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Die Erfindung betrifft ein Stoffgemisch.
Der Anteil von hormonabhängigen Geschwülsten (Tumoren) an bösartigen Neubildungen im menschlichen Körper ist zahlenmässig erheblich Als die häufigsten Formen gelten der Gebarmutterkrebs (bis zu 80% der Geschwülste der weiblichen Geschlechtsorgane), der Milchdrüsen- krebs (in einigen Ländern die häufigste Geschwulstart bei Frauen), Krebs der Eierstöcke (bis zu
16% der Geschwülste der weiblichen Geschlechtsorgane), Krebs der Vorsteherdrüse (2 bis 3% aller Geschwülste bei Männern). Seltener kommen in der klinischen Praxis Krebs von Leber und Thymus vor. Die Behandlung von hormonabhängigen Geschwülsten ist öfters operativer Art. Jedoch sind in vielen Fällen wegen der Ausbreitung der Geschwulst die Bestrahlung und Chemotherapie notwendig.
Der Erfolg von der Arzneimitteltherapie hängt grossteils von der zytostatischen und/oder zytotoxischen Wirkung der Geschwulst-Präparate auf die Krebszellen ab. Das onkofetale Eiweiss des menschlichen Blutserums Alpha-Fetoprotein (im Folgenden kurz : AFP genannt) findet für diese Ziele seit langem schon Anwendung. Bekannt ist AFP für sein selektives Eindringen in die Geschwulstzellen, welche auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für dieses Eiweiss (Rezeptorendozytose) besitzen ; hierbei sind die normalen Zellen eines erwachsenen Organismus nicht zur AFP-Resorption geeignet [1, 2]. Erstmals hat Doktor Deutsch der Universität in Madison (Staat Viskonsin, USA) das AFP zur gezielten Beförderung des Zytostatikums Daunomizin verwendet [3].
In Russland geht die zweite Etappe der klinischen Prüfungen des Anttgeschwutstpräparates auf Basis von einem fetalen menschlichen AFP (als Transporteiweiss) und einem kovalenten Doxorubicin-Estron-Ver- bund (als Zytostatikum) im onkologischen wissenschaftlichen Blochin-Zentrum in Moskau erfolgreich zu Ende [4].
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Stoffgemisch mit verbesserter und spezifischer Wirkung gegen insbesondere hormonabhängige Geschwülste zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Stoffgemisch gelöst, welches onkofetales Alpha-Fetoprotein (AFP) und ein Zytotoxikum aus der Gruppe der polychlorierten Biphenyle, aus der Gruppe der polychlorierten Dibenzofurane und/oder aus der Gruppe der polychiorier- ten Dibenzodioxine enthält.
Es hat sich gezeigt, dass ein Stoffgemisch der erfindungsgemässen Zusammensetzung die biologische Aktivität der freien (nicht im Gemisch mit AFP) erfindungsgemäss vorliegenden Zytotoxika erheblich erhöht. Weiters weist das erfindungsgemässe Stoffgemisch eine hohe Selektivität in Bezug auf verschiedene Zell linien auf
Bevorzugt stammt das Zytotoxikum aus der Gruppe von Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD), 1, 2, 3, 7, 9-Pentachlordibenzofuran, 2, 3, 4, 7, 8-Pentachlordibenzofuran, 2, 3, 7, 8- Tetrachlordibenzofu- ran sowie 1, 3, 6, 8-Tetrachlordibenzofuran. Besonders bevorzugt ist das Zytotoxikum Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD).
TCDD stellt eine der toxischsten chemischen Verbindungen dar [5-7]. Die Eignung von TCDD zum Töten der Zellen nach einem apoptotischen Mechanismus (programmierbares Zugrundegehen von Zelle, PCD) ist bekannt [8, 9]. Insbesondere kommt diese apoptotische TCDD-Wirkung bei Zellen von hormonabhängigen Organen und Geweben zum Ausdruck. Insbesondere werden in diesem Zusammenhang Gebärmutter, Milchdrüse, Thymus, Eierstöcke und Vorsteherdrüse erwähnt [9-12]. Es wurde entdeckt, dass das TCDD in vitro und in vivo eine ausserordentlich hohe zytotoxische Aktivität gegenüber menschlichen Krebszellen der Milchdrüse, Gebärmutter und Eierstöcke aufweist [13-15]. Aber bis vor kurzem blieben für eine klinische Anwendung von TCDD zwei Hauptprobleme ungelöst.
1) Eine geringe TCDD-Löslichkeit im wässrigen Medium (TCDD ist eine hochhydrophobe Verbindung, was seine Anwendung in wassrigen Systemen verhindert).
2) Die ungenügende Selektivität von TCDD auf Zielzellen (eine TCDD-lnJektion in den Körper führt neben einer geschwulsthemmenden Aktivität zur Entstehung vielfacher toxischen Systemreaktionen).
Es wurde nun gefunden, dass TCDD imstande ist, sich an menschliches fetales AFP zu binden. Als Folge entsteht ein nichtkovalentes AFP-TCDD-Konjugat in einem molaren Verhältnis von AFP : TCDD = 1 : 2.
Es zeigt sich, dass In diesem Konjugat eine Steigerung der TCDD-Löslichkeit in wässrigen Medien etwa um das 5000-fache im Vergleich zu freiem TCDD erreicht werden kann. Durch den
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Einsatz von AFP als Transporteiweiss kann weiters eine hohe spezifische Selektivität in Bezug auf verschiedene Zielzellen erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das erfindungsgemässe Stoffgemisch als Iyophili- siertes Pulver vor. Es hat sich gezeigt, dass das Konjugat aus AFP und TCDD als Iyophilisiertes
Pulver über längere Zeit ohne Änderung des Verhältnisses AFPITCDD und ohne Einbussen an bio- logischer Aktivität lagerbar ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird auch durch ein Arzneimittel gelöst, welches das erfindungsgemässe Stoffgemisch enthält. Weiters wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Arzneimittel zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von hormonabhängigen Geschwülsten, insbesondere Tumoren, gelöst, welches ein erfindungsgemässes Stoffgemisch ent- hält.
