AT511174A1 - Steriles invitro messverfahren für adhärente säugetierzellen - Google Patents

Abstract

Ein Untersuchungssystem (1) für in einem kontinuierlichen Strom eines Mediums kultivierte Zellen, insbesondere adhärente Säugerzellen, weist einen Kreislauf (10) auf mit einer über den Kreislauf mit dem Medium gespeisten Flusszellenstation (12), in der Zellen der genannten Art kultivierbar und beobachtbar sind, einem Bioreaktor (11) mit einer Steuerunganlage zur Messung und/oder Kontrolle der Temperatur und anderer Prozessparameter des in dem Reaktor erzeugten und gespeicherten Mediums, eine peristaltische Pumpe (15), einem stromauf der Flusszellenstation (12) vorgesehenen Blasenfänger (13) zum Entfernen von Gasblasen aus dem im Kreislauf strömenden Medium; sowie vorteilhafter Weise mit einer Probennahmeeinrichtung (14) stromab der Flusszellenstation (12).

Description

PI 2027

Steriles invitro Messverfahren für adhärente Säugetierzellen

Die Erfindung betrifft ein Untersuchungssystem für in einem kontinuierlichen Strom eines Mediums kultivierte Zellen, insbesondere adhärente Säugerzellen, mit einer Flusszellenstation, in der Zellen der genannten Art kultivierbar und beobachtbar sind, und einem an die Flusszellenstation angeschlossenen Kreislauf zur Versorgung der Flusszellenstation mit dem Medium. Ein derartiges Untersuchungssystem dient insbesondere für sterile in-vitro-Messverfahren für adhärente Zellen. Die in der Flusszellenstation gezüchteten Zellen sind vorzugsweise Säugerzellen, jedoch ist die gegenständliche Erfindung im Allgemeinen für Eukaryontenzellen geeignet, wie z.B. Tierzellen, insbesondere Wirbelticrzellen oder Insektenzellen, in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung bzw. Untersuchung.

Bei der Planung und Durchführung eines Experiments mit adhärenten Zellkulturen (z.B. Säugerzellkulturen) sind als erstes Überlegungen anzustellen, welche Parameter zu messen sind und welche einen Einfluss auf die Ergebnisse haben werden. Je komplexer die Fragestellungen sind, desto mehr Parameter werden mit den gewünschten Daten wechselwirken. Bei der Messung eines einzelnen Parameters, wobei das komplexe Verhalten von Säugerzelllinien aufrecht erhalten bleibt, sind herkömmliche und insbesondere auf dem Markt erhältliche Lösung in der Regel nicht oder nur unter unzumutbar großem Aufwand verwendbar.

Hierbei werden die zu untersuchenden Zellen in einer Flusszellenstation kultiviert, die eine von dem Medium durchströmte Flusszelle enthält und die Beobachtung der Zellen während des Ablaufs des Experiments ohne Eingriff in die Flusszelle ermöglicht. Im Rahmen der Erfindung wird unter Flusszelle eine von einem Medium kontinuierlich durchströmbare Einrichtung verstanden, in der Zellen gehalten (z.B. auf einem in der Flusszelle vorhandenen Träger) und kultiviert werden können und die zumindest teilweise transparent ist, um eine Beobachtung (insbesondere mittels eines Lichtmikroskops) oder andere bildgebende Untersuchung der Zellen zu -2- P12Ü27 ermöglichen. Selbstverständlich muss die Flusszelle für den für das Experiment vorgesehenen Durchfluss des Mediums und über (zumindest) die vorgesehene Zeitdauer ausreichend stabil ausgelegt sein. Vorteilhafter Weise sollte eine Flusszelle außerdem kontaminationsfrei handhabbar und /oder bei Bedarf sterilisierbar sein.

Komplexe Systeme, die eine ausreichende Kontrolle von diversen Prozessparametern wie Temperatur, pH und Konzentration gelösten Sauerstoffs für längere Prozesszeiten und unter kontaminationsfreien Bedingungen bieten, müssen zur Vermeidung von Kontaminationen gegenüber der Umgebung ausreichend abgeschlossen sein. Speziell ist es bei diesen bekannten Systemen nicht möglich, kontinuierlich kleine Probenmengen zu entnehmen, ohne das Medium zu kontaminieren, und die Morphologie der Zellen, insbesondere mittels Mikroskopie, im laufenden Prozess zu untersuchen. Einfachere Systeme dagegen sind für längere Prozesszeiten nicht verwendbar und können Parameter wie Temperatur, pH und Sauerstoffkonzentration nicht oder nicht ausreichend kontrollieren.

