O 9491 1 A 1156/2006
Salzverbindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Salzverbindung und ein Verfahren zu deren Herstellung.
[alpha]-Liponsäure (die auch Thioctsäure genannt wird) ist ein natürlich vorkommendes Produkt, das in zahlreichen Pflanzen und Tieren zu finden ist. [alpha]-Liponsäure ist als aktives pharmazeutisches Mittel zur Behandlung verschiedener Krankheiten, wie z.B. Lebererl[alpha]ankungen oder diabetischer und alkoholischer Polyneuropathie, bekannt.
Die DE 198 18 563 offenbart die Verwendung von [alpha]-Liponsäure oder deren Salzen zum Reduzieren des Appetits und/oder Verringern des Körpergewichts.
Aus der EP 0 318 891 AI ist z.B. bekannt, dass [alpha]-Liponsäure als solche in Wasser und anderen Lösungsmitteln, die zur Herstellung von Injektionsprodukten verwendet werden, nur schlecht löslich ist.
Monomersalze von [alpha]-Liponsäure und Ornithin sind bekannt. Die FR 4.630 M offenbart zum Beispiel das Thioacetat von Ornithin.
Die EP 0 702 953 AI und die EP 0 947 194 o-ffenbaren Verabreichungsformen zur peroralen Verwendung, die Salze der racemischen [alpha]-Liponsäure und/oder der R-Form von Liponsäure, einschliesslich Salze mit verschiedenen Aminosäuren, enthalten.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer neuen Salzverbindung, welche die hohe antioxidative Wirksamkeit der [alpha]-Liponsäure aufweist, dabei aber leicht in verschiedene Verabreichungsformen, wie z.B.
Lösungen und feste Verabreichungsformen, verarbeitbar ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:
a) das Umsetzen einer Aminosäure und von [alpha]-Liponsäure in einer wässrigen Lösung b) das Halten dieser Lösung bei einer erhöhten Temperatur für einen Zeitraum von 1 bis 5 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden c) das Ausfallen der gebildeten Verbindung aus der konzentrierten Lösung durch Mischen mit einer alkoholischen Lösung d) das Sammeln der ausgefällten Verbindung aus dieser Mischlösung.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass, wenn eine Aminosäure und [alpha]-Liponsäure in einer wässrigen Lösung umgesetzt werden und diese Lösung für einen bestimmten, obenstehend definierten Zeitraum bei einer erhöhten Temperatur gehalten wird, anstelle eines Monomersalzes der Aminosäure und der [alpha]-Liponsäure eine oligomere Salzverbindung entsteht.
Die in Schritt a) eingesetzte Aminosäure ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ornithin, Arginin und Lysin. Die Aminosäure liegt vorzugsweise in ihrer LForm vor. Am meisten bevorzugt wird L-Ornithin verwendet.
Die in Schritt a) eingesetzte Aminosäure liegt vorzugsweise in Form einer wässrigen Lösung mit einem pH- Wert von (1-0,4) bis (1+0,4), am meisten bevorzugt von (1-0,1 bis I), vor, wobei I der isoelektrische Punkt der jeweils verwendeten Aminosäure ist.
Das heisst, im Falle von Ornithin (isoelektrischer Punkt = 9,6) beträgt der bevorzugte pH- Wert der wässrigen Lösung 9,2 bis 10,0, insbesondere 9,5 bis 9,6. In diesem Bereich von pH- Werten, die nahe beim isoelektrischen Punkt der jeweiligen Aminosäure liegen, ist die Aminosäure in einer Form mit einer positiven Ladung vorhanden und kann folglich mit der [alpha]-Liponsäure, die eine negative Ladung aufweist, eine Salzverbindung bilden.
Die wässrige Lösung der in Schritt a) eingesetzten Aminosäure kann hergestellt werden, indem zu einer Lösung, die das Hydrochloridsalz der Aminosäure enthält, NaOH hinzugefügt wird, bis der gewünschte pH- Wert erhalten wird.
Die in Schritt a eingesetzte [alpha]-Liponsäure kann in ihrer R(+)-Form, S(-)-Form oder in racemischer Form vorliegen.
Schritt b) umfasst vorzugsweise den Schritt des Konzentrierens der wässrigen Lösung.
Das heisst, das Reaktionsgemisch kann gegen Ende des Schritts b) konzentriert werden, bis z.B. 50% des Wassers entfernt ist.
Es wurde festgestellt, dass die Oligomerisation der beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten [alpha]-Liponsäure zusätzlich zur Behandlung bei einer erhöhten Temperatur von der Summe der Konzentrationen der beiden Reaktionspartner im Reaktionsgemisch abhängt. Die Summe der jeweiligen Konzentrationen von Ornithin und [alpha]-Liponsäure in der wässrigen Lösung beträgt in Schritt a) bevorzugt 15% bis 45% (w/v), vorzugsweise 25% bis 35% (w/v).
Obwohl die Oligomerisation bei höheren Konzentrationen sogar noch ausgeprägter ist, ist es aufgrund der hohen Viskosität des resultierenden Reaktionsgemisches nicht empfehlenswert, eine Konzentration von 45% (w/v) zu überschreiten.
Das Molverhältnis von Aminosäure und [alpha]-Liponsäure beträgt in Schritt a) vorzugsweise etwa 1 : 1. Im Besonderen löst sich überschüssige [alpha]-Liponsäure nicht leicht in der Lösung.
Diese erhöhte Temperatur beträgt in Schritt b) 30[deg.]C oder mehr, vorzugsweise 40 bis 50[deg.]C.
In dieser Hinsicht scheinen niedrigere Temperaturen eine Oligomerisation zu fördern, Temperaturen unter 30[deg.]C sind jedoch wiederum aufgrund der Viskosität des Reaktionsgemisches nicht empfehlenswert.
Bei der in Schritt c) verwendeten alkoholischen Lösung handelt es sich vorzugsweise um eine ethanolische Lösung.
Der Wassergehalt der Mischung aus der wässrigen Lösung und der ethanolischen Lösung, die in Schritt c) zum Ausfällen der Verbindung der Formel I verwendet wird, kann vorzugsweise 12% oder weniger betragen. Wenn der Wassergehalt der Lösung höher ist, neigt das Fällungsprodukt dazu, klebrig zu sein, und ist schwer zu trocknen. Wenn der Wassergehalt andererseits zu gering ist, muss eine höhere Menge an konzentriertem Ethanol verwendet werden, was die Produktionskosten erhöht.
Ein endgültiger Ethanolgehalt von 88% erwies sich sowohl als wirtschaftlich als auch als vorteilhaft hinsichtlich der Ausbeute und der Reinheit des Endprodukts (mögliche Ausfällung anorganischer Salze, wie z.B. NaCl, im Falle einer hohen Ethanolkonzentration).
Es wird angenommen, dass die neue Salzverbindung, die durch das erfindungsgemässe Verfahren erhältlich ist, die Formel (I)
<EMI ID=3.1>
0<">R<+>
(c), aufweist, wobei R<+>einen Aminosäurerest bezeichnet, der an der Carboxylgruppe in Form eines Salzes anhaftet, und wobei n 2 bis 5 ist.
Der Aminosäurerest ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ornithin, Arginin und Lysin.
