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Im prokaryotischen und eukaryotischen Leben sind Zellen und subzellulare Räume vonei an- der durch Membranen getrennt. Der regulierte und selektive Durchtritt von spezifischen Molekmien durch diese Membranen ist ein grundlegendes und hochbewährtes Prinzip. Die Bedeutung des Membrantransports wird durch Umstand veranschaulicht, dass fast 20 % der Gene des E. coll Transportfunktionen zugeordnet sind (1). Transmembraner Transport wird durch spezifische ffro- teine vermittelt, die der Membran zugeordnet sind, in einer Zahl von Familien gruppiert sind und deren Mitglieder miteinander hinsichtlich Sequenz, molekularem Mechanismus und evolutina em Ursprung verwandt sind.
Transporter stellen immer noch einen Mittelpunkt dar, insbesondere in der biologischen nd medizinischen Forschung, mit zystischer Fibrose Arzneimitteln und antibiotischer Resistenz als ständige Herausforderungen.
Wir waren daran interessiert, ob Taurin in der Lage ist, den Membrantransport zu induzieren oder zu unterdrücken mit der Grundlage, dass die gut belegte detoxifizierende Wirkung des Ta rin gegenüber endogenen Toxinen und Xenobiotika von unterschiedlicher und völlig voneinander unabhängiger chemischer Struktur (2) ihre Ursache in der Aktivierung des Transportmechanisnus Gifte aus der Zelle zu pumpen haben kann ; ein Mechanismus, der für das Phänomen der Arz ei- mittelresistenz beschrieben ist (3).
Hierfür haben wir das Prinzip des Auffindens von Genen durch substraktive Hybridisier ng (SH) gewahlt, ein Verfahren, bei dem mRNA in Organen von mit Taurin behandelten Ratten von mRNA in Organen von nicht behandelten Ratten und umgekehrt abgezogen wird, um so ine substraktive Bank zu bilden.
Die subtrahierten mRNAs werden durch reverse Transkription in cDNA umgewandelt, d rch PCR vervielfältigt und die erhaltenen cDNAs wurden sequenzlert. Die Sequenzen aus der SH werden mit Genbank-Sequenzen verglichen und so identifiziert.
Durch Anwenden dieser Technik fanden wir eine Reihe von aufwärts- oder hinunter regulie ten Transporter-Transkripten im Hirn und im Herz von mit Taurin behandelten Ratten. Unsere D ten
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hiefür eine Basis bilden.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Taurin zur Herstellung ei ies Mittels zum Beeinflussen des Transportes von Substanzen aus pro-und eukaryotischen Ze len oder in solche Zellen, insbesondere zur Transporter mediierten Detoxifizierung.
Bevorzugterweise wird Taurin erfindungsgemäss für die Herstellung eines Mittels zum Be in- flussen des Transportes von Substanzen aus pro-oder eukaryotischen Zellen oder in solche Ze len verwendet, wobei der Transport durch ein Protein, ausgewählt aus dem Phosphonat-Trans ort
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n-eingeschrankt sein soll, sowie der Zeichnungsfiguren näher erläutert.
Beispiel : Verfahren : 6 Sprague-Dawley-Ratten, 12 Wochen alt, weiblich, werden drei Wochen lang oral mit 100 mg/kg Körpergewicht Taurin (Sigma) gefüttert und 6 Tiere dienten als Kontrolle (Institut of Animal Breeding, Hlmberg, AT). Sie hatten freien Zugang zu Trinkwasser und Rattenkuchen (AI : romine) und wurden unter einem Tag-Nacht-Rhythmus (4) gehalten.
Am Ende der Fütterungsperiode wurden sie durch Halsdislokation getötet, das gesamte Hirn und das gesamte ventrikuläre Gew be wurden entnommen und in flussigem Stickstoff schockgefroren Das Auffinden der Gene wurde an gesammelten Hirnen und Herzen von jeder der beiden Gruppen nach der subtraktiven Hybridi ie- rung ausgeführt
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Protokoll der subtraktiven Hybridisierung (5) :
Die Pools an Hirn und Herz von mit Taurin behandelten und von unbehandelten Ratten wurden in flüssigen Stickstoff gegeben und für die Isolierung von mRNA zerkleinert.
Die Isolierung von mRNA wurde mit dem Quick Prep Micro mRNA-Reinigungs-Kit (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, SE, Kat. 27 92 55 01) ausgeführt.
1 Mikrogramm von mRNA von jeder (der zwei) Präparationen wurde mit einem cDNA-Klo- nierungs-Kit (Gibco, Life Technologies, Eggenstein, DE, Kat. 18248013) qualitätsgeprüft, wobei der Einbau von [alpha-32 P] dATP (Amersham, Buckinghamshire, UK, Kat. AA0004) mit nachfolgender Elektrophorese auf 1 % Agarose, gefolgt vo Autoradiographie verwendet wurde. Der Reflektionfilm (Dupont NEF 496) wurde bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von zwei Stunden exponiert.
Erstellen der subtraktiven Bank : 10 Mikrogramm jeweils von mRNA aus dem Hirn von DS und der Kontrolle wurden durch UV-Bestrahlung bei 360 nm nach den Anleitungen des Subtraktor-Kits (invitrogen, Leek, NL, Kat K432001) biotinyliert. 1 Mikrogramm der mRNA-Pools jeweils von der DS-Hirnprobe wurde einer reversen Transkriptasereaktion (Subtraktor-Kit Invitrogen) unterworfen und die cDNA-Pools wurden mit den entsprechenden biotinylierten mRNAs aus den Kontrollen hybridisiert Die subtraktive Hybridisierungsmischung wurde mit Streptavidin entsprechend dem oben erwähnten Subtraktor-Kit inkubiert und so die biotinilierten Moleküle (nicht einschliesslich biotinilierte mRNA und das Hybrid [biotiniliertes mRNA/cDNA])
komplexiert. Die Streptavidinkom- plexe wurden durch mehrfache Phenol-Chloroformextraktion abgetrennt und die subtrahierten cDNA wurden aus der wässerigen Phase durch Alkoholfällung (Subtraktor-Kit) abgetrennt.