Ein weiterer problematischer Aspekt ist die Entnahme von Proben während eines Experiments. Herkömmliche Probennahmesysteme sind in den Bioreaktor integriert und ermöglich keine oftmalige Probennahme unter Sterilbedingungen. Zusätzlich sind diese Systeme auf eher große Probenmengen, jedoch nicht für die Entnahme kleiner Proben, d.h. im Bereich von wenigen Millilitern (ml) oder darunter (insbesondere Zehntelmillilitern), ausgelegt. Dies führt jedoch zu einer Verarmung an den zu messenden Zellprodukten der gesamten Biomasse im Reaktor, sowie an Medium mit Substraten und Zusätzen (z.B. Antibiotika). Dies ist besonders bei Bioreaktoren der Labor-Größe problematisch, wegen des ungünstigen Mengenverhältnisses zwischen Probe und restlicher Reaktormenge. Die Probennahme kann daher zu einer beträchtlichen Abnahme der Menge des Mediums im Reaktor führen, wenn eine regelmäßige oder gar kontinuierliche Entnahme von Proben durchgeführt wird. Beispielsweise führt die Entnahme einer Probe von 10 ml alle zwei Stunden über 48 h hinweg zu einer entnommenen Gesamtmenge von 240 ml, was ein beträchtlicher Anteil der Menge eines Labor-Bioreaktors mit einem typischen Inhalt von 11 ist. P12027 ·· ·· ·« * ·««· ·« * · * · « « ·« « « * • · * · · · « · ·

Ein Bioreaktor mit einer Einrichtung zur Entnahme von Proben aus dem Bioreaktor ist in WO 2007/121887 A2 beschrieben. Die Probenentnahme erfolgt mithilfe eines Probennahmeventils zur sterilen Entnahme von Proben, mit einer Probenkammer, einem vorderen Dichtelement und einem hinteren Dichtelement, wobei das vordere Dichtelement direkten Kontakt mit dem Volumen des Bioreaktors hat. Da sich dieses Probennahmeventil direkt in der Reaktorwand befindet, ist der Einbau und Ausbau (insbesondere bei Wartung oder Reparatur) des Ventils sehr aufwendig und geht unweigerlich mit einer Außerbetriebnahme des gesamten Reaktors einher. Außerdem kommt es beim Öffnen des Ventils bei laufendem Betrieb zu einer Änderung des Strömungsverhaltens des Mediums im Reaktor, ebenso wie zu einer Erhöhung der Scheerkräfte im System und damit zur Zerstörung von Zellen.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, die genannten Nachteile zu überwinden und insbesondere ein Prozesssystem zu schaffen, in dem langfristige Experimente unter genau kontrollierbaren Prozessparametern und sterilen Bedingungen durchführbar sind, wobei währenddessen eine Probennahme und mikroskopische Untersuchung möglich ist, insbesondere zur Lebendzellmikroskopie. Ein solches System soll nach Möglichkeit überschaubare Größe haben, vorzugsweise auf einen Arbeitstisch in Form einer sogenannten Sterilbank ('clearibench') passen.

Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass in dem Kreislauf des eingangs genannten Untersuchungssystems zudem folgende Komponenten vorgesehen sind: - ein Bioreaktor, in dem das Medium erzeugbar und speicherbar ist; eine Pumpe, vorzugsweise peristaltischer Art (Schlauchquetschpumpe); und - einen Blasenfänger, der stromauf der Flusszellenstation vorgesehen ist, zum Entfernen von Gasblasen aus dem im Kreislauf strömenden Medium.

Die Erfinder haben den genannten Prozessaufbau entwickelt, aufgebaut und getestet, welcher die ih-u/'fra-Untersuchung von empfindlichen Zellkulturen, wie z.B. adhä-renten Säugerzellkulturen, gestattet und dennoch als kompakte Anlage realisierbar -4- tl ·· » · · Mit *· PI 2027 ist. Mithilfe dieser Lösung kann ein ausgewählter Parameter insbesondere physikalischer, chemischer oder pharmakologischer Parameter, und dessen Einfluss auf Zellwachstum und -morphologie, Proteinproduktion und anderen Faktoren untersucht werden. Dabei kann eine stabile Prozessumgebung unter kontaminationsfreien Bedingungen gesichert werden, während zugleich und beliebig oft Probenentnahme und (digitale) Mikroskopie möglich sind.

In einer zweckmäßigen Weiterbildung des erfindungsgemäßen Untersuchungssystems ist außerdem zumindest ein Filter zum Zurückhalten von Zellen, die aus der Flusszellenstation ausgeschwemmt und vom Kreislauf mitgeführt werden, vorgesehen. Ein derartiges Filter ist im Kreislauf stromab der Flusszellenstation anzuordnen, vorzugsweise stromab der Probennahmeeinrichtung, beispielsweise unmittelbar vor dem Rücklauf in den Bioreaktor. Um ein Auswechseln des Filters auch während eines laufenden Experiments zu ermöglichen, können mehrere Filter - zweckmäßiger Weise in einer parallelen Anordnung - vorgesehen sein. Insbesondere können zwei Filter sowie ein Dreiwegeventil vorgesehen sein, wobei der Kreislauf mithilfe des Dreiwegcventils zwischen den zwei Filtern umschaltbar ist.

Zur Sicherung stabiler Untersuchungsbedingungen ist es günstig, wenn der Bioreaktor mit einer Steuerungsanlage zur Messung und/oder Kontrolle der Temperatur und anderer Prozessparameter des in dem Reaktor befindlichen Mediums ausgestattet ist.