Weiters wird die L-Form der jeweiligen Aminosäure bevorzugt.
Der am meisten bevorzugte Aminosäurerest ist L-Ornithin.
Der Rest (la)
<EMI ID=4.1>
der erfindungsgemässen Verbindung kann das R(+)-Enantiomer oder das S(-)-Enantiomer sein. Alternativ kann der Rest la in racemischer Form vorhanden sein.
Die Verbindung der Formel I kann insbesondere als pharmazeutisches Produkt, in einem kosmetischen Produkt und/oder in einem Nahrungsmittelprodukt verwendet werden.
Im Besonderen scheint die Verbindung der Formel I im Vergleich zu [alpha]-Liponsäure äusserst hitzebeständig zu sein.
Die Verbindung der Formel I besitzt eine überraschend hohe antioxidative Wirkung.
Die Verbindung der Formel I scheint weiters konstant [alpha]-Liponsäure freizusetzen, d.h., sie kann als Produkt zur "kontrollierten Freisetzung", das eine [alpha]-Liponsäure-artige Wirkung aufweist, verwendet werden.
Im Gegensatz zu [alpha]-Liponsäure verursacht die Verbindung der Formel I keine Probleme, wenn sie peroral verarbreicht wird (Halsprobleme).
Die Verbindung der Formel I ist stark wasserlöslich und kann folglich auch bei einem alkoholfreien Getränk verwendet werden. Die Verbindung der Formel I besitzt günstige Gelbildungseigenschaften, und daher kann der Bedarf an einem Bindemittel zur Herstellung von Tabletten reduziert oder sogar beseitigt werden.
Demgegenüber kann [alpha]-Liponsäure aufgrund ihres niedrigen Schmelzpunktes nicht richtig komprimiert werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
Nachfolgend wird insbesondere die bevorzugte Verbindung der Formel I, wobei Ornithin der Aminosäurerest R<+>ist, detaillierter besprochen. Diese Verbindung wird auch mit dem Begriff "LAORN" bezeichnet.
In den Zeichnungen:
zeigt Fig. 1 den zeitlichen Ablauf der Freisetzung von LAORN nach Auflösung in Wasser, zeigen die Figuren 2 und 3 die FT-IR-Spektren von [alpha]-Liponsäure (Fig. 2) bzw.
LAORN
(Fig- 3), zeigt Fig. 4 das NMR-Spektrum (Flüssigkeit) von LAORN, zeigt Fig. 5 das Ergebnis einer Untersuchung der antioxidativen Kapazität von LAORN, zeigt Fig. 6 die Ergebnisse einer Untersuchung der antioxidativen Kapazität von LAORN bei verschiedenen Konzentrationen von LAORN, zeigt Fig. 7 die Ergebnisse einer Untersuchung der Autoxidationshemmung von Linolsäure durch LAORN, zeigt Fig. 8 weitere Ergebnisse einer Untersuchung der Autoxidationshemmung von
Linolsäure durch LAORN, zeigt Fig. 9 das Ergebnis einer Analyse des Reduktionsvermögens von LAORN, zeigt Fig. 10 weitere Ergebnisse einer Analyse des Reduktionsvermögens von LAORN, zeigt Fig. 11 den Einfluss der Reaktionszeit und der Temperatur auf die Salzbildung, zeigt Fig.
12 den Einfluss der Reaktionszeit und der Konzentration auf die Salzbildung.
Wie obenstehend erwähnt, wird angenommen, dass die Verbindung der Formel I eine Oligomerstruktur aufweist, bei der an jeder Carboxylgruppe des Hauptmoleküls 1 Aminosäurerest anhaftet.
Wenn der Oligomerisationsgrad n 2 beträgt, wird angenommen, dass die Struktur der erfindungsgemässen Verbindung folgendermassen aussieht:
<EMI ID=6.1>
0-R<+>
(H)
Wenn der Oligomerisationsgrad n 3 beträgt, wird angenommen, dass die Struktur der erfindungsgemässen Verbindung folgendermassen aussieht:
<EMI ID=6.2>
O<'>R
(HI)
Diese Kette kann um eine oder mehrere Einheiten (n=4 bzw. 5) verlängert werden.
Die endgültige Struktur hängt davon ab, wo (d.h., bei welcher Sulfidgruppe) eine weitere Oligomerisation stattfindet.
Im Falle von LAORN bezeichnet R<+>in den obenstehenden Strukturformeln einen Ornithinrest.
Die Verbindung der Formel I kann als Mischung von Verbindungen vorhanden sein, die jeweils einen unterschiedlichen Oligomerisationsgrad n aufweisen.
Salzcharakter von LAORN
LAORN hat in Wasser eine hohe Löslichkeit (>10% m/m), kann jedoch in organischen Lösungsmitteln nicht gelöst werden. Daher scheint LAORN einen Salzcharakter zu haben.
Nachweis eines 1 ^-Verhältnisses zwischen dem Liponsäureanteil und Ornithin:
Entsprechend der Theorie sollte 1 Molekül [Ornithin(+) Liponsäure(-)] 39% Ornithin enthalten. Ornithin trägt zwei Stickstoffatome. Die Berechnung des Stickstoffgehalts bei 1 g des obenstehend erwähnten Moleküls ergibt 83,4 mg/g.
Eine Bestimmung des Stickstoff gehalts gemäss Kjeldhal ergab 86,1 mg/g. Dies wird als überzeugender Beweis für ein 1:1Verhältnis angesehen.
Fehlen des Thiolanrings der Liponsäure
Der Thiolanring in der Liponsäure zeigt bei etwa 320 nm ein gutes Absorptionsband, das auch in Lösungen wohlbekannter Salze der Liponsäure (K+,Na+) vorhanden ist.
Der neuen dargebotenen Einheit fehlt bei etwa 320 nm jegliche Extinktion, wenn die Messung unmittelbar nach dem Auflösen in Wasser erfolgt, was daraufhinweist, dass der Thiolanring während der Erzeugung der neuen Einheit aufgebrochen wird.
Oligomerstruktur
Unter Berücksichtigung
des Fehlens einer intakten Liponsäure (und folglich des Vorhandenseins von Dihydroliponsäure)
dass nach einer sofortigen Auflösung in Wasser weder Liponsäure noch Dihydroliponsäure zu beobachten sind,
dass im Zeitablauf nur Liponsäure aus einer Lösung in Wasser freigesetzt wird,
dass eine frisch zubereitete, mit Diethylether extrahierte Lösung bei einer Dünnschichtchromatographie einen Punkt ergibt, der ein lineares Oligomer anzeigt,
ist die Struktur gemäss Formel I die einzige verlässliche Struktur für LAORN.
Direkter Nachweis der Struktur
Der direkte analytische Nachweis der Struktur von LAORN ist mittels HPLC, GC, MS, NMR und FT-IR nicht möglich. Es wird angenommen, dass der Grund im konzentrationsund temperaturabhängigen Verhalten von Liponsäure/Dihydroliponsäure in einer wässrigen Lösung bei verschiedenen pH- Werten liegt (Aufspaltung, Polymerisation, Disulfidaustausch, der "Mischsulfide" hervorbringt,...).
