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Die Erfindung betrifft die Verwendung von CD222 oder eines abgeleiteten Peptids zur Hemmung von Fibrinolyse, Zelladhäsion und Zellmigration in vitro, sowie das Peptid selbst. Sie bezieht sich auf den molekularen Mechanismus, wie die Funktionen des UrokinasetypPlasminogen-Aktivator-Rezeptors (uPA-R, CD87) kontrolliert werden.
Die nachfolgend verwendeten Abkürzungen sind wie folgt: GPI, Glycosylphosphatidylinositol; IGF2, Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 2; M6-P, Mannose-6-Phosphat; M6P/IGF2-R, Manno- se-6-Phosphat/Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 2 Rezeptor; PAI-1, Plasminogen-Aktivator Inhibitor Typ 1; PBMCs, Periphere mononukleäre Blutzellen; pepA, Peptid A; pepB, Peptid B; pepBscr, permutiertes Peptid B; pepC, Peptid C; Plg, Plasminogen; TA, Tranexaminsäure ; uPA,Urokinasetyp-Plasminogen-Aktivator; uPA-R, Urokinasetyp-Plasminogen-Aktivator-Rezeptor.
Reagenzien - Peptid B (pepB, AVDTKNNVLYKINIAGSV), die permutierte Version von PepB (pepBscr, DILVNGAKVATKIVNYNS) und Peptid C (pepC, HDLKTRTYHSVGDSVLRS) wurden von Genosphere Biotechnologies (Paris, Frankreich), Peptid A (pepA, QYLFSWYT) von Pichem (Graz, Österreich) hergestellt. Vitronectin, pro-uPA, uPA, Glu-Plg und PAI-1, alle menschlichen Ursprungs, sind Produkte der Fa. Technoclone (Wien, Österreich). Menschliches Fibronectin, Collagen-1 von Ratte und Mauslaminin sind Produkte der Fa. Upstate (Lake Placid, NY). Kristallviolett, Polybrene, Triton X-100 and Tranexaminsäure (TA) stammen von der Fa. Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Das Plasminsubstrat S-2251 wurde von Chromogenix (Mailand, Italien) hergestellt. BSA ist ein Produkt von Behring (Marburg, Deutschland).
Zellkulturen - Die CD222-negativen Mausfibroblasten wurde von Dr. E. Wagner (1) zur Verfügung gestellt und in RPMI-1640-Medium mit Penizillin, Streptomycin, Glutamin und 10% FKS kultiviert. Die ecotrope Verpackungszellinie Phoenix wurde von Dr. G.P. Nolan (2) zur Verfügung gestellt und wurde in DMEM-Medium unter Standardkonditionen kultiviert. Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus dem Blut gesunder Individuen mittels Ficoll Hypaque Dichtegradienten isoliert. Daraus wurden Monozyten durch einstündiges Inkubieren an einer Plastikoberfläche gewonnen.
Generation von stabil-transduzierten Zellen - Das 8-kb Fragment der vollständigen menschlichen CD222 cDNA und das 1. 4-kb Fragment der vollständigen menschlichen CD87 cDNA wurden in den retroviralen Vektor BMN-Z (3) kloniert. Alle Transfektions- und Transduktionsprozesse wurden bereits früher beschrieben (2,4). Die retroviralen Plasmide wurden transient mittels der Superfect Transfektionsmethode (Qiagen, Deutschland) in die ecotrope Verpackungzellinie Phoenix tranfiziert. 3 Tage nach der Transfektion wurden die Überstandenthaltenden viralen Partikel mit Polybrene (4 g/ml) vermischt und die Mischungen wurden benutzt, um Mausfibroblasten von CD222 defizienten Embryos (-/-) zu infizieren.