In einer einfachen und doch effizienten Ausbildung des Blasenfängers ist dieser unter Verwendung eines T-Stücks ausgebildet, dessen Abzweigstutzen nach oben gerichtet und mit einem Sperrventil zum Ableiten angesammelten Gases versehen ist.

Zur Entnahme von Proben aus dem Kreislauf des erfindungsgemäßen Prozesssystems während eines laufenden Experiments, d.h. während des Betriebs des Kreislaufs, ist es vorteilhaft, wenn stromab der Flusszellenstation eine Probennahmevorrichtung angeordnet ist. Für diese Vorrichtung eignet sich in besonderer Weise ♦ · • · * · P12027 • ·· « · · ♦« · · · • * · · · « m · m 0 9 0 0 »00 9 9 9 0 0 »009 00 ·· ·♦·· + ·* · 09 -5- ein Ventil, das während des Betriebs in den externen Kreislauf des Reak-tor/Kesselsystems eingesetzt ist. Das Ventil ist mit einem Ventilgehäuse mit zumindest drei Anschlüssen sowie mit einem in das Ventilgchäuse eingesetzten, konischen oder zylindrischen Absperrkörpcr realisiert; der Absperrkörper ist dabei mithilfe eines Griffstücks um eine Ventilachse drehbar und weist einen Kanal auf, welcher in einer ersten Stellung des Absperrkörpers einen ersten und einen zweiten der Anschlüsse verbindet und in einer zweiten Stellung des Absperrkörpers den ersten und einen dritten der Anschlüsse verbindet. Dabei werden der erste und zweite Anschluss als Zulauf bzw. Ablauf mit dem Kreislauf verbunden, während der dritte Anschluss mit einer Probeneinheit (d.h. eine Anschlusseinrichtung für ein Probengefäß, z.B. eine Spritze) verbunden wird.

Diese Weiterbildung ermöglicht nicht nur die Entnahme geringfügiger steriler Proben, z.B. in Mengen zu 1 ml, 0,5 ml oder 0,1 ml, während eines ablaufenden Experiments oder bei kontinuierlichen Prozessen, die über lange Zeiträume erfolgt, sondern verringert auch die Gefahr von Kontaminationen über den Entnahmeweg. Dadurch können Proben wiederholt und in großer Zahl über eine lange Zeit hinweg entnommen werden, ohne die Sterilität an der Entnahmestelle zu beeinträchtigen, was über herkömmliche Lösungen zur Probennahme hinausgeht. Zudem kann die Vorrichtung ohne Weiteres für sich oder in Verbindung mit dem externen Kreislauf autoklaviert werden und ist somit für verschiedenartige Experimente wiederverwendbar.

Die erfindungsgemäße Probennahmevorrichtung kann in sterile und nicht-sterile externe Kreisläufe zur Anwendung kommen. Zentraler Teil der Probennahmevorrichtung ist ein vorzugsweise glasgeschliffener Hahn mit einer Bohrung, die als Kanal dient. Mithilfe dieses Kanals wird je nach Stellung des Hahns der Zufluss mit einem der Abflüsse verbunden. Auf diese Weise kann zwischen zumindest zwei Abflüssen gewählt werden, wovon der eine zu dem Reaktorgefäß, der andere zu einer Probeneinheit führt, an der Proben gezogen werden können. P12027 P12027 « »

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In einer zusätzlichen Weiterbildung ermöglicht die Vorrichtung zudem eine Temperaturmessung, vorzugsweise digitale Temperaturmessung, des durch den Kreislauf strömenden Reaktormediums. Die Verwendung eines Temperatursensors gestattet die Messung der Temperatur des Mediums am Ort der Probennahme unter sterilen Bedingungen. Zu diesem Zweck kann eine Halterung für einen (digitalen oder analogen) Temperatursensor in die erfindungsgemäße Vorrichtung integriert werden. Hierzu ist es günstig, wenn zumindest einer der Anschlüsse eine Aufnahme für einen Temperatursensor aufweist, dessen Spitze in eingesetztem Zustand in den Leitungskanal des Anschlusses hineinragt. Hierbei kann die Aufnahme für den Temperatursensor vorzugsweise in dem als Zulauf ausgelegten Anschluss des Ventils angeordnet sein.

In einer besonders effektiven und einfach zu handhabenden Ausgestaltung des Ventils mit Absperrkörper kann der Kanal gewinkelt und die Anschlüsse um die Ventilachse herum jeweils um den Winkel des Kanals zueinander versetzt angeordnet sein. Der Winkel kann beispielsweise bei drei Anschlüssen 120° betragen, und bei mehr Anschlüssen 360°/n, wobei n für die Anzahl der Anschlüsse steht. Je nach Anwendung und Anzahl der Anschlüsse können die Winkel abgeändert werden. Γη einer vorteilhaften Realisierung der Erfindung sind die Leitungen des externen Kreislaufs mit flexiblen Schläuchen ausgeführt, was besonders im Falle experimenteller Anlagen den Zugang und die Handhabung erleichtert. In diesem Fall können die Anschlüsse der Probennahmevorrichtung als Anschlusstüllen für je ein Ende eines flexiblen Schlauchs ausgebildet sein. Als Schläuche können sämtliche Schlaucharten verwendet werden, die für die hier beschriebenen biotechnologischen Anwendungen geeignet, vorzugsweise sterilisierbar, und/oder mit integrierten bzw. externen Schlauchquetschpumpen bzw. Membranpumpen geeignet sind.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert, nämlich einem Reaktorsystem zur Untersuchung adhärenter Säugerzellen, welches in den beigefügten Zeichnungen dargestellt ist. Die Zeichnungen zeigen: Γ12(127 • «*·« ·» * * I # » « · I · C « » r * · « « « * f · »i -7-