Um diese Veränderungen zu verhindern, muss die neue Einheit in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden. Dies ist jedoch nicht möglich. Eine andere Methode besteht darin, die neue Einheit im festen Zustand zu untersuchen (FT-IR, NMR). Die Ergebnisse zeigen die vorgeschlagene Stniktur, sind jedoch nicht bestätigend.
MS und GC erbringen keine schlüssigen Ergebnisse, da eine hohe Temperatur eingesetzt wird, welche die vorgeschlagene Struktur offensichtlich zerstört.
Weitere Eigenschaften von LAORN
Das Produkt ist ein kristallines rieselfähiges Pulver mit einem Schmelzpunkt von 165170[deg.]C.
Im Produkt sind keine Polymere vorhanden. Das Produkt ist stark wasserlöslich. Bei der Freisetzung von Liponsäure durch Auflösung werden keine anderen Verbindungen (abgesehen von Dihydroliponsäure aufgrund der pH-abhängigen Gleichgewichtskonstanten in Wasser) gebildet.
Freisetzung von [alpha]-Liponsäure
Wenn sie in Wasser gelöst ist, weist LAORN einen pH- Wert von 7,5 auf.
Die Freisetzung von Liponsäure aus LAORN nach Auflösung in Wasser ist in Fig. 1 im Zeitablauf dargestellt.
Löslichkeit von LAORN
Die Löslichkeit von LAORN in verschiedenen Lösungsmitteln wurde getestet und mit der Löslichkeit von [alpha]-Liponsäure verglichen. Die Resultate sind in der untenstehenden Tabelle 1 dargestellt:
Tabelle 1 :
Löslichkeit von LAORN
Lösungsmittel LAORN Liponsäure
Wasser löslich teilweise löslich
Acetylchlorid teilweise löslich löslich
Acetonitril unlöslich löslich
Dichlormethan unlöslich löslich
2-Propanol unlöslich löslich
Aceton unlöslich löslich
Diethylether unlöslich löslich
Hexan unlöslich unlöslich
Octan unlöslich unlöslich
Toluol unlöslich -
Petrolether unlöslich
<EMI ID=8.1>
Tetrahydrofuran unlöslich Lösungsmittel LAORN Liponsäure
Octanol unlöslich -
Benzol unlöslich -
Dioxan unlöslich
<EMI ID=9.1>
Das Löslichkeitsmuster weist stark auf ein fest gebundenes Salz hin. Nur solche Verbindungen sind ausschliesslich in Wasser löslich. Am interessantesten ist, dass LAORN im Gegensatz zu [alpha]-Liponsäure eine gute Wasserlöslichkeit (>10%) besitzt.
FT-IR-Spektroskopie:
Die Figuren 2 und 3 zeigen die FT-IR-Spektren von [alpha]-Liponsäure (Fig. 2) bzw.
LAORN
(Fig. 3) (feste KBr-Tablette).
Die Spektren zeigen, dass in LAORN keine [alpha]-Liponsäure an sich vorhanden ist.
NMR-Spektroskopie
Fig. 4 zeigt das NMR-Spektrum (Flüssigkeit) von LAORN.
Eine Bande, die sich auf das Aminosäure-CH-Proton im freien Zustand bezieht, ist deutlich sichtbar (Triplettsignal bei 3 ppm). Dies liefert den eindeutigen Beweis, dass die Aminosäure an den Liponsäurerest nicht chemisch gebunden ist (keine Amidbindung).
Andere Eigenschaften von LAORN
Beim Hinzufügen einer kleinen Säuremenge (ungeachtet der Art von Säure) zu einer konzentrierten Lösung von LAORN (>5% m/m) bildet sich sofort eine gummiartige Masse.
Beim Hinzufügen einer kleinen Säuremenge (ungeachtet der Art von Säure) zu einer stärker verdünnten Lösung von LAORN (<1% m/m) bildet sich sofort eine stabile Emulsion.
Da LAORN in Diethylether nicht löslich ist, wurde es in Wasser gelöst und mit Diethylether extrahiert. Unter diesen Bedingungen kann das Vorhandensein von Polymeren ausgeschlossen werden, da bei der Dünnschichtchromatographie kein Punkt zu sehen war. Bei einer UV/VIS-Spektroskopie wurde bei in Wasser frisch gelöstem LAORN das Fehlen jeglicher Absorption bei 320 nm beobachtet. Dies weist eindeutig auf das Fehlen von Liponsäure (Thiolanring) an sich hin. Das Produkt reagiert positiv mit o-Phthaldehyd sowie mit einer künstlichen Mischung von Liponsäure und Ornithin.
Dies weist auf die Möglichkeit der Freisetzung von zumindest einigen freien Thiolgruppen und auf das Vorhandensein von Funktionen freier Aminosäuren hin.
LAORN zeigt eine sofortige Reaktion mit FeSO (braunes Fe(OH)3) wird sichtbar).
Bei einer Filtration wurde eine klare Lösung erhalten, die bei Zugäbe einer Säure kein Polymer aufbaut. Dies weist auf die Tatsache hin, dass LAORN reduziert und der Polymerisationsprozess dadurch blockiert werden kann.
Wenn Mercaptoethanol zu LAORN hinzugefügt wird, werden Liponsäure und Dihydroliponsäure in einem Verhältnis von 1:5 vorgefunden, während die Behandlung von Liponsäure allein ein Verhältnis von 1:0,6 ergibt. Dies deutet auf die Existenz einer intermolekularen -S-S-Bindung hin.
Eine Behandlung von LAORN mit H2O2in neutraler Lösung ergibt Liponsäure ohne weitere Peaks.
Eine Behandlung von Liponsäure mit H2O2in neutraler Lösung ergibt einen signifikanten und deutlichen Peak, der früher als bei Liponsäure eluiert wird. Es wurde bestätigt, dass dieser Peak durch das Vorhandensein/Fehlen von Ornithin nicht beeinflusst wird und dass er bei einer Behandlung von Ormthin allein auch nicht zu sehen ist.
Die Oxidation von Liponsäure zum entsprechenden Thiosulfmat und Thiosulfonat ist in der Literatur beschrieben; folglich kann das Vorhandensein von Liponsäure in LAORN an sich wieder ausgeschlossen werden. Eine Behandlung mit NaBHU in alkalischer Lösung ergibt in der Theorie nahezu sofort 100% Dihydroliponsäure. Liponsäure reagiert in dieser Hinsicht ähnlich.
Antioxidative Kapazität von LAORN
LAORN wurde hinsichtlich seiner antioxidativen Gesamtkapazität untersucht, wobei eine bekannte Testanalyse zur Anwendung kam.
Die Testanalyse (Calbiochem, Kat.Nr. 615700) misst die Fähigkeit einer bestimmten Verbindung, die Bildung eines Radikals zu unterdrücken. Als Testprinzip wird die Oxidation von 2,2'-Atino-di-(3-ethylbenz-thiazolinsulfonat) (ABTS) mit Metmyoglobin, die das ABTS<+>-Radikal hervorbringt, gewählt. Das gebildete Radikal kann durch Analyse der Extinktion bei 600 nm überwacht werden. Falls kein Radikallanger eingebracht wird, entwickelt sich das Radikal rasch. Wenn andererseits eine Verbindung mit Radikalfähgereigenschaften vorhanden ist, wird die Entwicklung unterdrückt. Die Resultate werden gegenüber einem Standard kalibriert, der mit einer Antioxidationsmittelkonzentration von 1,78 mmol markiert ist.