Um die subtrahierte cDNA zu vervielfältigen und zu kloneren, wurden sie mit Not t-Linkern ligiert, gefolgt durch Not !-Verdau. Diese Not t-ge ! inkten cDNAs wurden in die Not l-Stelle des sPORT 1-Klonierungsvektor (cDNA-Klonierungssatz, Gibco) ligiert.
Um die subtrahierten cDNA zu visualisieren, wurden die klonierten cDNA unter Verwendung universeller Primer
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11 5'-ACAGCTATGACCATG-3' aus der multiplen Klonierungsstelle des sPORT-1-Vektors (cDNA-Klonierungs-Kit, Gibco) amplifiziert. Die amplifizierten cDNAs wurden auf 1 % Agarose-Elektrophorese analysiert.
Knieren von subtrahierten Not-l-gelinkten cDNA
Not t-ge) inkte cDNAs, die mit sPORT 1-Vektor ligiert waren, wurden für die Transformation von hochkompetenten INFalpha F'E. coli-Zellen (Invitrogen, Leek, Netherlands, Kat. C2020-03) verwendet und die platierte Klone wurden mit dem Plasmid-Isolations-Kit (Quiagen, Hilden, Germany, Kat. 12245) analysiert und Verdau mit Eco RI/Hind 111 ausgeführt. Rekombinante Klone wurden durch K. Granderath, MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland) sequenztert.
Homologien wurden durch computerunterstützten Vergleich der Daten aus der Genbankse- quenz-Bank : fastA@ebi. ac. uk (GBALL, Gen Bank, EMBL, Heidelberg, Deutschland) bestimmt.
Subtraktive Hybridisierung wurde kreuzweise ausgeführt, d. h. DS-Proben mRNA Subtraktion von Kontrolle und umgekehrt im 1 : 3-Niveau (DSmRNA : control mRNA).
Ergebnisse
Hirn
Alle Sequenzen, die aus der subtraktiven Bank erhalten wurden, wurden wenigstens dreifach nach unten oder aufwärts reguliert, da das Niveau der mRNA, die für die Subtraktion verwendet wurden, auf 1 : 3 eingestellt war,
1. Der Klon P33 der subtraktiven Bank enthielt eine aufwarts regulierte Sequenz mit hoher Homologie von 66, 3% zu der Phosphonat-Transport-ATPase PHNC von E. coli.
Die Länge des Fragmentes war 262 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten ist in Fig. 1 gezeigt.
Fig. 1
Das Alignment des Klons P33 aus der Taurin- subtraktiven Bank wurde mit der PhosphonatTransport-ATPase PHNC-Sequenz aus der Genbank EMBL (P16677) verglichen : : bedeutet identische Basenpaare, * steht für identische Aminosäuren und 0 bedeutet Aminosäuren mit ähnlicher Funktion.
2. Der Klon P29 aus der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine aufwärts regulierte Sequenz mit
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hoher Homologie von 76, 8% zu dem Multidrug-Transporter-Homologen MTH104 von Methcino- bakterium thermoautotrophicum
Die Länge des Fragmentes war 459 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten i t in Fig. 2 gezeigt.
Fig. 2
Das Alignment von Klon P29 aus Taurin-SL wurde mit dem Multidrug-Transporterhomolcgen MTH104 von Methanobakterium thermoautotrophicumsequenz (026207) von der Genbank Ef BL bestimmt.
3. Der Klon P21 aus der subtraktiven Bibliothek (SL) enthielt eine hinunter regulierte Sequenz mit hoher Homologie von 71, 4% zu dem Protein-Export-Membran-Protein SECD von Haemop ilus influenza.
Die Lange des Fragmentes war 616 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten ist in Fig. 3 gezeigt.
Fig. 3
Das Alignment des Klons P21 der Taurin-SL wurde zu der Protein-Exportmembran-Protein SECD-Sequenz aus der Genbank EMBL (P44591) bestimmt.
4. Der Klon P23 aus der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine hinunter regulierte Sequenz mit hoher Homologie von 62, 1% zu dem Oligopeptid-Transporter oppA von heliobacter pylori.
Die Länge des Fragmentes betrug 594 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdatel ist in Fig. 4 gezeigt.
Fig. 4
Das Alignment des Klons P23 der Taurin-SL wurde zu dem Oligopeptid-Transporter 0 pASequenz von der Genbank EMBL (025845) bestimmt.
5. Der Klon D9 aus der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine hinunter regulierte Sequenz mit Homologie von 54, 4% zu dem Oligopeptid-Transporter oppD von rhodobakter sphaeroides
Die Länge des Fragmentes war 483 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten 't in Fig 5 gezeigt.
Fig. 5
Das Alignment des Klons D9 der Taurin-SL ist zu dem Oligopeptid-Transporter oppD-Sequenz von der Genbank EMBL (B07798) bestimmt.
Herz
6. Der Klon P14 der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine aufwärts regulierte Sequenz mit hc her Homologie von 69, 6% zu dem ABC-Transporter BRAF-2 von archaebacterium fulgidus.