Fig. 1 ein Schaltungsschema des Reaktorsystems mit Bioreaktor und externen Kreislauf einschließlich einer Flusszellenstation;

Fig. 2 eine Ansicht einer Probennahmevorrichtung mit angeschlossener Probeneinheit,

Fig. 3 eine Schnittansicht durch die Probennahmevorrichtung der Fig. 2,

Fig. 4 eine Flusszelle, die mithilfe einer Objekthalterung auf einem Mikroskoptisch montiertem Zustand ist, und

Fig. 5 ein Funktionsschema der Flusszelle und Objekthalterung der Fig. 4 in Schnittansicht.

Das im Folgenden beschriebene und in den Zeichnungen dargestellte Reaktorsystem hat lediglich beispielhaften Charakter und ist nicht einschränkend zu verstehen.

Fig. 1 zeigt ein Aufbauschema eines Reaktorsystems 1 gemäß dem Ausführungsbeispiel. Darin ist ein Bioreaktor 11 über einen externen Kreislauf 10 mit einer Zellkultur aus adhärenten Säugetierzellen verbunden, die in einer Flusszellenstation 12 angesiedelt sind und dort von einer als Nährmedium dienenden Flüssigkeit umspült werden. Der Kreislauf führt eine (hinsichtlich des Volumsverhältnisses) kleine Menge des Mediums aus dem Bioreaktor 11 durch die Flusszellenstation 12 und wieder zu dem Bioreaktor zurück. Im Einzelnen weist das System 1 folgende in dem Kreislauf angeordnete Komponenten auf: - den bereits erwähnten Bioreaktor 11, der die Messung und/oder Steuerung der Temperatur und anderer Prozessparametern wie pH-Wert, Sauerstofflevel und Nährstoffkonzentrationen in dem im Reaktor befindlichen Medium gestattet; - eine Flusszellenstation 12 zum Kultivieren und Beobachten adhärenter Zellen, in der adhärcnte Zellen der untersuchten Zellart kultiviert werden und der außerdem ein Beobachtungsgerät, z.B. ein Mikroskop, zugeordnet ist; - einen Blasenfänger 13, der stromauf der Flusszellenstation 12 angeordnet ist, zum Entfernen von Gasblasen aus dem Kreislauf; PI 2027

» «I # »fl • fl • fl «Μ 8 - eine Probennahmeeinrichtung 14 stromab der Flusszellenstation 12; - eine peristaltische Pumpe 15; - zumindest ein Filter vorzugsweise zwei Filter 16, 17, im Kreislauf stromab der Flusszellenstation 12 und der Probennahmeeinrichtung 14 angeordnet, zum Zurückhalten von Zellen aus dem in den Reaktor zurückströmenden Medium; und - gegebenenfalls ein Drciwegeventil 18, mit dem zwischen den erwähnten zwei Filtern 16,17 umgeschaltet werden kann.

Dabei kann das gesamte Reaktorsystem 1 als kompakte sterile bzw. kontaminationsfreie Apparatur aufgebaut sein, die auf einem üblichen sterilen Arbeitstisch ('Work-bench') der Stufe 2 untergebracht werden kann. Auf diese Weise ist es möglich, die Kontaminationsfreiheit des darin realisierten Prozesses sicherstellen, während die Tischapparatur während des gesamten Ablaufs eines Experiments bequem gehand-habt und überwacht werden kann.

Die Leitungen des Leitungssystems, das die beschriebenen Komponenten zu einem Kreislauf 10 wie in Fig. 1 gezeigt verbindet, sind vorteilhafter Weise sterilisierbare Schlauchleitungen und werden entsprechend gegebenenfalls auftretenden Erfordernissen des Mediums und dem durchzuführenden Prozess ausgewählt. In der dargestellten Ausführungsform werden beispielsweise sterilisierbare Versilic®-Silikon-Schläuche mit 5 mm Innendurchmesser verwendet. Für die Pumpe 15 können dagegen Pumpenschläuche des Typs Ismaprene Pharmed 3,2 mm verwendet werden, die nicht nur Zellkultur-geeignet, sondern auch druck-widerstandsfähig sind.