Probenvorbereitung:
Reine [alpha]-Liponsäure und Ornithin sowie die neue Verbindung (LAORN) wurden in Wasser gelöst, das mit NaOH auf pH=7,5 eingestellt wurde.
Die folgenden Konzentrationen wurden getestet:
- 6,1 mg [alpha]-Liponsäure /10 mL
- 3,9 mg Ornithin /10 mL
6,1 mg [alpha]-Liponsäure plus 3,9 mg Ornithin / 10 mL 10 mg LAORN/ 10 mL.
Die Konzentrationen wurden basierend auf dem Molverhältnis von 1 :1 bei [alpha]-Liponsäure und Ornithin gewählt. Alle 4 Proben enthielten daher 3 mmol der entsprechenden Verbindungen. In einer Prüfanordnung wurden 2,5, 5 und 10 mg LAORN/10 mL (entsprechend 0,75, 1,5 und 3 mmol) hinsichtlich einer Bestimmung der dosisproportionalen Reaktion untersucht. Jede Probe wurde 3-mal getestet, und die gelieferten Resultate sind Durchschnittswerte.
Die Genauigkeit der 3 Bestimmungen war besser als 3%.
Resultate
Fig. 5 zeigt die antioxidative Gesamtkapazität in mmol/L für jene Proben, die 3 mmol entsprechende Verbindung/L enthalten.
Wie in Fig. 5 ersichtlich ist, wirkt die neue Verbindung synergistisch im Vergleich zu reiner Liponsäure, Ornithin und einer äquimolaren Mischung von Liponsäure und Ornithin.
Die neue Verbindung ist etwa 7-mal wirksamer als Liponsäure und etwa 4,5-mal wirksamer als eine Mischung von Liponsäure und Ornithin.
Fig. 6 zeigt die Resultate bei verschiedenen Konzentrationen von LAORN.
Ein deutlicher linearer dosisproportionaler Anstieg der antioxidativen Gesamtkapazität von LAORN konnte beobachtet werden. Hemmung der Autoxidation von Linolsäure
Die Analyse beruht auf der Hemmung der beschleunigten Autoxidation von Linolsäure, die bei 50[deg.]C festgestellt wird.
Die Resultate sind verglichen mit der negativen Kontrolle (keine Hemmung) als relative Induktion der Autoxidation ausgedrückt.
Als positive Kontrolle (vollständige Hemmung) wurden 10 mM Butylhydroxytoluol (BHT)/L eingebracht. Jede Probe wurde in 3 Replikaten vorbereitet.
Fig. 7 zeigt den Zeitverlauf der Induktion, der bei
- 5 mM Liponsäure ("LA")/L
- 5 mM Ornithin ("ORN")/L
- 5 mM Liponsäure/L + 5 mM Ormthin/L und
- 10 mM LAORN erhalten wird. Zusätzlich zeigt der Graph einen Schwellenwert bei 1,5, der die Induktionsperiode anzeigt (Werte darunter weisen auf einen Schutz hin; Werte darüber weisen auf keinen weiteren Schutz hin).
Es zeigte sich, dass die positive Kontrolle die Autoxidation von Linolsäure bei 50[deg.]C 72 Stunden lang hemmte. 5 mM LA/L erzeugten in der Testperiode ebenfalls einen vollständigen Schutz.
Erwartungsgemäss erbringt die negative Kontrolle nach einer 12stündigen Inkubation eine beträchtliche Autoxidation.
Nach einer 12-stündigen Inkubation deuten die bei 5 mM ORN/L erzielten Resultate stark daraufhin, dass Ornithin auf die Autoxidation von Linolsäure keine schützende Wirkung hatte.
Eine Mischung von 5 mM LA/L und 5 mM ORN/L erwies sich in Hinblick auf ihr schützendes Verhalten als Grenzfall, während festgestellt wurde, dass 10 mM LA-ORN/L einen vollständigen Schutz erbrachten.
Fig. 8 zeigt den Zeitverlauf der Induktion, der bei 50 mM LA/L, 50 mM ORN/L, 50 mM LA/L + 50 mM ORN/L und 100 mM LAORN/L erhalten wird.
Zusätzlich zeigt der Graph einen Schwellenwert bei 1,5, der die Induktionsperiode anzeigt (Werte darunter weisen auf einen Schutz hin; Werte darüber weisen auf keinen weiteren Schutz hin).
Es zeigte sich, dass die positive Kontrolle die Autoxidation von Linolsäure bei 50[deg.]C 72 Stunden lang hemmte. 50 mM LA/L erzeugten in der Testperiode ebenfalls einen vollständigen Schutz. Erwartungsgemäss erbringt die negative Kontrolle nach einer 12stündigen Inkubation eine beträchtliche Autoxidation.
Nach einer 24-stündigen Inkubation deuten die bei 50 mM ORN/L erzielten Resultate stark daraufhin, dass Ornithin auf die Autoxidation von Linolsäure keine schützende Wirkung hatte.
Es wurde festgestellt, dass eine Mischung von 50 mM LA/L und 50 mM ORN/L und 100 mM LA-ORN/L einen vollständigen Schutz erbrachten.
Verfahren
Kontrolle:
H2O (negativ)
Butylhydroxytoluol (positiv) 10, 50 und 100 mg/10 mL (H2O, pH=8,0)
Proben: a) LA 0,1, 0,61, 1, 5, 6,1 und 10 mg/mL (H2O, pH=8,0) b) ORN 0,1, 0,39, 1, 3,9, 5 und 10 mg/mL (H2O, pH=8,0) c) LA + ORN 0,1, 1, 5 und 10 mg/1 mL (H2O, pH=8,0), bei jeder Messung ein Verhältnis von 61/39. d) LA-ORN 0,1, 1, 5 und 10 mg/10 mL (H2O, pH=8,0)
Reagenzien: 25 mL 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH=7,0 350 mg Linolsäure/25 mL Ethanol (95%) Ethanol 75% 3,5% (m/v) Salzsäure 1,5 g Ammoniumthiocyanat/5 mL H2O 25,0 mg Eisen-[pi]-Chlorid/10 mL 3,5% HC1
Probeninkubation:
0,25 mL jeder Probe + 0,5 mL Puffer + 0,5 mL Linolsäurelösung werden in eine 2 mL-Plastikampulle mit festsitzenden Schraubkappen übertragen. Jede
Probe wird in 3 Replikaten vorbereitet.
Die Proben werden bei 50[deg.]C mit Lichtschutz inkubiert.
Die Autoxidation wurde zum Zeitpunkt Null und nach 12, 24 und 72 Stunden getestet.
Testanalyse: Vermischen von 25 [mu]L inkubierter Probe mit 1 ,20 mL Ethanol 75% und 25 [mu]L Ammoniumthiocyanat sowie 25 [mu]L Eisen-U-Chlorid Ablesen der Absorption bei 500 nm nach 3-minütigem Vermischen.
Resultate bei der Analyse des Reduktionsvermögens:
Die Analyse beruht auf der Reduktion von Eisen-IH zu Eisen-U.
Die Resultate werden als % Reduktion ausgedrückt, und zwar verglichen mit der Kontrolle, die das gesamte Eisen-HI bei einer Konzentration von 5 mg/mL reduzierte.
