, a BLAST analysis was performed. The proteins found were entered in a cladogram (FIG. 10). Orthologues can be found, inter alia. also in the biocontrol active fungus Trichoderma atroviride, the plant pathogen Fusarium graminearum, and the pharmaceutically interesting ergot fungus Claviceps purpurea with E values of 0.0, 2e-70 and 8e-71 or sequence similarities of 86%, 60% and 55%. A "multiple alignment" results in two highly conserved regions: one C-terminal around the DNA binding domain (A394 - C505) and a second in the middle part (K120 - G337), without function prediction.
SEQUENCE LISTING <110> Technische Universität Wien <120> Verfahren <130> 47436 <160> 32 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 504SEQUENCE LISTING <110> Vienna University of Technology <120> Procedure <130> 47436 <160> 32 <170> Patent version 3.5 <210> 1 <211> 504
<212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 1<212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 1
Met Ala Gin Ala Leu Asp Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Gly Pro Leu 1. 5 10 15Met Ala Gin Ala Leu Asp Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Gly Pro Leu 1. 5 10 15
Val Ala Leu Pro Glu Arg Thr Leu Gly Pro Pro Ala Ser Ala lie Thr 20 25 30Val Ala Leu Pro Glu Arg Thr Leu Gly Pro Pro Ala Ser Ala lie Thr 20 25 30
Pro Pro Ser Thr Val Gin Arg Ser Ala Trp Thr Ser Ser Pro Arg Ala 35 40 45Pro Pro Ser Thr Val Gin Arg Ser Ala Trp Thr Ser Ser Pro Arg Ala 35 40 45
Pro Ala Met Asp Met Phe Asn Phe Thr Thr Ala Ala Ser Ala Ser Ala 50 55 60Pro Ala Met Asp Met Phe Asn Phe Thr Thr Ala Ala Ser Ala Ser Ala 50 55 60
Val Ala Ser Tyr Ala Pro Ala Gly Gly Ser Asn Ser Asn Ser Asn Ser 65 70 75 80Val Ala Ser Tyr Ala Pro Ala Gly Gly Ser Asn Ser Asn Ser Asn Ser 65 70 75 80
Asn Ser Gly Gly Asn Ser Gly Gly Leu Gly Asp Met Asn Phe Ser Gin 85 90 95Asn Ser Gly Gly Asn Ser Gly Gly Leu Gly Asp Met Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Met Pro Gin Tyr Ser Gly Arg Asn Pro Leu Gin Ser Met Leu Ser Gin 100 105 110Met Pro Gin Tyr Ser Gly Arg Asn Pro Leu Gin Ser Met Leu Ser Gin 100 105 110
Thr Lys Glu Gly Pro Asp Ala Lys Arg Ile Lys Val Glu Ser Pro His 115 120 125Thr Lys Glu Gly Pro Asp Ala Lys Arg Ile Lys Val Glu Ser Pro His 115 120 125
Ser Ala Leu Asp Ser He Asp Ser Trp Leu Gin Phe Asp Glu Asp Ala 130 135 140Ser Ala Leu Asp Ser He Asp Ser Trp Leu Gin Phe Asp Glu Asp Ala 130 135 140
Asp Lys Phe Gly Ser Phe Glu lie Asp Phe Ser Lys Gin Tyr Asn Thr 145 150 155 160Asp Lys Phe Gly Ser Phe Glu l Asp Phe Ser Lys Gin Tyr Asn Thr 145 150 155 160
Ala Asn Gin Pro Arg Ala Ser Thr Asn Met Thr Pro Gly Leu Gly Ser 165 170 175Ala Asn Gin Pro Arg Ala Ser Thr Asn Met Thr Pro Gly Leu Gly Ser 165 170 175
Gly Leu Tyr Ala Asn Pro Thr Ala Pro Phe Arg Glu Glu Asp Phe Leu 180 185 190Gly Leu Tyr Ala Asn Pro Thr Ala Pro Phe Arg Glu Glu Asp Phe Leu 180 185 190
Asp Asp Ser Ala Phe Asp His Ser Leu Ser Glu Asp Asp Glu Met Phe 195 200 205Asp Asp Ser Ala Phe Asp His Ser Leu Ser Glu Asp Asp Glu Met Phe 195 200 205
Asp Asn lie Asn lie Asn Asp Gin Leu Ser Lys Leu Gly Thr Leu Pro 210 215 220Asp Asn lie Asn lie Asn Asp Gin Leu Ser Lys Leu Gly Thr Leu Pro 210 215 220
Ser Thr Glu Ala Gin Ser Ser Arg Ser Leu Phe Ser Thr Pro Ser Met 225 230 235 240Ser Thr Glu Ala Gin Ser Ser Arg Ser Leu Phe Ser Thr Pro Ser Met 225 230 235 240
Gly Trp Glu Lys Pro Gin Gin Gly Val Gin Pro Ser Ala Val Met Gly 245 250 255Gly Trp Glu Lys Pro Gin Gly Val Gin Pro Ser Ala Val Met Gly 245 250 255
Asp Glu Ile Pro Arg Arg Met Thr Ser Asp Ser Trp Asp Pro lie Pro 260 265 270Asp Glu Ile Pro Arg Arg Met Thr Ser Asp Ser Trp Asp Pro Pro Pro 260 265 270
Gin Gly Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Asp Glu Arg Arg Arg Leu Leu 275 280 285Gin Gly Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Asp Glu Arg Arg Arg Leu Leu 275 280 285
Glu Ile Ala Met Gly Pro Gly Arg Leu Ala Ser Tyr Val Asn Pro Ser 290 295 300Glu Ile Ala Met Gly Pro Gly Arg Leu Ala Ser Tyr Val Asn Pro Ser 290 295 300
Arg Phe Asn Met Gly Phe Gly Ser Thr Met Gin Pro Ser Ile Ser Gin 305 310 315 320Arg Phe Asn Met Gly Phe Gly Ser Thr Met Gin Pro Ser Ile Ser Gin 305 310 315 320
Glu Phe Gly Gly Phe Gly Ala Pro Lys Gin Gly Leu Ser His Met Gly 325 330 335Glu Phe Gly Gly Phe Gly Ala Pro Lys Gin Gly Leu Ser His Met Gly 325 330 335