Die Länge des Fragmentes war 238 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten i. t in Fig 6 gezeigt.
Fig. 6
Das Alignment des Klons P14 aus der Taurin-SL wurde zu dem ABC-Transporter BRAI :-2Sequenz aus der Genbank EMBL (029436) ermittelt.
7. Der Klon P19 der subtraktiven Bank (SL) enthielt eine aufwärts regulierte Sequenz mit hcher Homologie von 68, 1% zu der Kation-Transport-ATPase PACS von Synechocystis sp.
Die Länge des Fragmentes war 745 bp und das Alignment des Klons mit Genbankdaten ist in Fig 7 gezeigt
Fig. 7
Das Alignment des Klons P19 der Taunn-SL wurde mit dem Kation-Transport-ATPase PACS- Sequenz von der Genbank EMBL (P73241) ermittelt.
Diskussion
Die orale Verabreichung von Taurin führte zu einer Modifikation der Transporterexpressio) in Hirn und Herz. Da das Niveau der Subtraktion auf 1 : 3 eingestellt war, ist davon auszugehen, dass
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zustand-Niveaus beitragen.
Die Phosphonat-Transport ATPase PHNC (PHNC) ebenso wie andere Transporter, di In dieser Untersuchung beobachtet wurden, wurden nie zuvor im Säugetiersystem beschneben, obwohl die bekannte, hohe Kor' : erung von Transportsystemen die Anwesenheit dieser Biom) ie- küle in allen Spezien stark natk : ! egt.
PHNC ist ein transportbezogenes Protein, das für die Aufnahme und den Abbau von Pros-
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phonat in Bakterien notwendig ist. Biochemisch dient es als Nukleotid-bindendes Protein des bindeproteinabhängigen Phosphonattransportsystems (6). Metcalf und Wanner haben das Wissen ausgeweitet, indem sie gezeigt haben, dass PHNC zusammen mit anderen Mitgliedern des PHNGen-Klusters einen bindeproteinabhängigen Phosphonattransporter darstellt, der auch Phosphate, Phosphatester und anorganische Phosphate transportiert (7). Die Aufwärtsregulierung eines Phosphat-Phosphonatträgers stimmt mit Beobachtungen überein, dass Taurin bei der Proteinphosphorylation eine Rolle spielt (8).
Die Überexpression des Multidrug-Transporter-Homologen MTH104 im Hirn von mit Taurin behandelten Ratten reflektiert möglicherweise die hauptsächliche Erkenntnis der Studie, da es die detoxifizierenden Eigenschaften von Taurin mit dem Multidrug-Transport-System zu verknüpfen vermag. Das Multidrug-Transporter-System, das durch das Multidrug-Resistenz-System (MDR) veranschaulicht ist, spielt eine grössere Rolle für Multidrug-Resistenz, d. h. therapeutisches Versagen bei der Chemotherapie von Krebs und Infektion. Verstärkte MDR-Expression in Tumorzellen führt zu einer erhöhten Beseitigung von zytotoxischen Wirkstoffen, da chemotherapeutische Arzneimittel aus der Zelle gepumpt werden (3,9, 10).
Anderseits kann das MDR-Transportsystem unter physiologischen Bedingungen von äusserster Wichtigkeit für Detoxifizierungsprozesse sowohl
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Transportprozesses würde teleologisch auf eine solche biologische Funktion hinweisen und dies würde auch die hochkonservierte Natur von Multidrug-Transportern erklären (11,12). Die Aufwärtsregulierung des Multidrug-Transporter-Homologen durch Taurin, das seinerseits eine Vielzahl von chemisch nicht verwandten Verbindungen entgiftet, kann diese Wirkung von Taurin gut erklären.
Die Demonstration des Protein-Export-Membran-Proteins SECD im Rattenhim ist das Erste, um die Anwesenheit des bakteriellen, integralen Membran-Protein Translokationfaktors sec für den Proteinexport im Säugetierorgan zu zeigen. Gardel und Mitarbeiter haben gezeigt, dass die secDStelle von E. coli für zwei Membran-Proteine kodiert, die für den Proteinexport erforderlich sind (13). Pogliano und Beckwith konnten jedoch zeigen, dass secD den Proteintransport in E. coli nicht voraussetzt, jedoch erleichtert (14). Wir sind nicht in der Lage der Feststellung der Abwärtsregulation des Protein-Export-Membranproteins SECD im Rattenhirn eine funktionelle Implikation zuzuordnen.
Die neue Feststellung des oppA und oppD ABC-Transporter-Homologen im Rattenhim zeigt, dass diese Oligopeptid-Transporter im Säugetiersystem enthalten sind. Dieses Oligopeptid-Transportsystem besteht aus zwei ATP-bindende Proteine, oppD und oppF, zwei integralen MembranProteinen, oppB und oppC, und einem Substrat-Bindeprotein oppA. Die Rolle des oppA in Bakterien ist nicht nur die Funktion als Peptidtransporter (15-17), sondern auch als ein Chaperon (18).
Diese biologische Bedeutung von durch Taurin im Rattenhirn hinunter reguliertem oppA und oppD kann derzeit nicht beantwortet werden. Es gibt jedoch einen Schlüssel von oppA defizienten Mutanten, die nicht in der Lage sind, Leuenkephalin zu transportieren (17) Eine allgemeine Rolle für proteolytische und Peptid-Recycling-Systeme kann abgeleitet werden.