Fig. 9 zeigt das Ergebnis der Analyse des Reduktionsvermögens.
Weiters fasst auch die untenstehende Tabelle 2 die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 2: Reduktionsvermögen von LA, ORN, LA+ORN, LA-ORN und Kontrolle durch den getesteten Konzentrationsbereich
% Reduktion i m Vergleich zur Kontra! e
Konz. mg/mL LA LA+ORN ORN LA-ORN Kontrolle
0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
1 7,2 5,8 19,9 12,0 22,7
5 22,2 41,5 53,3 47,4 100,0
<EMI ID=14.1>
10 24,7 64,2 64,5 81,9 100,0
Erklärung: LA... Liponsäure, ORN... Ornithin, LA+ORN... äquimolare Mischung von LA und ORN, LAORN... erfindungsgemässe Verbindung, Kontrolle... NaBH4.
In einem weiteren Test wurden LA und ORN bei einer Konzentration von 50 mM/L getrennt analysiert.
Weiters wurde eine Mischung von LA und ORN, die aus 50 mM LA/L und 50 mM ORN/L bestand, untersucht. Schliesslich wurden 100 mM LAORN/L getestet. Wie in Fig. 10 zu sehen ist, übte LAORN im Vergleich zu einer einfachen Mischung von LA und ORN eine starke synergistische Wirkung aus.
Herstellungsverfahren : Beispiel 1:
16,8 g (0,1 mol) L-Omithin-HCl-Salz werden in 160 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird gerührt, bis das L-Ornithin-HCl-Salz vollständig gelöst ist. Der pH- Wert der Lösung beträgt 4,6.
4 g (0, 1 mol) NaOH werden zu dieser Lösung hinzugefügt. Die Mischung wird gerührt, bis das NaOH vollständig gelöst ist. Der pH- Wert der Lösung beträgt 9,6.
20,6 Gramm [alpha]-Liponsäure (0,1 mol) werden langsam in die oben erwähnte Lösung hinzugefügt.
Die Mischung wird gerührt, bis die [alpha]-Liponsäure vollständig gelöst ist.
Die Mischung wird fünf Stunden lang bei 40[deg.]C gehalten. Am Ende dieser Zeitperiode wird die Lösung unter vermindertem Dmck (50[deg.]C, Vakuum bei 0,09 mpa) konzentriert, bis 50% des Wassers entfernt ist. Dabei würden alle möglichen organischen Lösungsmittel im Rohmaterial abgedampft werden. Das Volumen der restlichen Lösung beträgt etwa 100 ml, der pH-Wert ist 7,5.
Die konzentrierte Salzlösung wird zu 1250 ml Ethanol (95%) hinzugefügt. Die resultierende Lösung wird gerührt. Ein weisses Präzipitat bildete sich. Der Wassergehalt der Lösung wurde auf unter 11% reguliert. Die Lösung wurde filtriert, um das Präzipitat zu erhalten.
Die Ausgangslösung kann erneut verwendet werden, um Ethanol rückzugewinnen und ein weiteres Produkt zu erhalten.
Das Präzipitat wird bei etwa 35[deg.]C 6 Stunden lang getrocknet. 27 Gramm des erfindungsgemässen Produkts werden erhalten.
Erscheinungsbild: leicht gelbliches Pulver
Schmelzpunkt: 165¯170[deg.]C
PH- Wert: 7,56 (0,5 Gramm, gelöst in 20 ml Wasser)
Einfluss der Reaktionszeit, der Konzentration der Reagenzien und der Temperatur
Mehrere Tests wurden in Hinblick auf den Einfluss der Reaktionszeit, der Konzentration der Reagenzien und der Temperatur durchgeführt. R(+)-Liponsäure wurde als Ausgangsmaterial für diese Tests herangezogen. Der Oligomerisationsgrad des R(+)-Liponsäure- Ausgangs materials wurde hinsichtlich der spezifischen Drehung der Reaktionslösung gemessen.
Durch Oligomerisation der Liponsäure wird die S-S-Bindung der Liponsäure zerbrochen, was auf eine Veränderung der spezifischen Drehung hinausläuft. Je geringer die spezifische Drehung ist, desto stärker fällt die Bildung der erfindungsgemässen oligomerisierten Verbindung aus.
Fig. 11 zeigt den Einfluss der Reaktionszeit und der Temperatur auf die Salzbildung bei einer feststehenden Gesamtkonzentration an R(+)-Liponsäure und Ornithin von 35% im Reaktionsgemisch.
Es ist leicht zu erkennen, dass die Salzbildung bei niedrigeren Temperaturen stärker ist. Die Viskosität der Lösung begrenzt jedoch die Mindesttemperatur.
Daher sind Temperaturen von 30[deg.]C bis 50[deg.]C optimal.
Aus Fig. 11 ist weiters ersichtlich, dass es nach einer 3 -stündigen Reaktionszeit zu keiner signifikanten Veränderung der Salzbildung kommt.
Fig. 12 zeigt die Auswirkung der Summe der Konzenfrationen an R(+)-Liponsäure und Ornithin im Reaktionsgemisch auf die Salzbildung bei einer feststehenden Temperatur von 40[deg.]C. Je höher die Konzenfration ist, desto höher ist der Grad der Salzbildung. Die hohe Viskosität setzt der maximalen Konzenfration jedoch wieder eine Grenze. Daher beträgt die Konzenfration vorzugsweise 25% bis 35% (w/v).
O 9491 1 A 1156/2006
salt compound
The present invention relates to a novel salt compound and a process for its preparation.
[alpha] lipoic acid (also called thioctic acid) is a naturally occurring product found in many plants and animals. [alpha] -lipoic acid is useful as an active pharmaceutical agent for the treatment of various diseases, e.g. Lebererl [alpha] drugs or diabetic and alcoholic polyneuropathy, known.
DE 198 18 563 discloses the use of [alpha] -lipoic acid or its salts for reducing the appetite and / or reducing body weight.
From EP 0 318 891 A1 is known e.g. It is known that [alpha] -lipoic acid as such is poorly soluble in water and other solvents used to make injection products.
Monomer salts of [alpha] -lipoic acid and ornithine are known. For example, FR 4,630M discloses the thioacetate of ornithine.
EP 0 702 953 A1 and EP 0 947 194 discloses oral administration forms containing salts of the racemic [alpha] -lipoic acid and / or the R-form of lipoic acid, including salts with various amino acids.
It is an object of the present invention to provide a novel salt compound which has the high antioxidant activity of the [alpha] -lipoic acid while being easily incorporated in various forms of administration, such as e.g.
Solutions and solid dosage forms, is processable.
This object is achieved by a method comprising the following steps:
a) reacting an amino acid and [alpha] -lipoic acid in an aqueous solution b) keeping this solution at an elevated temperature for a period of 1 to 5 hours, preferably 3 hours c) precipitating the resulting compound from the concentrated solution by mixing with an alcoholic solution d) collecting the precipitated compound from this mixed solution.
Surprisingly, it has been found that when an amino acid and [alpha] -lipoic acid are reacted in an aqueous solution and this solution is maintained at an elevated temperature for a certain period as defined above, instead of a monomer salt of the amino acid and the [alpha] -lipoic acid an oligomeric salt compound is formed.