Plasminogen-Aktivierungstest - Die zuvor beschriebene Methode (5) wurde leicht verändert. Nach Trypsinisierung wurden Mausfibroblasten in eine 96-Näpfchen-Platte (Nunc. Dänemark) in einer Dichte von 2x103 Zellen/Näpfchen eingebracht und anschliessend in RPMI-1640 Medium, das 10% FKS enthielt, bis zur Subkonfluenz gezüchtet. Monozyten wurden von menschlichem PBMCs durch 1-stündige Adhäsion separiert und dann in eine 96-Näpfchen Platte (1x106/Näpfchen) übertragen. Die Zellen wurden mit serumfreiem Medium gewaschen und mit 3 nM Pro-uPA bei 37 C für 20 min inkubiert. Nach 2-maligem Waschen wurde Plg (50 nM) und das chromogene Plasminsubstrat S-2251 (0. 8 mM) hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 37 C inkubiert und nach verschiedenen Zeitintervallen wurde die Absorption bei 405 nm mittels eines ELISA Lesegerätes bestimmt (Anthos Labtec Instr., Salzburg, Österreich).
Adhäsionsuntersuchung - Die Versuchszellen wurden in serumfreien Medium gewaschen und resuspendiert. Eine 96-Näpfchen-Platte (Nunc) wurde mit verschiedenen Matrixproteinen in RPMI-1640 Medium für 2 Stunden bei 37 C beschichtet. Die freien Bindungsstellen der Näpfchen wurden mittels einer 1%igen BSA Lösung geblockt. Anschliessend wurde gewaschen und dann entweder mit Mausfibroblasten (1#104/Näpfchen) oder mit menschlichem PBMCs
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(1x106/Näpfchen) in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 nM uPA inkubiert. Nach einer 10minütigen Inkubation bei 37 C wurden die Näpfchen durch Eintauchen in eine mit RPMI-1640 Medium gefüllte Plastikschale vorsichtig gewaschen. Adhärente Zellen wurden mit Methanol fixiert und mit Crystalviolet gefärbt.
Nach dem Waschverfahren wurden die Zellen in 0.5% Triton X-100 solubilisiert und die Anzahl der Zellen wurde durch Messung der Absorption bei 595 nm mittels eines ELISA Lesegerätes bestimmt.
Chemotaxisuntersuchung - Chemotaxisanalysen wurden in einer 24-Näpfchen-Platte durchgeführt, wobei Gewebekultur-Polycarbonatfiltereinsätze (10 mm Durchmesser, 8 um Porengrösse, Nunc), beschichtet mit Vitronectin (10 g/ml und blockiert mit BSA, verwendet wurden. Mausfibroblasten (5x104) oder menschliche PBMCs (1x106) wurden für die Adhäsionsuntersuchung vorbereitet, in 300 l serumfreien Medium resuspendiert und in die obere Kammer des Einsatzes gefüllt. 10 nM uPA in 300 l serumfreiem Medium wurde in die untere Kammer hinzugefügt.
Nach 4 Stunden Inkubation bei 37 C wurden die Filter entfernt, die Oberseite der Filter von Zellen gereinigt und die Anzahl der Zellen, die auf die Unterseite migriert waren mittels Crystalviolet, wie oben beschrieben, bestimmt.
CD222 reguliert CD87-abhängige Funktionen - Etliche Studien belegen die Rolle von CD87 im fibrinolytischen System und in der Zellmigration. Keine davon verweist auf eine Rolle von CD222 an diesen biologischen Prozessen. Unter Verwendung eines retroviralen Systems wurden das humane CD222 (CD222+), humane CD87 (CD87+) oder beide Moleküle (CD222+/CD87+) in Fibroblasten von CD222-defizienten Mäusen (CD222 -/-) zur Expression gebracht (siehe Materialien und Methoden). Diese Zellen wurden dann verwendet, um den Effekt von CD222 auf CD87-mediierte Plg-Aktivierung, Zelladhäsion und Chemotaxis zu analysieren.