Der Bioreaktor 11 ist beispielsweise in Form eines Reaktors des Typs Bio-t mini 2L Bioreaktorsystem der Firma Zeta (Schweiz) realisiert. Dieser verfügt über einen 2 1-Rührkessel mit einer Mindestfüllmenge von 0,41, mit einem Rührwerk 19 als Mittel zum Durchmischen des Rcaktorinhalts. Er weist wie bereits erwähnt Mess- und Steuereinrichtungen 20 auf, um nach an sich bekannter Art die Messung und Steuerung der Temperatur und anderer Prozessparametern wie pH-Wert, Konzentration gelösten Sauerstoffs und Nährstoffkonzentrationen in dem im Reaktor befindlichen Medium zu gewährleisten. Der Reaktor weist außerdem mehrere Anschlussstellen P12027 • · • · I t « · • · · * · ’ » · · m >··· • · « · « · * » · »i -9-für den erwähnten Kreislauf zur Entnahme bzw. Zufuhr des im Kreislauf zirkulierenden Mediums. Vorzugsweise sind zumindest drei Anschlussstellen 21, 22, 23 vorgesehen, nämlich zwei Anschlussstellen 21, 22 für die Zufuhr (Rückfuhr) von Medium in den Reaktor und eine dritte Anschlussstelle 23 mit z.B. einem Ernterohr zur Entnahme von Medium aus dem Reaktor.

Die peristaltische Pumpe 15 sorgt für einen gleichmäßigen Flüssigkeitsstrom des Mediums im Kreislauf und bewegt hierzu das Medium durch den Kreislauf mit genau festgelegter Durchflussrate. Beispielsweise kann eine Schlauchquetschpumpe der Firma Ismatec SA (Schweiz) verwendet werden, beispielsweise vom Typ MCP-Process IP 65, die sehr genau beim Dosieren der Flussrate und über Computer steuerbar ist.

Der Blasenfänger 13 dient dem Ableiten von Gasblasen, die mit dem Medium aus dem Reaktor mitgeführt werden, bevor diese mit den adhärenten Zellen in Kontakt kommen und diese beeinträchtigen oder aus der Flusszelle mitreißen können. Der Blasenfänger 13 ist z.B. in Form eines T-Stücks ausgeführt, durch das in Längsrichtung das Medium geführt wird, während der Querstutzen (d.h. der abzweigende und zur Längsrichtung quer verlaufende, dritte Anschlussschenkel) nach oben gerichtet ist und mit einem Ventil verbunden ist, das an der anderen Seite ins Freie oder in ein Gas-Sammelgefäß (z.B, Ballon oder anderes auswechselbares Gefäß; nicht gezeigt) führt. Gasblasen, die durch die Leitung mitgeführt werden, sammeln sich aufgrund ihres Auftriebs in diesem Querstutzen bzw. dem daran angeschlossenen Seitenstrang an. Das Ventil kann hündisch geöffnet werden, wenn eine gewisse Gasmenge angesammelt ist, um diese abzulassen, beispielsweise in die Umgebung (bei geeigneter Entlüftung) oder in ein Sammelgefäß.

Außerdem ist in dem Kreislauf zumindest ein Filter 16,17 vorgesehen. Vorzugsweise sind zwei (oder mehr) Filter vorgesehen, die parallel geschaltet sind. Diese Filter 16, 17 geringer Proteinbindung werden im Allgemeinen benötigt, um zu verhindern, dass Zellen, die aus der Zellkultur 12 gelöst werden, in den Bioreaktor 11 gelangen, da dies zu einer Beeinträchtigung des im Reaktor ablaufenden Prozesses führen kann. Dem entsprechend sind die Filter vorzugsweise unmittelbar stromauf der Rückführung 21, 22 in den Reaktor 11 angeordnet. In dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel werden z.B. Steril-Komplettfilter der Firma Pall Corp. (USA) Mini-Kleenpak, Supor EKV, 0.2 pm vorsterilisiert verwendet. Diese binden sehr wenig Protein, sind sterilisierbar und können bei Bedarf entlüftet werden; zudem halten sie großen Durchflussgeschwindigkeiten stand (bis etwa 200 cm3/min). Lediglich wenn ein Freiwerden von Zellen aus dem Kulturträger nicht zu erwarten ist, kann auf ein Filter verzichtet werden.

Wie bereits angedeutet sind vorzugsweise zwei Filter 16,17 vorgesehen, die parallel geschaltet sind und abwechselnd benutzt werden. Zur Auswahl eines der Filter ist ein Dreiwegeventil 18 vorgesehen, mit dem zwischen zwei Filtern der beschriebenen Art geschaltet werden kann. Dies ermöglicht es, auf das zweite Filter 17 zu wechseln, wenn das erste Filter 16 aufgrund akkumulierter Zellen blockiert sein sollte und auszuwechseln ist. Das Dreiwegeventil ist vorteilhafter Weise ein sterilisierbares standard-artiges 3-Wege-Ventil, z.B. ein 3-Wege-Ventil aus PTFE bis 6,8 mm der Firma Bürkle GmbH (Deutschland).

Bezug nehmend auf Fig. 2 und 3 ist zur Entnahme von Proben aus dem Kreislauf vorzugsweise ein Probeentnahmesystem 14 vorgesehen. Dies ist im Gegensatz zu herkömmlichen Lösungen, bei denen in einem Abschnitt des Kreislaufs ein Schlauchstück vorgesehen ist, durch das zur Entnahme einer Probe eine sterile Spitze eingestochen wurde; denn die dadurch entstehende Verletzungen der Schlauchmembran (die im Einzelfall zumeist vernachlässigbar wäre) kumulieren sich im Laufe eines Experiments derart, dass die notwendige Sterilität nicht mehr gewährleistet werden kann.