The amino acid used in step a) is preferably selected from the group consisting of ornithine, arginine and lysine. The amino acid is preferably in its L-form. Most preferably, L-ornithine is used.
The amino acid used in step a) is preferably in the form of an aqueous solution having a pH of from (1-0.4) to (1 + 0.4), most preferably from (1-0.1 to I), wherein I is the isoelectric point of the particular amino acid used.
That is, in the case of ornithine (isoelectric point = 9.6), the preferred pH of the aqueous solution is 9.2 to 10.0, especially 9.5 to 9.6. In this range of pH values close to the isoelectric point of the respective amino acid, the amino acid is present in a positive charge form and thus can form a salt compound with the [alpha] -lipoic acid having a negative charge.
The aqueous solution of the amino acid used in step a) can be prepared by adding NaOH to a solution containing the hydrochloride salt of the amino acid until the desired pH is obtained.
The α-lipoic acid used in step a can be in its R (+) form, S (-) form or in racemic form.
Step b) preferably comprises the step of concentrating the aqueous solution.
That is, the reaction mixture may be concentrated towards the end of step b) until e.g. 50% of the water is removed.
It has been found that the oligomerization of the [alpha] -lipoic acid used in the process according to the invention, in addition to the treatment at an elevated temperature, depends on the sum of the concentrations of the two reactants in the reaction mixture. The sum of the respective concentrations of ornithine and [alpha] -lipoic acid in the aqueous solution in step a) is preferably 15% to 45% (w / v), preferably 25% to 35% (w / v).
Although the oligomerization is even more pronounced at higher concentrations, it is not recommended to exceed a concentration of 45% (w / v) due to the high viscosity of the resulting reaction mixture.
The molar ratio of amino acid and [alpha] -lipoic acid in step a) is preferably about 1: 1. In particular, excess [alpha] -lipoic acid does not easily dissolve in the solution.
This elevated temperature in step b) is 30 ° C. or more, preferably 40 to 50 ° C.
In this regard, lower temperatures appear to promote oligomerization, but temperatures below 30 ° C. are again not recommended due to the viscosity of the reaction mixture.
The alcoholic solution used in step c) is preferably an ethanolic solution.
The water content of the mixture of the aqueous solution and the ethanolic solution used in step c) to precipitate the compound of formula I may preferably be 12% or less. When the water content of the solution is higher, the precipitate tends to be sticky and is difficult to dry. On the other hand, if the water content is too low, a higher amount of concentrated ethanol must be used, which increases the production cost.
A final ethanol content of 88% proved to be both economical and advantageous in terms of yield and purity of the final product (possible precipitation of inorganic salts such as NaCl in the case of high ethanol concentration).
It is believed that the novel salt compound obtainable by the process according to the invention has the formula (I)
<EMI ID = 3.1>
0 < "> R <+>
(c), wherein R + denotes an amino acid residue attached to the carboxyl group in the form of a salt, and wherein n is 2 to 5.
The amino acid residue is preferably selected from the group consisting of ornithine, arginine and lysine.
Furthermore, the L-form of the respective amino acid is preferred.
The most preferred amino acid residue is L-ornithine.
The rest (la)
<EMI ID = 4.1>
The compound of the invention may be the R (+) enantiomer or the S (-) enantiomer. Alternatively, the group la may be present in racemic form.
The compound of the formula I can be used in particular as a pharmaceutical product, in a cosmetic product and / or in a food product.
In particular, the compound of formula I appears to be extremely heat resistant compared to [alpha] -lipoic acid.
The compound of formula I has a surprisingly high antioxidant activity.
The compound of formula I also appears to release constant [alpha] -lipoic acid, that is, it can be used as a "controlled-release" product having an [alpha] -lipoic acid-like action.
In contrast to [alpha] -lipoic acid, the compound of formula I causes no problems when it is administered perorally (throat problems).
The compound of formula I is highly water-soluble and consequently can also be used in a non-alcoholic beverage. The compound of formula I has favorable gelation properties, and therefore the need for a binder for making tablets can be reduced or even eliminated.
In contrast, [alpha] -lipoic acid can not be properly compressed due to its low melting point.
Detailed description of the invention:
In the following, in particular, the preferred compound of the formula I wherein ornithine of the amino acid residue R + is discussed in more detail. This compound is also referred to by the term "LAORN".
In the drawings:
1 shows the time course of the release of LAORN after dissolution in water, FIGS. 2 and 3 show the FT-IR spectra of [alpha] -lipoic acid (FIG.
LAORN
Fig. 4 shows the NMR spectrum (liquid) of LAORN, Fig. 5 shows the result of a study of the antioxidant capacity of LAORN, Fig. 6 shows the results of an investigation of the antioxidant capacity of LAORN at various concentrations from LAORN, Fig. 7 shows the results of a study of the autoxidation inhibition of linoleic acid by LAORN, Fig. 8 shows further results of an investigation of the autoxidation inhibition of
FIG. 9 shows the result of an analysis of the reducing power of LAORN, FIG. 10 shows further results of an analysis of the reducing power of LAORN, FIG. 11 shows the influence of the reaction time and the temperature on salt formation, FIG.
12 the influence of the reaction time and the concentration on salt formation.
As mentioned above, it is considered that the compound of the formula I has an oligomer structure in which 1 amino acid residue is attached to each carboxyl group of the main molecule.
If the degree of oligomerization is n 2, it is assumed that the structure of the compound according to the invention is as follows:
<EMI ID = 6.1>
0-R <+>
(H)
If the degree of oligomerization is n 3, it is assumed that the structure of the compound according to the invention is as follows:
<EMI ID = 6.2>
O < '> R
(HI)
This chain can be extended by one or more units (n = 4 or 5).
The final structure depends on where (i.e., at which sulfide group) further oligomerization occurs.
In the case of LAORN, R + in the above structural formulas denotes an ornithine residue.
The compound of the formula I can be present as a mixture of compounds which each have a different degree of oligomerization n.
Salt character of LAORN
LAORN has a high solubility in water (> 10% m / m), but can not be dissolved in organic solvents. Therefore, LAORN seems to have a salt character.
Evidence of a 1-ratio between the lipoic acid portion and ornithine:
According to the theory, 1 molecule [ornithine (+) lipoic acid (-)] should contain 39% ornithine. Ornithine carries two nitrogen atoms. The calculation of the nitrogen content at 1 g of the above-mentioned molecule gives 83.4 mg / g.
A determination of the nitrogen content according to Kjeldhal showed 86.1 mg / g. This is considered convincing proof of a 1: 1 ratio.
Absence of the thiolane ring of the lipoic acid
The thiolane ring in the lipoic acid shows a good absorption band at about 320 nm, which is also present in solutions of well-known salts of lipoic acid (K +, Na +).
The new entity presented lacks any extinction at about 320 nm when measured immediately after dissolution in water, indicating that the thiolane ring is broken during the generation of the new unit.
oligomer
Considering
the absence of an intact lipoic acid (and thus the presence of dihydrolipoic acid)
that after an immediate dissolution in water neither lipoic acid nor dihydrolipoic acid are observed,
that over time only lipoic acid is released from a solution in water,
that a freshly prepared solution extracted with diethyl ether on a thin-layer chromatography gives a point indicating a linear oligomer,
the structure according to formula I is the only reliable structure for LAORN.
