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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von hypoxisch ischämischen Zuständen nd Krankheitsbildern.
Die Pathomechanismen bei der perinatalen Asphyxie (Pa) auf Genexpressions-Niveau im allgemeinen und die Rolle von Transkriptionsfaktoren (TF) im besonderen sind bis jetzt noch nicht aufgeklärt. Im Hirn, dem besonders dramatischen Ziel von asphyktischen Schäden, sind hfonnationen über die Rolle von TF nicht verfügbar. Dies kann dem Umstand zugeschrieben werden, dass kein geeignetes Tiermodell für PA verfügbar war und die bestehenden Modelle eher den Sch aganfall oder die Ischämie als PA wiedergaben (1).
Es gibt jedoch Berichte über TF in Hypoxie, einem pathophysiologischen Zustand, der der PA wenigstens ähnelt : Giacca und Mitarbeiter berichteten die Aktivierung des Hitzeschocktransk pti- onsfaktors in normalen und Tumorzellinien mit maximaler Induktion bei oder nach 3 Stunden (2).
Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 durch Hypoxie in Tumorzellen wurde von Yao nd Mitarbeitern 1994 berichtet (3) und die Analyse der Kinetik der TF-Expression zeigte an, dass die Expression von c-jun und junD während der hypoxischen Exposition induziert wurde und dass die mRNA-Niveaus während der erneuten Sauerstoffzufuhr abnahmen. AP-1-lnduktion durch die Hypoxie aktivierenden Gene wie Endothelin-1, plättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor, Collage nase IV, wurde dann in endothelialen Zellen durch Banyopadhyay (4) und in He La-Zellen durch ardere (5) bestätigt.
Ein wichtiger TF, allgegenwärtig spezifisch und gut dokumentiert, ist der Hypoxie induziert are Faktor (6-12) : Er wurde zuerst als eine DNA bindende Aktivität beschrieben, die insbesondere ein 8bp-Motiv erkennt, das als wesentlich für die Hypoxie induzierbare Erythropoietin-Gentranskrip ion bekannt ist. Später wurde HIF-1-Aktivität auch in Zellinie gefunden, die Erythropoietin nicht e pri- mieren, was nahelegt, dass HIF-1 Teil eines weitreichenden Sauerstoff erfassenden Mechanismus ist. Es ist ein heterodimerer, basischer Helix-Schleifen-Helix- TF, der Gene steuert, deren Prod kte Schlüsselrolle im Beibehalten der Oz-Homeostase spielen. Kvietikova und Mitarbeiter ha en berichtet, dass die TF ATF-1 und CREB-1 konstitutiv an das HIF-1 binden (13).
Wir fanden die Hirn HIF-1-Expression im Hirn von hypoxischen Ratten Stunden nach der hypoxischen Exposi on, waren jedoch nicht in der Lage, dessen Expression im Hirn von Ratten mit PA und einer asp yk- tischen Phase von 20 min zu entdecken (14). Ein anderer TF, EPAS1, verwandt zum HIF-1 nd durch Hypoxie in endothelialen Zellen induzierbar, wurde unlängst durch Tian und Mitarbeiter er- öffentlicht (15), er bildet mit dem Arylkohlenwasserstoff-Kerntransporter vor der transkription len Aktivierung der Zielgene, wie beispielsweise dem Tyrosinkinasegen Tie-2, einen heterodim ren Komplex.
Die Aktivierung von TF NF-kappa B p65, gefolgt von einer Induktion von Cycloo ge- nase-2 in menschlichen, vasulären Endothelialzellen wurde von Schmedtje und seiner Gruppe gezeigt (16) : menschliche endotheliale Zellen der Nabelvene zeigten eine mehr als vierfa he Induktion von COX-2-Protein bei 1 % Sauerstoff, vermittelt durch Binden von NF-kappa B pub zu dem 3'NF kappa B Konsensus-Element in der Promotorregion stromaufwärts von COX-2. Yan nd Mitarbeiter berichteten unlängst, dass Kernfaktor Interleukin 6-Motive die gewebespezifische Gentranskription in Hypoxie mediierte (17) ; Aktivierung der Transkription beim Nuklearfaktor-Interle kin 6-DNA-Bindungsmotiv veränderte die Expression von multiplen Genen, die wichtig sind in irtadaption und Entwicklungsmechanismen.