Zur Sicherstellung der dauerhaft sterilen Entnahme wird ein Probeentnahmesystem 14 wie in Fig. 2 und 3 gezeigt vorgeschlagen, das ein Ventil 40 mit (zumindest) drei Anschlüssen 41-43 umfasst. Zwei der Anschlüsse 41, 42 werden in den Kreislauf 10 eingebunden, während mit einem dritten Anschluss 43 eine Leitung verbunden ist, an die z.B. eine Probeneinheit 24 angeschlossen ist, welche als Anschlusseinrichtung für ein auswechselbar bzw. vorübergehend angeschlossenes Probengefäß (z.B. eine Spritze) dient.

Fig. 2 zeigt eine Ansicht des Probeentnahmesystems 14. Fig. 3 zeigt einen Schnitt durch das Ventil 40 einschließlich der Halterung 94 eines Temperatursensors 25, wobei die Schnittebene in der Ebene der Kanäle des Ventils 40, senkrecht zur Drehachse des Absperrkörpers 44 des Ventils verläuft.

Bezugnehmend auf Fig. 2 und 3 enthält das Ventil 40 einen als Absperrkörper 44 dienenden Schliffstopfen, der einen Kanal 45 aufweist und in das Gehäuse des Ventils eingesetzt ist. Das Gehäuse weist wie bereits erwähnt drei Anschlüsse 41-43 auf, die jeweils einen Kanal aufweisen, der zum Zentrum des Ventils fluchtet und in Anschlusstüllen enden.

Der Schliffstopfen ist am hinteren Ende mit einer Dichtung verschlossen, die eine Drehung des Hahns am vorderen Ende ermöglicht und damit den Wechsel zwischen den Abflüssen. Dadurch wird verhindert, dass Nährmedium bei der Drehung am hinteren Ende des Stopfens austreten kann.

Durch Drehen des Absperrkörpers wird der Kanal entsprechend gedreht, und auf diese Weise kann wahlweise der Zuflussanschluss 42 aus dem angeschlossenen Kreislauf entweder mit dem Abflussanschluss 41 in den Kreislauf oder mit dem Anschluss 43 zur Probennahme verbunden werden. In einer Variante kann das Ventil auch derart angeschlossen sein, dass der Abflussanschluss 41 entweder mit dem Zuflussanschluss 42 oder dem Anschluss 43 verbunden ist; letztere Lösung ist dann vorteilhaft, wenn - ausgehend von der in Fig. 1 gezeigten Kreislaufkonfigu-ration - es bei der Entnahme von Proben unerwünscht ist, dass das Medium unter der Pumpwirkung der Pumpe 15 unter gegebenenfalls großem und/oder pulsierendem Druck steht. Zur Kenntlichmachung der Einstellung kann auf dem Hahn eine -12- (z.B. mit Farbe verdeutlichte) Line, die dem Kanal im Schliffstopfen entspricht, aufgebracht sein.

Bezugnehmend auf Fig. 2 ist an der Tülle des Anschlusses 43 zur Probennahme ein kurzer Schlauch (um möglichst wenig Volumen zu verbrauchen) angebracht. Dieser verläuft in eine Probeneinheit 24 mit einem Sterilfilter 26, der eine Kontamination des ganzen Systems verhindert. An diesen Filter kann mittels eines Luer-Anschlusses 27 eine Einmal-Mikroliterspritze angesteckt werden, mit der eine Probe entnommen wird. Auf diese Weise wird eine sterile Probeneinheit zum Entnehmen von Proben realisiert, die ohne Verschleißteile wie etwa eine Membran od.dgl. auskommt. Dieser Filter ist für extrazelluläre Produkte bzw. die Analyse von Medienkomponenten angebracht; für die Messung intrazellulärer Produkte (dafür müssen dem System ganze Zellen entnommen werden) kann der Filter innerhalb einer sterilen Werkbank durch einen Anschlussadapter (z.B. für Luer) ersetzt werden, welcher zwischen den Probenahmen z.B. in ein sterilisierendes Agens getaucht wird.

Die hier gezeigte Probennahmeeinrichtung ist in erster Linie für Probengrößen von 0,1 bis 5 ml ausgelegt, kann jedoch ohne Weiteres für Probengrößen bis zu 50 ml angepasst werden.