Direct evidence of the structure
The direct analytical proof of the structure of LAORN is not possible by HPLC, GC, MS, NMR and FT-IR. The reason is believed to be the concentration- and temperature-dependent behavior of lipoic acid / dihydrolipoic acid in an aqueous solution at different pH values (splitting, polymerization, disulfide exchange, which produces "mixed sulfides", ...).
To prevent these changes, the new unit must be dissolved in an organic solvent. This is not possible. Another method is to examine the new unit in the solid state (FT-IR, NMR). The results show the suggested structure, but are not confirmed.
MS and GC give inconclusive results as a high temperature is used which apparently destroys the proposed structure.
Further features of LAORN
The product is a crystalline free-flowing powder with a melting point of 165170 ° C.
There are no polymers in the product. The product is highly water soluble. Upon dissolution of lipoic acid by dissolution, no other compounds (apart from dihydrolipoic acid due to the pH-dependent equilibrium constants in water) are formed.
Release of [alpha] -liponic acid
When dissolved in water, LAORN has a pH of 7.5.
The release of lipoic acid from LAORN after dissolution in water is shown in Fig. 1 over time.
Solubility of LAORN
The solubility of LAORN in various solvents was tested and compared to the solubility of [alpha] -lipoic acid. The results are shown in Table 1 below:
Table 1 :
Solubility of LAORN
Solvent LAORN lipoic acid
Water soluble partially soluble
Acetyl chloride partially soluble
Acetonitrile insoluble soluble
Dichloromethane insoluble soluble
2-Propanol insoluble soluble
Acetone insoluble
Diethyl ether insoluble soluble
Hexane insoluble insoluble
Octane insoluble insoluble
Toluene insoluble -
Petroleum ether insoluble
<EMI ID = 8.1>
Tetrahydrofuran insoluble solvent LAORN lipoic acid
Octanol insoluble -
Benzene insoluble -
Dioxane insoluble
<EMI ID = 9.1>
The solubility pattern strongly indicates a tightly bound salt. Only such compounds are soluble in water only. Most interestingly, unlike [alpha] -liponic acid, LAORN has good water solubility (> 10%).
FT-IR spectroscopy:
FIGS. 2 and 3 show the FT-IR spectra of [alpha] -lipoic acid (FIG.
LAORN
(Figure 3) (solid KBr tablet).
The spectra show that in LAORN no [alpha] -liponic acid is present per se.
NMR spectroscopy
Fig. 4 shows the NMR spectrum (liquid) of LAORN.
A band related to the amino acid CH proton in the free state is clearly visible (triplet signal at 3 ppm). This provides clear evidence that the amino acid is not chemically bound to the lipoic acid residue (no amide bond).
Other features of LAORN
Adding a small amount of acid (regardless of the type of acid) to a concentrated solution of LAORN (> 5% m / m) will immediately form a gummy mass.
Adding a small amount of acid (regardless of the type of acid) to a more dilute solution of LAORN (<1% m / m) instantly forms a stable emulsion.
Since LAORN is not soluble in diethyl ether, it was dissolved in water and extracted with diethyl ether. Under these conditions, the presence of polymers can be ruled out since there was no dot on thin layer chromatography. In UV / VIS spectroscopy, with LAORN freshly dissolved in water, the absence of any absorption at 320 nm was observed. This clearly indicates the absence of lipoic acid (thiolane ring) per se. The product reacts positively with o-phthaldehyde as well as with an artificial mixture of lipoic acid and ornithine.
This indicates the possibility of releasing at least some free thiol groups and the presence of free amino acid functions.
LAORN shows an immediate reaction with FeSO (brown Fe (OH) 3) becomes visible).
Filtration resulted in a clear solution that does not build up a polymer when an acid is added. This points to the fact that LAORN can be reduced and the polymerization process thereby blocked.
When mercaptoethanol is added to LAORN, lipoic acid and dihydrolipoic acid are found in a ratio of 1: 5, while the treatment of lipoic acid alone gives a ratio of 1: 0.6. This indicates the existence of an intermolecular -S-S bond.
Treatment of LAORN with H2O2 in neutral solution gives lipoic acid without further peaks.
Treatment of lipoic acid with H2O2 in neutral solution gives a significant and distinct peak eluted earlier than lipoic acid. It was confirmed that this peak is unaffected by the presence / absence of ornithine and that it is not seen in a treatment of ormithine alone.
The oxidation of lipoic acid to the corresponding thiosulfate and thiosulfonate is described in the literature; consequently, the presence of lipoic acid in LAORN per se can be ruled out again. Treatment with NaBHU in alkaline solution yields in theory almost immediately 100% dihydrolipoic acid. Lipoic acid reacts similarly in this regard.
Antioxidant capacity of LAORN
LAORN was tested for total antioxidant capacity using a known test analysis.
The assay analysis (Calbiochem, cat.no. 615700) measures the ability of a particular compound to suppress the formation of a radical. As a test principle, the oxidation of 2,2'-atino-di- (3-ethylbenz-thiazolinsulfonate) (ABTS) with metmyoglobin yielding the ABTS <+> radical is chosen. The generated radical can be monitored by analyzing the absorbance at 600 nm. If no radical catalyst is introduced, the radical will develop rapidly. On the other hand, if there is a compound having radical-capable properties, the development is suppressed. The results are calibrated against a standard labeled with an anti-oxidant concentration of 1.78 mmol.
Sample preparation:
Pure [alpha] -lipoic acid and ornithine and the new compound (LAORN) were dissolved in water, which was adjusted to pH = 7.5 with NaOH.
The following concentrations were tested:
- 6.1 mg [alpha] -liponic acid / 10 mL
- 3.9 mg ornithine / 10 mL
6.1 mg [alpha] -lipoic acid plus 3.9 mg ornithine / 10 mL 10 mg LAORN / 10 mL.
The concentrations were chosen based on the molar ratio of 1: 1 for [alpha] -liponic acid and ornithine. All 4 samples therefore contained 3 mmol of the corresponding compounds. In a test setup, 2.5, 5 and 10 mg LAORN / 10 mL (corresponding to 0.75, 1.5 and 3 mmol) were examined for a determination of the dose-proportional response. Each sample was tested 3 times and the results provided are average values.
The accuracy of the 3 determinations was better than 3%.
results
Fig. 5 shows the total antioxidant capacity in mmol / L for those samples containing 3 mmol corresponding compound / L.
As can be seen in Figure 5, the new compound acts synergistically in comparison to pure lipoic acid, ornithine and an equimolar mixture of lipoic acid and ornithine.
The new compound is about 7 times more potent than lipoic acid and about 4.5 times more potent than a mixture of lipoic acid and ornithine.
Fig. 6 shows the results at various concentrations of LAORN.
A significant linear dose-proportional increase in the total antioxidant capacity of LAORN was observed. Inhibition of autoxidation of linoleic acid
The analysis is based on the inhibition of the accelerated autoxidation of linoleic acid, which is detected at 50 ° C.
The results are expressed as relative induction of autoxidation compared to the negative control (no inhibition).
As a positive control (complete inhibition), 10 mM butylhydroxytoluene (BHT) / L was introduced. Each sample was prepared in 3 replicates.