Zuerst wurde die Fähigkeit dieser Zellen in Bezug auf die Plg Aktivierung getestet. Die Zellen wurden mit menschlichem Pro-uPA vorinkubiert, gewaschen und dann mit Plg zusammen mit dem chromogenen Plasminsubstrat S-2251 inkubiert. Unter diesen Konditionen wurde Plg nach 3 Stunden effizient aktiviert. CD87+ Zellen zeigten deutlich stärkere Plg-Aktivierung, verglichen mit der basalen Plg-Aktivierung durch -/- Zellen. Im Gegensatz dazu reduzierte die CD222Expressionen die Basalaktivität. Wenn CD222 mit CD87 koexprimiert wurde, war die PlgAktivierung in Vergleich zu den CD87 Einzel-Transduktanten signifikant reduziert (Fig. 1). Die Plg-Aktivierung wurde durch Tranexaminsäure (TA), ein Lysinanalog, zerstört. Da TA ein Hemmer der Plg-Bindung an die Zelloberfläche ist, zeigt dieser Versuch, dass zellgebundenes Plg für die Aktivierung notwendig ist.
Der uPA Hemmer PAI-1 hemmte ebenfalls die Plg-Aktivierung, was auf die uPA Abhängigkeit dieses Prozesses hindeutet (Fig. 1). Die Entdeckung, dass die Koexpression von humanem CD222 die Fähigkeit von CD87+ Zellen Plg zu aktivieren reduziert, war die erste Indikation, dass CD222 einen regulatorischen Effekt auf CD87-mediierte Funktionen besitzt.
Als nächstes wurde die adhäsive Kapazität der hergestellten Transduktanten untersucht. Dazu wurden die Zellen in Näpfchen, die mit verschiedenen Matrixproteinen beschichtet waren, in Anwesenheit oder Abwesenheit von menschlichem uPA inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Anzahl der adhärenten Zellen bestimmt (Fig. 2). CD222-negative Zellen (-/-) hafteten an Kollagen reproduzierbar stärker als an Vitronectin (453% bzw. 352% adhärente Zellen). Die Adhäsion an Fibronectin war schwächer (191%) und die Adhäsion zu Laminin war schwach (81%). Im Vergleich dazu zeigten die CD87+ Zellen stärkere Adhäsion zu Vitronectin (522%, Fig. 2A) und dieser Effekt wurde erheblich durch uPA gesteigert (742% adhärente Zellen, vergl. Fig. 2A und B).
Die Koexpression von CD222 mit CD87 (CD222+/CD87+ Zellen) drückte die CD87-abhängige Adhäsion zu Vitronectin auf den Basalwert sowohl in den uPAbehandelten als auch unbehandelten Zellen (493% bzw. 362% adhärente Zellen, Fig. 2A, B). Im Gegensatz zur Adhäsion an Vitronectin, hatten die Expression von CD87 und die Koexpression mit CD222 einen minimalen oder gar keinen Effekt auf die Adhäsion der Transfektanten zu Fibronectin, Collagen und Laminin. Der uPA-Hemmer PAI-1 inhibierte die CD87/uPA induzierte
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Adhäsion zu Vitronectin, was die Spezifität des Systems bestätigt (Fig. 2C).
Drittens wurde der Einfluss von CD87 und CD222 auf die uPA-induzierte Chemotaxis beurteilt. Dazu wurden modifizierte Boydenkammern, die mit Vitronectin beschichtet waren, verwendet (Fig. 3). Die-/- Zellen zeigten eine geringe Basalmigration. Wenn CD87 exprimiert wurde, migrierten ungefähr 2 Mal mehr Zellen (282% versus 141%). Wenn uPA in den unteren Behälter der Kammer gefüllt wurde, erhöhten CD87+ Zellen ihre migratorische Antwort (503% der Zellen); dieser Effekt wurde durch PAI-1 aufgehoben. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die CD87 plus CD222 coexprimierten oder CD222 allein exprimierten, im Vergleich zu-/- Zellen keine erhöhte Migration. Dies wurde sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit von uPA beobachtet.