Es zeigt sich, dass das erfindungsgemässe Arzneimittel gegenüber den Zellen des mensch- lichen T-Zellen-Lymphoms CEM, den menschlichen Krebszellen der Milchdrüse MCF-7 und menschlichen Hepatomzellen HepG2 eine ausgesprochen gute zytotoxische Aktivität in vitro entwickelt. Erfindungsgemässe Arzneimittel können zur Behandlung der Gebärmuttergeschwulst, von
Milchdrüsenkarzinom, von Eierstöcken-, Vorsteherdrüse-, Leber-, Hoden- und Thymuskrebs verwendet werden.
Mit dem vorliegenden erfindungsgemässen Stoffgemisch sowie dem erfindungsgemässen Arzneimittel wird es somit ermöglicht, ein Verfahren zur Unterdrückung des Krebszellenwachstums von hormonabhängigen Organen zur Verfügung zu stellen.
Zur Herstellung eines erfindungsgemässen Stoffgemisches wird bevorzugt ein molarer Überschuss an Zytotoxikum in Dioxan aufgelöst, dieser Lösung die benötigte Menge an AFP gelöst in Phosphatpuffer langsam zugegeben, die Reaktionsmasse inkubiert und der gebildete Komplex auf einer Säule von überschüssigem Ausgangsmaterial und Verunreinigungen abgetrennt.
Als Ergebnis des Verfahrens wird ein stabiler, nicht kovalenter TCDD/AFP-Verbund mit einem molaren Verhältnis von Liganden zu Eiweiss gleich 2 : 1 erzielt. Dieser Verbund weist eine hohe Wasserbeständigkeit auf. Die Messungen ergaben, dass das TCDD/AFP-Verhältnis bei einer Lagerung des erzeugten Verbundes in wässriger Pufferlösung bei einer Temperatur von +4 C zumindest 15 bis 20 Tage stabil bleibt.
Nach einer Lyophilisation aus dem wässrigen Puffer im Beisein von Mannitol als Stabilisator und bei einer Lagerung unter Inertgas bei einer Temperatur von-70 C wurden innerhalb von 60 Tagen weder Änderungen am Verhältnis TCDD/AFP noch Einbussen an biologischer Aktivität festgestellt.
Im Falle der Verwendung einer Standardmethode, die zur Erzeugung eines Überschusses an gebundenem TCDD und sowie zur Abtrennung von überschüssigem freiem TCDD vom erzeugten Verbund mittels Gel-Filtration dient, hängt der TCDD-Gehalt Im AFP-hältigen Verbund von der ursprünglichen Eiweisskonzentration, dem Verhältnis des Probevolumens zu Säulenvolumen und - geometrie, dem verwendeten Elutionsmittel und anderen Faktoren ab. Üblicherweise lag die TCDD-Konzentration im erzeugten Verbund bei 2 bis 7 ig/rn !. Durch den Einsatz von modernen Membraneinrichtungen zur Eiweisskonzentrierung lässt sich die TCDD-Konzentration auf 10 bis 30 jlg/ml ohne wesentliche Verluste oder Änderungen in der Stöchiometrie des Verbundes steigern.
Beispiele
1) Erhalt von menschlichem Aloha-Fetoorotein (AFP) :
Fraktionierung mit Ammoniumsulfat :
Es wurde nach der Prüfung auf Hepatitis B-Antigene, Syphilis und AIDS ein Nabelserum nach einer normalen Geburt bei einer Schwangerschaftsdauer von 32 bis 40 Wochen erhalten. Die aus diesen Tests negativ ausfallenden Serumproben wurden eingefroren und bis zur Verwendung bei einer Temperatur von-70 C aufbewahrt. Vor dem Beginn der AFP-Ausscheidung wurde das Serum aufgetaut (12 Stunden bei +4 C). Die unlöslichen Bestandteile wurden mit einer Zentrifuge beseitigt (Zentrifuge J2-21, Rotor JA-14 Beckman, USA ; 30 Minuten, 10 000 Ulmin).
Dem Überstand wurde unter Rühren und Abkühlen mit Eis eine kalte gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung bis
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zum Erreichen der 30%igen Sättigung zugemischt. Nach der Zugabe der notwendigen Sulfatmenge wurde die Lösung zur Sedimentbildung ruhig in einem Kühlschrank bei +4 C über Nacht stehen gelassen. Das Sediment wurde wiederum mit einer Zentrifuge (40 min, 10 000 Ulmin) abgetrennt. Dem Überstand wurde unter Rühren und Abkühlen mit Eis trockenes Ammoniumsulfat bis zum Erreichen der 70%igen Sättigung zugemischt.
Nach der Zugabe der notwendigen Sulfatmenge wurde die Lösung zur Sedimentbildung ruhig in einem Kühlschrank bei +4 C über Nacht stehen gelassen Das Sediment wurde wiederum mit einer Zentrifuge (45 min, 10 000 U/min) abgetrennt. Das erhaltene Sediment wurde in einer 10 mM Natriumphosphat-Lösung pH 7. 3 (das Endvolumen betrug gewöhnlich 65-70% vom Ausgangs-Serumvolumen) gelöst und zur Beseitigung vom Ammoniunsulfat gegen 10 110 mM Phosphatpuffer in einer semipermeablen Membran vom Typ "künstliche Niere" dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung zentrifugiert (45 min, 10 000 Ulmin) und die erhaltene helle Lösung auf die Affinitätschromatographiesäule mit den zum AFP spezifischen monoklonalen Antikörper aufgetragen.
