Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte mit einem im wesentlichen rechteckigen Rahmen und Streifen, wobei die Streifen nebeneinander im Rahmen anordenbar sind und eine Reihe untereinander verbundener Kavitäten enthalten, die einen Boden und eine oder mehrere Seitenwände mit einem oberen und unteren Rand aufweisen, wobei der untere Rand mit dem Boden verbunden ist, ein Verfahren zur Herstellung einer Mikrotiterplatte, einen Kit, bestehend aus einer Mikrotiterplatte mit einem Rahmen und Streifen und jeweils deren Verwendung.
Mikrotiterplatten besitzen eine Vielzahl von spalten- und reihenförmig angeordneten, eine Rundwabenstmktur bildende, sehr kleinen Reaktionsräume, auch Kavitäten genannt, in die jeweils kleinste Anteile einer Flüssigkeitsprobe, z.B.
einer Blutprobe für die Diagnose von im Blut erkennbaren medizinischen Parametern oder Krankheiten oder einer Wasserprobe für die Überwachung der Wasserqualität, eingebracht werden, die anschliessend jeweils mit unterschiedlichen Reagenzien in Kontakt gebracht werden, um so eine chemische oder biologische Reaktion oder dgl. hervorzurufen, welche von einer Änderung einer physikalisch messbaren Grösse, z.B. Färbung oder Entfärbung in der Flüssigkeitsprobe begleitet wird. Diese Farbänderung als Ergebnis der Reaktion wird üblicherweise visuell oder photometrisch ausgelesen, weshalb Mikrotiterplatten aus einem transparentem Material, insbesondere transparentem Boden bestehen.
Mikrotiterplatten können auch für Titrationen verwendet werden, indem man viele unterschiedliche Konzentrationen eingebrachter Flüssigkeitsproben mit demselben Reagenz reagieren lässt.
In grossem Massstab werden Mikrotiterplatten zum Ausführen von z.B. diagnostischen Untersuchungen, wie immunochemischen Untersuchungen auf Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien, Parasiten, etc., Proteine und Nukleinsäuren verwendet. Zum Zwecke dieser Untersuchungen wird jede Kavität mit einer für diese Untersuchung spezifischen Be-
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Schichtung, z.B. einem besonderem Protein, ausgestattet.
Nach dem die zu untersuchende Probe in den Behälter eingefüllt und der Behälter nach der Bindung erneut gewaschen wurde, wird ein Sekundärantikörper in den Behälter gegeben, der zusammen mit dem Protein der Beschichtung und der nachzuweisenden Substanz einen Immunkomplex bildet und dadurch eine messbare Veränderung, wie z.B. Farbveränderung, hervorruft, die anzeigt, dass bei Vorhandensein eines Analyten ein Farbänderung erzielt wird. Die Untersuchungen werden üblicherweise automatisch mittels Maschinen bzw. Roboter ausgeführt. Institutionen, die Mikrotiterplatten verwenden, sind beispielsweise Blutbanken, Krankenhäuser, Laboratorien, etc.
In bekannten Mikrotiterplatten sind oftmals Streifen mit acht oder zwölf starr miteinander verbunden Kavitäten in einem Halter angeordnet.
Abhängig von der Anzahl der zu untersuchenden Proben wird entweder der gesamte Halter mit beschichteten oder unbeschichteten Streifen bestückt. Um noch flexibler arbeiten zu können, wurden Mikrotite[phi]latten entwickelt, deren Kavitäten vom Streifen einfach abgebrochen werden können, sodass eine willkürliche Anzahl von Kavitäten vom Rest des Streifens abgetrennt werden kann.
Somit können die Kavitäten in kleineren Einheiten in einem wieder verwendbaren Rahmen transportiert werden und einer Verarbeitung zugänglich gemacht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Mikrotiterplatte, mit welcher sowohl die Fehleranfälligkeit vermindert als auch die Ökonomie der Analyse verbessert werden kann, zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird jeweils eigenständig durch eine Mikrotiterplatte gelöst, wobei ein Mittel zur Kennzeichnung von zumindest einer Kavität und/oder eines Streifens angeordnet ist, sowie Verfahren zur Herstellung der Mikrotiterplatte, wobei ein Farbstoff dem für die Herstellung der Mikrotiterplatte erforderlichen Rohstoff, insbesondere Kunststoffgemisch, beigemengt wird oder der Farbstoff nach bzw. während der Herstellung der Mikrotiterplatte auf die Kavitäten bzw.
Streifen aufgebracht wird und ein Kit, wobei zumindest ein Streifen mehr im Kit enthalten ist, ^e der Rahmen fassen kann. Generell erweist sich dabei als vorteilhaft, dass durch die Kennzeichnung eine Unterscheidung des einen Streifens bzw. der einen Kavität von den restlichen Kavitäten und/oder Streifen ermöglicht wird und dadurch eine besondere Funktion und Unterscheidungskraft der zumindest einen gekenn-
N2004/13000 zeichneten Kavität bzw. dem zumindest einen gekennzeichneten Streifen zugeordnet werden kann.
Im Kit erweist sich als vorteilhaft, dass durch die Anordnung mehrerer gekennzeichneter Kavitäten bzw. Streifen im Kit eine mehrmalige Verwendung des Rahmens ermöglicht wird, wobei jeweils die benötigte Anzahl von nicht oder anders gekennzeichneten Kavitäten und/oder Streifen und zumindest ein gekennzeichneter Streifen bzw. Kavität im Rahmen angeordnet wird.
Bei einer erneuten Verwendung der Mikrotiterplatte wird der gekennzeichnete Streifen bzw. Kavität ersetzt und in die nicht bzw. anders gekennzeichneten, noch nicht verwendeten Kavitäten wird die Probe pipettiert. Dadurch muss beispielsweise bei der Austestung von nur wenigen Patientenproben auf der Mikrotiterplatte nur jene Anzahl von Kavitäten verwendet werden, welche tatsächlich benötigt wird und dennoch können sämtliche benötigte Kontrollen in den gekennzeichneten Kavitäten bzw. Streifen durchgeführt werden. Bei einer abermaligen Verwendung des Rahmens mit den restlichen Kavitäten für andere Patientenproben wird der gekennzeichnete Streifen, wie z.B. Kalibratorstreifen bzw. die Kontrollkavitäten durch neue ersetzt.
Es ist somit eine sehr ökonomische Austestung vieler Patientenproben mit demselben Rahmen bzw. mit nur den tatsächlich benötigten Patientenkavitäten bzw. Patientenstreifen möglich und dennoch steht immer ein Streifen bzw. Kavitäten zur Verfügung, die sich von den anderen unterscheiden, und somit für vorbestimmbare Proben, wie z.B. Kalibratoren, Kontrollen, etc. verwendet werden können.
Durch die Anordnung von horizontalen und/oder vertikalen Trennwänden im Inneren des Rahmens können auch nur einzelne Kavitäten angeordnet werden. Dadurch wird allerdings auch ermöglicht, dass Streifen bzw. nur Teile eines Streifens im Rahmen exakt positioniert werden.
In einer Weiterbildung der Mikrotiterplatte erweist sich als vorteilhaft, dass das Mittel zur Kennzeichnung ein sichtbarer Farbstoff bzw.
Substanzen zur Bildung eines sichtbaren Farbstoffes ist/sind, wobei zumindest eine Kavität und/oder ein Streifen mit einem Farbstoff versehen ist, wodurch die Unterscheidung dieser Kavität bzw. dieses Streifens von den anderen Kavitäten bzw. Streifen erleichtert wird. Beispielsweise kann dadurch in die farbigen Kavitäten bzw. Streifen eine Kontrolllösung, z.B. oder eine positive bzw. negative
N2004/13000 Kotrolllösung oder Kalibratorlösung vorgelegt werden und in die restlichen miteinem anderen Farbstoff markierten oder nicht markierten Kavitäten und/oder Streifen werden die Patientenproben bzw. die zu analysierenden Flüssigkeiten pippetiert.
Der Boden zumindest einer Kavität und/oder Streifens ist transparent und die Seitenwand/wände sind mit zumindest einem Farbstoff ausgebildet, wodurch dennoch eine Messung der Proben in den farbigen Kavitäten bzw.
Streifen durch visuelle oder photometrische Detektion möglich ist ohne das Messergebnis zu verfalschen. Ein transparenter Boden erweist sich auch als vorteilhaft, weil eine optische Kontrolle während des Arbeitsvorganges bzw. während der Inkubation der Mikrotiterplatte ermöglicht wird. Dadurch kann in geeigneter Weise noch nach Zubereitung des Reaktionsgemisches, in die in der Kavität ablaufende Reaktion eingegriffen werden.
Eine nicht transparente bzw. lichtundurchlässige Ausbildung zwischen den Böden der einzelnen Kavitäten kann sich ebenfalls als vorteilhaft erweisen, weil dadurch Streulicht, welches das Messergebnis verfalschen könnte, während der Detektion vermieden werden kann.
In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass der obere Rand der Seitenwand/- wände zumindest einer Kavität und/oder Streifens mit einem Farbstoff ausgebildet ist, wodurch ein leicht herstellbares, die Analyse nicht beeinflussendes Werkzeug zur visuellen Unterscheidung vorliegt.
Eine weitere Möglichkeit zur Unterscheidung wird dadurch gegeben, dass zumindest eine Kavität in Seitenansicht quadratisch, rechteckig, kegelförmig, insbesondere kegelstumpfförmig, bzw.
in Bezug auf eine Seitenwand kegel(stumpf)förmig, oder halbkugelförmig im Gegensatz zu den anderen, die Patientenproben fassenden Kavitäten, ausgebildet ist. Vorteilhaft dabei erweist sich, dass im Normalfall Kavitäten im Querschnitt rechteckig sind und die andersformigen Kavitäten nunmehr für Kontroll- oder Kalibratorlösungen verwendet werden und somit von den Kavitäten mit den Patientenproben einfach unterschieden werden können.
In einer alternativen Ausbildung kann zumindest eine Kavität in Draufsicht rund, oval, viereckig, wie quadratisch, rechteckig oder in Form eines Parallelogramms, hexagonal, octogonal oder in einer Sonderform, wie die Form eines Minus- oder Pluszeichens ausgebildet sein, wodurch abermals eine Unterscheidung möglich ist und dadurch die Ver-
N2004/13000 [phi] wechslungsgefahr zwischen einer Kavität mit einer Kontroll- bzw.
Kalibratorlösung und einer Kavität mit einer Patientenprobe auf ein Minimum reduziert werden kann.
Ein weiteres Merkmal zur Unterscheidung kann dadurch vorliegen, dass zumindest eine Seitenwand zumindest einer Kavität und/oder eines Streifens in ihrer Dimension länger oder kürzer ausgebildet ist, wie die Seitenwände der restlichen Kavitäten bzw. Streifen und wie der Rahmen und somit bereits visuell bzw. haptisch (Tastsinn) erkennbar ist, welche Kavitäten bzw. Streifen für Kontroll- bzw. Kalibratorlösungen und welche Kavitäten bzw. Streifen für Patientenproben zu verwenden sind.
Von Vorteil erweist sich auch, wenn die Kavität bzw. der Streifen mit den Mitteln zur Kennzeichnung eine Einheit bildet, wodurch bei einer mehrmaligen Verwendung des Rahmens mit nur einem Teil jener Streifen, die für die zu analysierenden Proben vorgesehen sind, die Kavitäten bzw.
Streifen mit den Mitteln zur Kennzeichnung einfach ersetzt werden können und somit der Rahmen mit den restlichen Streifen für Patientenproben abermals verwendet werden kann.