Im Herz wurden zwei Transportsysteme als taurinsensitiv festgestellt. Der ABC-Transporter BRAF-2 kann das sehr ähnliche, menschliche Homologe des bakteriellen Transportsystems verzweigtkettiger Aminosäuren sein, das aus fünf Komponenten zusammengesetzt ist : BraC, ein penplasmatisches Bindeprotein für verzweigtkettige Aminosäuren ; BraD und BraE integrale Mem- branproteine ; BraF und BraG mutmassliche Nukleotid-bindende Proteine (19). Aufwärtsregulation von BRAF-2 kann in Übereinstimmung sein mit dem verstärkten Transport verzweigtkettiger Aminosäuren im Herz und dies kann wieder die Folge von Taurin sein, für sich oder durch Produkte, die sich aus seiner Wechselwirkung mit dem Carbohydrat-Insulin-verzweigtkettige Aminosäure Metabolismus sein (20).
Die zweite aufwärts regulierte Sequenz war das Kupfer-Transport-Säugetier-Homologe eines Kupfertransport P-Typ ATPase pacS, das in dem Thylakoidmembran von Synechococcus gefunden wurde. Dieses Mitglied einer grossen Familie von Kationenpumpen spielt entscheidende Rollen in vielen Organismen einschliesslich Bakterien, Pflanzen und Säugetieren. Es wurde festgestellt, dass PacS ein mutmassliches Metallbindungsmotiv (Gly-Met-X-Cys-X-X-Cys) in seinem N-ständigen Endteil besitzt, und tatsächlich erhöhen Metalle spezifisch pacS-mRNA und es gibt einen Nachweis, dass pacS in der Kupfer-Homeostase eine Rolle spielt (21).
Es wurde hervorgehoben, dass
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Taurin bei der Detoxifizierung von Metallen/metallischen Kationen eine Rolle spielt (22). Der vo ge- schlagene Metalle detoxifizierende Mechanismus war die Chelatbildung und Komplexbildung von Metallen durch Taurin. Hier schlagen wir die Aktivierung des PACS-Transportmechanik für das Einschliessen von metallischen Toxinen vor.
Wir haben eine Reihe von bakteriellen Transporter-Genen im Säugetierhirn und Herz und ihre Modulation durch Taurin beschrieben. Wir sind der Fehlerquellen und Nachteile der Genaurfin- dungsmethode bewusst, jedoch die hohe Homologie - Sequenzen wurden einer bekannten Da tenbanksequenz nur zugeordnet, wenn die Homologie über 50% betrug - berechtigt diese Identi zierungen Modifikation der Transporter-Genexpression kann von physiologischer Bedeutung ein, wenn man berücksichtigt, dass Taurin nicht nur ein normaler Bestandteil des Körpers ist, sondern auch in der Nahrung vorliegt.
Im pro- und eukaryotischen Leben werden Zellen und Subzellular-Räume durch Membranen getrennt und der regulierte und selektive Durchgang von spezifischen Molekülen durch d ese Membranen ist ein grundlegendes und hochkonserviertes Prinzip.
Uns hat interessiert, ob Taurin, eine natürlich vorkommende Aminosäure, in der Lage ware die Expression von Transportern zu induzieren oder zu unterdrücken, mit der Grundlage, dass gezeigt wurde, dass Taurin eine Reihe von endogenen Toxinen und Xenobiotika mit verschiedenen, hemisch nicht verwandten Strukturen detoxifiziert.
Hiezu wurde eine Genauffindungstechnik, die subtraktive Hybridisierung verwendet, bel der mRNA von taurinbehandeltem Rattenhirn und-herz von nichtbehandelten Kontrolltiere subtra iert wurde. Die subtrahierten mRNA wurden dann in cDNA umgewandelt, amplifiziert, sequenziert und durch Genbankdaten identifiziert.
Wir fanden fünf Transportertranskripte, die Phosphonat-Transport ATPase PHNC, das ulti- drug-Transporter-Homologe MTH104, das Protein-Export-Membran-Protein SECD, die Oligo ep- M-Transporter oppA und oppD im Hirn, und zwei ABC-Transporter BRAF-2 und Kationtransp rter ATPase PACS im Herz. Homologen der gefundenen Sequenzen waren in jedem Fall über 50%, so dass die Identifizierung der Transporter mit hoher Wahrscheinlichkeit möglich war.
Die biologische Bedeutung konnte sein, dass eine natürlich vorkommende Aminosäure, Taurin komplexe Transportsysteme moduliert Die wesentliche Erkenntnis ist die Aufwärtsregulation e nes Multidrug-Transporter-Transknpts, das einen Mechanismus für die nichtselektive, entgiftende ir- kung von Taurin erklärt.
Literatur
1. Bachmann BJ (1990) Linkage map of Escherichia coli K12. Microbial Rev 54 : 130-197.
2. Huxtable RJ (1992) Physiological actions of taurine. Physiol Rev 72 : 101-163.
3. Higgins CF (1992) ABC transporters : From microorganisms to man. Annu Rev Ce ! ! Bio ! 8 : 67-113.
4 Lubec B, Hoeger H, Kremser K, Amann G, Koller DY, Gialamas J (1996) Decreased tu mor incidence and increased survival by one year oral low dose arginine supplementation in the mo se.
Life Sci 58 : 2317-2325.
5. Labudova 0 and Lubec G (1998) cAMP upregulates the transposable element mys- : a possible link between signaling and mobile DNA. LifeSci 62'431-437,
6. Chen CM, Ye QZ, Zhu ZM, Wanner BL, Walsh CT (1990) Molecular biology of car onphosphorus bond cleavage. Cloning and sequencing of the phn genes involved in alkylphos honate uptake and C-P lyase activity in Escherichia coli B. J Biol Chem 265 : 4461-4471.