Transgene Mäuse, die eine durch Mutation inaktivierte NF Interleukin 6-Stelle tragen, zeigten keine Zunahme der Genexpression nach Exposition zu Hypoxie. So wichtig sie jedoch sind, zeigten die meisten Studien von TFs kein klares Muster der eine konzertierte Wirkung von Transkriptionsfaktoren. Wir wendeten daher die subtraktive Hyb idi- sierung an, eine Technik zum Auffinden von Genen, um die Unterschiede bei der TF-Expres ion zwischen dem normoxischen und dem asphyktischen Rattenhirn in einem gut dokumentierten liermodell von PA aufzuzeigen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war demgemäss ein verlässliches Verfahren zur Detek ion von hypoxisch ischämischen Zuständen zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose von hypoxisch Ischamischen Zuständen und Krankheitsbildern, welches sich dadurch auszeichnet, dass in e ner von einem Patienten mit Verdacht auf hypoxisch ischämische Zustände und Krankheitsbilder ntnommenen Probe, die Anwesenheit und Menge wenigstens eines Transkriptionsfaktor- (TF)-cE NA
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InNFI/CAAT-Bindungsprotein (EMBL X92857), NF-kappa-B p65-Untereinheit (EMBL M62399), N-myc (EMBL X63281), basisches Helix-Schlaufen-Helix-Protein (EMBL D82868), MIBP1 (c-myc intron-Bindungsprotein) (EMBL D37951), SOX4 (EMBL X70683), neuronaler Todesfaktor (EMBL D83697), c-maf=c-Maf-Protein (Protooncogen) (EMBL S74567), PEBP2alphaA (PEBP majorTranskriptionsfaktor) (EMBL Af005936),
DNA-Bindungsprotein (Brn-2) (EMBL L27663), Homeodo- mainprotein (EMBL Af004431) und Zink-Finger-Transkriptionsfaktor (EMBL M65008), detektiert und quantifiziert.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert.
Beispiel : Verfahren : Tiere und Versuchsmuster
Asphyxie wurde induziert In Jungtieren, die durch Kaiserschnitt trächtiger Sprague-Dawley- Ratten (18, Review in 19) gewonnen wurden. Innerhalb des letzten Tages der Trächtigkeit, ermittelt durch Estabularium-Protokolle, wurden die Tiere durch Halsdislokation getötet und hysterektomiert.
Die noch die Föten enthaltenden Gebärmutterhörner wurden 20 min lang in ein Wasserbad bei 37 C gegeben Durch Kaiserschnitt gewonnene Kontrolljungtiere und asphyktische Jungtiere stammen von der selben Mutter, da jede Ratte etwa 10 bis 14 Jungtiere ergab. Nach der asphyktischen Phase von 10 oder 20 min, - d, h. Inkubation bei 37 C-wurden die Gebarmutterhömer rasch geöffnet und die Jungtiere entnommen. Die Jungtiere wurden durch Enthaupten 10 min nach der asphyktischen Phase getötet und die Gehirne rasch entfernt. Es wurden nur Würfe mit Jungtieren mit einem Gewicht von mehr als 4, 5 g zum Zeitpunkt des Gewinnens In den Versuchen verwendet.
Die Tierversuch wurden gemäss den Richtlinien der American Physiological Society durchgeführt.
Ganze Hirne (ein Vorrat von drei jeder Gruppe, d. h. von normoxischen Tieren, 10 min Asphyxie und 20 min Asphyxie) die für die subtraktiven Hybridisierungsstudien verwendet wurden, wurden
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wurden für die Isolierung von mRNA zur Verwendung des Quick Prep Micro mRNA-ReinigungsKits (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Sweden, Kat. 27 92 55 01) herangezogen.
1 Mikrogramm mRNA aus jeder Präparation wurde mit einem cDNA-Klonierungs-Kit (Gibco, Life Technologies, Eggenstein, Germany, Kat. 18248013) hinsichtlich Qualität überprüft, wobei der Einbau von [Atpha-P) dATP] (Amersham, Buckinghamshire, UK, Kat. AA0004)) mit nachfolgender Elektrophorese auf 1%-ig Agarose gefolgt von Autoradiographie verwendet wurde. Der Reflexionsfilm (Dupont NEF 496) wurde dem Gel für eine Zeitspanne von zwei Stunden bei Raumtemperatur exponiert.