Von Vorteil erweist sich auch, wenn 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 oder 3456 Kavitäten angeordnet sind, wodurch eine standardisierte Anzahl an Kavitäten in standardisierten Rahmen eingesetzt werden und somit in jedem automatisierten Laboranalysegerät ausgewertet bzw. mit jedem vollautomatisierten Pipettierroboter bedienbar sind. Von Vorteil erweist sich dabei auch, dass viele verschiedene Patientenproben bzw. Biomakromoleküle gleichzeitig analysiert werden können.
Des weiteren erweist sich als vorteilhaft, dass die Kavitäten im Streifen bzw. Rahmen in einem gleichmässigen Raster angeordnet sind, wobei abermals eine vollautomatisierte Handhabung der Mikrotiterplatte ermöglicht wird.
Durch die gleichartige Anordnung der Kavitäten werden auch auf vorteilhafte Weise bei automatisiert durchgeführter Manipulation der Mikrotiterplatte relativ zu gleichen Bezugspunkten der Kavitäten auf verschiedene Kavitäten stets die gleichen parallel zu einer Aufstandsebene auszuführenden Bewegungen durchgeführt.
Zumindest eine Seitenwand der Kavität kann konisch, konkav, konvex oder zylindrisch angeordnet sein, wodurch abermals eine Unterscheidungsmöglichkeit der Kavitäten mit
N2004/130Ö0 den Kontroll- bzw. Kallibratorlösungen von den restlichen Kavitäten, insbesondere mit den Patientenproben, ermöglicht wird. Zudem kann das Volumen in den Kavitäten verändert werden und dennoch durch den üblichen Durchmesser des Bodens der Kavität beispielsweise das Anwachsen von Zellkulturen ermöglicht werden.
Von Vorteil erweist sich diese Weiterbildung auch dadurch, dass durch eine standardisierte Anordnung der konischen, konkaven, konvexen bzw. zylindrischen Kavitäten eine sehr platzökonomische Gestaltung der Mikrotiterplatte erreicht wird.
Der Boden der Kavitäten kann als U-Boden, V-Boden oder F-Boden ausgebildet sein, wodurch je nach zu bestimmendem Analyt bzw. verwendeter Methode eine Mikrotiterplatte mit entsprechender Kavitätenform zur Verfügung steht.
Von Vorteil erweist sich auch, dass die Kavitäten ein Fassungsvermögen ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1 [mu]l, vorzugsweise 50 [mu]l, insbesondere 100 [mu]l und einer oberen Grenze von 30 ml, vorzugsweise 10 ml, insbesondere 5 ml aufweisen, wodurch das Volumen in den Kavitäten der Mikrotiterplatte abermals an die jeweiligen Bedürfnisse bzw.
an die jeweils zu analysierende Probe angepasst werden kann. Durch die Verwendung der geringen Volumina wird eine sehr kosteneffektive Analyse ermöglicht.
Die innere Oberfläche der Kavitäten zur Anbindung von Biomakromolekülen kann oberflächenbehandelt, insbesondere chemisch modifiziert, sein, wodurch eine spezifische Bindung eines, den nachzuweisenden Analyten aus einer Probe bindenden, Moleküls erzielt werden kann.
Die Kavitäten, Streifen bzw.
der Rahmen können aus einem Material, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Polypropylen, Polystyrol, Acrylbutadienstyrol, Polyamid, Polycarbonat, Polyester, Polymethylmethacrylat, Polysulfon, Cycloolefin(co)polymer, Polymethylpenten (TPX(R)), Styrol-Maleinsäureanhydridcopolymer und/oder Styrolacrylnitril und/oder einem Gemisch daraus, gebildet sein, wodurch je nach Verwendung der Mikrotiterplatte eine effiziente Oberflächenbehandlung bzw. Beschichtung der Platte durchgeführt werden kann, ohne deren Oberfläche zu zerstören. Von Vorteil ist dabei eine Weiterbildung mit unterschiedlichen Materialien, weil diese teilweise resistent gegen organische Lösungsmitteln, wie z.B. Aceton, Benzen, Acetonnitril, Dioxan, 2,2,2-Trifluorethanol sind.
Des weiteren sind sie mit verschiedenen, häufig gebrauchten Salzen, Puffern und Polymeren,
N2004/130Ö0 die für verschiedene Reaktionen verwendet werden, kompatibel. Polypropylen und Cycloolefincopolymere sind ausserdem weniger permeabel für Wasserdampfund daher weniger sensitiv für die Verdunstung, als beispielsweise Behälter aus Polystyrol.
In einer alternativen Ausführungsform ist es möglich, d>ass der Rahmen und/oder die Kavitäten und/oder Streifen aus unterschiedlichen Materialien ausgebildet sind, wodurch unterschiedliche Ansprüche, wie sie beispielsweise an einen Rahmen im Gegensatz zu einer Kavität gestellt werden, erfüllt werden können.
So muss beispielsweise der Rahmen eine hohe Stabilität gegen Verwindungen aufweisen, wohin gegen die Kavität eine Oberfläche für eine optimale Beschichtung zur Verfügung stellen muss oder den Anforderungen durch organische Lösungsmittel bestehen muss und deren Steifigkeit von untergeordneter Bedeutung ist.
Eine Koordinatenerkennung für die Anordnung der Kavitäten und/oder Streifen am Rahmen erweist sich als vorteilhaft, weil dadurch die Position einer Kavität bzw. eines Streifens exakt determiniert werden kann.
Durch eine entsprechende Markierung der Mikrotiterplatte kann ein internes Kontrollsystem und Orientierungssystem für die automatisierte Bearbeitung eingebracht werden.
Die Abmessungen des Rahmens und der Kavitäten gemäss den Empfehlungen der SBS (Society of Biomolecule Screerdng) ermöglichen unter anderem, dass eine optimale Menge eines Volumens eines bestimmten Reagenz in der jeweiligen Kavität entsprechend den Bedürfnissen der Analyse vorgelegt wird.
Der Rahmen kann zur Positionierung der Streifen eine Einrichtung, wie z.B. einen Fortsatz oder Vorsprung, aufweisen, wodurch ein einfaches Entnehmen und wieder Einsetzen eine Streifens bzw. einer Kavität an die gleiche Position im Rahmen ermöglicht wird. Dadurch kann auch bei automatisierter Handhabung der Mikrotiterplatte eine richtige Zuordnung der Streifen in den jeweiligen Bereich des Rahmens ermöglicht werden.
Vorteilhaft erweist sich dabei auch, dass eine Positionierung in einer vordefinierten Position ermöglicht wird und somit die Reproduzierbarkeit des Experiments vereinfacht wird bzw. die Handhabung des Rahmens und der Streifen simplifiziert wird.
N2004/13000 Durch die Anordnung einer Sollbruchstelle am Streifen, wird gegenüber bekannten Mikrotiterplatten mit unzerbrechlichen Streifen der Vorteil erzielt, dass nur so viele beschichtete Behälter in einem Rahmen angeordnet werden, die für die Ausführung der Untersuchung erforderlich sind. Dies hat den Vorteil, dass wenn nur eine einzige Probe untersucht werden soll, ein Streifen zerbrochen werden kann und nur ein Teil des Streifens für die Untersuchung verwendet werden muss. Der andere Teil des Streifens kann für eine spätere Untersuchung aufbewahrt werden.
Insbesondere an Orten, wo Untersuchungen überaus kurzfristig durchgeführt werden müssen und es nicht möglich ist zu warten, bis der gesamte Streifen mit Proben gefüllt ist, kann eine Sollbruchstelle des Streifens substantielle Einsparungen ermöglichen, da nur die notwendige Anzahl beschichteter Kavitäten verwendet wird. Bei einer grossen Anzahl von Untersuchungen ist dies von grosser ökonomischer Bedeutung.
Durch die Anbringung einer zusätzlichen Kennzeichnung am Streifen und/oder Rahmen bzw. in einem Bereich davon, wird ein Verwechseln verunmöglicht.
Weist ein zumindest weiterer Streifen ein Mittel zur Kennzeichnung auf erweist sich von Vorteil, dass dieser von den restlichen Streifen, welche die Patientenproben enthalten, unterschieden werden kann.
Bei der Anbringung der Streifen und den Kavitäten vertikal oder horizontal im Rahmen entsprechend der Geometrie der Mikrotiterplatte, wird es ermöglicht, dass jeweils ein Streifen, welcher beispielsweise die Kavitäten für Kontroll- oder Kalibratorlösungen umfasst, zur Gänze ausgetauscht wird.
Im Kit erweist sich als vorteilhaft, dass zumindest ein weiterer Streifen enthalten ist, wodurch eine mehrmalige Verwendung des Rahmens mit den restlichen, noch nicht gebrauchten Streifen für Patientenproben ermöglicht wird, wobei bei jeder Verwendung eine komplette Anzahl der Kavitäten des Kontroll- bzw.
Kalibratorstreifens zur Verfügung stehen.
Durch die Identifikation eines Antikörpers gegen ein Antigen aus einer Gmppe umfassend Phospholipid (Cardiolipin), Prothrombin, Smooth muscle (ASMA), Mitochondria (AMA), CCP bzw. anti-Citrullinated Filaggrin, Histon, PCNA, Liver kidney microsome 1 (antiLKM-1), Thyroglobulin (anti Tg), Thyroid peroxidase (anti TPO), Insulin (anti-Pancreatic
N2004/13000 islet cells), Glutamic acid decarboxylase (anti-GAD), Saccharomyces cervisiae antibody (ASCA), Intra-epidermal (Desmoglein3,l), Basement membrane zone (BP 180), Myelin basic protein, Alanyl-tRNA-Synthetase, Alpha-Fodrin, Alpha-Enolase, Aminoacyl-tRNASynthetase, Proteinase 3, Myleoperoxidase, Elastase, Kathepsin G, Azurozidin, Laktoferrin, Lysozym, BPI, CENP-E, CENP-F, Centrophilin, dsDNA, IFI 16, Histon, La/SS-B, Mi2, Ro/SS-A, Scl-70, ssDNA, Ul-sRNP A, Ul-sRNP C, Ul-sRNP BB', Ul-sRNP 68/70,
Ul-sRNP Dl, Ul-sRNP D2, Ul-sRNP D3, Ul-sRNP E, Ul-sRNP F, Ul-sRNP G, tTG, GBM, Beta-2 Glykoprotein I, BiP/[rho]68, Calpastatin, Calretikulin, Clq, p23/[rho]25, Coilin, EF1 A, Fer, Fibrillarin, Golgi-Apparat (AGA), HMG, IgA, IgG, IgM, HitzeschockProteine, Isoleucin-tRNA-Sythease, Histidyl-tRNA-Sythease, Actin, Aggrecan, Collagen IV, Collagen VI, Collagen IX, Collagen X, Cytokeratin 8, Cytokeratin 14, Cytokeratin 19, Decorin, Desmin, Elastin, Fibronectin, Gliaprotein, Keratin, Laminin, Myosin, Perlecan, Tubulin , Vimentin, Vinculin, Gliaprotein, Neurofilament M, Neurofilament L, Neurofilament H, Myelin, Myelin Basisches Protein (MBP), Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), Myelin-Oligodendroglia-Glykoprotein (MOG), Myelin Proteolipid (Proteolipidprotein), Kryoglobuline, L5/5S, L7, L12, Mas, NOR-90, Nukleolin, PMS1, RNAPolymerase I, To/Th, Nukleophosmin, Nukleolin, aPE, aPc, aPi,
APSA, PM-Scl-100, RA33, Prothrombin, Topoisomerase I, Trimethylguanosin, U2-RNP, U4/U6-RNP, U5RNP, U7-RNP, Ul 1-RNP wird die Detektion und gegebenenfalls ein Screerdng von diagnostischen oder prognostischen Marker bzw. eine Verlaufskontrolle für Autoimmunerkrankungen ermöglicht, wodurch gegebenenfalls der Therapieverlauf kontrolliert oder rechtzeitig mit einer entsprechenden Therapie Langzeitschäden vorgebeugt werden kann.