7. Metcalf WW and Wanner BL (1991) Involvement of the Escherichia coli phn gene cluster in assimilation of phosphorus in the form of phosphonates, phosphite, Pi esters, and Pi. J Bac hol 173 : 587-600.
8. Lombardini JB (1996) Taurinedepletionintheintactanimalstimulatesinvitrophosphojyla- tion of an approximately 44-kDa protein present in the mitochondrial fraction of the rat heart. J Mol Cell Cardiol28 : 1957-1961
9. Germann UA (1993) Molecular analysis of the multidrug transporter. Cytotechnology 12 : 33-62.
10. Gottesmann MM, Hrycyna CA, Schoenlein PV, Germann UA, Pastan I (1995) Geretic
EMI5.1
<Desc/Clms Page number 6>
analysis of the multidrug transporter. Ann Rev Genet 29 : 607-649.
11 Van Veen HW, Venema K, Bolhuis H, Oussenko I, Kok J, Poolman B, Driessen AJ, Konings WN (1996) Multidrug resistance mediated by a bacterial homolog of the human multidrug transporter MDR1. Proc Natl Acad Sci (USA) 93 : 10668-10672.
12. Neyfakh AA, Bidnenko VE, Chen LB (1991) Efflux-mediated multidrug resistance in bacillus subtilis : similarities and dissimilarities with the mammalian system. Proc Natl Acad Sci (USA) 88 : 4781-4785.
13. Garde) C, Johnson K, Jacq A, Beckwith J (1990) The secD locus of E. coli codes for two membrane proteins required for protein export. EMBO J 9 : 3209-3216
14. Pogliano JA and Beckwith J (1994) SecD and SecF facilitate protein export in E. coli. EMBO J 13 : 554-561.
15. Tame JR, Murshudov GN, Dodson EJ, Neil TK, Dodson GG, Higgins CF, Wilkinson AJ (1994) The structural basis of sequence-independent peptide binding bu OppA protein. Science 264 : 1578-1581.
16. Koide A and Hoch JA (1994) Identification of a second oligopeptid transport system in bacillus subtilis and determination of its role in sporulation. Mol Microbiol13 : 417-426.
17. Tynkkynen S, Buist G, Kunji E, Kok J, Poolman B, Venema G, Haandrikman A (1993)
EMI6.1
J Bacteriol 175 : 7523-7532
18. Richarme G and Caldas TD (1997) Chaperone properites of the bacterial periplasmic substrate - binding proteins. J Biol Chem 272 : 15607-15612.
19. Hoshino T, Kose-Terai-K, Sato K (1992) Solubilization and reconstitution of the Pseudomonas aeruginosa high affinity branched chain amino acid transport system. J Biol Chem 267 21313-21318.
20. Lampson WG, Kramer JH, Schaffer SW (1983) Potentiation of the actions of insulin by taurine. Can J Phys Pharmacol61 : 457-463.
21. Kanamaru K, Kashiwagi S, Mizuno T (1994) A copper-transportmg P-type ATPase found in the thylakoid membrane of the cyanobacterium Synechococcus species PCC7942. Mol Microbiol 13 : 369-377.
22 Howard AG and Nickless G (1977) Heavy metal complexation in polluted molluscs. Chem Biollnteract 17 : 257-263.
PATENTANSPRÜCHE :
1 Verwendung von Taurin zur Herstellung eines Mittels zum Beeinflussen des Transportes von Substanzen aus pro-und eukaryotischen Zellen oder in solche Zellen, insbesondere zur Transporter mediierten Detoxifizierung.
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In prokaryotic and eukaryotic life, cells and subcellular spaces are separated from each other by membranes. The regulated and selective passage of specific molecules through these membranes is a fundamental and well-proven principle. The importance of membrane transport is illustrated by the fact that almost 20% of the E. coll genes are assigned transport functions (1). Transmembrane transport is mediated by specific proteins, which are assigned to the membrane, are grouped in a number of families and whose members are related to one another in terms of sequence, molecular mechanism and evolutionary origin.
Transporters are still a focus, especially in biological and medical research, with cystic fibrosis drugs and antibiotic resistance as constant challenges.
We were interested in whether taurine is able to induce or suppress membrane transport on the basis that the well-proven detoxifying effect of tarin against endogenous toxins and xenobiotics of different and completely independent chemical structure (2) is the cause may have to pump toxins out of the cell in the activation of the transport mechanism; a mechanism that has been described for the phenomenon of drug resistance (3).
For this we chose the principle of finding genes by subtractive hybridization (SH), a method in which mRNA in organs from taurine-treated rats is extracted from mRNA in organs from untreated rats and vice versa, so as to create a subtractive bank form.
The subtracted mRNAs are converted into cDNA by reverse transcription, amplified by PCR and the cDNAs obtained were sequenced. The sequences from the SH are compared with Genbank sequences and thus identified.
Using this technique, we found a series of up or down regulated transporter transcripts in the brain and heart of taurine-treated rats. Our data
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build a base for it.
Accordingly, the present invention relates to the use of taurine for the production of an agent for influencing the transport of substances from pro- and eukaryotic cells or into such cells, in particular for transporter-mediated detoxification.
According to the invention, taurine is preferably used for the production of an agent for influencing the transport of substances from pro- or eukaryotic cells or into such cells, the transport being carried out by a protein selected from the phosphonate trans site
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should be n-restricted, and the drawing figures explained in more detail.
Example: Procedure: 6 Sprague-Dawley rats, 12 weeks old, female, are orally fed with 100 mg / kg body weight taurine (Sigma) for three weeks and 6 animals served as controls (Institut of Animal Breeding, Hlmberg, AT). They had free access to drinking water and rat cake (AI: romine) and were kept under a day-night rhythm (4).