Konstruktion der der subtraktiven Bank : 10 Mikrogramm jeweils von mRNA von Hirn von PA und Kontrollieren wurden durch UV-Bestrahlung bei 360 nm gemäss den Vorschriften In dem Subtraktor-Kit (invitrogen, Leek, Netherlands, Kat. K432001) biotinyliert. 1 Mikrogramm mRNA-Pools jeweils von dem DS-Hlrn Probe wurden der reversen Transkriptasereaktion (Subtraktor-Satz, Invitrogen) unterworfen und die cDNA-Vorräte wurden mit der entsprechenden biotinylierten mRNAs aus den Versuchstieren hybndisiert.
Die SH-Mischung wurde mit Streptavidin gemäss dem obigen Subtraktor-Kit inkubiert und so die biotinylierten Moleküle (nichtinduzierte, biotinylierte mRNAs und das Hybrid [biotinylierte mRNAs/ cDNAs]) komplexiert. Die Streptavidinkomplexe wurden durch wiederholte Phenol-ChloroformExtraktion entfernt und die subtrahierten cDNAs wurden aus der wasserigen Phase durch Alkohol- fällung (Subtraktor-Kit) abgetrennt.
Um subtrahierte cDNAs zu vermehren und zu kloneren, wurden sie mit Not l-Linkern ligiert, gefolgt durch Not t-Verdau. Die Not !-Linker tragenden cDNAs wurde in die Not l-Stelle des sPORT 1-Klonierungsvektors (cDNA-Klonierungs-Kit, Gibco) ligiert.
Um die Visualisierung von subtrahierten cDNAs zu ermöglichen, wurden die klonierten cDNAs unter Verwendung der universellen Primer I 5'-GT AAAACGACGACGGCCAGT -3'und
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II 5'-ACAGCTATGACCATG-3' aus der multiplen Klonierungsstelle des sPORT-1-Vektors (cDNA-Klonierungs-Kit Gibco) am) ! ! fi- ziert. Die amplifizierten cDNAs wurden durch 1%ige Agarose-Elektrophorese analysiert.
Klonieren von subtrahierten Not ! inkten cDNAs Not !-geklingte cDNAs, ligiert mit sPORT 1-Vektor, wurden für die Transformation von hochkompetenten INFalphaF'E. coli-Zellen (Invitrogen, Leek, Netherlands, Kat. C2020-03) verwendet und platierte Klone wurden durch einen Plasmidisolations-Kit (Quiagen, Hifden, Germany, Kat 12245) und Verdau mit Eco Rl/Hind 111 analysiert. Rekombinante Klone wurden durch K. G an- derath, MWG-Blotech (Ebersberg, Germany) sequenziert.
Homologien wurden durch computergestützen Vergleich der Daten aus der Genbanksequ nzbank : fastA@ebi. ac. uk (GBALL, Gen, Bank, EMBL, Heidelberg, Germany) bestimmt.
SH wurde kreuzweise ausgeführt, d. h. PA-Proben mRNA-Subtraktlon von der Kontrolle und umgekehrt beim 1 : 3-Niveau (asphyktisches Hirn-mRNA : normox sches Hirn mRNA). ! Ergebnisse SH zeigte, dass eine Reihe von Sequenzen im PA-Hirn verschieden ist vom normoxischen Hirn, die wie in Tabelle 1 gezeigt, als TF identifiziert wurden.
Tabelle 1 Bei 10 min Asphyxie wurden funf TF aufwärtsreguliert (NFI/CAAT-Bindungsportein, NF-kappaB p65, N-myc, basisches Helix-Schlaufen-Helix-Protein, c-myc-Intronbindungsprotein). Bei 20 min Asphyxie wurden nur zwei TF, SOX4 und der neurale Totfaktor als aufwärtsreguliert gefunden, eine Reihe von sechs TF (NF-H-Gen, c-maf, PEB-Haupttranskriptionsfaktor, brn-2, Homoedornainprotein und Zinkfingertransknptionsfaktor) wurden hinunterreguliert.