Met Tyr Gin Arg Asn Asn Ser Ala Asp Thr Ser Ala Ser Pro Leu Ser 340 345 350Met Tyr Gin Arg Asn Asn Ser Ala Asp Thr Ser Ala Ser Pro Leu Ser 340 345 350
Gin Ser Arg Glu Leu Lys His Lys Gin Pro Lys Val Glu Thr Pro Pro 355 360 365Gin Ser Arg Glu Leu Lys His Lys Gin Pro Lys Val Glu Thr Pro Pro 355 360 365
Lys Thr Val Pro Thr Lys Arg Pro Ser Thr Leu Ser Glu Thr Ser Ser 370 375 380Lys Thr Val Pro Thr Lys Arg Pro Ser Thr Leu Ser Glu Thr Ser Ser 370 375 380
Ile Gly Lys Glu Lys Val Lys Ser Ala Asp Arg Met Ala His Asn Asp 385 390 395 400Ile Gly Lys Glu Lys Val Lys Ser Ala Asp Arg Met Ala His Asp Asp 385 390 395 400
Val Glu Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Asp Lys Ile Thr Glu Leu 405 410 415Val Glu Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Asp Lys Ile Thr Glu Leu 405 410 415
Arg Asn Ala Val Pro Ala Leu Gin Gin Val Ala Glu Gly Glu Pro Asp 420 425 430Arg Asn Ala Val Pro Ala Leu Gin Gin Val Ala Glu Gly Glu Pro Asp 420 425 430
Ala Ala Gin Gly Ile Ala Lys Val Ser Lys Gly Thr Val Leu Thr Lys 435 440 445Ala Ala Gin Gly Ile Ala Lys Val Ser Lys Gly Thr Val Leu Thr Lys 435 440 445
Ala Thr Glu Tyr Ile His Gin Leu Glu Gin Arg Asn Lys Asp Ile Met 450 455 460Ala Thr Glu Tyr Ile His Gin Leu Glu Gin Arg Asn Lys Asp Ile Met 450 455 460
Thr Glu His Lys Gin Leu Met Arg Arg Leu Gin Ala Phe Glu Ala Leu 465 470 475 480Thr Glu His Lys Gin Leu Met Arg Arg Leu Gin Ala Phe Glu Ala Leu 465 470 475 480
Leu Asn Asn Ser Met Arg Val Asp Ile Met Pro Ser His Ser Met Thr 485 490 495Leu Asn Asn Ser Met Arg Val Asp Ile Met Pro Ser His Ser Met Thr 485 490 495
Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe Cys 500 <210> 2 <211> 3655Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe Cys 500 <210> 2 <211> 3655
<212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 2 cagatggtga agacgggcag aaaggggagc gaaagctgaa aaatacttaa gcagcagctg 60 ttccccgtac gttcgtggag atggcaagag cagccggccg cggggagtct ggagcaggag 120 ccgcagctgc gtagctgccg gttgctgctg cccatctgcc caggttcgtt tgcgccggat 180 ccgtccaaat atctcctgat aaatgcggcc acttttccct catgctcgtc cttttttatt 240 ccccgaagcg cagcaaacga gcagcaagag caaagagcag agcagaaagt cgcctcatct 300 cgggcgccgc cttgcctaac ggggtagcaa taagcccatc gacaccgacg gcgggcggcg 360 ggctggccaa tcagcggcgc gcggtgctgt tcctttggcc cttggagcct tggggaatca 420 tacgatgtct gagcagccaa ttcttgcatt cttcccacat gcatggcatc ccatggcgca 480 gggtcccccc cccttctccc ctctccgctc tcttctcctc tcttcttggc tgaggtgctc 540 tgctccctct gctcggccag ctaagacaac cagcgctgtg gcccggcaag acagccactc 600 ttgtcattcg ccaggggggt tggaggaggg cgccacggct ccgcggaaag tcaggccatt 660 ttcatcaaca gccgcagaca ctggcccaga gaactatcct tatcctggac gcgcgcacgt 720 cgaaaatttt catttttgct cgcccaggcg cgcctgcaat tcgccatgcg ggctgctcga 780 tacccacgca gacggcaaat gacaggccat tctggctcac agacgccgcc gtcccggctc 840 tcgccgaggt ggaaaagggt catctgggtt cgttgcgctg agctctagct aggccagaag 900 acacagccga gacatgccta ttcgacgtgc ctacggggcg gaggcagagg gcagaggaca 960 ggagggcagg aggacatccc aacaaaggct ccccatgccg gaaacgcaaa gagaagcatc 1020 ggagagctgc gaagcacccg ccgaaacagc cactacctta cccagcaaga gcagcagctc 1080 tcttgaatgg cctgactggc gacaccgcgg gtccctagcg ccggggcctt gcctggatgg 1140 caccggtccc tggagcggga tcctcgtcgc tggtgctcga cgggctgtgg tgctgctgtg 1200 cgtcttgcgc tgccggctgg gctgggctgg gctgggctgg atctgagctg cttgcagcgc 1260 cgttccctca ggcttcggaa tcgcagccgt cgcggcgttg cccgaacagc cacccggagc 1320 ttggcctgcc tctgcgaggt gctaatgctg aaactggtcg accctgtata ttacccgtga 1380 tgctctggca ccgcagctcc agacccagac ccgggtctag gttcccaata tcgatcctgt 1440 agcattgata tcgaacggta cttgctgggt actacctccc actcttgctg ctcggtaccc 1500 tgccctgtct cacctgtgca tgcacagaag caccatcact atccattgac ttccaatttt 1560 gcatctgcat ccgtcggcct atcttgccgg catctacttc tacttctact tctacgtctc 1620 cgcctgcact cgcattgacc tctttttgca tctacatctg cggcagagct gtgcgctatc 1680 taccttacct cgtcttgaac ccccctgatc cgagcatcgt atccctccat aaccacctcg 1740 gctcgctacc tcacctcctt cgtgataggt attcaatcgt ggtgtctctt gctcatctgc 1800 atctggaatt cttccctttc tcctcttgac atcttctacc tattatcgcg ctcttcctcc 1860 tccgtctgca accccccaga cgccgccgaa cccgatctgt ggctgccatt agcctttcgg 1920 cgcgcattcc tctacgccac ccggtttggg tcccccttca cccccagcac atattccgac 1980 aaccctgtgt ctgcagccgc atggcacaag ccctcgacat ttcctcgtcg tcaggacccg 2040 gacccctcgt cgccctgccc gagcgaactc tcggcccccc agcctcggcc atcacgcctc 2100 cctcgaccgt ccagcgctcg gcctggacgt cgtcgcctcg cgcgcccgcc atggacatgt 2160 tcaacttcac aaccgctgcc tcggcatccg cagtcgcctc gtatgccccc