Ausscheidung monoklonaler Antikörper
Ascites-Flüssigkeit (100-150 ml) wurde aufgetaut und das Sediment mit der Zentrifuge (Rotor JA-20,500 U/min, 20 Minuten) abgetrennt. Der Flüssigkeit wurde unter Rühren und Abkühlen mit Eis das gleiche Volumen von gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung zugegeben und die Mischung für 12 Stunden bei +4 C stehen gelassen. Das Sediment wurde durch Zentrifugation auf übliche Weise abgetrennt. Die Flüssigkeit wurde abgelassen, das Sediment in 100 mi 20 mM Phosphatpuffer, der 150 mM Natriumchlorid enthält, pH 7, 3 (PSP) aufgelöst. Um das Ammoniumsulfat zu beseitigen, wurde gegen denselben Puffer dialysiert. Dann wurde die Lösung auf eine mit Protein A modifizierte Agarose ( (Protein A Sepharose (Pharmacia, Schweden)) gefüllte Säule (1, 6 x 10 cm) aufgetragen.
Das Eiweiss im Eluat wurde mittels Photometer bei 280 nm (Unicord Sll (LKB, Schweden)) detektiert. Nach dem Auftragen wurde die Säule mit PSP bis zur Stabilisierung der Detektor- Basislinie gewaschen und die Antikörper aus der Säule mit 0, 1 M Natriumcitrat-Buffer, pH 4, 0 eluiert. Unmittelbar nach der Elution des Proteinpeaks aus der Säule wurde das Eluat mittels gedünnter NaOH-Lösung auf einen neutralen pH-Wert gebracht und die Lösung auf der PolycarbonatMembran (PM-30 (Amikon, Niederlande)) konzentriert.
Vorbereitung der Affinitätschromatographiesäute
Das Affinitätssorbens (100-140 ml) auf der Basis von monoklonalen Antikörpern und modifizierter Agarose ( (Sepharose CL-4B (LKB-Pharmacia, Schweden)) wurde gemäss der Standardmethode für die Aktivierung von modifizierter Agarose (Sepharose) mit Bromcyan in Aceton mit Triethylamin als Katalysator [16] erhalten. Nach der Konjugation mit monoklonalen Antikörpern wurden die Nebenprodukte der Reaktion vom Sorbens abgewaschen, in die Säule mit einem Durchmesser von 50 mm gepackt und mit PSP abgeglichen.
Affinitätschromatographie
Die das AFP enthaltende Ammoniumsulfat-Fraktion wurde nach der Dialyse innerhalb von 12-14 Stunden auf die Affinitätschromatographiesäule aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit 0, 1 M Tris-Chloridbuffer, pH 8, 2, gewaschen, bis kurz vor der völligen Elution des ungebundenen Proteins. Das Zielprotein wurde mit demselben Puffer mit einem Anteil von 4 M Harnstoff eluiert.
Das Protein im Eluat wurde mit einem Durchgangsphotometer bei 280 nm detektiert. lonenaustausch-Chromatographie
Der Proteinpeak wurde nach der Affinitätschromatographiesäule ggf. nach Korrektur des pHWertes unmittelbar auf die mit 0, 1 M Tris Chlorid-Puffer, pH 8, 2, abgeglichene lonenaustauschSäule (1, 6 x 15 cm) mit kovalent gebundenem Diethylaminoethylgruppen ( (DEAE-ToyoPearl M650 (Toyo Soda, Japan)) aufgetragen. Nach dem Auftragen der ganzen Probe wurde die Säule mit demselben Puffer durch Erhöhung der Kaliumchlorid-Konzentration (von 0 bis 0, 6 M) eluiert.
Gelpermeations-Chromatograph le
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einer Ultraschalizelle mittels einer Polycarbonat-Membran ( (PM-10 (Amicon, Niederlande)) konzentriert. Eine Säule (2, 6 x 150 cm) gefüllt mit einer Matrix aus mit N, N'-Methylenbis (acrylamid) vernetzten Dextranketten ( (Sephacryl S200HR (LKB-Pharmacia Schweden)) wird mit PSP, dem 0, 02% Natriumazid zugesetzt worden, abgeglichen. Die Probe wird aufgetragen und die Saule mit demselben Puffer eluiert. Das Protein wurde entsprechend dem photometrischen Profil ausgewählt Die Fraktionen, die AFP in monomerer Form enthielten, wurden vereinigt, auf der Membran (PM-10 (Amikon, Niederlande)) bis zur Dichte 2-4 mg/ml konzentriert, Iyophilisiert, die die Abfüllung des Lyophilisas in Ampullen erfolgt unter Stickstoffumgebung.
Die Aufbewahrung der Ampullen erfolgt bei -70oC.
2) Herstellung des nicht-kovalenten Koniuoates aus TCDD und AFP :
TCCD (0, 8-0, 9 mg/mi) wurde in Dioxan aufgelöst. Die Lösung wurde in Stickstoffumgebung bei +4 C aufbewahrt. Die TCDD-Lösung in Dioxan wurde der AFP-Lösung mit einer Proteinkonzentration von 1, 5-2, 0 mg/mI in PSP langsam unter Rühren zugegeben, so dass die Endkonzentration an Dioxan 5% (v/v) nicht überstieg. Die Reaktionsmasse wurde 1 bis 6 Stunden bei 30-35 C inkubiert.