At the end of the feeding period, they were killed by neck dislocation, the entire brain and the entire ventricular tissue were removed and snap frozen in liquid nitrogen. The genes were found on the collected brains and hearts of each of the two groups after the subtractive hybridization
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Subtractive hybridization protocol (5):
The brain and heart pools of taurine-treated and untreated rats were placed in liquid nitrogen and crushed for the isolation of mRNA.
The isolation of mRNA was carried out using the Quick Prep Micro mRNA purification kit (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, SE, cat. 27 92 55 01).
1 microgram of mRNA from each (of the two) preparations was quality checked with a cDNA cloning kit (Gibco, Life Technologies, Eggenstein, DE, Cat. 18248013), the incorporation of [alpha-32 P] dATP (Amersham , Buckinghamshire, UK, Cat. AA0004) followed by electrophoresis on 1% agarose followed by autoradiography. The reflection film (Dupont NEF 496) was exposed at room temperature for a period of two hours.
Creating the subtractive bank: 10 micrograms each of mRNA from the brain of DS and the control were biotinylated by UV irradiation at 360 nm according to the instructions of the subtractor kit (invitrogen, Leek, NL, Kat K432001). 1 microgram of the mRNA pools from each of the DS brain samples was subjected to a reverse transcriptase reaction (subtractor kit Invitrogen) and the cDNA pools were hybridized with the corresponding biotinylated mRNAs from the controls. The subtractive hybridization mixture was treated with streptavidin in accordance with the subtractor mentioned above. Incubated kit and thus the biotinilized molecules (not including biotinilated mRNA and the hybrid [biotinilated mRNA / cDNA])
complexed. The streptavidine complexes were separated by multiple phenol-chloroform extraction and the subtracted cDNA were separated from the aqueous phase by alcohol precipitation (subtractor kit).
To multiply and clone the subtracted cDNA, they were ligated with Not t linkers, followed by Not! Digestion. This need t-ge! intact cDNAs were ligated into the Not I site of the sPORT 1 cloning vector (cDNA cloning kit, Gibco).
In order to visualize the subtracted cDNA, the cloned cDNA were made using universal primers
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11 5'-ACAGCTATGACCATG-3 'from the multiple cloning site of the sPORT-1 vector (cDNA cloning kit, Gibco) amplified. The amplified cDNAs were analyzed on 1% agarose electrophoresis.
Knees of subtracted Not-1 linked cDNA
Not t-ge) inkt cDNAs ligated with sPORT 1 vector were used for the transformation of highly competent INFalpha F'E. coli cells (Invitrogen, Leek, Netherlands, Cat. C2020-03) were used and the plated clones were analyzed with the plasmid isolation kit (Quiagen, Hilden, Germany, Cat. 12245) and digested with Eco RI / Hind 111 . Recombinant clones were sequenced by K. Granderath, MWG-Biotech (Ebersberg, Germany).
Homologies were determined by computer-aided comparison of the data from the gene bank sequence bank: fastA & ebi. ac. uk (GBALL, Gen Bank, EMBL, Heidelberg, Germany).
Subtractive hybridization was carried out crosswise, i. H. DS samples mRNA subtraction from control and vice versa at the 1: 3 level (DSmRNA: control mRNA).
Results
brain
All sequences obtained from the subtractive bank were down or up regulated at least three times since the level of the mRNA used for the subtraction was set to 1: 3.
1. Clone P33 of the subtractive bank contained an up-regulated sequence with high homology of 66.3% to the phosphonate transport ATPase PHNC from E. coli.
The length of the fragment was 262 bp and the alignment of the clone with gene bank data is shown in FIG. 1.
Fig. 1
The alignment of clone P33 from the taurine-subtractive bank was compared with the phosphonate transport ATPase PHNC sequence from the gene bank EMBL (P16677): means identical base pairs, * stands for identical amino acids and 0 means amino acids with a similar function.
2. The clone P29 from the subtractive bank (SL) also contained an up-regulated sequence
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high homology of 76.8% to the multidrug transporter homolog MTH104 from Methcinobacterium thermoautotrophicum
The length of the fragment was 459 bp and the alignment of the clone with gene bank data i t is shown in FIG. 2.
Fig. 2
The alignment of clone P29 from taurine SL was determined with the multidrug transporter homolog MTH104 from Methanobacterium thermoautotrophicumsequenz (026207) from the Genebf Ef BL.
3. Clone P21 from the subtractive library (SL) contained a down-regulated sequence with high homology of 71.4% to the protein export membrane protein SECD from Haemop ilus influenza.
The length of the fragment was 616 bp and the alignment of the clone with gene bank data is shown in FIG. 3.
Fig. 3
The alignment of the clone P21 of the taurine SL was determined to the protein export membrane protein SECD sequence from the gene bank EMBL (P44591).
4. The clone P23 from the subtractive bank (SL) contained a down-regulated sequence with high homology of 62.1% to the oligopeptide transporter oppA from heliobacter pylori.
The length of the fragment was 594 bp and the alignment of the clone with gene bank data is shown in FIG. 4.
Fig. 4
The alignment of the clone P23 of the taurine SL was determined by the gene bank EMBL (025845) to the oligopeptide transporter 0 pA sequence.
5. The clone D9 from the subtractive bank (SL) contained a down-regulated sequence with homology of 54.4% to the oligopeptide transporter oppD from rhodobakter sphaeroides
The length of the fragment was 483 bp and the alignment of the clone with gene bank data 't is shown in FIG. 5.