Von Vorteil erweist sich des weiteren, dass durch die Verwendung des Kits eine Analyse einer Probe, wobei zumindest ein Teil eines Streifens mit einem Mittel zur Kennzeichnung ausgestattet ist und dadurch zur Unterscheidung mit dem weiteren Teil des Streifens oder mit weiteren Streifen herangezogen werden kann, ermöglicht wird.
In einer Weiterbildung des Kits ist vorgesehen, dass zumindest ein Waschpuffer umfassend NaCl, KH2PO4, Na2HPO4, KCl, Indigocarmin,
Tween-20(R) und Thiomersal oder Natriumazid, eine Enzymkonjugatlösung, insbesondere Meerrettichperoxidase (Horse-RadishPeroxidase HRP)-Konjugatlösung, umfassend NaCl, KH2PO , Na2HPO4, KCl, Gelborange S, Rinderserumalbumin (BSA), HRP-Antikörper-Konzentrat und Thiomersal oder Natriu-
N2004/13000 mazid, oder als Enzym auch alkalische Phosphatase bzw. ss-Galactosidase, ein Probenverdünnungspuffer umfassend NaCl, KH2PO , Na2HPO4, KCl, Tartrazin, Rinderserumalbumin (BSA) und Thiomersal oder Natriumazid und eine Enzymsubstratlösung umfassend NaCl, KCl, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und H2O2enthalten sind, wodurch die für die Analyse benötigten Komponenten bereits im Kit enthalten sind und somit weder selbst zubereitet noch zugekauft werden müssen, wodurch externe Fehlerquellen ausgeschlossen werden können.
Zudem sind die Komponenten des Kits als System aufeinander abgestimmt und ist dieser als in-vitro Diagnostikum einsetzbar. Werden Enzymkonjugatlösungen mit alkalischer Phosphatase oder ss-Galactosidase verwendet, so wird auch die Enzymsubstratlösung entsprechend nach aus dem Stand der Technik bekannten Methoden angepasst.
Einführend sei festgehalten, dass in den unterschiedlich beschriebenen Ausfuhrungsformen gleiche Teile mit gleichen Bezeichnungen versehen werden, wobei die in der gesamten Beschreibung enthaltenen Offenbarungen sinngemäss auf gleiche Teile mit gleichen Bezeichnungen übertragen werden können. Auch sind die in der Beschreibung gewählten Lageangaben, wie z.B. oben, unten, seitlich usw. auf die unmittelbar beschriebenen Beispiele bezogen und sind bei einer Lageänderung sinngemäss auf die neue Lage zu übertragen.
Weiters können auch Einzelmerkmale oder Merkmalskombinationen aus den gezeigten und beschriebenen unterschiedlichen Ausführungsbeispielen für sich eigenständige, erfinderische oder erfindungsgemässe Lösungen darstellen.
Sämtliche Angaben zu Wertebereichen in gegenständlicher Beschreibung sind so zu verstehen, dass diese beliebige und alle Teilbereiche daraus mitumfassen, z.B. ist die Angabe 1 bis 10 so zu verstehen, dass sämtliche Teilbereiche, ausgehend von der unteren Grenze 1 und der oberen Grenze 10 mitumfasst sind, d.h. sämtliche Teilbereich beginnen mit einer unteren Grenze von 1 oder grösser und enden bei einer oberen Grenze von 10 oder weniger, z.B. 1 bis 1,7, oder 3,2 bis 8,1 oder 5,5 bis 10.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte, wobei diese aus einem Rahmen und darin angeordneten Streifen bzw.
Kavitäten besteht.
Der Rahmen kann im Umriss quadratisch oder rechteckig sein und ist durch jeweils zwei einander paarweise gegenüberliegende Trag- und Verbindungsschenkel begrenzt.
N2004/13000 Die Kavitäten können einzeln angeordnet sein, wobei bei dieser Ausführungsform zwischen jeweils zwei einander gegenüberliegenden Schenkel Stege angeordnet sind, um die Kavitäten zu halten.
Bei der Anordnung der Kavitäten in Streifen ist die Anordnung der Stege in Form eines gleichmässigen Rasters im Rahmen nicht zwingend notwendig. Die Stege können zur Erhöhung der Stabilität des Rahmens dennoch angeordnet sein.
Bei der erfindungsgemässen Mikrotiterplatte unterscheidet sich zumindest eine Kavität von den restlichen Kavitäten, welche auf derselben Mikrotiterplatte angeordnet sind durch ein Mittel zur Kennzeichnung.
Sind die Kavitäten zu Streifen, also zu Einheiten zusammengefasst, so kann sich auch zumindest ein Streifen von den restlichen Streifen derselben Mikrotiterplatte unterscheiden.
In einer dazu alternativen Ausführungsform ist es auch möglich, dass die Kavitäten teilweise einzeln und teilweise zu Streifen zusammengefasst sind, wobei sich wiederum einzelne Kavitäten bzw. Streifen von den anderen Kavitäten bzw. Streifen unterscheiden. Wird in diesem Zusammenhang von Streifen gesprochen, so besteht ein Streifen zumindest aus zwei Kavitäten.
Bei einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten besteht ein Streifen, wenn dieser vertikal angeordnet ist, aus maximal 8 Kavitäten und wenn der Streifen horizontal angeordnet ist, aus maximal 12 Kavitäten.
Als Mittel zur Kennzeichnung kann eine bestimmte Geometrie einer Kavität bzw. eines Streifens oder ein anderes visuelles Mittel, wie z.B. ein Farbstoff, dienen.
Wird als Mittel zur Kennzeichnung ein Farbstoff oder Substanzen zur Bildung eines sichtbaren Farbstoffes verwendet, so können unterschiedliche Teile des Streifens bzw. der Kavität gefärbt sein. Bei einer Ausführungsvariante ist vorstellbar, dass der gesamte Streifen bzw. die gesamte Kavität in Farbe ausgebildet ist, indem beispielsweise dem Kunststoff, aus welchem der Streifen bzw. die Kavität besteht, ein Farbstoff beigemengt wird.
Zur vollständigen Einfarbung des Streifens oder einer Kavität kann aber auch die Oberfläche mit einem Farbstoff versehen werden. Als gewählte Farbstoffe kommen alle handelsüblichen Substanzen in Frage.
N2004/13000 In alternativen Ausführungsformen kann aber auch nur ein Teil der Kavität bzw. eines Streifens farbig ausgebildet sein. So kann beispielsweise nur die Seitenwand einer Kavität farbig ausgebildet sein oder mit einer Farbe beschichtet sein. Ist der Boden einer Kavität mit einem Farbstoff ausgebildet, so muss die photometrische Bestimmung durch die transparente Seitenwand erfolgen, um nicht das Messergebnis zu verfälschen.
Bevorzugt sind aber die Seitenwände oder zumindest Teile der Seitenwände einer Kavität farbig und der Boden transparent, damit bei einer photometrischen Auswertung der Mikrotiterplatte Licht durch den Boden dringen kann.
Auf einer Mikrotiterplatte können als Mittel zur Kennzeichnung nicht nur zwei unterschiedliche Farbstoffe angewendet werden, sondern es können auch viele verschiedene Farbstoffe verwendet werden, sodass beispielsweise die Positivkontrolle und die Negativkontrolle jeweils eine spezifischen Farbstofftragen und die Patientenproben oder jede Patientenprobe wiederum eine spezifische Farbe hat.
Auch die Kalibratorstreifen können einen für sie charakteristischen Farbstoff aufweisen.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann jeweils nur der obere Rand der Seitenwand/wände zumindest einer Kavität und/oder Streifens mit einem Farbstoff hergestellt sein.
Wird die Unterscheidung aufgrund der Geometrie der Kavität bzw. des Streifens getroffen, so kann eine gekennzeichnete Kavität in Seitenansicht z.B.
quadratisch, kegelförmig, insbesondere kegelstumpfförmig, oder halbkugelförmig ausgebildet sein.
Alternative Mittel zur geometrischen Unterscheidung ergeben sich beispielsweise dadurch, dass die zu unterscheidende Kavität im Gegensatz zu den anderen in Draufsicht runden Kavitäten in Draufsicht oval, viereckig wie quadratisch, rechteckig oder in Form eines Parallelogramms, hexagonal, octogonal, oder in einer Sonderform, wie in Form eines Minusoder Pluszeichens ausgebildet ist.
Neben der geometrischen Form kann sich eine Kavität oder ein Streifen auch durch die unterschiedliche Dimensionierung, beispielsweise der Seitenwand der Kavität oder des Durchmesser der Öffnung bzw. des Bodens der Kavität unterscheiden.
Beispielsweise können die Seitenwände der Kavitäten mit den Kontrolllösungen länger ausgebildet sein,
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13oder der Durchmesser der Kavitäten grösser sein, als jener der Kavitäten mit den Patientenproben.
Eine alternative Kennzeichnung kann durch Oberflächenstrukturen an der Oberseite der Kavitäten bzw. Streifen gebildet werden, wie z.B. durch Erhebungen und Vertiefungen entsprechend der Ausbildung von Wellenbergen und -tälern.
Als weiteres alternatives Mittel zur Unterscheidung kann auch die Seitenwand zumindest einer Kavität und/oder eines Streifens in ihrer Dimension länger oder kürzer wie die Seitenwand anderer Kavitäten, Streifen und/oder des Rahmens ausgebildet sein.
Die Seitenwände der Kavitäten mit den Kontrolllösungen können konisch, konkav, konvex oder zylindrisch ausgebildet sein.
Weist eine Kavität mehr als eine Seitenwand auf so kann diese bzw. ein Teil der Seitenwand auch konisch angeordnet sein, wohin gegen die anderen Seitenwände oder der andere Teil der Seitenwand zylindrisch ausgebildet sind oder ist. Durch diese Ausbildung kann zusätzlich zur Unterscheidung beispielsweise ein leichteres Abkippen von Flüssigkeit, insbesondere Waschflüssigkeit, beim Wenden der Mikrotiterplatte erzielt werden oder eine Volumenvergrösserung bei gleich bleibender Bodenfläche erzielt werden.
Aber auch die Form des Bodens der Kavität kann ein Mittel zur Kennzeichnung sein. Der Boden kann beispielsweise als U-Boden, der eine runde Bodenform beschreibt, als VBoden, der einen konisch zulaufenden Boden beschreibt oder als F-Boden, der für einen flachen Boden steht und/oder als Half-Boden mit halbem Durchmesser ausgebildet sein.
In der Regel bilden die Kavitäten bzw.
Streifen mit der gleichen Kennzeichnung eine Einheit.
Im Rahmen können Streifen mit jeweils einer unterschiedlichen Anzahl von Kavitäten eingesetzt werden, wobei die Gesamtanzahl der Kavitäten auf der Mikrotiterplatte 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 oder 3456 Kavitäten betragen kann. Vorzugsweise sind die Kavitäten in einem gleichmässigen Raster angeordnet, um eine automatisierte Handhabung durchführen zu können.