Nach dem Inkubationsende wurde das gebildete Konjugat aus AFP-TCDD von den niedrigmolekularen Beimischungen durch Gelchromatographie ( (Sephadex G-25 sf (Pharmacia, Schweden)) abgetrennt. Die Säule war mit PSP das 10% Acetonitril (v/v) enthielt abgeglichen. Jene Fraktionen, die das Zielkonjugat enthielten, wurden vereinigt und bei +4 C bis zu einer qualitativen bzw. quantitativen Analyse, in der Regel nicht mehr als 24 Stunden, aufbewahrt. Für eine längere Lagerung wurde der Lösung trockenes Mannit (bis 10%) zugegeben, die Mischung über einen Ultrafilter (0, 22 m) gefiltert, in Glasampullen abgefüllt und Iyophilisiert. Nach dem Trocknen wurden die Ampullen mit sterilem Stickstoff oder Argon gefüllt, mit einem Wasserstoffbrenner dichtgelötet und bei -700C eingelagert.
3) Quantitative Bestimmung vom TCDD mittels Reversed Phase-Chromatographie
Die Ermittlung des TCDD-Gehaltes im erzielten Konjugat wurde anhand einer extra hierfür entwickelten chromatographischen Methode mit einem äusseren Standard durchgeführt. Die Analyse dauerte von 3 bis 15 min, die Nachweisgrenze lag bei 10 ng, der Variationskoeffizient bei 4%. Ein typisches Chromatogramm, welches bei der TCDD-Detektion in seinem Konjugat mit AFP erhalten wurde, ist in Fig. 1 dargestellt.
Die quantitative und qualitative Bestimmung von TCDD wurde mittels Reversed Phase-
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man, USA)), einem Schlaufeninjektor (M-7125) mit einem Schlaufenvolumen von 500 111 (Rhedyne, USA), einer HPLC-Reversed Phase-Säule mit Oktyl-Gruppen (Ultraspere Octyl, 3 jim, 0, 46 x 7, 5 cm) und einem spektrophotometrischen Detektor ( (M-167 (Beckman, USA)). Die Fläche der chromatographischen Peaks und die Bearbeitung der Analysenergebnisse wurden unter Verwendung des chromatographischen Programms "GOLD Personal Chromatograph" (Beckman, USA) durchgeführt.
Die Trennung wurde im System. A = 0, 1 M Ammoniumacetat, pH 6, 0, 10% Gehalt an Aceto- nitril (v/v) ;
B = 50 : 50 = Acetonitril : lsopropanol durchgeführt.
Die Analyse wurde bei einer Flussgeschwindigkeit von 1, 5 ml/min nach einer Gradientenelution von 65 bis 85% der B-Komponente, Retentionszeit 10 min, durchgeführt. Bei genügenden TCDDKonzentrationen in den Proben (mehr als 1 pM) wurde die Analyse gemäss einer isokratischen Elu- tion bei 75% von B durchgeführt. In diesem Fall betrug das Probevolumen höchstens 20 111 und die Analysezeit verringerte sich auf 3 Minuten. Um eine qualitative Bestimmung durchzuführen, wurden auf die Säule von 5 bis 500 111 einer Lösung des TCDD : AFP-Konjugats aufgetragen.
Es wurde gleichzeitig ein äusserer Standard unter Verwendung einer TCDD-Lösung in Dioxan (Konzentration 0, 1-0, 2 mg/mi) bestimmt : Den Mittelwert erhielt man aufgrund dreier paralleler Konzentrationsbestimmungen sowohl in den Proben, als auch in Standardlösungen, Die Fehler wurden nach der
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Methode kleinster Quadrate errechnet.
4) Prüfung biologischer Aktivität in vitro.
Zellenzüchtung
Für den biologischen Test von TCDD und dessen Konjugat mit AFP wurden verwendet : Menschliches T-Lymphozyten der Zellinie CEM, Karzinom menschlicher Milchdrüse Linie MCF-7 und menschliches Hepatom Linie HepG2. Die Zellen der Linie CEM wurden in Kunststofffläschchen (Costar, USA), in flüssigem RPMI 1640-Medium ohne L-Glutamin und mit Natriumbicarbonat (Sigma, USA) mit einem Gehalt von 10% embryonalem Kälberserum (Gibco, USA), 100 Einhei-
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kultiviert. Die Zellinie MCF-7 wurde bei gleichen Bedingungen, jedoch mit dem Dulbecco's modified Eagle's Medium mit L-Glukose, Natrium Bicarbonat, Pyridoxin Hydrochlorid, ohne L-Glutamin (DMEM (Sigma)) gezüchtet.
Bestimmung der zytotoxischen Aktivität :
Um die Toxizität von TCDD und seinem nichtkovalenten Komplex mit AFP einzuschätzen, wurde eine Aussaat von Zellen in 96-Wells Mikrotiterplatten (Costar) mit je 15 000 Zellen pro Well unter Zusatz verschiedener Konzentrationen der zu testenden Verbindungen vorgenommen. Diese wurden unter Standardbedingungen für 72 Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem MMT-Test nach der Mosmann-Methode [17] festgestellt. 2 Stunden vor dem Inkubationende wurde jedem Well je 50 ut 1 Lösung MTT-Bromid (= (3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (Sigma, USA)) im Medium für Zelizüchtung in einer Konzentration von 1 mg/mi zugegeben.
Nach der Färbung wurde das Medium entfernt, die ausgefallenen Formazan-Kristalle In 150 J Dimethylsulfoxid aufgelöst und die Farbungsintensität mittels Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 540 nm mit dem mehrkanaligen Spektrophotometer (Labsystem, Finland) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde in Prozent zur entsprechenden Kontrollgruppe bestimmt.
5) Ergebnisse der Prüfung auf die biologische Aktivität
Die biologische Aktivität des Konjugates aus TCDD und AFP gegenüber freiem TCDD wurde nach seiner toxischen Wirkung auf menschliche Tumorzellen unterschiedlicher Herkunft beurteilt.