gccggcggca 2220 gcaatagcaa tagcaatagc aatagcggcg gcaacagcgg cggcctgggc gacatgaact 2280 tctctcagat gccgcagtac tctggccgca atcccctgca gtcgatgctc tcccagacca 2340 aggagggccc cgatgccaag cggataaagg tcgagtcgcc gcactcggcg ctggattcga 2400 tcgattcatg gcttcagttt gacgaggatg ccgacaagtt tggcagcttc gagattgact 2460 tttccaaaca gtacaacacg gccaaccagc caaggtgagc tgcgctcctg aaccgccaat 2520 ctggtgtttc ccgctctcta acacattgcg acattaagag cttccacaaa catgacgccg 2580 ggactgggca gcggtctcta cgccaatccc accgccccct tcagagaaga agactttctc 2640 gacgacagcg cctttgacca ctctctgtcc gaagacgacg agatgttcga caacatcaac 2700 atcaatgacc agctgtccaa gcttggcacg ctgccctcga ccgaagctca gtcatccagg 2760 agtctcttct ccacgccgtc gatgggctgg gagaagcctc agcaaggcgt ccagcccagc 2820 gccgtcatgg gcgacgagat cccgaggcgc atgactagcg attcctggga cccgattccg 2880 cagggcacca attacaccct cacgccggac gagcgccgcc gactgctcga aatcgccatg 2940 ggccccggca gattggcgtc ctacgtcaac cccagccggt tcaacatggg cttcggatct 3000 acgatgcagc ccagcataag ccaggagttt ggcttcggct tcggcgctcc gaaacagggg 3060 ctgagccata tgggcatgta ccagaggaac aactcggccg acacgagcgc atcccccctc 3120 tcgcagagtc gggaattgaa acacaagcag cccaaggtcg agacgccgcc gaagacggtg 3180 cccacaaagc ggcccagcac gctttcggag acgagcagca tcggcaaaga aaaggtcaag 3240 tccgccgacc gcatggcgca caacgacgtt gagcgcaagt atcgaaccaa tctcaaggac 3300 aagattaccg agctgcgaaa tgcggtgccg gcgctgcagc aggtggctga aggggagccg 3360 gacgctgcgc agggcattgc caaagtgagc aaggtgagtt ggaaaacagc atgccccatc 3420 ttgtcagtga ctcgtgaaga cggcatcact gactctgatc ctatagggca ccgtattgac 3480 aaaagcgact gaatacattc atcagctcga gcaacgcaac aaggatatca tgacggagca 3540 taagcagctt atgcgacgac tgcaagcctt cgaagcactt ctcaacaact cgatgagagt 3600 cgacatcatg cccagccata gcatgacgct cttcgacccg agaggattct gttga 3655 <210> 3 <211> 17<212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 2 cagatggtga agacgggcag aaaggggagc gaaagctgaa aaatacttaa gcagcagctg 60 ttccccgtac gttcgtggag atggcaagag cagccggccg cggggagtct ggagcaggag 120 ccgcagctgc gtagctgccg gttgctgctg cccatctgcc caggttcgtt tgcgccggat 180 ccgtccaaat atctcctgat aaatgcggcc acttttccct catgctcgtc cttttttatt 240 ccccgaagcg cagcaaacga gcagcaagag caaagagcag agcagaaagt cgcctcatct 300 cgggcgccgc cttgcctaac ggggtagcaa taagcccatc gacaccgacg gcgggcggcg 360 ggctggccaa tcagcggcgc gcggtgctgt tcctttggcc cttggagcct tggggaatca 420 tacgatgtct gagcagccaa ttcttgcatt cttcccacat gcatggcatc ccatggcgca 480 gggtcccccc cccttctccc ctctccgctc tcttctcctc tcttcttggc tgaggtgctc 540 tgctccctct gctcggccag ctaagacaac cagcgctgtg gcccggcaag acagccactc 600 ttgtcattcg ccaggggggt tggaggaggg cgccacggct ccgcggaaag tcaggccatt 660 ttcatcaaca gccgcagaca ctggcccaga gaactatcct tatcctggac gcgcgcacgt 720 cgaaaatttt catttttgct cgcccaggcg cgcctgcaat tcgccatgcg ggctgctcga 780 tacccacgca gacggcaaat gacaggccat tctggctcac agac GCCGCC gtcccggctc 840 tcgccgaggt ggaaaagggt catctgggtt cgttgcgctg agctctagct aggccagaag 900 acacagccga gacatgccta ttcgacgtgc ctacggggcg gaggcagagg gcagaggaca 960 ggagggcagg aggacatccc aacaaaggct ccccatgccg gaaacgcaaa gagaagcatc 1020 ggagagctgc gaagcacccg ccgaaacagc cactacctta cccagcaaga gcagcagctc 1080 tcttgaatgg cctgactggc gacaccgcgg gtccctagcg ccggggcctt gcctggatgg 1140 caccggtccc tggagcggga tcctcgtcgc tggtgctcga cgggctgtgg tgctgctgtg 1200 cgtcttgcgc tgccggctgg gctgggctgg gctgggctgg atctgagctg cttgcagcgc 1260 cgttccctca ggcttcggaa tcgcagccgt cgcggcgttg cccgaacagc cacccggagc 1320 ttggcctgcc tctgcgaggt gctaatgctg aaactggtcg accctgtata ttacccgtga 1380 tgctctggca ccgcagctcc agacccagac ccgggtctag gttcccaata tcgatcctgt 1440 agcattgata tcgaacggta cttgctgggt actacctccc actcttgctg ctcggtaccc 1500 tgccctgtct cacctgtgca tgcacagaag caccatcact atccattgac ttccaatttt 1560 gcatctgcat ccgtcggcct atcttgccgg catctacttc tacttctact tctacgtctc 1620 cgcctgcact cgcattgacc tctttttgca tctacatctg cggcagagct gt gcgctatc taccttacct 1680 cgtcttgaac ccccctgatc cgagcatcgt atccctccat aaccacctcg 1740 gctcgctacc tcacctcctt cgtgataggt attcaatcgt ggtgtctctt gctcatctgc 1800 atctggaatt cttccctttc tcctcttgac atcttctacc tattatcgcg ctcttcctcc 1860 tccgtctgca accccccaga cgccgccgaa cccgatctgt ggctgccatt agcctttcgg 1920 cgcgcattcc tctacgccac ccggtttggg tcccccttca cccccagcac atattccgac 1980 aaccctgtgt ctgcagccgc atggcacaag ccctcgacat ttcctcgtcg tcaggacccg 2040 gacccctcgt cgccctgccc gagcgaactc tcggcccccc agcctcggcc atcacgcctc 2100 cctcgaccgt ccagcgctcg gcctggacgt cgtcgcctcg cgcgcccgcc atggacatgt 