N20Q4/13000 Abhängig von der Anzahl der Kavitäten auf der Mikrotiterplatte beträgt das Fassungsvermögen zwischen 1 [mu]l und 30 ml. Werden die Mikrotiterplatten beispielsweise für Zellkultivierung verwendet, so wird meist eine Mikrotiterplatte mit einer geringeren Anzahl von Kavitäten und somit mit einem grösseren Fassungsvermögen verwendet.
Für ein Hochdurchsatzscreening (High Throughput Screerdng) werden Mikrotiterplatten mit einer sehr grossen Anzahl von Kavitäten verwendet, wodurch eine grosse Anzahl von Proben gescreent werden kann und somit der Verbrauch von Chemikalien bzw. von Proben, welche womöglich nur in limitierter Menge zur Verfügung stehen, minimiert wird. Diese Kavitäten fassen somit ein geringeres Volumen.
Die Mikrotiterstreifen können stimseitig abstehende Aushebelaschen aufweisen, die mit ihrem freien Ende über die Oberkante des Rahmens hinaus horizontal überstehen.
Damit lassen sich die Mikrotiterstreifen auf einfache Weise maschinell aufiiehmen und gegebenenfalls auch manuell handhaben.
Zum Transport der Mikrotiterstreifen und/oder zur exakten Positionierung der Kavitäten in einem Analysegerät können die Mikrotiterstreifen an ihren Seitenflanken oder der Aushebelasche angeordnete, den Kavitäten in einer definierten Lagebeziehungen einzeln zugeordnete Transport- und/oder Zentrierausnehmungen bzw. Positionseinrichtungen aufweisen.
In einer Weiterbildung können an den Seitenwänden der Kavitäten Beschriftungsfelder angeordnet sein, die eine exakte Bestimmung der Kavitäten und deren Inhalt auch bei ungewollter Vereinzelung eines Streifens zulassen.
Sowohl an der Aussen- als auch an der Innenseite des Rahmens können Positionseinrichtungen zur lösbaren Verbindung der Streifen mit dem Rahmen angeordnet sein.
Durch die Anordnung der Positionseinrichtungen an der Innenseite des Rahmens lassen sich die Streifen testspezifisch in einem Rahmen zusammenstellen und vereinzeln. Die Streifen können gegebenenfalls auch parallel an mehreren Messstationen bearbeitet werden. Weiters ist es damit möglich den Rahmen je nach Aufgabenstellung mit einer variablen Anzahl von Streifen zu bestücken und dennoch eine genaue Positionierung der Streifen zu erzielen. Dabei lässt sich durch entsprechende Dimensionierung des Rahmens und der Streifen auch eine Kompatibilität mit herkömmlichen Streifen gewährleisten. Positionseinrichtun-
N2004/13000 gen ermöglichen somit eine zuverlässige Sicherung der Streifen im Rahmen und zugleich eine einfache Vereinzelung.
Mit Probenmaterial kontaminierte Streifen können einzeln entsorgt werden.
Die Positionseinrichtungen können auch an der Aussenseite der Seitenwände des Rahmens in Form von Vorsprüngen oder Fortsätzen angeordnet sein, welche beispielsweise eine Positionierung des Rahmens in einer automatisierten Pipettieranlage bzw. Analysevorrichtung ermöglichen. Solche Positionseinrichtungen können auch an der Ober- oder Unterseite des Rahmens angeordnet sein.
Ist der Rahmen wie vorab beschrieben mit Stegen ausgestattet, so erweist es sich auch als vorteilhaft, dass an den Trennstegen Positionseinrichtungen angeordnet sind. Die Positionseinrichtungen können in Form von Vorsprüngen ausgebildet sein.
Diese Vorsprünge bewirken eine Klemmhaltung der Streifen bzw. der einzelnen Kavitäten.
Ist der Rahmen ohne Stege ausgebildet, sind die Vorsprünge vorzugsweise entsprechend der Form, insbesondere entsprechend dem äusseren Umfang der Kavitäten geformt. Die Vorsprünge können also komplementär zur Form der zu haltenden Kavität geformt sein. Beispielsweise kann bei zylindrisch geformten Kavitäten der Vorsprung in Form einer Sichel bzw. eines Halbkreises ausgebildet sein.
Um die Streifen sicher und positionsgenau im Rahmen zu halten und zugleich deren Entnahme zu ermöglichen, können im Rahmen auch überstehende Positionseinrichtungen angeordnet sein, die in komplementäre Ausnehmungen der Streifen einrasten.
Die Positionseinrichtungen auf der Aussenseite des Rahmens erhöhen zudem die Griffsicherheit bei manueller Handhabung.
Die Schenkel des Rahmens können an ihren voneinander abgewandten Aussenseiten eine untere Randstufe aufweisen, die eine Anlagefläche für einen den Transportrahmen übergreifenden Deckel bildet oder als Griffleiste wiederum die Griffsicherheit bei manueller Handhabung erhöht.
Um bestimmte Biomakromoleküle nachweisen zu können, kann die Innenseite der Kavitäten oberflächenbehandelt sein. Verschiedenste Oberflächenbehandlungen, sowohl durch chemische Modifikationen als auch durch Adsorption von biologischen Molekülen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
N2004/13Ö00 Der Rahmen der Mikrotiterplatte bzw. die einzelnen Kavitäten oder Streifen können aus unterschiedlichen Materialien, insbesondere unterschiedlichen Kunststoffen, hergestellt sein. Es kann auch der Rahmen aus einem anderen Kunststoff wie die Streifen bzw. die Kavitäten bestehen.
Auch die Kavitäten müssen nicht notwendigerweise alle aus dem gleichen Material hergestellt sein. Als Materialien kommen Polypropylen, Polystyrol, Acrylbutadienstyrol, Polyamid, Polycarbonat, Polyester, Polymethylmethacrylat, Polysulfon, Cycloolefin(co)polymer, Polymethylpenten (TPX(R)), Styrol-
Maleinsäureanhydridcopolymer und/oder Styrolacrylnitril und/oder einem Gemisch daraus, in Frage. Dabei wird zur Durchführung optischer Untersuchungen vorzugsweise ein lichtdurchlässiges Material verwendet.
Zusätzlich zum Mittel der Kennzeichnung kann am Rahmen der Mikrotiterplatte eine Koordinatenerkennung für die Anordnung der Kavitäten und/oder der Streifen angeordnet sein, um eine bessere Orientierung auf der Mikrotiterplatte zu ermöglichen. Wie bereits vorab beschrieben können auch Beschriftungsfelder angeordnet sein.
Vorzugsweise ist in vertikaler Richtung eine alphabetische Kennzeichnung und in horizontaler Richtung eine numerische Kennzeichnung vorgesehen. Die Koordinatenerkennung muss aber nicht notwendigerweise auf dem Rahmen der Mikrotiterplatte angebracht sein, sondern kann auch auf den Streifen selbst aufgebracht werden. Die Koordinatenerkennung kann in einem speziell dafür vorgesehenen Bereich der Streifen bzw. der einzelnen Kavitäten aufgebracht werden. Dieser speziell vorgesehene Bereich kann beispielsweise ein Vorsprung an der Oberkante der Seitenwand einer Kavität sein oder beispielsweise die Vorsprünge für das Einhängen, dh die Aushebelaschen des Streifens, in den Rahmen können als Bereich zur Anbringung der Koordinatenerkennung oder für die Kennzeichnung jeglicher Art verwendet werden.
Zudem kann am Rahmen oder Streifen auch noch eine Kennzeichnung, wie beispielsweise das Logo oder der Name des Herstellers angebracht sein.
Eine automatische und differenzierte Identifizierung der Mikrotiterstreifen und der damit transportierten bzw. enthaltenen Proben lässt sich dadurch realisieren, dass der Rahmen, die Mikrotiterstreifen und/oder Kavitäten mit einer weiteren Kennzeichnung, wie maschinell lesbarer Codierung, insbesondere einem maschinenlesbaren Strichcode bedmckt sind.
N2004/13000 Um eine automatisierte bzw. standardisierte Bearbeitung oder Auswertung der Mikrotiterplatte mit den darin enthaltenen Streifen bzw. Kavitäten zu ermöglichen, werden die Abmessungen für die Mikrotiterplatte gemäss den Empfehlungen der SBS (Society of Biomolecular Screerdng) gewählt.
Sind die Kavitäten zu Einheiten, wie z.B.
Streifen zusammengefasst, so können zwischen den einzelnen Kavitäten Sollbrachstellen vorgesehen sein. Diese Sollbruchstellen ermöglichen eine Trennung der Kavitäten von der Einheit, sodass bei Nichtgebrauch einzelner Kavitäten eines Streifens diese vor Verwendung abgetrennt werden können und somit für weitere Versuche zur Verfügung stehen.
Die Mikrotiterstreifen weisen vorzugsweise auch über den Boden der Kavitäten nach unten überstehende und dabei deren Bodenfläche freihaltende, vorzugsweise zwischen benachbarten Kavitäten verlaufende Querstege auf, die beispielsweise als Stellfüsse ausgebildet sein können, um die Standfahigkeit der Mikrotiterstreifen zu verbessern und die Bodenfläche der Kavitäten gegen Transportbeschädigungen zu schützen, wobei die Lichtdurchtrittsfläche für optische Untersuchungen nicht eingeschränkt wird.
Neben der Ausbildung von Stellfüssen kann als Abstandhalter zur Aufstandsfläche auch eine ringförmige Wulst im Umfang des Bodens der Kavität angeordnet sein. Diese ringförmige Wulst bzw. zumindest partiell ausgebildete ringförmige Wulst erfüllt den gleichen Zweck wie die Stellfüsse.
Bei der Verwendung der Kavitäten in Form von Einheiten, wie z.B. Streifen, können die Streifen im Rahmen sowohl vertikal als auch horizontal eingesetzt werden. Wird der Streifen vertikal eingesetzt, so kann beispielsweise bei Verwendung einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten ein Streifen mit acht Kavitäten in Spalte 1 angeordnet werden und am oberen Rand eine farbige, z.B. rote Markierung aufweisen. Die daneben, d.h. in den Spalten 2 bis 12 angeordneten Streifen mit jeweils acht Kavitäten können am oberen Rand der Seitenwand eine grüne Markierung aufweisen.
Somit ist für den Anwender dieser Mikrotiterplatten eindeutig visuell erkennbar, dass der Streifen in der Spalte 1 für die Verwendung von Kalibrator- bzw. Kontrolllösungen vorgesehen ist und die Streifen in den Spalten 2 bis 12 für die Verwendung von Probenlösungen vorgesehen sind. Beispielsweise kann in den Kavitäten 1 und 2 des ersten Streifens die Negativ- und Positivkontrolle angeordnet sein und in den restlichen sechs Kavitäten die Kalibratoren vorliegen. Zudem kann z. B. an den
N2004/13000 Seitenwänden der Kavitäten noch eine Markierung bzw. Beschriftung angeordnet sein, durch welche eine Identifikation der einzelnen Kavität bzw. deren Inhalt möglich ist, auch falls irrtümlicherweise ein Streifen in einzelne Kavitäten zerlegt wird.
Benötigt ein Anwender nun nicht die komplette Anzahl der Kavitäten für die Proben, so kann die überschüssige Anzahl der Streifen für Proben der Mikrotiterplatte entnommen werden und zur Seite gestellt werden. Beispielsweise sind bei der Bestimmung von 16 Patientenproben lediglich zwei Streifen für die Probenlösung und ein Streifen für die Kontroll- bzw. Kalibratorlösungen zu verwenden. Um die restlichen Streifen dieser Mikrotiterplatte nicht wegwerfen zu müssen, wird für die nächste Analyse ein neuer Streifen für die Kontrolllösung, dh z.B. mit roter Markierung, in den Rahmen der Mikrotiterplatte positioniert und die restlichen noch erforderlichen Streifen werden in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt.