Fig. 7 shows the time course of the induction, at
5 mM lipoic acid ("LA") / L
5 mM ornithine ("ORN") / L
- 5 mM lipoic acid / L + 5 mM ormthin / L and
- 10 mM LAORN is obtained. In addition, the graph shows a threshold at 1.5 indicating the induction period (values below indicate protection, values above this indicate no further protection).
It was found that the positive control inhibited autoxidation of linoleic acid at 50 ° C for 72 hours. 5 mM LA / L also produced complete protection during the test period.
As expected, after a 12 hour incubation, the negative control gives considerable auto-oxidation.
After a 12-hour incubation, the results obtained with 5 mM ORN / L strongly suggest that ornithine had no protective effect on the autoxidation of linoleic acid.
A mixture of 5 mM LA / L and 5 mM ORN / L proved to be a limiting case in terms of their protective behavior, while it was found that 10 mM LA-ORN / L provided complete protection.
Figure 8 shows the time course of induction obtained at 50 mM LA / L, 50 mM ORN / L, 50 mM LA / L + 50 mM ORN / L and 100 mM LAORN / L.
In addition, the graph shows a threshold at 1.5 indicating the induction period (values below indicate protection, values above this indicate no further protection).
It was found that the positive control inhibited autoxidation of linoleic acid at 50 ° C for 72 hours. 50 mM LA / L also produced complete protection during the test period. As expected, after a 12 hour incubation, the negative control gives considerable auto-oxidation.
After a 24-hour incubation, the results obtained at 50 mM ORN / L strongly suggest that ornithine had no protective effect on the autoxidation of linoleic acid.
It was found that a mixture of 50 mM LA / L and 50 mM ORN / L and 100 mM LA-ORN / L afforded complete protection.
method
Control:
H2O (negative)
Butylhydroxytoluene (positive) 10, 50 and 100 mg / 10 mL (H2O, pH = 8.0)
Samples: a) LA 0.1, 0.61, 1, 5, 6.1 and 10 mg / mL (H 2 O, pH = 8.0) b) ORN 0.1, 0.39, 1, 3.9 , 5 and 10 mg / mL (H2O, pH = 8.0) c) LA + ORN 0.1, 1, 5 and 10 mg / 1 mL (H2O, pH = 8.0), with a ratio of 61/39. d) LA-ORN 0.1, 1, 5 and 10 mg / 10 mL (H2O, pH = 8.0)
Reagents: 25 mL 0.1 M Na phosphate buffer, pH = 7.0 350 mg linoleic acid / 25 mL ethanol (95%) ethanol 75% 3.5% (v / v) hydrochloric acid 1.5 g ammonium thiocyanate / 5 mL H2O 25.0 mg iron [pi] chloride / 10 mL 3.5% HC1
Sample incubation:
0.25 mL of each sample + 0.5 mL of buffer + 0.5 mL of linoleic acid solution is transferred to a 2 mL plastic ampoule with tight-fitting screw caps. each
Sample is prepared in 3 replicates.
The samples are incubated at 50 ° C. with light protection.
Autoxidation was tested at time zero and at 12, 24 and 72 hours.
Test analysis: Mix 25 μl of incubated sample with 1.20 mL of 75% ethanol and 25 μl of ammonium thiocyanate and 25 μl of iron U-chloride. Read the absorbance at 500 nm after 3 minutes of mixing.
Results in the analysis of the reducing power:
The analysis is based on the reduction of iron-IH to iron-U.
The results are expressed as% reduction, compared to the control that reduced total iron HI at a concentration of 5 mg / mL.
Fig. 9 shows the result of the analysis of the reducing power.
Furthermore, Table 2 summarizes the results below.
Table 2: Reducing power of LA, ORN, LA + ORN, LA-ORN and control of the concentration range tested
% Reduction in comparison to the Contra! e
Conc. Mg / mL LA LA + ORN ORN LA-ORN control
0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
1 7.2 5.8 19.9 12.0 22.7
5 22.2 41.5 53.3 47.4 100.0
<EMI ID = 14.1>
10 24.7 64.2 64.5 81.9 100.0
Explanation: LA ... lipoic acid, ORN ... ornithine, LA + ORN ... equimolar mixture of LA and ORN, LAORN ... compound of the invention, control ... NaBH4.
In another test, LA and ORN were separately analyzed at a concentration of 50 mM / L.
Further, a mixture of LA and ORN consisting of 50 mM LA / L and 50 mM ORN / L was examined. Finally, 100 mM LAORN / L was tested. As can be seen in Figure 10, LAORN exerted a strong synergistic effect as compared to a simple mixture of LA and ORN.
Production method: Example 1:
16.8 g (0.1 mol) of L-omithine HCl salt are dissolved in 160 ml of water. The solution is stirred until the L-ornithine HCl salt is completely dissolved. The pH of the solution is 4.6.
4 g (0.1 mol) of NaOH are added to this solution. The mixture is stirred until the NaOH is completely dissolved. The pH of the solution is 9.6.
20.6 grams of [alpha] -lipoic acid (0.1 mol) are slowly added to the above-mentioned solution.
The mixture is stirred until the [alpha] -lipoic acid is completely dissolved.
The mixture is held at 40 ° C. for five hours. At the end of this period, the solution is concentrated under reduced pressure (50 ° C, vacuum at 0.09 mPa) until 50% of the water is removed. All possible organic solvents in the raw material would be evaporated off. The volume of the remaining solution is about 100 ml, the pH is 7.5.
The concentrated saline solution is added to 1250 ml of ethanol (95%). The resulting solution is stirred. A white precipitate formed. The water content of the solution was regulated below 11%. The solution was filtered to obtain the precipitate.
The starting solution can be reused to recover ethanol and obtain another product.
The precipitate is dried at about 35 ° C. for 6 hours. 27 grams of the product according to the invention are obtained.
Appearance: slightly yellowish powder
Melting point: 165¯170 ° C
PH: 7.56 (0.5 grams, dissolved in 20 ml of water)
Influence of reaction time, concentration of reagents and temperature
Several tests were carried out with regard to the influence of the reaction time, the concentration of the reagents and the temperature. R (+) - lipoic acid was used as starting material for these tests. The degree of oligomerization of the R (+) - lipoic acid starting material was measured with respect to the specific rotation of the reaction solution.
Oligomerization of the lipoic acid breaks the S-S bond of the lipoic acid, resulting in a change in specific rotation. The smaller the specific rotation, the stronger the formation of the oligomerized compound according to the invention.
Figure 11 shows the influence of reaction time and temperature on salt formation with a fixed total concentration of R (+) - lipoic acid and ornithine of 35% in the reaction mixture.
It is easy to see that salt formation is stronger at lower temperatures. However, the viscosity of the solution limits the minimum temperature.
Therefore, temperatures of 30 ° C to 50 ° C are optimal.
From Fig. 11 it can further be seen that there is no significant change in salt formation after a 3 hour reaction time.
Figure 12 shows the effect of the sum of the concentrations of R (+) - lipoic acid and ornithine in the reaction mixture on salt formation at a fixed temperature of 40 ° C. The higher the concentration, the higher the degree of salt formation. However, the high viscosity again sets a limit on the maximum concentration. Therefore, the concentration is preferably 25% to 35% (w / v).