Die Unterschiede in der TF-Expression waren wenigstens dreifach, da in der subtrakt ven Hybridisierungsprozedur ein dreifacher Überschuss der entsprechenden mRNAs, wie oben ang ge- ben, verwendet wurden.
Fig. 1 (a-i) zeigt die Ausrichtung der Sequenzen, die in unseren Klonen gefunden sind (a ph) zu den Sequenzen aus der Genbank EMBL. Nur Sequenzen mit einer Homologie mehr als 0% wurden ausgerichtet.
TABELLE 1. TRANSKRIPTIONSFAKTOREN aufwärts- oder hinunterreguliert in perinataler Asphyxie
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<tb>
<tb> Nr. <SEP> Bank <SEP> Dauer <SEP> d. <SEP> Name <SEP> d. <SEP> EMBL <SEP> Orga- <SEP> Länge <SEP> der <SEP> % <SEP> Hompologie
<tb> Asphyxie <SEP> Gen <SEP> Nummer <SEP> nis-cDNA <SEP> Überlap- <SEP> dercDNA <SEP>
<tb> mus <SEP> pung
<tb> (bp)
<tb> # <SEP> A/C <SEP> 10 <SEP> min <SEP> NFI/CAAT- <SEP> X92857 <SEP> hs <SEP> 234 <SEP> 200 <SEP> 56
<tb> Bind. <SEP> prot. <SEP>
<tb>
11 <SEP> A/C <SEP> 10 <SEP> min <SEP> NF-kappa-B <SEP> M62399 <SEP> hs <SEP> 513 <SEP> 513 <SEP> 90
<tb> p65 <SEP> Untereinheit
<tb> 111 <SEP> AlC <SEP> 10 <SEP> min <SEP> N-myc <SEP> X63281 <SEP> rat <SEP> 272 <SEP> 272 <SEP> 100
<tb> IV <SEP> A/C <SEP> 10 <SEP> min <SEP> basisches <SEP> Helix- <SEP> D82868 <SEP> rat <SEP> 349 <SEP> 349 <SEP> 100
<tb> Schlaufen-HelixProtein
<tb> V <SEP> A/C <SEP> 10 <SEP> min <SEP> MIBP1 <SEP> D37951 <SEP> rat <SEP> 477 <SEP> 477 <SEP> 100
<tb> (c-myc <SEP> intron
<tb> Bindungsprotein)
<tb> VI <SEP> A/C <SEP> 20mmin <SEP> SOX4 <SEP> X70683 <SEP> hs <SEP> 388 <SEP> 388 <SEP> 94
<tb> VII <SEP> A/C <SEP> 20 <SEP> min <SEP> Neuronaler <SEP> D83697 <SEP> rat <SEP> 373 <SEP> 373 <SEP> 100
<tb> Todesfaktor
<tb> VIII <SEP> C/A <SEP> 20 <SEP> min <SEP> c-maf--c-Maf <SEP> S74567 <SEP> mouse <SEP> 410 <SEP> 404 <SEP> 53
<tb> Proton
<tb> (Protooncogen)
<tb>
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<tb>
<tb> Nr. <SEP> Bank <SEP> Dauer <SEP> d. <SEP> Name <SEP> d. <SEP> EMBL <SEP> Orga- <SEP> Länge <SEP> der <SEP> % <SEP> Homologie
<tb> Asphyxie <SEP> Gen <SEP> Nummer <SEP> n <SEP> : <SEP> s- <SEP> cDNA <SEP> Über <SEP> ! <SEP> ap- <SEP> dercDNA <SEP>
<tb> mus <SEP> pung
<tb> (bp)
<tb> IX <SEP> C/A <SEP> 20 <SEP> min <SEP> PEBP2alphaA <SEP> Af005936 <SEP> mouse <SEP> 323 <SEP> 323 <SEP> 97
<tb> (PEBP <SEP> majorTranscriptionsfaktor)
<tb> X <SEP> C/A <SEP> 20 <SEP> mln <SEP> DNA <SEP> Bindungs- <SEP> L27663 <SEP> rat <SEP> 235 <SEP> 235 <SEP> 100
<tb> protein <SEP> (Brn-2)
<tb> XI <SEP> C/A <SEP> 20 <SEP> min <SEP> Homeodomain- <SEP> Af004431 <SEP> rat <SEP> 237 <SEP> 237 <SEP> 100
<tb> protein
<tb> XII <SEP> C/A <SEP> 20 <SEP> min <SEP> Zink-Finger-M65008 <SEP> rat <SEP> 405 <SEP> 405 <SEP> 100
<tb> Transcriptionsfaktor
<tb>
A/C-Durch Asphyxie induzierte Transkription
C/A-Durch Asphyxie hinunterregulierte Transkription
Die etwa 5000 TF in einem Säugetierhirn sind von fundamentaler Bedeutung für die Hirnfunktionen, wie Verknüpfungen im Hirn, Entwicklung, Reparatur, Plastizität, um einige wenige zu nennen (22). Wir fanden eine Änderung der steady-state von TF-mRNA im neonatalen Rattenhim mit PA schon ab 10 min nach 10 oder 20 min Asphyxie.