Diese Prozedere kann mehrmals wiederholt werden.
In der alternativen Ausführungsform ist auch vorstellbar, dass die Streifen bzw. die Kavitäten für die Kontrollen an der Oberseite der Seitenwand eine rote Markierung aufweisen und die Streifen bzw. Kavitäten für die unterschiedlichen Patienten eine unterschiedliche Farbe aufweist. So kann beispielsweise auf einer Platte eine Vielzahl von unterschiedlichen Farben verwendet werden, wobei jede Farbe einen Patienten bzw. eine Probe darstellt. Die Verwendung eines definierten Farbstoffes kann auch für einen ausgewählten Analyten stehen.
Durch diese Kennzeichnung ist ein Verwechseln der Kontrollen bzw. der Proben von Patienten beinahe unmöglich, weil ein visuell sehr auffalliges Mittel zur Kennzeichnung zur Verfügung steht.
Bei den erfindungsgemässen Mikrotiterplatten kann das Mittel zur Kennzeichnung bereits bei der Herstellung beigemengt werden oder nach der Herstellung aufgebracht werden. So ist es beispielsweise möglich bei Kennzeichnung mit einem Farbstoff diesen bereits dem Rohstoff, insbesondere Kunststoffgranulat, aus welchem die Mikrotiterplatte hergestellt wird, beizumengen.
Bei einer alternativen Variante kann der Farbstoff auch nach der Herstellung der Mikrotiterplatte auf den oberen Rand zumindest einer Kavität aufgebracht werden.
Der Farbstoff kann auch nur auf die Seitenwand der Kavitäten oder auf die zwischen den Kavitäten vor-
N2004/130ÖÖ liegenden, aber zumindest einer Kavität oder einem Streifen zuordenbaren, Kunststoff brücken aufgebracht werden.
Im erfindungsgemässen Kit ist neben zumindest einer erfindungsgemässen Mikrotiterplatte auch zumindest ein Streifen mehr im Kit enthalten, wie der Rahmen der Mikrotiterplatte in einem Arbeitsschritt gleichzeitig fassen kann.
Mit dem Kit ist eine Identifikation unterschiedlicher Antigene bzw. Antikörper gegen Antigene, insbesondere Autoirnmunantikörper, möglich.
Spezifische Autoimmunantikörper treten oft in Zusammenhang mit definierten Autoimmunerkrankungen, wie z.B. rheumatoider Arthritis, auf.
Eine Auswahl für bestimmte Autoimmunerkrankungen charakteristischer Autoimmunantikörper ist im nachfolgenden aufgelistet, wobei diese teilweise durch deren für einen Fachmann bekannte Abkürzung angeführt sind :
Phospholipid (Cardiolipin), Prothrombin, , Smooth muscle (ASMA), Mitochondria (AMA), cyclic citrallinated peptide (CCP) bzw. anti-Citrullinated Filaggrin, Histon, Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Liver kidney microsome 1 (anti-LKM-1), Thyroglobulin (anti Tg), Thyroid peroxidase (anti TPO), Insulin (anti-Pancreatic islet cells), Glutamic acid decarboxylase (anti-GAD), Saccharomyces cervisiae antibody (ASCA), Intra-epidermal (Desmoglein3,l), Basement membrane zone (BP 180), Myelin basic protein, Alanyl-tRNA-Synthetase, Alpha-Fodrin, AlphaEnolase, Aminoacyl-tRNA-Synthetase, Proteinase 3, Myleoperoxidase, Elastase, Kathepsin G, Azurozidin, Laktoferrin, Lysozym, Bactericidal/Permeability Increasing Protein (BPI), centromere proteins (CENP-E, CENP-F), Centrophilin, dsDNA, Interferon inducible Protein (IFI 16), Histon, La/SS-B, Mi-2, Ro/SS-A, Scleroderma (Scl-70), ssDNA,
small nuclear RNAs wie z.B. Ul-sRNP A, Ul-sRNP C, Ul-sRNP BB', Ul-sRNP 68/70, UlsRNP Dl, Ul-sRNP D2, Ul-sRNP D3, Ul-sRNP E, Ul-sRNP F, Ul-sRNP G, tissue transglutaminase (tTG), Glomerular Basement Membrane (GBM), Beta-2 Glykoprotein I, BiP/p68, Calpastatin, Calretikulin, Clq, p23/p25, Coilin, elongation factor (EF1 A), protein-tyrosine kinase (Fer), Fibrillarin, Golgi-Apparat (AGA), High mobility group (HMG), IgA, IgG, IgE, IgM, Hitzeschock-Proteine, Isoleucin-tRNA-Sythease, Histidyl-tRNASythetase, Actin, Aggrecan, Collagen IV, Collagen VI, Collagen IX, Collagen X, Cytokeratin 8, Cytokeratin 14, Cytokeratin 19, Decorin, Desmin, Elastin, Fibronectin, Gliaprotein,
N2004/13000 Keratin, Laminin, Myosin, Perlecan, Tubulin , Vimentin, Vinculin, Gliaprotein, Neurofilament M, Neurofilament L, Neurofilament H, Myelin, Myelin Basisches Protein (MBP), Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG),
Myelin-Oligodendroglia-Glykoprotein (MOG), Myelin Proteolipid (Proteolipidprotein), Kryoglobuline, L5/5S, L7, L12, Mas, nucleolar organizer region (NOR-90), Nukleolin, PMS1, RNA-Polymerase I, To/Th, Nukleophosmin, Nukleolin, aPE, aPc, aPi, antipigeon antigen antibodies (APSA), PolymyositisSklerodermie- Antigen 100 kDa (PM-Scl-100), rheumatoid arthritis (RA33), Prothrombin, Topoisomerase I, Trimethylguanosin, U2-RNP, U4/U6-RNP, U5-RNP, U7-RNP, Ul 1RNP.
Neben den bereits aufgelisteten Komponenten sind im erfindungsgemässen Kit wahlweise auch ein Waschpuffer, eine Enzymkonjugatlösung, ein Probenverdünnungspuffer und/oder eine Enzymsubstratlösung enthalten.
Der Waschpuffer ist aus 200 mg bis 400 mg NaCl, 20 mg bis 100 mg KH2PO4, 100 mg bis 500 mg Na2HPO4, 20 mg bis 80 mg KCl, 10 mg bis 50 mg Indigocarrnin, 0,05 ml bis 1 ml Tween-20 und 0,
5 mg bis 5 mg Thiomersal auf 1000 ml destilliertem Wasser zusammengesetzt.
Die Enzymkonjugatlösung, insbesondere Meerrettichperoxidase (Horse-Radish-Peroxidase HRP)-Konjugatlösung, ist aus 10 mg bis 50 mg NaCl, 1 mg bis 10 mg KH2PO4, 10 mg bis 50 mg Na HPO4, 2 mg bis 8 mg KCl, 1 mg bis 20 mg Gelborange S, 1 mg bis 500 mg BSA, 10 [mu]l bis 100 [mu]l HRP- Antikörper-Konzentrat und 1 mg bis 10 mg Thiomersal auf 100 ml destilliertem Wasser zusammengesetzt.
Selbstverständlich können alternativ zu HRP auch alkalische Phosphatase oder ssGalactosidase verwendet werden, wobei auch die Enzymsubstratlösung entsprechend angepasst werden muss.
Der Probenverdünnungspuffer ist aus 1 g bis 100 g NaCl, 0,5 g bis 10 g KH2PO , 1 g bis 50 g Na2HPO4, 0,5 g bis 10 g KCl, 1 mg bis 10 mg Tartrazin,
1 g bis 50 g BSA und 1 mg bis 50 mg Thiomersal auf 1000 ml destilliertem Wasser zusammengesetzt.
N2004/13000 Die Enzymsubstratlösung ist aus 0,5 g bis 10 g NaCl, 50 mg bis 600 mg KCl, 10 mg bis 500 mg 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und 100 [mu]l bis 500 [mu]l H2O2(30 %-ig) auf 1000 ml destilliertem Wasser zusammengesetzt.
Wie bereits erwähnt kann der Kit zum Nachweis eines Autoimmunantikörpers verwendet werden, wobei dieser als diagnostischer und/oder prognostischer Marker eingesetzt werden kann oder damit auch eine Verlaufskontrolle durchgeführt werden kann.
Im speziellen kann der Kit zum Nachweis von humanen polyklonalen Autoimmunantikörper der Klasse IgG, IgA, IgM und/oder IgE verwendet werden, wobei diese Autoimmunantikörper eine hinreichende Avidität (d.h. die Gesamtbindungsstärke kann von mehreren Bindungsregionen beeinflusst werden) zu einem der Antigene, welche vorab angeführt wurden, aufweisen.
Im vorliegenden Text sind mit der Bezeichnung Farbstoff auch jene Substanzen umfasst, die unter einer chemischen Reaktion zur Bildung eines Farbstoffes befähigt sind, auch wenn dies nicht an jeder Stelle ausdrücklich angeführt ist.
Wird die Analyse einer Patientenprobe beschrieben so ist im Zusammenhang mit diesem Text beispielsweise auch eine Umweltprobe, wie z.B.
Abwasserprobe oder Oberflächenabstrich, mit umfasst.
Die Ausführungsbeispiele zeigen mögliche Ausführungsvarianten der Mikrotiterplatte und des Kits, wobei an dieser Stelle bemerkt sei, dass die Erfindung nicht auf die speziell dargestellten Ausführungsvarianten derselben eingeschränkt ist, sondern vielmehr auch diverse Kombinationen der einzelnen Ausführungsvarianten untereinander möglich sind und diese Variationsmöglichkeit aufgrund der Lehre zum technischen Handeln durch gegenständliche Erfindung im Können des auf diesem technischen Gebiet tätigen Fachmannes liegt.
Es sind also auch sämtliche denkbaren Ausführungsvarianten, die durch Kombinationen einzelner Details der dargestellten und beschriebenen Ausführungsvariante möglich sind, vom Schutzumfang mitumfasst.
Die den eigenständigen erfinderischen Lösungen zugrundeliegende Aufgabe kann der Beschreibung entnommen werden.
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The invention relates to a microtiter plate having a substantially rectangular frame and strips, wherein the strips are arranged side by side in the frame and include a series of interconnected cavities having a bottom and one or more side walls with an upper and lower edge, the lower edge connected to the ground, a method for producing a microtiter plate, a kit consisting of a microtiter plate with a frame and strips and each of their use.
Microtiter plates have a plurality of column and row arranged, a Rundwabenstmktur forming, very small reaction spaces, also called cavities, in each of the smallest proportions of a liquid sample, eg. B.
a blood sample for the diagnosis of blood-detectable medical parameters or diseases, or a water sample for monitoring water quality, which are then each contacted with different reagents, so as to effect a chemical or biological reaction or the like. cause which of a change in a physically measurable size, eg. B. Coloring or discoloration in the liquid sample is accompanied. This color change as a result of the reaction is usually read out visually or photometrically, which is why microtiter plates consist of a transparent material, in particular a transparent bottom.
Microtiter plates can also be used for titrations by allowing many different concentrations of incorporated liquid samples to react with the same reagent.