2160 tcaacttcac aaccgctgcc tcggcatccg cagtcgcctc gtatgccccc gccggcggca 2220 gcaatagcaa tagcaatagc aatagcggcg gcaacagcgg cggcctgggc gacatgaact 2280 tctctcagat gccgcagtac tctggccgca atcccctgca gtcgatgctc tcccagacca 2340 aggagggccc cgatgccaag cggataaagg tcgagtcgcc gcactcggcg ctggattcga 2400 tcgattcatg gcttcagttt gacgaggatg ccgacaagtt tggcagcttc gagattgact 2460 tttccaaaca gtacaacacg gccaaccagc caaggtgagc tgcgctcctg aaccgcca at 2520 ctggtgtttc ccgctctcta acacattgcg acattaagag cttccacaaa catgacgccg 2580 ggactgggca gcggtctcta cgccaatccc accgccccct tcagagaaga agactttctc 2640 gacgacagcg cctttgacca ctctctgtcc gaagacgacg agatgttcga caacatcaac 2700 atcaatgacc agctgtccaa gcttggcacg ctgccctcga ccgaagctca gtcatccagg 2760 agtctcttct ccacgccgtc gatgggctgg gagaagcctc agcaaggcgt ccagcccagc 2820 gccgtcatgg gcgacgagat cccgaggcgc atgactagcg attcctggga cccgattccg 2880 cagggcacca attacaccct cacgccggac gagcgccgcc gactgctcga aatcgccatg 2940 ggccccggca gattggcgtc ctacgtcaac cccagccggt tcaacatggg cttcggatct 3000 acgatgcagc ccagcataag ccaggagttt ggcttcggct tcggcgctcc gaaacagggg 3060 ctgagccata tgggcatgta ccagaggaac aactcggccg acacgagcgc atcccccctc 3120 tcgcagagtc gggaattgaa acacaagcag cccaaggtcg agacgccgcc gaagacggtg 3180 cccacaaagc ggcccagcac gctttcggag acgagcagca tcggcaaaga aaaggtcaag 3240 tccgccgacc gcatggcgca caacgacgtt gagcgcaagt atcgaaccaa tctcaaggac 3300 aagattaccg agctgcgaaa tgcggtgccg gcgctgcagc aggtggctga aggggagccg 336 0 gacgctgcgc agggcattgc caaagtgagc aaggtgagtt ggaaaacagc atgccccatc 3420 ttgtcagtga ctcgtgaaga cggcatcact gactctgatc ctatagggca ccgtattgac 3480 aaaagcgact gaatacattc atcagctcga gcaacgcaac aaggatatca tgacggagca 3540 taagcagctt atgcgacgac tgcaagcctt cgaagcactt ctcaacaact cgatgagagt 3600 cgacatcatg cccagccata gcatgacgct cttcgacccg agaggattct gttga 3655 <210> 3 <211> 17
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (15) .. (15)
<223> Xaa is D or V <4 0 0> 3<223> Xaa is D or V <4 0 0> 3
Ala His Asn Asp Xaa Glu Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Xaa Lys 1. 5 10 15 lie <210> 4 <211> 15Ala His Asn Asp Xaa Glu Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Xaa Lys 1. 5 10 15 lie <210> 4 <211> 15
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2)<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6)<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (6) .. (6)
<223> Xaa is T or A <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (7) .. (7)<223> Xaa is T or A <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (7) .. (7)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any amino acid residue <4 0 0> 4<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (9) .. (9) <223> Xaa can be any amino acid residue <4 0 0> 4
Lys Xaa Ser Lys Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Ala Thr Glu Tyr lie 1. 5 10 15 <210> 5Lys Xaa Ser Lys Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Ala Thr Glu Tyr lie 1. 5 10 15 <210> 5
<211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2)<211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2)
<223> Xaa is R or K <4 0 0> 5<223> Xaa is R or K <4 0 0> 5
Arg Xaa Leu Gin Ala Phe 1. 5Arg Xaa Leu Gin Ala Phe 1. 5
<210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <4 0 0> 6<210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <4 0 0> 6
Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe Cys 1. 5 <210> 7 <211> 9Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe Cys 1. 5 <210> 7 <211> 9
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3)<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (3) .. (3)
<223> Xaa is F or Y <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4)<223> Xaa is F or Y <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (4) .. (4)
<223> Xaa is D or E <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7)<223> Xaa is D or E <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (7) .. (7)
<223> Xaa is F or Y <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is R or K <4 0 0> 7<223> Xaa is F or Y <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (9) .. (9) <223> Xaa is R or K <4 0 0> 7
Gly Ser Xaa Xaa lie Asp Xaa Ser Xaa 1. 5Gly Ser Xaa Xaa was given by Asp Xaa Ser Xaa 1. 5
<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)
<223> Xaa is S or T <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (7) .. (7)<223> Xaa is S or T <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (7) .. (7)