Fig. 5
The alignment of clone D9 of the taurine SL is determined to the oligopeptide transporter oppD sequence from the gene bank EMBL (B07798).
heart
6. The clone P14 of the subtractive bank (SL) contained an up-regulated sequence with high homology of 69.6% to the ABC transporter BRAF-2 from archaebacterium fulgidus.
The length of the fragment was 238 bp and the alignment of the clone with gene bank data i. t shown in Fig. 6.
Fig. 6
The alignment of the clone P14 from the taurine SL was determined for the ABC transporter BRAI: -2 sequence from the gene bank EMBL (029436).
7. The subtractive bank (SL) clone P19 contained an up-regulated sequence with high homology of 68.1% to the cation transport ATPase PACS from Synechocystis sp.
The length of the fragment was 745 bp and the alignment of the clone with gene bank data is shown in FIG. 7
Fig. 7
The alignment of the clone P19 of the Taunn SL was determined using the cation transport ATPase PACS sequence from the gene bank EMBL (P73241).
discussion
Oral administration of taurine led to a modification of transporter expression in the brain and heart. Since the level of subtraction was set to 1: 3, it can be assumed that
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State levels contribute.
The phosphonate transport ATPase PHNC (PHNC) as well as other transporters that have been observed in this study have never been covered in the mammalian system, although the well-known, high correlation of transport systems the presence of these biomecules in all species strong natk:! egt.
PHNC is a transport-related protein that is essential for the uptake and breakdown of pros
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phonat in bacteria is necessary. Biochemically, it serves as a nucleotide-binding protein of the binding protein-dependent phosphonate transport system (6). Metcalf and Wanner have expanded their knowledge by showing that PHNC, together with other members of the PHNGen cluster, is a binding protein-dependent phosphonate transporter that also transports phosphates, phosphate esters and inorganic phosphates (7). Up-regulation of a phosphate-phosphonate carrier is consistent with observations that taurine plays a role in protein phosphorylation (8).
The overexpression of the multidrug transporter homolog MTH104 in the brain of rats treated with taurine may reflect the main finding of the study, since it can link the detoxifying properties of taurine with the multidrug transport system. The multidrug transporter system, illustrated by the multidrug resistance system (MDR), plays a greater role in multidrug resistance; H. therapeutic failure in chemotherapy for cancer and infection. Increased MDR expression in tumor cells leads to an increased elimination of cytotoxic agents, since chemotherapeutic drugs are pumped out of the cell (3,9, 10).
On the other hand, the MDR transport system can be of extreme importance for detoxification processes under physiological conditions
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Transport process would indicate such a biological function teleologically and this would also explain the highly conserved nature of multidrug transporters (11,12). The upward regulation of the multidrug transporter homolog by taurine, which in turn detoxifies a large number of chemically unrelated compounds, can explain this effect of taurine well.
The demonstration of the protein export membrane protein SECD in rat him is the first to show the presence of the bacterial, integral membrane protein translocation factor sec for protein export in the mammalian organ. Gardel and co-workers have shown that the E. coli secD site codes for two membrane proteins that are required for protein export (13). However, Pogliano and Beckwith were able to show that secD does not require protein transport in E. coli, but does make it easier (14). We are unable to ascertain a functional implication of the downward regulation of the protein export membrane protein SECD in the rat brain.
The new finding of the oppA and oppD ABC transporter homolog in rat rat shows that these oligopeptide transporters are contained in the mammalian system. This oligopeptide transport system consists of two ATP-binding proteins, oppD and oppF, two integral membrane proteins, oppB and oppC, and a substrate binding protein oppA. The role of oppA in bacteria is not only the function as a peptide transporter (15-17), but also as a chaperone (18).
This biological meaning of oppA and oppD regulated down by taurine in the rat brain cannot be answered at present. However, there is a key to oppA deficient mutants that are unable to transport leukephalin (17). A general role for proteolytic and peptide recycling systems can be derived.
Two transport systems in the heart were found to be taurine sensitive. The ABC transporter BRAF-2 can be the very similar human homologue of the bacterial transport system of branched-chain amino acids, which is composed of five components: BraC, a penplasmatic binding protein for branched-chain amino acids; BraD and BraE integral membrane proteins; BraF and BraG putative nucleotide-binding proteins (19). Upward regulation of BRAF-2 may be in accordance with the increased transport of branched chain amino acids in the heart and this may again be the result of taurine, by itself or by products resulting from its interaction with the carbohydrate-insulin branched chain amino acid metabolism (20 ).
The second up-regulated sequence was the copper transport mammal homologue of a copper transport P-type ATPase pacS found in the Synechococcus thylakoid membrane. This member of a large family of cation pumps plays critical roles in many organisms including bacteria, plants and mammals. PacS has been found to have a putative metal binding motif (Gly-Met-X-Cys-XX-Cys) in its N-terminal portion, and indeed metals specifically increase pacS mRNA and there is evidence that pacS in the copper Homeostasis plays a role (21).
It was highlighted that
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Taurine plays a role in the detoxification of metals / metallic cations (22). The proposed metal detoxifying mechanism was the chelation and complexation of metals by taurine. Here we propose the activation of the PACS transport mechanism for the containment of metallic toxins.
We have described a number of bacterial transporter genes in the mammalian brain and heart and their modulation by taurine. We are aware of the sources of error and disadvantages of the gene discovery method, but the high homology - sequences were only assigned to a known database sequence if the homology was over 50% - justifies these identifications. Modification of transporter gene expression can be of physiological importance if one takes into account that taurine is not only a normal part of the body, but is also present in food.