On a large scale microtiter plates for carrying out z. B. diagnostic studies, such as immunochemical investigations on microorganisms, such as viruses, bacteria, parasites, etc. , Proteins and nucleic acids used. For the purposes of these studies, each cavity shall be equipped with a specific
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Layering, z. B. a special protein.
After the sample to be tested has been introduced into the container and the container has been washed again after binding, a secondary antibody is added to the container, which together with the protein of the coating and the substance to be detected forms an immune complex and thereby a measurable change, such , B. Color change, which indicates that in the presence of an analyte, a color change is achieved. The investigations are usually carried out automatically by means of machines or Robot running. Institutions using microtiter plates include blood banks, hospitals, laboratories, etc.
In known microtiter plates often strips with eight or twelve rigidly interconnected cavities are arranged in a holder.
Depending on the number of samples to be examined, either the entire holder is filled with coated or uncoated strips. In order to be able to work even more flexibly, microtitre laths have been developed whose cavities can easily be broken off by the strip so that an arbitrary number of cavities can be separated from the rest of the strip.
Thus, the cavities can be transported in smaller units in a reusable frame and made available for processing.
The object of the invention is to provide a microtiter plate with which both the susceptibility to errors can be reduced and the economy of the analysis can be improved.
The object is independently achieved by a microtiter plate, wherein a means for labeling of at least one cavity and / or a strip is arranged, as well as methods for producing the microtiter plate, wherein a dye is added to the required for the production of the microtiter plate raw material, in particular plastic mixture or the dye is after or during the production of the microtiter plate on the cavities or
Strip is applied and a kit, wherein at least one more strip is included in the kit, ^ e the frame can hold. In general, it proves to be advantageous that by the marking a distinction of a strip or a cavity of the remaining cavities and / or strips is made possible and thereby a special function and distinctive character of the at least one gekenn-
N2004 / 13000 marked cavity or the at least one marked strip can be assigned.
In the kit proves to be advantageous that by the arrangement of several marked cavities or Strip in the kit allows repeated use of the frame, wherein in each case the required number of unidentified or differently marked cavities and / or strips and at least one marked strip or Cavity is arranged in the frame.
When reusing the microtiter plate, the marked strip or Cavity replaced and in the not or differently marked, not yet used cavities, the sample is pipetted. As a result, when testing only a few patient samples on the microtiter plate, for example, only the number of cavities that is actually required must be used, and yet all required controls in the labeled cavities or Strips are performed. In a repeated use of the frame with the remaining cavities for other patient samples, the marked strip, such. B. Calibrator strip or replaced the control cavities with new ones.
It is thus a very economical testing of many patient samples with the same frame or with only the actually required patient cavities or Patient stripe possible and still is always a strip or Cavities available that differ from the others, and thus for predeterminable samples such. B. Calibrators, controls, etc. can be used.
The arrangement of horizontal and / or vertical partitions in the interior of the frame and only individual cavities can be arranged. However, this also allows strips or only parts of a strip are accurately positioned in the frame.
In a further development of the microtiter plate proves to be advantageous that the means for labeling a visible dye or
Substances for forming a visible dye is / are, wherein at least one cavity and / or a strip is provided with a dye, whereby the distinction of this cavity or this strip from the other cavities or Strip is facilitated. For example, this can be done in the colored cavities or Strip a control solution, e.g. B. or a positive or negative
N2004 / 13000 Kotrolllösung or calibrator solution are submitted and in the remaining with another dye labeled or unmarked cavities and / or strips are the patient samples or the liquids to be analyzed are pipetted.
The bottom of at least one cavity and / or strip is transparent and the sidewall / walls are formed with at least one dye, whereby nevertheless a measurement of the samples in the colored cavities or
Strip by visual or photometric detection is possible without falsifying the measurement result. A transparent floor also proves to be advantageous because a visual inspection during the operation or during the incubation of the microtiter plate is made possible. As a result, the reaction proceeding in the cavity can be intervened in a suitable manner even after preparation of the reaction mixture.
A non-transparent or Opaque formation between the bottoms of the individual cavities can also prove to be advantageous, because this scattered light, which could corrupt the measurement result during detection can be avoided.
In an alternative embodiment it is provided that the upper edge of the sidewall / walls of at least one cavity and / or strip is formed with a dye, whereby an easily producible, not influencing the analysis tool for visual differentiation is present.
Another possibility for distinguishing is given by the fact that at least one cavity in a side view square, rectangular, conical, in particular frustoconical, or
is tapered (blunt) or hemispherical with respect to one side wall as opposed to the other patient sampling cavities. Advantageously, it turns out that in the normal case cavities in the cross section are rectangular and the different cavities are now used for control or Kalibratorlösungen and thus can be easily distinguished from the cavities with the patient samples.
In an alternative embodiment, at least one cavity in plan view round, oval, square, such as square, rectangular or in the form of a parallelogram, hexagonal, octogonal or in a special form, such as the form of a minus or plus sign may be formed, which again makes a distinction possible and thereby
N2004 / 13000 [phi] Danger of change between a cavity with a control or
Calibrator solution and a cavity with a patient sample can be reduced to a minimum.
A further feature for distinguishing may be that at least one side wall of at least one cavity and / or strip is designed to be longer or shorter in dimension, such as the side walls of the remaining cavities or Stripes and like the frame and thus already visually or haptic (tactile sense) is recognizable which cavities or Strip for control or Calibrator solutions and which cavities or Strips are to be used for patient samples.
It also proves advantageous if the cavity or the strip with the means for marking forms a unit, whereby in a repeated use of the frame with only a portion of those strips which are provided for the samples to be analyzed, the cavities or
Strip can be easily replaced with the means for labeling and thus the frame can be used with the remaining strips for patient samples again.
It also proves advantageous if 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 or 3456 cavities are arranged, whereby a standardized number of cavities are used in standardized frames and thus evaluated in each automated laboratory analyzer or can be operated with any fully automated pipetting robot. It also proves advantageous that many different patient samples or Biomacromolecules can be analyzed simultaneously.
Furthermore, it proves to be advantageous that the cavities in the strip or Frame are arranged in a uniform grid, again a fully automated handling of the microtiter plate is made possible.
As a result of the arrangement of the cavities of the same type, the same type of microtiter plate is automatically carried out relative to the same reference points of the cavities on different cavities in an advantageous manner always carrying out the same movements to be performed parallel to an elevation plane.
At least one side wall of the cavity can be arranged conical, concave, convex or cylindrical, which in turn makes it possible to differentiate the cavities
N2004 / 130Ö0 the control or Calibrator solutions of the remaining cavities, in particular with the patient samples, is made possible. In addition, the volume in the cavities can be changed and yet, for example, the growth of cell cultures is made possible by the usual diameter of the bottom of the cavity.
This development also proves to be advantageous in that by a standardized arrangement of the conical, concave, convex or cylindrical cavities a very space-economical design of the microtiter plate is achieved.
The bottom of the cavities may be formed as U-bottom, V-bottom or F-bottom, whereby, depending on the analyte to be determined or method used is a microtiter plate with appropriate Kavitätenform available.
It is also advantageous that the cavities have a capacity selected from a range with a lower limit of 1 μl, preferably 50 μl, in particular 100 μl, and an upper limit of 30 ml, preferably 10 ml , in particular 5 ml, whereby the volume in the wells of the microtiter plate again to the respective needs or
can be adapted to the particular sample to be analyzed. By using the small volumes, a very cost-effective analysis is made possible.
The inner surface of the cavities for binding biomacromolecules may be surface-treated, in particular chemically modified, whereby specific binding of a molecule to be detected, the analyte to be detected from a sample can be achieved.
The cavities, strips or
the frame may be made of a material selected from a group comprising polypropylene, polystyrene, acrylbutadiene styrene, polyamide, polycarbonate, polyester, polymethyl methacrylate, polysulfone, cycloolefin (co) polymer, polymethylpentene (TPX (R)), styrene-maleic anhydride copolymer and / or styrene acrylonitrile and or a mixture thereof, whereby, depending on the use of the microtiter plate an efficient surface treatment or Coating the plate can be performed without destroying the surface. The advantage here is a training with different materials because these are partially resistant to organic solvents such. B. Acetone, benzene, acetonitrile, dioxane, 2,2,2-trifluoroethanol.
Furthermore, they are mixed with various commonly used salts, buffers and polymers,
N2004 / 130Ö0 which are used for different reactions, compatible. Polypropylene and cycloolefin copolymers are also less permeable to water vapor and therefore less sensitive to evaporation than, for example, polystyrene containers.
In an alternative embodiment, it is possible that the frames and / or the cavities and / or strips are formed from different materials, whereby different requirements, such as are imposed, for example, on a frame as opposed to a cavity, can be met.
For example, the frame must have a high stability against twisting, whereas against the cavity must provide a surface for optimum coating or must meet the requirements of organic solvents and their rigidity is of minor importance.
A coordinate detection for the arrangement of the cavities and / or strips on the frame proves to be advantageous because thereby the position of a cavity or of a strip can be determined exactly.
By an appropriate marking of the microtiter plate, an internal control system and orientation system for automated processing can be introduced.
The dimensions of the frame and the cavities according to the recommendations of the SBS (Society of Biomolecule Screerdng), among other things, allow an optimal amount of a volume of a specific reagent in the respective cavity to be presented according to the needs of the analysis.
The frame can be used to position the strips a device such. B. a projection or projection, whereby a simple removal and reinsertion of a strip or a cavity is allowed to the same position in the frame. As a result, a correct assignment of the strips in the respective region of the frame can be made possible even with automated handling of the microtiter plate.
It also proves advantageous that a positioning in a predefined position is made possible and thus the reproducibility of the experiment is simplified or the handling of the frame and the strips is simplified.
N2004 / 13000 By placing a predetermined breaking point on the strip, the advantage over known microtiter plates with unbreakable strips is that only so many coated containers are arranged in a frame, which are necessary for carrying out the examination. This has the advantage that if only a single sample is to be examined, a strip can be broken and only a portion of the strip must be used for the study. The other part of the strip can be stored for later examination.
In particular, in locations where examinations must be carried out at very short notice and it is not possible to wait until the entire strip is filled with samples, a predetermined breaking point of the strip can allow substantial savings, since only the necessary number of coated cavities is used. In a large number of investigations, this is of great economic importance.
By attaching an additional marking on the strip and / or frame or in a range thereof, a confusion is impossible.
If at least one further strip has a marking means, it is advantageous that it can be differentiated from the remaining strips containing the patient samples.
When attaching the strips and the cavities vertically or horizontally in the frame according to the geometry of the microtiter plate, it is possible that in each case a strip which comprises, for example, the cavities for control or Kalibratorlösungen is completely replaced.
In the kit proves to be advantageous that at least one further strip is included, whereby a repeated use of the frame is made possible with the remaining, not yet used strips for patient samples, with each use a complete number of cavities of the control or
Calibrator strip are available.