<223> Xaa is V, I or L <400> 8<223> Xaa is V, I or L <400> 8
Pro Gly Leu Gly Xaa Gly Xaa Tyr 1. 5 <210> 9Pro Gly Leu Gly Xaa Gly Xaa Tyr 1. 5 <210> 9
<211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (13) . . (13)<211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (13). , (13)
<223> Xaa is R or K <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18)<223> Xaa is R or K <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (18) .. (18)
<223> Xaa is I or L <4 0 0> 9<223> Xaa is I or L <4 0 0> 9
Arg Glu Gly Leu Tyr Ser Thr Pro Leu Ser Trp Glu Xaa Pro Gin Pro 1. 5 10 15Arg Glu Gly Leu Tyr Ser Thr Pro Leu Ser Trp Glu Xaa Pro Gin Pro 1. 5 10 15
Gly Xaa Arg Met Asp 20 <210> 10 <211> 17Gly Xaa Arg Met Asp 20 <210> 10 <211> 17
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> misc_feature <222> (11)7.(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <4 0 0> 10<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> misc_feature <222> (11) 7. (11) <223> Xaa can any naturally occurring amino acid <4 0 0> 10
Gly Arg Ala Pro Gin Leu Ser Gin Gin Gin Xaa Gin Gin Gin Gin Gin 1. 5 10 15Gly Arg Ala Pro Gin Leu Ser Gin Gin Xaa Gin Gin Gin Gin Gin 1. 5 10 15
Gin <210> 11 <211> 19Gin <210> 11 <211> 19
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (8) .. (8)<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (8) .. (8)
<223> Xaa is R or K <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (17) . . (17)<223> Xaa is R or K <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (17). , (17)
<223> Xaa is S or T <4 0 0> 11<223> Xaa is S or T <4 0 0> 11
Pro Pro Pro Glu Val Pro Pro Xaa Glu Gly Leu Tyr Ser Thr Pro Leu 1. 5 10 15Pro Pro Glu Val Pro Pro Xaa Glu Gly Leu Tyr Ser Thr Pro Leu 1. 5 10 15
Xaa Trp Glu <210> 12Xaa Trp Glu <210> 12
<211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)<211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)
<223> Xaa is A or P <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (17) . . (17)<223> Xaa is A or P <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (17). , (17)
<223> Xaa is L or M <4 0 0> 12<223> Xaa is L or M <4 0 0> 12
Pro Ser Thr Glu Xaa Gin Ser Ser Arg Ser Leu Tyr Ser Thr Pro Ser 1. 5 10 15Pro Ser Thr Glu Xaa Gin Ser Ser Arg Ser Leu Tyr Ser Thr Pro Ser 1. 5 10 15
Xaa Gly Trp Glu 20 <210> 13 <211> 23Xaa Gly Trp Glu 20 <210> 13 <211> 23
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <4 0 0> 13<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <4 0 0> 13
Thr Lys Ala Lys Pro Gly Glu Lys Met Ala Gin Leu Glu Ser Ile Ser 1. 5 10 15Thr Lys Ala Lys Pro Gly Glu Lys Met Ala Gin Leu Glu Ser Ile Ser 1. 5 10 15
Thr Ser Gin Gin Pro Leu Asp 20 <210> 14 <211> 15Thr Ser Gin Gin Pro Leu Asp 20 <210> 14 <211> 15
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> misc_feature <222> (9).7(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <4 0 0> 14<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> misc_feature <222> (9) .7 (9) <223> Xaa may be any naturally occurring amino acid <4 0 0> 14
Ala Leu Glu Asn Ser Ala Gin Gly Xaa Asp Lys Phe Gin Pro Gly 1. 5 10 15 <210> 15 <211> 49Ala Leu Glu Asn Ser Ala Gin Gly Xaa Asp Lys Phe Gin Pro Gly 1. 5 10 15 <210> 15 <211> 49
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (15) .. (15)
<223> Xaa is D or V <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is a peptide having 20 to 40 amino acid residues <22 0><223> Xaa is D or V <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (18) .. (18) <223> Xaa is a peptide having 20 to 40 amino acid residues <22 0>
<221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20)<221> MISC_FEATURE <222> (20) .. (20)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (24) ..(24)<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (24) .. (24)
<223> Xaa is T or A <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (25) . . (25)<223> Xaa is T or A <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (25). , (25)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> misc_feature <222> (27)7.(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is a peptide having 15 o 20 amino acid residues <22 0> <221> misc_feature <222> (36) .. (36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is a peptide having 15 to 25 amino acid residues <4 0 0> 15<223> Xaa is V or I <22 0> <221> misc_feature <222> (27) 7. (27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> ( 34) .. (34) <223> Xaa is a peptide having 15 o 20 amino acid residues <22 0> <221> misc_feature <222> (36) .. (36) <223> Xaa can any naturally occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (41) .. (41) <223> Xaa is a peptide having 15 to 25 amino acid residues <4 0 0> 15