In pro- and eukaryotic life, cells and sub-cellular spaces are separated by membranes and the regulated and selective passage of specific molecules through these membranes is a fundamental and highly conserved principle.
We were interested in whether taurine, a naturally occurring amino acid, was able to induce or suppress the expression of transporters, on the basis that it was shown that taurine is a series of endogenous toxins and xenobiotics with different, unrelated structures detoxified.
A gene discovery technique using subtractive hybridization was used to subtract the mRNA from taurine-treated rat brain and heart from untreated control animals. The subtracted mRNA was then converted to cDNA, amplified, sequenced and identified by gene bank data.
We found five transporter transcripts, the phosphonate transport ATPase PHNC, the ultimate drug transporter homolog MTH104, the protein export membrane protein SECD, the oligo ep-M transporters oppA and oppD in the brain, and two ABC transporters BRAF-2 and cation transp rter ATPase PACS in the heart. Homologs of the sequences found were in each case over 50%, so that the identification of the transporters was possible with a high degree of probability.
The biological significance could be that a naturally occurring amino acid, taurine, modulates complex transport systems. The main finding is the upward regulation of a multidrug transporter concept, which explains a mechanism for the non-selective, detoxifying effect of taurine.
literature
1. Bachmann BJ (1990) Linkage map of Escherichia coli K12. Microbial Rev 54: 130-197.
2. Huxtable RJ (1992) Physiological actions of taurine. Physiol Rev 72: 101-163.
3. Higgins CF (1992) ABC transporters: From microorganisms to man. Annu Rev Ce! ! Organic! 8: 67-113.
4 Lubec B, Hoeger H, Kremser K, Amann G, Koller DY, Gialamas J (1996) Decreased tu mor incidence and increased survival by one year oral low dose arginine supplementation in the mo se.
Life Sci 58: 2317-2325.
5. Labudova 0 and Lubec G (1998) cAMP upregulates the transposable element mys-: a possible link between signaling and mobile DNA. LifeSci 62'431-437,
6. Chen CM, Ye QZ, Zhu ZM, Wanner BL, Walsh CT (1990) Molecular biology of car onphosphorus bond cleavage. Cloning and sequencing of the phn genes involved in alkylphos honate uptake and C-P lyase activity in Escherichia coli B. J Biol Chem 265: 4461-4471.
7. Metcalf WW and Wanner BL (1991) Involvement of the Escherichia coli phn gene cluster in assimilation of phosphorus in the form of phosphonates, phosphite, Pi esters, and Pi. J Bac hol 173: 587-600.
8. Lombardini JB (1996) Taurinedepletionintheintactanimalstimulatesinvitrophosphojyla- tion of an approximately 44-kDa protein present in the mitochondrial fraction of the rat heart. J Mol Cell Cardiol28: 1957-1961
9. Germann UA (1993) Molecular analysis of the multidrug transporter. Cytotechnology 12: 33-62.
10. Gottesmann MM, Hrycyna CA, Schoenlein PV, Germann UA, Pastan I (1995) Geretic
EMI5.1
<Desc / Clms Page number 6>
analysis of the multidrug transporter. Ann Rev Genet 29: 607-649.
11 Van Veen HW, Venema K, Bolhuis H, Oussenko I, Kok J, Poolman B, Driessen AJ, Konings WN (1996) Multidrug resistance mediated by a bacterial homolog of the human multidrug transporter MDR1. Proc Natl Acad Sci (USA) 93: 10668-10672.
12. Neyfakh AA, Bidnenko VE, Chen LB (1991) Efflux-mediated multidrug resistance in bacillus subtilis: similarities and dissimilarities with the mammalian system. Proc Natl Acad Sci (USA) 88: 4781-4785.
13. Garde) C, Johnson K, Jacq A, Beckwith J (1990) The secD locus of E. coli codes for two membrane proteins required for protein export. EMBO J 9: 3209-3216
14. Pogliano JA and Beckwith J (1994) SecD and SecF facilitate protein export in E. coli. EMBO J 13: 554-561.
15. Tame JR, Murshudov GN, Dodson EJ, Neil TK, Dodson GG, Higgins CF, Wilkinson AJ (1994) The structural basis of sequence-independent peptide binding bu OppA protein. Science 264: 1578-1581.
16. Koide A and Hoch JA (1994) Identification of a second oligopeptide transport system in bacillus subtilis and determination of its role in sporulation. Mol Microbiol 13: 417-426.
17. Tynkkynen S, Buist G, Kunji E, Kok J, Poolman B, Venema G, Haandrikman A (1993)
EMI6.1
J Bacteriol 175: 7523-7532
18. Richarme G and Caldas TD (1997) Chaperone properites of the bacterial periplasmic substrate - binding proteins. J Biol Chem 272: 15607-15612.
19. Hoshino T, Kose-Terai-K, Sato K (1992) Solubilization and reconstitution of the Pseudomonas aeruginosa high affinity branched chain amino acid transport system. J Biol Chem 267 21313-21318.
20. Lampson WG, Kramer JH, Schaffer SW (1983) Potentiation of the actions of insulin by taurine. Can J Phys Pharmacol61: 457-463.
21. Kanamaru K, Kashiwagi S, Mizuno T (1994) A copper-transportmg P-type ATPase found in the thylakoid membrane of the cyanobacterium Synechococcus species PCC7942. Mol Microbiol 13: 369-377.
22 Howard AG and Nickless G (1977) Heavy metal complexation in polluted molluscs. Chem Biollnteract 17: 257-263.
PATENT CLAIMS:
1 Use of taurine for the production of an agent for influencing the transport of substances from pro- and eukaryotic cells or into such cells, in particular for transporter-mediated detoxification.
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