By the identification of an antibody against an antigen from a group comprising phospholipid (cardiolipin), prothrombin, smooth muscle (ASMA), mitochondria (AMA), CCP or anti-citrullinated filaggrin, histone, PCNA, liver kidney microsome 1 (anti-LKM-1), thyroglobulin (anti-Tg), thyroid peroxidase (anti-TPO), insulin (anti-pancreatic
N2004 / 13000 islet cells), glutamic acid decarboxylase (anti-GAD), Saccharomyces cerevisiae antibody (ASCA), intra-epidermal (desmoglein 3, I), basement membrane zone (BP 180), myelin basic protein, alanyl tRNA synthetase, Alpha-fodrine, alpha-enolase, aminoacyl-tRNAS synthetase, proteinase 3, Myleoperoxidase, elastase, cathepsin G, Azurozidine, lactoferrin, lysozyme, BPI, CENP-E, CENP-F, Centrophilin, dsDNA, IFI 16, histone, La / SS -B, Mi2, Ro / SS-A, Scl-70, ssDNA, Ul-sRNP A, Ul-sRNP C, Ul-sRNP BB ', Ul-sRNP 68/70,
Ul-sRNP D1, Ul-sRNP D2, Ul-sRNP D3, Ul-sRNP E, Ul-sRNP F, Ul-sRNP G, tTG, GBM, Beta-2 Glycoprotein I, BiP / [rho] 68, Calpastatin, Calretikulin , Clq, p23 / [rho] 25, Coilin, EF1A, Fer, Fibrillarin, Golgi Apparatus (AGA), HMG, IgA, IgG, IgM, Heat Shock Proteins, Isoleucine tRNA Sythease, Histidyl-tRNA Sythease, Actin, Aggrecan, Collagen IV, Collagen VI, Collagen IX, Collagen X, Cytokeratin 8, Cytokeratin 14, Cytokeratin 19, Decorin, Desmin, Elastin, Fibronectin, Gliaprotein, Keratin, Laminin, Myosin, Perlecan, Tubulin, Vimentin, Vinculin, Gliaprotein, Neurofilament M, Neurofilament L, Neurofilament H, Myelin, Myelin Basic Protein (MBP), Myelin-associated Glycoprotein (MAG), Myelin Oligodendroglia Glycoprotein (MOG), Myelin Proteolipid (Proteolipid Protein), Cryoglobulins, L5 / 5S, L7, L12, Mas, NOR-90, nucleolin, PMS1, RNAPolymerase I, To / Th, nucleophosmin, nucleolin, aPE, aPc, aPi,
APSA, PM-Scl-100, RA33, prothrombin, topoisomerase I, trimethylguanosine, U2-RNP, U4 / U6-RNP, U5RNP, U7-RNP, U1-RNP is used to detect and, where appropriate, screen diagnostic or prognostic markers or markers , a follow-up check for autoimmune diseases allows, if necessary, the course of therapy controlled or timely with appropriate therapy long-term damage can be prevented.
It is also advantageous that the use of the kit makes it possible to analyze a sample, wherein at least a part of a strip is provided with a marking means and can therefore be used to differentiate with the other part of the strip or with further strips becomes.
In a development of the kit it is provided that at least one washing buffer comprising NaCl, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, KCl, indigo carmine,
Tween-20 (R) and thiomersal or sodium azide, an enzyme conjugate solution, especially horseradish peroxidase (Horse Radish Peroxidase HRP) conjugate solution comprising NaCl, KH 2 PO, Na 2 HPO 4, KCl, Yellow Orange S, bovine serum albumin (BSA), HRP antibody concentrate and thiomersal or Natriu-
N2004 / 13000 mazid, or as an enzyme also alkaline phosphatase or ss-galactosidase, a sample dilution buffer comprising NaCl, KH2PO, Na2HPO4, KCl, tartrazine, bovine serum albumin (BSA) and thiomersal or sodium azide and an enzyme substrate solution comprising NaCl, KCl, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine and H2O2, whereby the components required for the analysis are already included in the kit and therefore neither have to be prepared nor bought in, which means that external sources of error can be ruled out.
In addition, the components of the kit are coordinated as a system and this can be used as an in-vitro diagnostic. If enzyme conjugate solutions with alkaline phosphatase or ss-galactosidase are used, the enzyme substrate solution is also adjusted according to methods known from the prior art.
By way of introduction, it should be noted that in the various embodiments described the same parts are given the same designations, wherein the disclosures contained in the entire description can be transferred analogously to the same parts with the same designations. Also, the location selected in the description, such as. B. top, bottom, side, etc. refer to the examples described immediately and are to be transferred analogously to the new situation in the event of a change of position.
Furthermore, individual features or combinations of features from the illustrated and described different embodiments may also represent separate, inventive or inventive solutions.
All information on ranges of values in objective description should be understood to include any and all portions thereof, e.g. B. the indication 1 to 10 is to be understood as meaning that all subregions are included, starting from the lower limit 1 and the upper limit 10, d. H. all sub-ranges start with a lower limit of 1 or greater and end at an upper limit of 10 or less, e.g. B. 1 to 1.7, or 3.2 to 8.1 or 5.5 to 10.
The present invention relates to a microtiter plate, which consists of a frame and arranged therein strip or
Cavities exists.
The frame may be square or rectangular in outline and is bounded by two pairs of opposite support and connecting leg.
N2004 / 13000 The cavities can be arranged individually, wherein in this embodiment, webs are arranged in each case between two opposite legs in order to hold the cavities.
When arranging the cavities in strips, the arrangement of the webs in the form of a uniform grid in the frame is not absolutely necessary. The webs can still be arranged to increase the stability of the frame.
In the case of the microtiter plate according to the invention, at least one cavity differs from the remaining cavities which are arranged on the same microtiter plate by a means for identification.
If the cavities are combined into strips, that is to say in units, at least one strip can also differ from the remaining strips of the same microtiter plate.
In an alternative embodiment, it is also possible that the cavities are partially combined individually and partially into strips, which in turn individual cavities or Strip from the other cavities or Distinguish stripes. If we speak of strips in this context, a strip consists of at least two cavities.
For a microtiter plate with 96 wells, a strip, if arranged vertically, consists of a maximum of 8 wells and, if the strip is arranged horizontally, a maximum of 12 wells.
As a means for labeling a certain geometry of a cavity or a strip or other visual means, such. B. a dye, serve.
Is a dye or substances used to form a visible dye as a means of labeling, so different parts of the strip or dyed the cavity. In one embodiment, it is conceivable that the entire strip or the entire cavity is formed in color, for example by the plastic from which the strip or the cavity consists, a dye is added.
For complete coloring of the strip or a cavity, however, the surface can also be provided with a dye. Suitable dyes are all commercially available substances in question.
N2004 / 13000 In alternative embodiments, however, only a part of the cavity or a strip be colored. For example, only the side wall of a cavity may be colored or coated with a paint. If the bottom of a cavity is formed with a dye, the photometric determination must be carried out through the transparent side wall so as not to falsify the measurement result.
Preferably, however, the side walls or at least parts of the side walls of a cavity are colored and the bottom is transparent so that light can penetrate the soil during a photometric evaluation of the microtiter plate.
Not only two different dyes can be used as a means of labeling on a microtiter plate, but many different dyes can be used so that, for example, the positive control and the negative control each have a specific dye and the patient samples or each patient sample again has a specific color.
The calibrator strips can also have a dye which is characteristic of them.
In a further alternative embodiment, in each case only the upper edge of the sidewall / walls of at least one cavity and / or strip can be produced with a dye.
If the distinction is due to the geometry of the cavity or hit the strip, so a marked cavity in side view z. B.
square, conical, in particular frusto-conical, or be formed hemispherical.
Alternative means for geometrical differentiation result, for example, from the fact that the cavity to be differentiated, in contrast to the other cavities that are round in plan view, is oval, quadrangular or square, rectangular or in the form of a parallelogram, hexagonal, octagonal, or in a special form, as in FIG Form of a minus or plus sign is formed.
In addition to the geometric shape, a cavity or a strip may also be due to the different dimensions, for example, the side wall of the cavity or the diameter of the opening or of the bottom of the cavity.
For example, the side walls of the cavities may be made longer with the control solutions,
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13or the diameter of the cavities should be greater than that of the cavities with the patient samples.
An alternative labeling can be achieved by surface structures on the top of the cavities or Strips are formed, such. B. through elevations and depressions according to the formation of wave crests and valleys.
As a further alternative means for distinguishing, the sidewall of at least one cavity and / or strip may also be dimensioned to be longer or shorter than the sidewall of other cavities, strips and / or the frame.
The side walls of the cavities with the control solutions may be conical, concave, convex or cylindrical.
If a cavity has more than one side wall, then this or a part of the side wall may also be arranged conically, where formed against the other side walls or the other part of the side wall is cylindrical or is. By virtue of this design, in addition to distinguishing, for example, easier tipping off of liquid, in particular washing liquid, can be achieved when turning the microtiter plate, or an increase in volume can be achieved while the bottom surface remains the same.
But the shape of the bottom of the cavity can also be a means of identification. For example, the bottom may be a U-bottom describing a round bottom shape, a V-bottom describing a tapered bottom, or an F-bottom representing a flat bottom and / or a half-bottom half-diameter.
As a rule, the cavities or
Strip with the same label one unit.
In the frame strips can each be used with a different number of cavities, wherein the total number of cavities on the microtiter plate 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 or 3456 cavities can be. The cavities are preferably arranged in a uniform grid in order to be able to carry out automated handling.
N20Q4 / 13000 Depending on the number of wells on the microtiter plate, the capacity is between 1 [mu] l and 30 ml. If the microtiter plates are used, for example, for cell cultivation, a microtiter plate with a smaller number of cavities and thus with a larger capacity is usually used.
For high throughput screening, microtiter plates with a very large number of wells are used, which means that a large number of samples can be screened and thus the consumption of chemicals or of samples that are possibly only available in limited quantities is minimized. These cavities thus hold a smaller volume.
The microtiter strips may have stimulus-protruding Aushebelschen that protrude horizontally with its free end over the top edge of the frame.
Thus, the microtiter strips can easily aufiiehmen by machine and possibly also handle manually.
For transporting the microtiter strips and / or for exact positioning of the cavities in an analyzer, the microtiter strips arranged on their side edges or the Aushebelasche, the cavities in a defined position relationships individually associated transport and / or Zentrierausnehmungen or Positioning devices have.
In a further development, labeling fields can be arranged on the side walls of the cavities, which permit an exact determination of the cavities and their contents even in the case of unwanted separation of a strip.
Both on the outside and on the inside of the frame position means for releasably connecting the strips may be arranged with the frame.
The arrangement of the position means on the inside of the frame, the strips can assemble test-specific in a frame and separate. If necessary, the strips can also be processed in parallel at several measuring stations. Furthermore, it is possible to equip the frame with a variable number of strips depending on the task and still achieve an accurate positioning of the strips. It can be ensured by appropriate dimensioning of the frame and the strips and compatibility with conventional strips. Positionseinrichtun-
N2004 / 13000 conditions thus enable a reliable securing of the strips in the frame and at the same time a simple separation.
Strips contaminated with sample material can be disposed of individually.
The positioning means may also be arranged on the outside of the side walls of the frame in the form of projections or extensions, which may for example be a positioning of the frame in an automated pipetting system or Allow analysis device. Such positioning devices can also be arranged on the top or bottom of the frame.
If the frame is equipped with webs as described above, it also proves to be advantageous that position devices are arranged on the separating webs. The position devices can be designed in the form of projections.
These projections cause a clamping position of the strips or the individual cavities.
If the frame is formed without webs, the protrusions are preferably shaped according to the shape, in particular corresponding to the outer circumference of the cavities. The projections can thus be shaped to be complementary to the shape of the cavity to be held. For example, in cylindrically shaped cavities of the projection in the form of a sickle or be formed of a semicircle.
In order to hold the strips safely and accurately in the frame and at the same time to enable their removal, it is also possible to arrange in the frame protruding position devices which engage in complementary recesses of the strips.
The positioning devices on the outside of the frame also increase the grip safety during manual handling.
The legs of the frame may have on their outer sides facing away from a lower edge level, which forms a contact surface for the transport frame cross-lid or handle again increases the grip safety with manual handling.