Diese Ergebnisse demonstrieren einen negativ regulatorischen Effekt von CD222 auf die CD87-mediierte Migration.
Die Erfindung besteht nun in der Verwendung von CD222 oder dem vom N-Terminus des Peptids CD222 abgeleiteten Peptids B mit der Aminosäuresequenz AVDTKNNVLYKINIAGSV zur Hemmung von Fibrinolyse, Zelladhäsion und Zellmigration in vitro. Die Erfindung umfasst jedoch auch das Peptid B mit der Aminosäuresequenz AVDTKNNVLYKINIAGSV.
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tumsfaktor 2 (M6P/IGF2-R, CD222) die uPA/CD87-mediierte Plasminogenaktivierung (Plg), Zelladhäsion und Chemotaxis reguliert. Zusätzlich wird gezeigt, dass die N-terminale Region von CD222 der funktionell aktive Teil zur Kontrolle des uPA/CD87 Systems ist. Ein Peptid, das von dieser Region in CD222 abgeleitet wurde, ahmt die hemmenden Effekte von CD222 auf CD87-Funktionen nach.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die erhaltenen Resultate eine neuartige Rolle von CD222 in der Regulierung von Fibrinolyse, Zelladhäsion und Migration demonstrieren und dadurch neuartige Werkzeuge und Zielstrukturen aufgezeigt werden, um diese zellulären Funktionen unter pathologischen Konditionen wie bei Tumormetastasierung und Entzündungen therapeutisch zu beeinflussen.
Die N-terminale Region von CD222 ist der Plg-bindenden Region in Streptokinase ähnlich und ein Peptid, das von dieser Region in CD222 abgeleitet ist, kann die CD87-abhängigen Funktionen modulieren. - Ein Vergleich der Aminosäurensequenz von CD222 mit Proteinen, die bekannt waren, Plg zu binden und zu aktivieren, zeigte Ähnlichkeit mit Streptokinase (Fig. 4).
Streptokinase ist ein Protein, das von Streptokokken abgesondert wird und die Fähigkeit besitzt, Gewebebarrieren zu verdauen, indem es Plg bindet und aktiviert (6). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Bereich der N-terminalen Region von Streptokinase, der dem N-Terminus von CD222 ähnlich ist, ein Epitop enthält, das auch in der vermeintlichen Plg-Bindungsstelle von Fibronectin zu finden ist (7). Die Sequenzvergleiche zeigten eine 21%ige Identität und eine 55%ige Ähnlichkeit zwischen den korrespondierenden Regionen von CD222 und Streptokinase.
Dieser Sequenzzusammenhang veranlasste uns Peptide, die auf der N-terminalen Sequenz von CD222 basieren, auf ihren Einfluss auf CD87 Funktionen zu analysieren.
Zwei Peptide wurden hergestellt: Peptid B (pepB) wurde abgeleitet von dem Bereich in CD222, der der beschriebenen Plg-Bindungsstelle in Streptokinase ähnlich ist {8); Peptide C (pepC) ist abgeleitet von der Sequenz in CD222, die zur bekannten Plg-Aktivierungsstelle in Streptokinase ähnlich ist (9) (Fig. 4). Die Peptide wurden so konstruiert, dass sie die konservierten Aminosäurereste und die Lysine, die an der Plg-Bindung vermutet wurden, einschlossen. Um die Entstehung von zyklischen oder intermolekularen Peptidkomplexen zu vermeiden (solche Beobachtungen wurden in früheren Studien mit Cystein-enthalteriden Peptiden gemacht), wurde-das Cystein von CD222 in pepB durch Alanin ersetzt (Fig. 4). Als Kontrolle wurde eine permutierte Form von pepB - pepBscr und Peptid A (pepA), letzteres Peptid ist von der Domäne 15 von CD222 abgeleitet, verwendet.