Bei 10 min PA war eine Sequenz die den nuklearen Faktor I/CAAT-Bindungsprotein repräsentiert aufwärtsreguliert. Bislang wurde diesem spezifischen TF keine Funktion zugeordnet (23) und dies ist der erste Bericht der NFI in der Säugetierpathophysiologie eine mögliche Rolle zuordnet.
NF-kappa B p65 (p65) wurde in unserer Studie bei 10 min Asphyxie aufwärtsreguliert und ist bereits als in Hypoxie verwickelt gezeigt worden, indem es die NAD (P) H : Quinonoxidoreduktase in vitro induziert (24). Koong und Mitarbeiter haben gezeigt, dass Hypoxie die Aktivierung des Nuklearfaktors kappa B in vitro durch die Phosphorylierung von I kappa B Alpha auf Tyrosinresten verursacht. Es ist bekannt, dass die Aktivierung von NF-kappa B eine Vielzahl von frühen Antwortgenen induziert (25). Wir konnten hiermit die Relevanz dieses TF für den hypoxischen Zustand von PA in vivo bestätigen.
Die Aufwärtsregulieren von N-myc, das im Hirn von Ratten mit einer asphyktischen Spanne von 10 min gefunden wurde, kann die Verwicklung in den apoptotischen Wegen reflektieren Die Teilnahme einer Reihe von myc-Protoonkogenen in den apoptotischen Wegen wurde beschrieben (26) und wir haben beschrieben, dass die Apoptose im Hirn von perinatal asphyktischen Ratten in dem oben beschriebenen Modell (27) stattfindet.
Das neue basische Helix-Schlaufen-Helix-Protein (bHLH) D82868 wurde bei 10 min von PA aufwärtsreguliert. Es ist einer der bHLH-TF, der bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems eine wesentliche Rolle spielt und der ausschliesslich im Hirn exprimiert wird (28). Die einzige Veröffentlichung, die über diesen TF erhältlich ist, beschreibt das molekulare Klonieren aus dem Rattenhirn und wir ordnen der Pathophysiologie von PA in der frühen Phase eine vorläufige Rolle zu.
Es wurde bereits beschrieben, dass Mitglieder der bHLH-Familie in hypoxischen Zuständen involviert sind : Das am meisten bekannte Mitglied ist das HIF-1, Sim-2 hemmt die Transkription durch aktive Repression und funktionelle Interferenz des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 (29) und ein bHLHPAS-Faktor mit einer Sequenzhomologie zu HIF-1 bindet in der Hypoxie zu dem HIF-1 kontrollierenden, vakulären, endothelischen Wachstumsfaktor (30).
Der fünfte TF, der bei 10 min von PA überexprimiert wird, ist das c-myc-Intron-Bindungsprotein (MIBP1). Der einzige veröffentlichte Bericht beschreibt das Kloneren und die Charakterisierung aus der Ratte, es ist reichlich im Hirn und enthält Zinkfingerregionen und bis jetzt wurde keine Funktion gezeigt. Wie oben vorgeschlagen, kann es sehr wohl mit myc-Motiven in dem Verfahren der Apoptose im Hirn von Ratten mit PA wechselwirken (31).