Ala His Asn Asp Xaa Glu Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Xaa Lys 1. 5 10 15Ala His Asn Asp Xaa Glu Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Xaa Lys 1. 5 10 15
Ile Xaa Lys Xaa Ser Lys Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Ala Thr Glu Tyr 20 25 30Ile Xaa Lys Xaa Ser Lys Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Ala Thr Glu Tyr 20 25 30
Ile Xaa Arg Xaa Leu Gin Ala Phe Xaa Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe 35 40 45Ile Xaa Arg Xaa Leu Gin Ala Phe Xaa Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe 35 40 45
Cys <210> 16 <211> 59Cys <210> 16 <211> 59
<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptide <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (3) .. (3)<212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Artificial Peptides <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (3) .. (3)
<223> Xaa is F or Y <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (4) .. (4)<223> Xaa is F or Y <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (4) .. (4)
<223> Xaa is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7)<223> Xaa is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) .. (7)
<223> Xaa is F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9)<223> Xaa is F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) .. (9)
<223> Xaa is R or K <220><223> Xaa is R or K <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is a peptide having 200 to 300 amino acid residues <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)<221> MISC_FEATURE <222> (10) .. (10) <223> Xaa is a peptide having 200 to 300 amino acid residues <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (15) .. (15)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (25) . . (25)<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (25). , (25)
<223> Xaa is D or V <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (28) ..(28) <223> Xaa is a peptide having 20 to 40 amino acid residues <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (30) . . (30)<223> Xaa is D or V <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (28) .. (28) <223> Xaa is a peptide having 20 to 40 amino acid residues <22 0> <221> MISC_FEATURE < 222> (30). , (30)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (34) . . (34)<223> Xaa is V or I <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (34). , (34)
<223> Xaa is T or A <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (35) . . (35)<223> Xaa is T or A <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (35). , (35)
<223> Xaa is V or I <22 0> <221> misc feature <222> (37)7.(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is a peptide having 15 o 20 amino acid residues <22 0> <221> misc_feature <222> (46)7.(46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is a peptide having 15 to 25 amino acid residues <4 0 0> 16<223> Xaa is V or I <22 0> <221> misc feature <222> (37) 7. (37) <223> Xaa can any natural occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (44) (44) <223> Xaa is a peptide having 15 o 20 amino acid residues <22 0> <221> misc_feature <222> (46) 7. (46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (51) .. (51) <223> Xaa is a peptide having 15 to 25 amino acid residues <4 0 0> 16
Gly Ser Xaa Xaa lie Asp Xaa Ser Xaa Xaa Ala His Asn Asp Xaa Glu 1. 5 10 15Gly Ser Xaa Xaa, Asp Xaa Ser Xaa Xaa Ala His Asn Asp Xaa Glu 1. 5 10 15
Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Xaa Lys Ile Xaa Lys Xaa Ser Lys 20 25 30Arg Lys Tyr Arg Thr Asn Leu Lys Xaa Lys Ile Xaa Lys Xaa Ser Lys 20 25 30
Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Ala Thr Glu Tyr Ile Xaa Arg Xaa Leu Gin 35 40 45Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Ala Thr Glu Tyr Ile Xaa Arg Xaa Leu Gin 35 40 45
Ala Phe Xaa Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe Cys 50 55 <210> 17Ala Phe Xaa Leu Phe Asp Pro Arg Gly Phe Cys 50 55 <210> 17