Die Peptide wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, die Funktionen von CD87 zu modulieren, überprüft. Zu diesem Zweck wurden sie in den vorhin beschriebenen Methoden eingesetzt. Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, dass pepB bei CD87+ Zellen die uPA-induzierte Plg-Aktivierung unterdrückt, als auch die Adhäsion zu und die Che-
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motaxis durch Vitronectin (Fig. 5). Die anderen Peptide hatten keinen oder nur geringen Effekt.
Letztendlich wurde gefunden, dass pepB auch die uPA-induzierte Plg-Aktivierung, Adhäsion zu und Chemotaxis auf Vitronectin in humanen Monozyten/PBMCs, hemmt. Weiters konnte pepB auch die uPA-induzierte Migration von humanen glatten Muskelzellen hemmen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit jenen, die mit transduzierten Mausfibroblasten erhalten wurden. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass ein Peptid (pepB), das vom N-Terminus von CD222 abgeleitet wurde, den Effekt von CD222 auf CD87 mediierte Plg Aktivierung, Zelladhäsion und Chemotaxis nachahmt. So wurde ein agonistisches Peptid von CD222 etabliert, das den regulatorischen Effekt von CD222 auf CD87 imitiert.
CD222 zirkuliert sehr schnell zwischen dem Trans-Golginetzwerk, Lysosomen, Plasmamembran und Endosomen. Dieser zelluläre Transport kann durch verschiedene Faktoren einschliesslich CD222 Liganden, Wachstumsfaktoren, Retinolsäure, Phorbolester reguliert werden (10-13). Die Anzahl von CD222 Molekülen in der Plasmamembran kann daher durch verschiedene Stimulationen schnell gewechselt werden. In Anbetracht unserer Daten könnte dieser Prozess Zellen unter verschiedenen physiologischen Umständen (z. B. Monozytendifferenzierung/Aktivierung während der Inflammation) eine schnelle Kontrolle von Zelloberflächenassoziierter Proteolyse, Adhäsion und Chemotaxis ermöglichen. Es wird weiters diskutiert, dass das CD222 Molekül eine Rolle in der Tumorsuppression spielt, weil es die Zerstörung des Wachstumsfaktors IGF2 und die Aktivierung des Zellhemmstoffes TGF-#1 vermittelt (14).
Der Verlust der CD222 Funktion könnte aber nicht nur zu unkontrolliertem Wachstum führen, sondern auch zum Verlust der Kontrolle über CD87 und in Konsequenz zu erhöhter perizellulärer Proteolyse und unkontrollierter Infiltration von Tumorzellen.
Legende zu den Abbildungen: FIG 1. Plg-Aktivierungstest. Die Zellen (-/-, CD87+, CD222+, CD222+/CD87+ Mausfibroblasten) wurden in eine 96-Näpfchen-Platte eingebracht und für 24 Stunden bis zur Konfluenz kultiviert.
Die Zellen wurden für 20 min bei 37 C mit serumfreiem Medium, welches 3nM pro-uPA enthielt, präinkubiert, gewaschen und dann mit Plg (50nM) und dem chromogenen Plasmin-spezifischen Substrat S-2251 (0. 8 mM) inkubiert. Die Plasminaktivität wurde zu verschiedenen Zeitintervallen durch das Messen der Absorption bei 405 nm ermittelt. Einige Experimente wurden in Anwesenheit von 5 mM TA oder 10 U/ml PAI-1 durchgeführt. (Die erhaltenen Daten sind für CD87+ Zellen gezeigt. ) Die Experimente wurden 3 Mal in Duplikaten wiederholt.