Das Probennahmesystem 14 kann zusätzlich mit einer digitalen Temperaturmessung kombiniert werden. Die Länge des Kreislaufs 10, d.h. die Summe der Länge der Leitungen vom Reaktor zur Flusszellenstation und zurück, hängt naturgemäß vom verwendeten Aufbau ab; im hier gezeigten Aufbau beträgt sie beispielsweise ca. 2,5 m. Der Bioreaktor 11 kontrolliert auch die Temperierung des Nährmediums, da Zellkulturen allgemein empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen sind. Da in dem externen Kreislauf Temperaturschwankungen durch thermischen Kontakt mit der Umgebung auftreten können, ist es günstig, eine mögliche Abkühlung (oder seltener Erwärmung) mit einem zusätzlichen Temperatursensor 25 außerhalb des Rührkessels zu erfassen. • * • · • · · · • ft PI 2027 .......* : : • · · · · ··«· * · ft* ···· * ·« · · -13-

Zu diesem Zweck ist, wie insbesondere aus Fig. 3 ersichtlich, in einen der Anschlüsse, vorzugsweise in den für den Zulauf verwendeten Anschluss 42, eine Halterung 90 für einen Sensor integriert, ein welche der bereits erwähnte Temperatursensor 25 eingebaut werden kann, wobei die Spitze des Sensors in den Kanal des Anschlusses hineinführt und der Sensor somit mit dem dort durchströmenden Medium in direktem Kontakt ist. Die Halterung ist als seitliche, in eine von außen zugängliche Öffnung mündende Erweiterung des Kanals realisiert, die in einem kurzen zylindrischen Sockel 91 mit einem Außengewinde endet. In diese Öffnung des Sockels 91 wird die Messspitze des Sensors 25 eingesteckt und mithilfe eines Dichtrings 92 und aufgeschraubten Überwurfkappe 93 (mit Innengewinde) fixiert und zugleich abgedichtet.

Auf diese Weise ist zum einen sowohl die sterile Abnahme kleiner Probenmengen, als auch die oftmalige Wiederholbarkeit der Stichprobenentnahme ermöglicht, zum anderen besteht die Möglichkeit des Einbaus eines Temperatursensors mit einer direkten Messung der Temperatur des Mediums am Ort der Probennahme.

In einer Variante der Erfindung kann auf die Implementation einer Probennahmevorrichtung im Kreislauf gänzlich verzichtet werden, wenn eine Entnahme von Proben während eines Experiments nicht beabsichtigt ist - beispielsweise weil schon die Beobachtung mit dem Mikroskop während des Experiments ausreichend ist.

Die Flusszellenstation 12 kann beispielsweise wie in der DE 202009 017583 Ul beschrieben realisiert sein. In der Flusszellenstation 12 ist eine Flusszelle (oder gegebenenfalls ein anderer geeigneter Objektträger, der einen von dem Nährmedium durchströmten Kanal aufweist), zum Kultivieren und Beobachten adharenter Zellen eingerichtet. Die Flusszelle kann beispielsweise in Form einer kommerziellen Flusszelle der ibidi GmbH (1 μ-Slide I0·4 Luer ibiTreat, Ser.Nr. 000906) realisiert sein. Die Flusszelle weist ein Fenster auf, das es ermöglicht, die in der d^ef Flusszellenstation kultivierten Zellen an Ort und Stelle zu beobachten. -14- P12027 « · • · * · ♦ · · · « *

Fig. 4 zeigt eine Schrägansicht der Flusszellenstation 12 mit der Flusszelle 52, die in der Objekthalterung 51 gehalten ist; die Objekthalterung 51 wiederum ist auf einem Mikroskoptisch 28 eines Mikroskops 29 montiert. Fig. 5 zeigt ein entsprechendes Funktionsschema der Flusszellenstation 52 in schematischem Querschnitt. Wie ersichtlich, ist die Flusszelle 52 mittels Klammern 94 und Schrauben 95 in einer Vertiefung der Objekthalterung 51 befestigt. An den beiden Anschlussstutzen 53, 54 der Flusszelle sind Versorgungsleitungen 55, 56 angeschlossen, die somit Zu- und Ablauf des Mediums in einem kontinuierlichen Kreislauf bilden. In der Mitte der Anordnung gestattet ein Fenster die Durchsicht entlang eines Sichtkanals (in Fig. 5 von oben nach unten verlaufend) für die Zwecke der Beobachtung der Vorgänge an den Zellen 57 in der Flusszelle mit dem Mikroskop.

Die Flusszelle 52 ist in der Objekthalterung über eine Platte 50 mit eingraviertem Gitter platziert und zusammen mit dieser in der Objekthalterung gehalten. Die Objekthalterung sorgt für eine stabile Positionierung der Flusszelle (des Objektträgers) während des Experiments und insbesondere während der Beobachtung bzw. Aufnahme mit dem Mikroskop (oder Beobachtungsgerät). Das Gitter ermöglicht bzw. erleichtert das Zählen von Zellen und/oder die Bestimmung und Auszählen von freien und zellbedeckten Flächen. Für nähere Details hinsichtlich der Flusszellenstation 12 und Montage der Flusszelle 52 in der Objekthalterung 51 wird auf die DE 202009 017583 Ul verwiesen, deren Inhalt hiermit als Teil der gegenständlichen Offenbarung aufgenommen wird.

Das der Flusszellenstation zugeordnete Mikroskop 29 kann jegliches geeignete Mikroskop sein; vorzugsweise wird ein Mikroskop mit digitaler Bildaufnahme für die Aufnahme, Speicherung und Bearbeitung von Bildern der im Kanal der Flusszelle sichtbaren Zellen verwendet. Falls erforderlich kann das Mikroskop gegen ein anderes der spezifischen Anwendung angepasstes Mikroskop bzw. Beobachtungsgerät (z.B, ein bildgebendes Gerät) ausgetauscht werden.