<211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 17 tgagagcggt ggtatccacg 20 <210> 18 <211> 25<211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 17 tgagagcggt ggtatccacg 20 <210> 18 <211> 25
<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 18 ggtaccacca gacatgacaa tgttg 25 <210> 19 <211> 23<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 18 ggtaccacca gacatgacaa tgttg 25 <210> 19 <211> 23
<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 19 tggatcgtca actggttcta cga 23 <210> 20 <211> 23<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 19 tggatcgtca actggttcta cga 23 <210> 20 <211> 23
<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 20 gcatgtgtag caacgtggtc ttt 23<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 20 gcatgtgtag caacgtggtc ttt 23
<210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <400> 21 agctactcaa caacgtgacg c 21<210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <400> 21 agctactcaa caacgtgacg c 21
<210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 22 atcccactgc tgctcaggta c 21 <210> 23<210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 22 atcccactgc tgctcaggta c 21 <210> 23
<211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 23 ggcctttgtt cttcatgact cc 22 <210> 24 <211> 19<211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 23 ggcctttgtt cttcatgact cc 22 <210> 24 <211> 19
<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 24 gtgagccaag gcatcttcg 19 <210> 25<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 24 gtgagccaag gcatcttcg 19 <210> 25
<211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 25 cggtatgata tcagaggttg gc 22 <210> 26 <211> 17<211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 25 cggtatgata tcagaggttg gc 22 <210> 26 <211> 17
<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 26 ctgggccatg agcttgc 17 <210> 27 <211> 19<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 26 ctgggccatg agcttgc 17 <210> 27 <211> 19
<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 27 tagccaggcg aattatgcg 19<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 27 tagccaggcg aattatgcg 19
<210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 28 ggtcctgggt atcgcctatc 20 <210> 29<210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 28 ggtcctgggt atcgcctatc 20 <210> 29
<211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 29 agatttctga cgcggacctc 20 <210> 30<211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 29 agatttctga cgcggacctc 20 <210> 30
<211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 30 agggcaatag acttgacggg 20 <210> 31<211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 30 agggcaatag acttgacggg 20 <210> 31
<211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 31 taccaactct tcgcaaacgt g 21 <210> 32 <211> 23<211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 31 taccaactct tcgcaaacgt g 21 <210> 32 <211> 23
<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 32 ccaggagtga tccagaagaa gtc 23<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Primer <4 0 0> 32 ccaggagtga tccagaagaa gtc 23
Claims (15)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ATA51115/2015A AT517831B1 (en) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | Process for the production of secondary metabolites |
PCT/EP2016/082400 WO2017114752A1 (en) | 2015-12-30 | 2016-12-22 | Process for the production of secondary metabolites |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ATA51115/2015A AT517831B1 (en) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | Process for the production of secondary metabolites |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
AT517831B1 AT517831B1 (en) | 2017-05-15 |
AT517831A4 true AT517831A4 (en) | 2017-05-15 |
Family
ID=57794258
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ATA51115/2015A AT517831B1 (en) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | Process for the production of secondary metabolites |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
AT (1) | AT517831B1 (en) |
WO (1) | WO2017114752A1 (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113406253B (en) * | 2021-07-12 | 2023-04-18 | 青岛农业大学 | Liquid chromatography-mass spectrometry analysis method and application of phenylpropane metabolic pathway metabolites |