FIG 2. Zelladhäsionsuntersuchung. Zellen (-/-, CD87+, CD222+, CD222+/CD87+ Mausfibroblasten) wurden geerntet, mit serumfreiem Medium gewaschen und in eine 96-NäpfchenPlatte eingebracht, die mit den erwähnten Matrixproteinen beschichtet wurde. Die Zellen wurden bei 37 C in einem Medium inkubiert, das keine zusätzlichen Moleküle (A), bzw. 10 nM uPA (B), oder 10 nM uPA plus 10 U/ml PAI-1 (C) enthielt. Nach 40 min wurden die Näpfchen gewaschen, die verbliebenen Zellen fixiert und mit Crystalviolet gefärbt. Die Zellzahl wurde durch Messen der Absorption bei 595 nm bestimmt. Die Zelladhäsion ist als Prozent der Gesamtmenge der eingesetzten Zellen ausgedrückt. Die Experimente wurden 3 Mal in Duplikaten wiederholt; es werden die Mittelwerte +/- SD (*P<0.05) gezeigt.
FIG 3. Zellchemotaxisuntersuchung. Die Chemotaxisanalysen wurden in einer 24-Näpfchen Platte unter Verwendung von Gewebekulturpolycarbonatfiltereinsätzen durchgeführt. Die unteren Seiten der verwendeten Filter wurden mit Vitronectin beschichtet und mit BSA geblockt.
Zellen (-/-, CD87+, CD222+, CD222+/CD87+ Mausfibroblasten) wurden geerntet, gewaschen, in serumfreiem Medium resuspendiert und in die obere Kammer gegeben. Medium mit entweder 10 nM uPA, uPA plus PAI-1 (10 nM plus 10 U/ml) oder ohne Zusatz wurde in die untere Kammer eingebracht. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37 C wurden die Filter gewaschen, die Oberseite der Filter von Zellen freigeschabt und die festhaftenden Zellen an der Unterseite fixiert und mit Crystalviolet gefärbt. Die Zellzahl wurde durch Messen der Absorption bei 595 nm bestimmt. Die Migration der Zellen an die Unterseite des Filters ist als Prozentsatz der Gesamtmenge der eingesetzten Zellen ausgedrückt. Die Experimente wurden 4 Mal in Duplikaten
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wiederholt; es werden die Mittelwerte +/- SD (*P<0.05) gezeigt.
FIG 4. Vergleich der N-terminalen Region von CD222 (Aminosäuren 53-105) mit der Plgbindenden Region von Streptokinase (SK, Aminosäure 7-59) und Fibronectin (FN, Aminosäure 1733-1785). Die konservierten Aminosäurereste zwischen den Sequenzen sind eingerahmt, ein konservativer Austausch ist durch Punkt bzw. Klammer angezeigt. Die von dieser Region abgeleiteten Peptide (pepB und pepC) sind aufgelistet. Alanin, welches innerhalb der pepB Sequenz gegen Cystein ausgetauscht wurde, ist unterstrichen.
FIG 5. Effekte der CD222-abgeleiteten Peptide auf uPA-induzierte Funktionen bei CD87+ Mausfibroblasten. Der Plg-Aktivierungstest, die Adhäsionsuntersuchung und die Chemotaxisuntersuchung wurden wie in Fig. 2, 3 oder 4 beschrieben, in Anwesenheit von entweder 15 uM der indizierten Peptide oder 10 U/ml PAI-1 durchgeführt. Die Hemmung von 0% bezieht sich auf den Wert, der in Anwesenheit von uPA erhalten wurde, die Hemmung von 100% bezieht sich auf den Wert, der in Abwesenheit von uPA erhalten wurde. Die Experimente wurden 3 Mal in Duplikaten wiederholt; es werden die Mittelwerte +/- SD (*P<0.05) gezeigt.
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Patentansprüche : 1. Verwendung von CD222 oder dem vom N-Terminus des Peptids CD222 abgeleiteten
Peptids B mit der Aminosäuresequenz AVDTKNNVLYKINIAGSV zur Hemmung von Fibri- nolyse, Zelladhäsion und Zellmigration in vitro.
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