In order to detect certain biomacromolecules, the inside of the cavities can be surface-treated. Various surface treatments, both by chemical modifications and by adsorption of biological molecules are known from the prior art.
N2004 / 13Ö00 The frame of the microtiter plate or the individual cavities or strips can be made of different materials, in particular different plastics. It can also be the frame made of a different plastic like the strips or the cavities exist.
Also, the cavities do not necessarily have to be all made of the same material. The materials used are polypropylene, polystyrene, acrylated butadiene styrene, polyamide, polycarbonate, polyester, polymethyl methacrylate, polysulfone, cycloolefin (co) polymer, polymethylpentene (TPX (R)), styrene
Maleic anhydride copolymer and / or styrene acrylonitrile and / or a mixture thereof, in question. In this case, a translucent material is preferably used to perform optical investigations.
In addition to the means of labeling, a coordinate recognition for the arrangement of the cavities and / or the strips may be arranged on the frame of the microtiter plate, in order to allow a better orientation on the microtiter plate. As already described above, labeling fields can also be arranged.
Preferably, an alphabetic identifier is provided in the vertical direction and a numerical identifier in the horizontal direction. However, the coordinate recognition does not necessarily have to be mounted on the frame of the microtiter plate, but can also be applied to the strip itself. The coordinate detection can in a specially designated area of the strip or the individual cavities are applied. This specially provided area may, for example, be a projection on the upper edge of the sidewall of a cavity, or, for example, the protrusions for hooking, ie, the stripping tabs of the strip, into the frame may be used as an area for attaching the coordinate detection or for marking any kind.
In addition, on the frame or strip also a label, such as the logo or the name of the manufacturer may be appropriate.
An automatic and differentiated identification of the microtiter strips and the transported or The samples contained can be realized by suspending the frame, the microtiter strips and / or cavities with a further marking, such as machine-readable coding, in particular a machine-readable barcode.
N2004 / 13000 To have an automated or standardized processing or evaluation of the microtiter plate with the strips contained therein or To allow cavities, the dimensions for the microtiter plate are selected according to the recommendations of the SBS (Society of Biomolecular Screerdng).
Are the cavities to units, such as. B.
Strips summarized, so Sollbrrachstellen can be provided between the individual cavities. These predetermined breaking points allow a separation of the cavities of the unit, so that when not using individual cavities of a strip these can be separated before use and thus are available for further experiments.
The microtiter strips preferably also have over the bottom of the cavities downwardly projecting and thereby the bottom surface free, preferably between adjacent cavities extending transverse webs, which may be formed, for example, as adjustable feet to improve the stability of the microtiter strips and the bottom surface of the cavities against transport damage protect the light passage surface for optical examinations is not limited.
In addition to the formation of adjustable feet can be arranged as a spacer to the footprint and an annular bead in the periphery of the bottom of the cavity. This annular bead or at least partially formed annular bead fulfills the same purpose as the feet.
When using the cavities in the form of units, such. B. Strip, the strips can be used in the frame both vertically and horizontally. If the strip is used vertically, for example, when using a microtiter plate with 96 wells, a strip with eight wells in column 1 can be arranged and at the top of a colored, z. B. have red marking. The next, d. H. arranged in columns 2 to 12 strips with eight cavities may have a green mark at the top of the side wall.
Thus, it is clearly visually recognizable to the user of these microtiter plates that the strip in column 1 indicates the use of calibrator or Control solutions is provided and the strips are provided in columns 2 to 12 for the use of sample solutions. For example, the negative and positive controls can be arranged in the cavities 1 and 2 of the first strip and the calibrators can be present in the remaining six cavities. In addition, z. B. to the
N2004 / 13000 sidewalls of the cavities one more mark or Label be arranged through which an identification of the individual cavity or their content is possible, even if a strip is mistakenly broken down into individual cavities.
If a user does not need the complete number of cavities for the samples, the surplus number of strips for samples of the microtiter plate can be removed and set aside. For example, in the determination of 16 patient samples, only two strips for the sample solution and one strip for the control or Calibrator solutions to use. In order not to throw away the remaining strips of this microtiter plate, for the next analysis, a new strip for the control solution, ie z. B. with red marking, positioned in the frame of the microtiter plate and the remaining strips still required are inserted into the frame of the microtiter plate.
This procedure can be repeated several times.
In the alternative embodiment, it is also conceivable that the strips or the cavities for the controls at the top of the side wall have a red marking and the strips or Cavities for the different patients has a different color. For example, on a plate a variety of different colors can be used, each color a patient or represents a sample. The use of a defined dye may also be for a selected analyte.
This marking is a confusion of controls or Patients' samples are almost impossible because there is a visually very prominent means of identification.
In the case of the microtiter plates according to the invention, the means for labeling can already be incorporated during the preparation or applied after the preparation. Thus, it is possible, for example, when labeling with a dye this already the raw material, in particular plastic granules from which the microtiter plate is made to mix.
In an alternative variant, the dye can also be applied after the production of the microtiter plate on the upper edge of at least one cavity.
The dye can also be applied only to the sidewall of the cavities or to the cavities between the cavities.
N2004 / 130ÖÖ lying, but at least one cavity or a strip assignable, plastic bridges are applied.
In the kit according to the invention, in addition to at least one microtiter plate according to the invention, at least one more strip is also included in the kit, as the frame of the microtiter plate can simultaneously hold in one working step.
The kit is an identification of different antigens or Antibodies against antigens, in particular autoimmune antibodies, possible.
Specific autoimmune antibodies often occur in association with defined autoimmune diseases such. B. rheumatoid arthritis, on.
A selection for certain autoimmune diseases of characteristic autoimmune antibodies is listed below, some of which are given by their abbreviation known to a person skilled in the art:
Phospholipid (cardiolipin), prothrombin, smooth muscle (ASMA), mitochondria (AMA), cyclic citrallinated peptide (CCP) anti-citrullinated filaggrin, histone, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), liver kidney microsome 1 (anti-LKM-1), thyroglobulin (anti-Tg), thyroid peroxidase (anti-TPO), insulin (anti-pancreatic islet cells), glutamic acid decarboxylase (anti-GAD), Saccharomyces cerevisiae antibody (ASCA), intra-epidermal (desmoglein 3, I), basement membrane zone (BP 180), myelin basic protein, alanyl tRNA synthetase, alpha-fodrin, alpha enolase, aminoacyl tRNA Synthetase, Proteinase 3, Myleoperoxidase, Elastase, Cathepsin G, Azurozidine, Lactoferrin, Lysozyme, Bactericidal / Permeability Increasing Protein (BPI), centromere proteins (CENP-E, CENP-F), Centrophilin, dsDNA, Interferon Inducible Protein (IFI 16), histone, La / SS-B, Mi-2, Ro / SS-A, scleroderma (Scl-70), ssDNA,
small nuclear RNAs such. B. Ul-sRNP A, Ul-sRNP C, Ul-sRNP BB ', Ul-sRNP 68/70, UlsRNP D1, Ul-sRNP D2, Ul-sRNP D3, Ul-sRNP E, Ul-sRNP F, Ul-sRNP G Tissue transglutaminase (tTG), Glomerular Basement Membrane (GBM), Beta-2 Glycoprotein I, BiP / p68, Calpastatin, Calretikulin, Clq, p23 / p25, Coilin, elongation factor (EF1A), protein tyrosine kinase (Fer) , Fibrillarin, Golgi apparatus (AGA), high mobility group (HMG), IgA, IgG, IgE, IgM, heat shock proteins, isoleucine tRNA-sythease, histidyl-tRNASythetase, actin, aggrecan, collagen IV, collagen VI, collagen IX, collagen X, cytokeratin 8, cytokeratin 14, cytokeratin 19, decorin, desmin, elastin, fibronectin, gliaprotein,
N2004 / 13000 Keratin, Laminin, Myosin, Perlecan, Tubulin, Vimentin, Vinculin, Gliaprotein, Neurofilament M, Neurofilament L, Neurofilament H, Myelin, Myelin Basic Protein (MBP), Myelin-associated Glycoprotein (MAG),
Myelin oligodendroglia glycoprotein (MOG), myelin proteolipid (proteolipid protein), cryoglobulins, L5 / 5S, L7, L12, Mas, nucleolar organizer region (NOR-90), nucleolin, PMS1, RNA polymerase I, To / Th, nucleophosmin , Nucleolin, aPE, aPc, aPi, antipeiotic antigen antibodies (APSA), polymyositis scleroderma antigen 100 kDa (PM-Scl-100), rheumatoid arthritis (RA33), prothrombin, topoisomerase I, trimethylguanosine, U2-RNP, U4 / U6- RNP, U5-RNP, U7-RNP, Ul1RNP.
In addition to the components already listed, the kit according to the invention optionally also contains a washing buffer, an enzyme conjugate solution, a sample dilution buffer and / or an enzyme substrate solution.
The washing buffer is from 200 mg to 400 mg NaCl, 20 mg to 100 mg KH2PO4, 100 mg to 500 mg Na2HPO4, 20 mg to 80 mg KCl, 10 mg to 50 mg indigocarrnine, 0.05 ml to 1 ml Tween-20 and 0
5 mg to 5 mg thiomersal to 1000 ml of distilled water.
The enzyme conjugate solution, in particular horseradish peroxidase (Horse Radish Peroxidase HRP) conjugate solution, is from 10 mg to 50 mg NaCl, 1 mg to 10 mg KH2PO4, 10 mg to 50 mg NaHPO4, 2 mg to 8 mg KCl, 1 mg to 20 mg of yellow orange S, 1 mg to 500 mg BSA, 10 μl to 100 μl HRP antibody concentrate and 1 mg to 10 mg thiomersal are combined to 100 ml distilled water.
Of course, as an alternative to HRP alkaline phosphatase or ssGalactosidase can be used, and the enzyme substrate solution must be adjusted accordingly.
The sample dilution buffer is from 1 g to 100 g NaCl, 0.5 g to 10 g KH 2 PO, 1 g to 50 g Na 2 HPO 4, 0.5 g to 10 g KCl, 1 mg to 10 mg tartrazine,
1 g to 50 g BSA and 1 mg to 50 mg thiomersal to 1000 ml of distilled water.
N2004 / 13000 The enzyme substrate solution is from 0.5 g to 10 g NaCl, 50 mg to 600 mg KCl, 10 mg to 500 mg 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine and 100 μl to 500 μl l H2O2 (30%) to 1000 ml of distilled water.
As already mentioned, the kit can be used to detect an autoimmune antibody, it being possible to use it as a diagnostic and / or prognostic marker, or to allow follow-up monitoring to be carried out.
In particular, the kit can be used to detect human polyclonal autoimmune antibodies of class IgG, IgA, IgM and / or IgE, which autoimmune antibodies have adequate avidity (i.e. H. the total binding strength may be affected by multiple binding regions) to one of the antigens listed above.
In the present text, the term dye also includes those substances which are capable of forming a dye under a chemical reaction, even if this is not expressly stated at each point.
If the analysis of a patient sample described so in the context of this text, for example, an environmental sample, such. B.
Wastewater sample or surface smear, comprising.
The embodiments show possible embodiments of the microtiter plate and the kit, it being noted at this point that the invention is not limited to the specifically illustrated embodiments thereof, but rather various combinations of the individual embodiments are possible with each other and this variation possibility due to the teaching of technical Acting by objective invention in the skill of those working in this technical field is the expert.
There are therefore also all possible embodiments, which are possible by combinations of individual details of the illustrated and described embodiment, the scope of protection.
The task underlying the independent inventive solutions can be taken from the description.
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