CN116986976B (en) * | 2023-09-26 | 2023-12-01 | 成都中医药大学 | Hazian diterpenoid compound, trichoderma hook fermentation liquor extract, pesticide, and preparation method and application thereof |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6949356B1 (en) * | 1999-10-20 | 2005-09-27 | Microbia, Inc. | Methods for improving secondary metabolite production in fungi |
WO2010115156A2 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Synthetic Genomics, Inc. | Endophytic fungus and uses therefor |
AT510299B1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-03-15 | Univ Wien Tech | METHOD AND AGENT FOR PRODUCING N-ACETYLNEURAMIC ACID (NEUNAC) |
EP2708553A1 (en) * | 2012-09-18 | 2014-03-19 | Technische Universität Wien | Modified fungal cell |
-
2015
- 2015-12-30 AT ATA51115/2015A patent/AT517831B1/en not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-12-22 WO PCT/EP2016/082400 patent/WO2017114752A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Derntl et al. Biotechnol Biofuls (2015) 8:112 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AT517831B1 (en) | 2017-05-15 |
WO2017114752A1 (en) | 2017-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wiemann et al. | Deciphering the cryptic genome: genome-wide analyses of the rice pathogen Fusarium fujikuroi reveal complex regulation of secondary metabolism and novel metabolites | |
Lu et al. | Systematic analysis of Zn2Cys6 transcription factors required for development and pathogenicity by high-throughput gene knockout in the rice blast fungus | |
CN114846146B (en) | Engineered guide RNAs for increasing efficiency of CRISPR/Cas12f1 systems and uses thereof | |
Yang et al. | Functional divergence among silkworm antimicrobial peptide paralogs by the activities of recombinant proteins and the induced expression profiles | |
Goebels et al. | Introns regulate gene expression in Cryptococcus neoformans in a Pab2p dependent pathway | |
Korn et al. | A genetic screen for pathogenicity genes in the hemibiotrophic fungus Colletotrichum higginsianum identifies the plasma membrane proton pump Pma2 required for host penetration | |
Liu et al. | Genetic basis for coordination of meiosis and sexual structure maturation in Cryptococcus neoformans | |
Roberti et al. | MTERF factors: a multifunction protein family | |
US20190390205A1 (en) | Incorporation of internal polya-encoded poly-lysine sequence tags and their variations for the tunable control of protein synthesis in bacterial and eukaryotic cells | |
JP4741558B2 (en) | Antifungal protein and use thereof | |
Domik et al. | A terpene synthase is involved in the synthesis of the volatile organic compound sodorifen of Serratia plymuthica 4Rx13 | |
Rey et al. | MtNF-YA1, a central transcriptional regulator of symbiotic nodule development, is also a determinant of Medicago truncatula susceptibility toward a root pathogen | |
Albuquerque et al. | small ORFs: a new class of essential genes for development | |
CN108546694B (en) | Asian locusta protein tyrosine phosphatase PTPN4 and coding gene and application thereof | |
AT517831B1 (en) | Process for the production of secondary metabolites | |
CN112094833B (en) | Bacteriostatic protein, and coding gene, application and strain thereof | |
KR20220004980A (en) | How to identify functional elements | |
Zhou et al. | Enhancing peptaibols production in the biocontrol fungus Trichoderma longibrachiatum SMF2 by elimination of a putative glucose sensor | |
CN110172465B (en) | Application of aspergillus flavus pathogenic gene wprA | |
AU2014336957B2 (en) | Method for modulating plant growth | |
EP2464728B1 (en) | A rational library | |
Argyros et al. | A phenylalanine to serine substitution within an O-protein mannosyltransferase led to strong resistance to PMT-inhibitors in Pichia pastoris | |
Barre-Villeneuve et al. | The unique dual targeting of AGO1 by two types of PRMT enzymes promotes phasiRNA loading in Arabidopsis thaliana | |
US20110152126A1 (en) | Process for Generating a Variant Library of DNA Sequences | |
Papanastasiou et al. | Cloning and phylogenetic analysis of the alpha subunit of the eighth complement component (C8) in rainbow trout |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM01 | Lapse because of not paying annual fees |
Effective date: 20201230 |