Zwei TFs werden bei 20 min PA im Rattenhirn aufwärtsreguliert : SOX4 ist ein Mitglied der
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hoch beweglichen Gruppen TF und es wurde gezeigt, dass es den menschlichen CD2-Verstä ker transaktiviert (32). Die beschriebene T-Zellen-und lymphoidspezifische Transkriptionsfunktion von SOX4 kann auf das Hirn ausgedehnt werden, wo es eine Funktion unterschiedlich zu der in L mphozyten haben kann Es kann durch seine Wechselwirkungen mit Interleukm - 2 NF-AT (32) zur PA-Pathophysiologie beitragen.
Der neuronate Todesfaktor D83697 wurde durch differentielles Display-Screening gefun en, ein Verfahren zum Suchen von Genen vergleichbar mit unserer Methode von SH. Dieser Faktor wurde durch Deprivation des Nervenwachstumsfaktors mit einer Spitze 15 Stunden nach der Induktion dessen programmierten, neuronalen Todes induziert. Überexpression des neuron len Todesfaktors in kultivierten Neuronen war für sich hinreichend, um Apoptose zu induzieren (3).
Diese Feststellungen zusammen mit unserer Beobachtung der frühen Aufwärtsregulierung legt
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Das Protooncogen c-maf ist ein basischer Zipper TF und ist verantwortlich für die gewebe pe- zifische Expression von lnterleukin-4 (34). Es wird im Hirn stark exprimiert und kann in der konzertierten Aktion mit anderen Protoonkogenen in Entwicklungsprozessen involviert sein (22,35). (ur- schner und Morgan haben gefunden, dass maf die Transkription von mehrfachen Stellen In einem Promotor stimuliert, der die Purkinje neuron-spezifische Genexpression dirigiert (36). Überdies kann Maf an AP-1-Stellen binden und bildet mit Fos und Jun Heterodimere (37) und dieses b Idet eine Verbindung zu einer Bedeutung von AP-1 in Hypoxie wie oben in der Einleitung erwähnt (3.
Die Regulierung von PEBP2alpha bei 20 min PA nach unten kann als die Regulierung ach unten eines anderen Protooncogens angesehen werden, zumal Stewart und Mitarbeiter diese TF als ein direktes Onkogen beschrieben haben und überdies eine Wechselwirkung mit myc Plotooncogenen berichtet worden ist (38).
Brn-2 ist ein zentrales Nervensystem-spezifischer POU-Domain TF, das in Migrati ns- und/oder Reifungsprozessen im Hirn eine Rolle spielt (39). Die Entfernung des genomischen 3rn- 2-Lokus beeinflusst die terminale Differenzierung und/oder die Beibehaltung von hypothalamisc en, neurosekretorischen Neuronen (40, 41) und in der Tat haben wir In dem Tiermodell von PA, da für die vorliegende Studie verwendet worden ist (nicht veröffentlicht) morphologische Abnormalit ten in Ratten festgestellt, die 20 min Asphyxie drei Monate lang überlebt haben.
Fuji und Ha ada berichteten 1993, dass Brn-2 überhaupt für die Bildung neuralen Zell-Linien von Säugetieren bentigt wird : Wenn die Brn-2-lnduktlon durch Antisense-RNA blockiert oder verzögert wurde, w ren undifferenzierte Zellen nicht in der Lage sich zu Neuronen und Astrozyten zu differenzieren tata- dessen differenzierten sie in nonneurale Zellen einschliesslich glatter und Skelettmuskelzellen 42). Die Regulierung nach unten bei 20 min PA kann sehr wohl Defekte der Hirnentwicklung und der Funktion erläutert werden, die PA begleitet und folgt (19).
Es gibt nur einen molekular-biologischen Nachweis für das homoedomäne Protein Afoot 431 und es sind keine funktionellen oder biologischen Daten verfügbar und Sch ! ussfo ! gerungen können nicht direkt von Funktionen der homeodomänen Superfamilie gezogen werden. Manak und cott haben zusammengefasst, was über die konservierten Homeobox-Gen-Funktionen bekannt ist 43).
Das Ergebnis dieses individuellen homeodomanen Proteins - Regulation nach unten im perir atalen, asphyktischen Hirn ist ein erster, vorläufiger Schlüssel zu einer möglichen Rolle In dem P thomechanismus von PA.