Für sämtliche untersuchte Zell linien ist die Zytotoxizität des TCDD/AFP-Verbundes wesentlich höher als diejenige von freiem Dioxin Dagegen war die Differenz in der Empfindlichkeit der Zellen für die Wirkung des freien TCDD je nach Zellinie wesentlich geringer (IC50 =0, 7-8 M).
Durch die höchste Empfindlichkeit für die Wirkung des Verbundes zeichnen sich die T-Lymphozyten der Zellinie CEM (IC50 < 0, 50 nM) aus. Einigermassen stabiler sind die Zellen des Adenokarzinoms der Milchdrüse MCF-7 (IC50 = 18 nM). Die niedrigste Empfindlichkeit bei dem Versuch zeigten die Hepatomzellen der Zellinie HepG2 (IC50 = 52 nM).
In den Fig. 2a, 2b und 2c sind diese Ergebnisse graphisch zusammengefasst. Auf der Ordinate ist die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen in % und auf der Abszisse die Menge an Wirksubstanz (Konjugat AFP/TCDD oder freies TCDD) in nM aufgetragen. Die Kurven zeigen jeweils die Ergebnisse bei einer Behandlung mit dem erfindungsgemässen Konjugat aus AFP und TCDD (Kurve mit Kreisen) sowie bei einer Behandlung mit freiem TCDD (Kurve mit Quadraten).
Die Ergebnisse lassen sich tabellarisch wie folgt zusammenfassen
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<tb>
<tb> Zelllinie <SEP> IC50 <SEP> bei <SEP> Behandlung <SEP> mit <SEP> IC50 <SEP> bei <SEP> Behandlung <SEP> mit
<tb> Konjugat <SEP> TCDD/AFP <SEP> (nM) <SEP> freiem <SEP> TCDD <SEP> (nM)
<tb> Menschliche <SEP> T-Lymphozyten <SEP> < 1 <SEP> 712
<tb> der <SEP> Zelllinie <SEP> CEM <SEP>
<tb> Menschliche <SEP> Zellen <SEP> des <SEP> 18 <SEP> 7000
<tb> Adenokarzinoms <SEP> der <SEP> Milchdüse <SEP> der <SEP> Linie <SEP> MCF-7
<tb> Menschliche <SEP> Hepatomzellen <SEP> 52 <SEP> 10400
<tb> der <SEP> Linie <SEP> HepG2
<tb>
In Fig. 3 sind die Angaben über die relative Toxizität von Dioxin und seines AFP-Verbundes für diese Ze) !linien dargestellt.
In der Koordinatenachse sind in dieser Abbildung das Verhältnis der Hemm-Konstanten des TCDD/AFP-Konjugates zu freiem Dioxin (IC50 (TCDD/AFP) IIC50 (TCDD) dargestellt. In Fig. 4 sind die IC50-Werte des TCDD/AFP-Konjugates für die gleichen Zelllinien graphisch dargestellt. Man sieht daran, dass die Differenz zwischen den mehr und weniger empfindlichen Zelilinien viel höher liegt als im Falle der relativen Toxizität.
Aufgrund dieser Erkenntnisse kann man den durchaus begründeten Schluss ziehen, dass die Erzeugung des TCDD/AFP-Konjugates nicht nur die Steigerung der Löslichkeit von organischen Toxinen im Wasser, sondern auch eine erhebliche Erhöhung der biologischen Selektivität gegen- über Tumorzellen von unterschiedlichen menschlichen Organen und Geweben zur Folge hat. Dies lässt sich ohne weiteres anhand des Vergleiches der Toxizität eines freien Dioxins mit dem TCDD/AFP-Verbund für mehr oder weniger empfindliche Zelllinien (z. B. CEM und HepG2) veranschaulichen. Im Falle von Dioxin liegt diese Differenz nur beim 15-fachem (10400 : 712), während beim Konjugat dieser Wert zumindest 100mal so gross ist (52 : 0. 5 = 104)
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PATENTANSPRÜCHE : 1. Stoffgemisch, enthaltend onkofetales Alpha-Fetoprotein (AFP) und ein Zytotoxikum aus der Gruppe der polychlorierten Biphenyle, aus der Gruppe der polychlorierten Dibenzo- furane und/oder aus der Gruppe der polychlorierten Dibenzodioxine.
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The invention relates to a mixture of substances.
The number of hormone-dependent tumors (tumors) in malignant neoplasms in the human body is significant in number The most common forms are uterine cancer (up to 80% of the tumors of the female genital organs), breast cancer (in some countries the most frequent tumor start for women). , Cancer of the ovaries (up to
16% of tumors of the female genital organs), cancer of the prostate gland (2 to 3% of all tumors in men). Cancer of the liver and thymus is less common in clinical practice. Treatment of hormone-dependent tumors is often surgical. However, radiation and chemotherapy are necessary in many cases because of the spread of the tumor.
The success of drug therapy largely depends on the cytostatic and / or cytotoxic effects of the tumor preparations on the cancer cells. The oncofetal protein of human blood serum alpha-fetoprotein (hereinafter referred to as AFP) has long been used for these goals. AFP is known for its selective penetration into the tumor cells, which have receptors for this protein on their surface (receptor endocytosis); the normal cells of an adult organism are not suitable for AFP absorption [1, 2]. For the first time, Doctor Deutsch from the University of Madison (State of Viskonsin, USA) used the AFP for the targeted transport of the cytostatic Daunomizin [3].
In Russia, the second stage of clinical trials of the anti-ulcer preparation based on a fetal human AFP (as a transport protein) and a covalent doxorubicin-estrone compound (as a cytostatic agent) at the oncological scientific Blochin Center in Moscow comes to a successful end [4] .