P12027 · « • · • · -15- Währcnd einzelne Komponenten dieses Prozessaufbaus an sich bekannt sind, gestattet es erst die besondere Kombination dieser Teile, in einem Reaktorsystem einen einzelnen Prozessparameter zu vermessen während die übrigen Einflussgrößen auf einen benötigten oder gewünschten Wert (oder Wertebereich) fest gehalten werden können. So können z.B. Änderungen der Proteinsekretion oder die Morphologie einer adhärenten Zellkultur bei einer bestimmten niedrigen Temperatur studiert werden, während pH-Wert, Sauerstofflevel, Nährstoffzufuhr und Metaboliten-beseitigung während des Prozesses gleich gehalten werden.

Die Erfindung ermöglicht somit eine neue Zugangsweise der Untersuchung von Zellkulturen und eine Vielzahl von möglichen Anwendungen. Beispielsweise kann der erfindungsgemäße Prozessaufbau auch für die kontinuierliche Abbildung lebender Zellkulturen über lange Zeitintervalle und/oder wechselnden Temperaturen verwendet werden.

Die in der Flusszellenstation gezüchteten Zellen sind vorzugsweise Säugerzellen, jedoch ist der hier behandelte Aufbau im Allgemeinen für Eukaryontenzellen, wie z.B. Tierzellen, insbesondere Wirbeltierzellen oder Insektenzellen, in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung bzw. Untersuchung verwendbar.

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Claims (8)

1. Ansprüche 1. Untersuchungssystem (1) für in einem kontinuierlichen Strom eines Mediums kultivierte Zellen, insbesondere adhärente Säugerzellen, mit einer Flusszellenstation (12), in der Zellen der genannten Art kultivierbar und beobachtbar sind, und einem an die Flusszellenstation angeschlossenen Kreislauf (10) zur Versorgung der Flusszellenstation mit dem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Kreislauf (10) folgende weitere Komponenten vorgesehen sind: - ein Bioreaktor (11), in dem das Medium erzeugbar und speicherbar ist; - eine Pumpe (15); und - einen Blasenfänger (13), der stromauf der Flusszellenstation (12) vorgesehen ist, zum Entfernen von Gasblasen aus dem im Kreislauf strömenden Medium.
2. 2. Untersuchungssystem nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch zumindest ein Filter (16, 17) zum Zurückhalten von Zellen, wobei das zumindest eine Filter im Kreislauf (10) stromab der Flusszellenstation (12), vorzugsweise stromab der Probennahmeeinrichtung (14) vorgesehen ist.
3. 3. Untersuchungssystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Filter (16,17) sowie ein Dreiwegeventil (18) vorgesehen sind, wobei der Kreislauf mit dem Dreiwegeventil (18) zwischen den zwei Filtern (16,17) umschaltbar ist.
4. 4. Untersuchungssystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor (11) mit einer Steuerunganlage zur Messung und/oder Kontrolle der Temperatur und anderer Prozessparameter des in dem Reaktor befindlichen Mediums ausgestattet ist und die Pumpe als peristaltische Pumpe ausgebildet ist.
5. 5. Untersuchungssystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Blasenfänger (13) als ein T-Stück ausgebildet ist, dessen Abzweigstutzen nach oben gerichtet und mit einem Sperrventil versehen ist. Λ · PI 2027 • » # « · · • · * -17-6. Untersuchungssystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Probennahmevorrichtung (14) stromab der Flusszellenstation (12) zur Entnahme von Proben während des Betriebs des Kreislaufs.
6. 7. Untersuchungssystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Probennahmevorrichtung (14) ein in den Kreislauf (10) des Reaktor/Kesselsystems einsetzbare Ventil (40) umfasst, mit einem Ventilgehäuse und zumindest drei Anschlüssen (41, 42, 43), wobei ein erster und ein zweiter der Anschlüsse als Zulauf bzw. Ablauf mit dem Kreislauf verbunden sind, sowie mit einem in das Ventilgehäuse eingesetzten, konischen oder zylindrischen Absperrkörpcr (44), der mithilfe eines Griffstücks um eine Ventilachse drehbar ist und einen Kanal (45) aufweist, welcher in einer ersten Stellung des Absperrkörpers den ersten und den zweiten der Anschlüsse verbindet und in einer zweiten Stellung des Absperrkörpers den ersten und einen dritten der Anschlüsse verbindet, wobei der dritter Anschluss mit einer Probeneinheit (24) verbindbar ist.
7. 8. Untersuchungssystem nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der Probennahmevorrichtung zumindest einer der Anschlüsse (42) eine Aufnahme (90) für einen Temperatursensor (25) aufweist, dessen Spitze in eingesetztem Zustand in den Leitungskanal des Anschlusses hineinragt.
8. 9. Untersuchungssystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme (90) für den Temperatursensor in dem als Zulauf ausgelegten Anschluss (42) des Ventils (40) der Probennahmevorrichtung angeordnet ist. Wien, den 0 i Msrz 2M