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M65008 in PA schon 10 min nach einer asphyktischen Periode von 20 min nach unten. Dieser TF ist ein Zinkfinger-Transkriptions-Aktivator und ein Mitglied der GSG-Element-Bindeprotein-Fa ilie und repräsentiert das Nervenwachstumsfaktor-induzlerte frühe Antwortgen NGFI-C. N FI-C mRNA ist innerhalb von Minuten der Stimulation von PC12-Zellen durch den Nervenwachst ms- faktor induziert (45).
In unserem Tiermodell von PA, eine Sequenz 100% homolog zu dem Nervenwachstumsf : ! ktor J04154 wird etwa dreifach bel 20 min PA überexpremiert (nicht veröffentlicht), möglicherweise zu spät, um den Zinkfinger TF M65008 (NGFI-C) zu induzieren Da die Tiere unseres Versu hes
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asphyktische Perioden länger als 20 min nicht überleben, kann die Regulation von NGFI-C nach oben, die in chronischen, hypoxischen Zuständen gefunden wurde, für unsere derzeitigen PA-Studien nicht relevant sein.
Zusammenfassend haben wir durch Anwendung der Genauffindungsmethode der SH ein Muster von TF-Expression in einem einfachen, gut dokumentierten Tiermodell von PA etabliert. Modifikation der TF-Expression schloss verschiedene Klassen von TF einschliesslich POU, Zinkfinger, Homeodomain und basische Helix-Schlaufen-Helix-Motive ein. Diese Änderungen können mithelfen, die Hirnschädigung und Zerstörungsfunktion während und nach PA zu erklären. Unsere Feststellungen können zum Verstehen der postnatalen gestörten Hirnentwickiung hinsichtlich Struktur, Verknüpfung und Pathologie von perinataler Asphyxie beitragen. Die Änderung der konzentrierten Wirkung von TF, nämlich das pathophysiologische Muster von TF, das entwickelt wurde, kann auch die Basis für das Auffinden von Markern für die Hirnschädigung in PA bilden.
Obwohl Expressionsunterschiede individueller Transkriptionsfaktoren (TF) bei Ischämie und Hypoxie berichtet wurden, ist keine Information über TF in perinataler Asphyxie (PA) verfügbar.
Daten über TF aus Ischämie oder Hypoxie können nicht einfach auf PA übertragen werden und es wurden keine Studien berichtet, wie ein Expressionsmuster oder eine konzentrierte Aktion von TF zeigen.
Wir haben daher eine Genauffindungstechnik, subtraktive Hybridisierung angewendet, um die Sequenzen verschieden im Hirn von normoxischen und perinatalen, asphyktischen (10 und 20 min von Asphyxie) Ratten zu zeigen. Diese subtrahierten Sequenzen wurden durch Genbank identifiziert und einzelnen Genen zugeordnet.
Bei 10 min PA wurden die TP NFI/CAAT-Bindungsprotein, NF-kappa-B p65, N-myc, basisches Helix-Schlaufen-Helix-Protein D82868 und c-myc intron Bindungsprotein aufwärtsreguliert. Bei 20 min PA wurden die TF SOX4 und neuronaler Todesfaktor aufwärtsreguliert, wogegen die TF c-maf, PEBP major Transkriptionsfaktor, brn-2, Homeodomain-Protein Af004431 und ZinkfingerTranskriptionsfaktor M65008 nach unten reguliert wurden.
Die biologische Bedeutung unserer Feststellung, ist das Aufzeigen des pathophysiologischen Musters von TF einschliesslich POU, Zinkfinger, Homeodomäne und basisches Helix-SchlaufenHelix-Motiv in PA, das Vorschlagen von Pathomechanismen für die Hirnschädigung durch PA, Erläuterung transkriptionaler Änderungen im allgemeinen (wie beispielsweise NF-kappa-B p65, usw) oder in speziellen Begriffen (wie beispielsweise der neuronale Todesfaktor).
Diese Ergebnisse stellen die molekular-biologische Basis für weitere Studien der bislang schlecht verstandenen komplexen Pathophysiologie von PA dar und fordern diese heraus.
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Menge wenigstens eines Transkriptionsfaktor- (TF)-cDNA in vitro festgestellt wird.