The aim of the present invention is to provide a mixture of substances with improved and specific activity against, in particular, hormone-dependent tumors.
The object of the present invention is achieved by a substance mixture which contains oncofetal alpha-fetoprotein (AFP) and a cytotoxic from the group of the polychlorinated biphenyls, from the group of the polychlorinated dibenzofurans and / or from the group of the polychlorinated dibenzodioxins.
It has been shown that a mixture of substances of the composition according to the invention significantly increases the biological activity of the free (not mixed with AFP) cytotoxics according to the invention. Furthermore, the mixture of substances according to the invention has a high selectivity with respect to different cell lines
The cytotoxic preferably comes from the group of tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), 1, 2, 3, 7, 9-pentachlorodibenzofuran, 2, 3, 4, 7, 8-pentachlorodibenzofuran, 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzofu - ran and 1, 3, 6, 8-tetrachlorodibenzofuran. The cytotoxic tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) is particularly preferred.
TCDD is one of the most toxic chemical compounds [5-7]. The suitability of TCDD for killing the cells by an apoptotic mechanism (programmable cell basing, PCD) is known [8, 9]. This apoptotic TCDD effect is particularly evident in cells from hormone-dependent organs and tissues. In particular, the uterus, milk gland, thymus, ovaries and prostate glands are mentioned in this context [9-12]. It was discovered that the TCDD has an extraordinarily high cytotoxic activity against human cancer cells of the mammary gland, uterus and ovaries in vitro and in vivo [13-15]. But until recently, two major problems remained unsolved for clinical use of TCDD.
1) Low TCDD solubility in the aqueous medium (TCDD is a highly hydrophobic compound, which prevents its use in aqueous systems).
2) The insufficient selectivity of TCDD on target cells (a TCDD injection into the body leads to the development of multiple toxic system reactions in addition to an anti-tumor activity).
It has now been found that TCDD is able to bind to human fetal AFP. The result is a non-covalent AFP-TCDD conjugate in a molar ratio of AFP: TCDD = 1: 2.
It turns out that in this conjugate an increase in TCDD solubility in aqueous media of about 5000 times compared to free TCDD can be achieved. By the
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Using AFP as a transport protein can also achieve a high specific selectivity in relation to different target cells.
In a preferred embodiment, the mixture of substances according to the invention is present as an lyophilized powder. The conjugate of AFP and TCDD has been shown to be lyophilized
Powder can be stored over a long period of time without changing the AFPITCDD ratio and without losing biological activity.
The object of the present invention is also achieved by a medicament which contains the substance mixture according to the invention. Furthermore, the object of the present invention is achieved by a medicament for use in a method for the treatment of hormone-dependent tumors, in particular tumors, which contains a substance mixture according to the invention.
It has been shown that the medicament according to the invention develops an extremely good cytotoxic activity in vitro towards the cells of the human T-cell lymphoma CEM, the human cancer cells of the mammary gland MCF-7 and human hepatoma cells HepG2. Medicaments according to the invention can be used to treat the growth of the uterus
Breast carcinoma, of ovarian, prostate, liver, testicular and thymus can be used.
The substance mixture according to the invention and the medicament according to the invention thus make it possible to provide a method for suppressing the growth of cancer cells in hormone-dependent organs.
To produce a mixture of substances according to the invention, a molar excess of cytotoxic agent is preferably dissolved in dioxane, the required amount of AFP dissolved in phosphate buffer is slowly added to this solution, the reaction mass is incubated and the complex formed is separated on a column from excess starting material and impurities.
As a result of the method, a stable, non-covalent TCDD / AFP composite with a molar ratio of ligand to protein of 2: 1 is achieved. This composite has a high water resistance. The measurements showed that the TCDD / AFP ratio remained stable for at least 15 to 20 days when the resulting composite was stored in an aqueous buffer solution at a temperature of +4 ° C.
After lyophilization from the aqueous buffer in the presence of mannitol as a stabilizer and storage under inert gas at a temperature of -70 ° C, no changes in the TCDD / AFP ratio or loss of biological activity were found within 60 days.
If a standard method is used, which is used to generate an excess of bound TCDD and to separate excess free TCDD from the composite produced by means of gel filtration, the TCDD content in the AFP-containing composite depends on the original protein concentration, the ratio of Sample volume on column volume and geometry, the eluent used and other factors. Usually the TCDD concentration in the composite produced was 2 to 7 ig / rn!. By using modern membrane devices for protein concentration, the TCDD concentration can be increased to 10 to 30 ml / ml without significant losses or changes in the stoichiometry of the compound.
Examples
1) Obtaining Human Aloha Fetoorotein (AFP):
Fractionation with ammonium sulfate:
After testing for hepatitis B antigens, syphilis and AIDS, an umbilical serum was obtained after a normal birth with a gestation period of 32 to 40 weeks. The serum samples negative from these tests were frozen and stored at -70 ° C until use. Before the AFP excretion started, the serum was thawed (12 hours at +4 C). The insoluble components were removed with a centrifuge (centrifuge J2-21, rotor JA-14 Beckman, USA; 30 minutes, 10,000 rpm).
A cold saturated ammonium sulfate solution was added to the supernatant with stirring and cooling with ice
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admixed to reach 30% saturation. After the necessary amount of sulfate had been added, the sedimentation solution was left to stand in a refrigerator at +4 C overnight. The sediment was again separated off using a centrifuge (40 min, 10,000 rpm). Dry ammonium sulfate was added to the supernatant with stirring and cooling with ice until 70% saturation was reached.
After the necessary amount of sulfate had been added, the sedimentation solution was left to stand in a refrigerator at +4 C overnight. The sediment was again separated off using a centrifuge (45 min, 10,000 rpm). The sediment obtained was dissolved in a 10 mM sodium phosphate solution pH 7. 3 (the final volume was usually 65-70% of the initial serum volume) and, in order to remove the ammonium sulfate against 10 110 mM phosphate buffer, in a semipermeable membrane of the "artificial kidney" type dialyzed. After dialysis, the solution was centrifuged (45 min, 10,000 rpm) and the bright solution obtained was applied to the affinity chromatography column with the monoclonal antibodies specific for AFP.
Elimination of monoclonal antibodies
Ascites liquid (100-150 ml) was thawed and the sediment was separated using the centrifuge (rotor JA-20,500 rpm, 20 minutes). The same volume of saturated ammonium sulfate solution was added to the liquid with stirring and cooling with ice and the mixture was left to stand at +4 C for 12 hours. The sediment was separated by centrifugation in the usual way. The liquid was drained, the sediment dissolved in 100 ml of 20 mM phosphate buffer containing 150 mM sodium chloride, pH 7.3 (PSP). Dialysis was carried out against the same buffer to remove the ammonium sulfate. The solution was then applied to a column (1.6 × 10 cm) filled with protein A modified agarose ((Protein A Sepharose (Pharmacia, Sweden)).
The protein in the eluate was detected using a photometer at 280 nm (Unicord Sll (LKB, Sweden)). After the application, the column was washed with PSP until the detector baseline stabilized and the antibodies eluted from the column with 0.1 M sodium citrate buffer, pH 4.0. Immediately after the protein peak was eluted from the column, the eluate was brought to a neutral pH using dilute NaOH solution and the solution was concentrated on the polycarbonate membrane (PM-30 (Amikon, Netherlands)).
Preparation of the affinity chromatography columns
The affinity sorbent (100-140 ml) based on monoclonal antibodies and modified agarose ((Sepharose CL-4B (LKB-Pharmacia, Sweden)) was prepared according to the standard method for the activation of modified agarose (Sepharose) with cyanogen bromide in acetone with triethylamine as catalyst [16] After conjugation with monoclonal antibodies, the by-products of the reaction were washed off from the sorbent, packed into the column with a diameter of 50 mm and compared with PSP.
Affinity chromatography
The ammonium sulfate fraction containing the AFP was applied to the affinity chromatography column within 12-14 hours after dialysis. After application of the sample, the column was washed with 0.1 M Tris chloride buffer, pH 8.2, until shortly before the unbound protein was completely eluted. The target protein was eluted with the same buffer containing 4 M urea.
The protein in the eluate was detected with a pass photometer at 280 nm. ion exchange chromatography
After the affinity chromatography column, if necessary after correcting the pH value, the protein peak was immediately applied to the ion exchange column (1.6 x 15 cm) with covalently bound diethylaminoethyl groups ((DEAE-ToyoPearl M650), which was compared with 0.1 M Tris chloride buffer, pH 8.2 (Toyo Soda, Japan)) After applying the whole sample, the column was eluted with the same buffer by increasing the potassium chloride concentration (from 0 to 0.6 M).
Gel permeation chromatograph le
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an ultrasonic cell using a polycarbonate membrane ((PM-10 (Amicon, Netherlands)). A column (2.6 x 150 cm) filled with a matrix of dextran chains crosslinked with N, N'-methylenebis (acrylamide) ((Sephacryl S200HR (LKB-Pharmacia Sweden)) is compared with PSP to which 0.02% sodium azide has been added. The sample is applied and the column is eluted with the same buffer. The protein was selected according to the photometric profile. The fractions containing AFP in monomeric Form contained, were pooled, concentrated on the membrane (PM-10 (Amikon, Netherlands)) to a density of 2-4 mg / ml, lyophilized, which is the filling of the lyophilisas into ampoules under nitrogen atmosphere.
The ampoules are stored at -70oC.
2) Production of the non-covalent coniuate from TCDD and AFP:
TCCD (0.8-0.9 mg / ml) was dissolved in dioxane. The solution was stored at +4 C in a nitrogen atmosphere. The TCDD solution in dioxane was slowly added to the AFP solution with a protein concentration of 1.5-2.0 mg / ml in PSP with stirring so that the final concentration of dioxane did not exceed 5% (v / v). The reaction mass was incubated at 30-35 C for 1 to 6 hours.
After the end of the incubation, the conjugate formed from AFP-TCDD was separated from the low molecular weight admixtures by gel chromatography ((Sephadex G-25 sf (Pharmacia, Sweden)). The column was compared with PSP which contained 10% acetonitrile (v / v) Fractions containing the target conjugate were pooled and stored at +4 C until a qualitative or quantitative analysis, usually no longer than 24 hours. Dry mannitol (up to 10%) was added to the solution for longer storage, the mixture was filtered through an ultrafilter (0.22 m), filled into glass ampoules and lyophilized, and after drying the ampoules were filled with sterile nitrogen or argon, soldered with a hydrogen burner and stored at -700C.
3) Quantitative determination of TCDD using reversed phase chromatography
The TCDD content in the conjugate obtained was determined using a specially developed chromatographic method with an external standard. The analysis lasted from 3 to 15 minutes, the detection limit was 10 ng, the coefficient of variation was 4%. A typical chromatogram, which was obtained in the TCDD detection in its conjugate with AFP, is shown in FIG. 1.
The quantitative and qualitative determination of TCDD was carried out using reversed phase
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man, USA)), a loop injector (M-7125) with a loop volume of 500 111 (Rhedyne, USA), an HPLC-reversed phase column with octyl groups (Ultraspere Octyl, 3 jim, 0, 46 x 7, 5 cm) and a spectrophotometric detector ((M-167 (Beckman, USA)). The area of the chromatographic peaks and the processing of the analysis results were carried out using the chromatographic program "GOLD Personal Chromatograph" (Beckman, USA).
The separation was in the system. A = 0.1 M ammonium acetate, pH 6.0, 10% content of acetonitrile (v / v);
B = 50:50 = acetonitrile: isopropanol.
The analysis was carried out at a flow rate of 1.5 ml / min after a gradient elution of 65 to 85% of the B component, retention time 10 min. With sufficient TCDD concentrations in the samples (more than 1 pM), the analysis was carried out according to an isocratic elution at 75% of B. In this case the sample volume was a maximum of 20 111 and the analysis time was reduced to 3 minutes. To carry out a qualitative determination, 5 to 500 111 of a solution of the TCDD: AFP conjugate were applied to the column.
An external standard was simultaneously determined using a TCDD solution in dioxane (concentration 0.1-0.2 mg / ml): the mean was obtained on the basis of three parallel concentration determinations both in the samples and in standard solutions, which became errors after
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Least squares method calculated.
4) Testing biological activity in vitro.
Cell growth
The following were used for the biological test of TCDD and its conjugate with AFP: Human T-lymphocytes from the cell line CEM, carcinoma of the human mammary gland line MCF-7 and human hepatoma line HepG2. The cells of the CEM line were in plastic vials (Costar, USA), in liquid RPMI 1640 medium without L-glutamine and with sodium bicarbonate (Sigma, USA) containing 10% embryonic calf serum (Gibco, USA), 100 units.
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cultured. The MCF-7 cell line was grown under the same conditions, but with Dulbecco's modified Eagle's Medium with L-glucose, sodium bicarbonate, pyridoxine hydrochloride, without L-glutamine (DMEM (Sigma)).
Determination of the cytotoxic activity:
In order to assess the toxicity of TCDD and its noncovalent complex with AFP, cells were sown in 96-well microtiter plates (Costar) with 15,000 cells per well with the addition of different concentrations of the compounds to be tested. These were incubated under standard conditions for 72 hours. The viability of the cells was determined using the MMT test according to the Mosmann method [17]. 2 hours before the end of the incubation, each well was given 50 μl of 1 solution of MTT bromide (= (3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma, USA)) in the medium for cell culture in one Concentration of 1 mg / ml added.
After the coloring, the medium was removed, the precipitated formazan crystals were dissolved in 150 J dimethyl sulfoxide and the color intensity was measured by means of absorption measurement at a wavelength of 540 nm using the multi-channel spectrophotometer (Labsystem, Finland). The viability of the cells was determined as a percentage of the corresponding control group.
5) Results of the biological activity test
The biological activity of the conjugate from TCDD and AFP towards free TCDD was assessed according to its toxic effect on human tumor cells of different origins.
For all cell lines investigated, the cytotoxicity of the TCDD / AFP compound is significantly higher than that of free dioxin. In contrast, the difference in the sensitivity of the cells to the effect of free TCDD was significantly lower depending on the cell line (IC50 = 0, 7-8 M ).
The T-lymphocytes of the cell line CEM (IC50 <0, 50 nM) are characterized by the highest sensitivity for the effect of the compound. The cells of the adenocarcinoma of the mammary gland MCF-7 (IC50 = 18 nM) are somewhat more stable. The hepatoma cells of the cell line HepG2 (IC50 = 52 nM) showed the lowest sensitivity in the experiment.
These results are summarized graphically in FIGS. 2a, 2b and 2c. The viability of the treated cells is plotted in% on the ordinate and the amount of active substance (conjugate AFP / TCDD or free TCDD) in nM is plotted on the abscissa. The curves each show the results of treatment with the conjugate of AFP and TCDD (curve with circles) according to the invention and treatment with free TCDD (curve with squares).
The results can be summarized in a table as follows
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<tb>
<tb> Cell line <SEP> IC50 <SEP> with <SEP> treatment <SEP> with <SEP> IC50 <SEP> with <SEP> treatment <SEP> with
<tb> conjugate <SEP> TCDD / AFP <SEP> (nM) <SEP> free <SEP> TCDD <SEP> (nM)
<tb> Human <SEP> T lymphocytes <SEP> <1 <SEP> 712
<tb> of the <SEP> cell line <SEP> CEM <SEP>
<tb> Human <SEP> cells <SEP> of the <SEP> 18 <SEP> 7000
<tb> Adenocarcinoma <SEP> of the <SEP> milk nozzle <SEP> of the <SEP> line <SEP> MCF-7
<tb> Human <SEP> hepatoma cells <SEP> 52 <SEP> 10400
<tb> of the <SEP> line <SEP> HepG2
<tb>
3 shows the information about the relative toxicity of dioxin and its AFP compound for these lines.
In this coordinate axis, the ratio of the inhibition constants of the TCDD / AFP conjugate to free dioxin (IC50 (TCDD / AFP) IIC50 (TCDD) is shown in the coordinate axis. The IC50 values of the TCDD / AFP conjugate are shown in FIG for the same cell lines, which shows that the difference between the more and less sensitive cell lines is much higher than in the case of relative toxicity.
On the basis of these findings, one can conclude that the generation of the TCDD / AFP conjugate not only increases the solubility of organic toxins in water, but also significantly increases the biological selectivity towards tumor cells from different human organs and tissues has the consequence. This can easily be illustrated by comparing the toxicity of a free dioxin with the TCDD / AFP compound for more or less sensitive cell lines (e.g. CEM and HepG2). In the case of dioxin, this difference is only 15 times (10400: 712), while in the conjugate this value is at least 100 times as large (52: 0.5 = 104)
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