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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion und Herstellung von Vakzin- und Diagnostika- Präparationen gegen Pathogene verschiedenster Art.
Mit der systematischen Einführung von Schutzimpfungen konnten in unserem Jahrhundert viele schwere Infektionskrankheiten zurückgedrängt werden. Krankheiten, wie Kinderlähmung, Tetanus, Diphtherie, Pocken und Meningitis, die früher fatale Folgen hatten, haben durch gezielte flächendeckende Impfprogramme ihren Schrecken verloren. Pocken konnten sogar im Jahre 1980 von der WHO als ausgerottet erklärt werden. Mit der Einführung der rekombinanten DNA-Techno- logie gelang es auch, Impfstoffe zu entwickeln, die zuvor zwar prinzipiell möglich waren, deren breite Anwendung aber durch die geringe Menge an Impfstoff-Material nicht realisiert werden konnte. Beispiele hierfür sind die Vakzine gegen das Hepatitis B-Virus und gegen Keuchhusten (verursacht von Bordetella pertussis).
Leider zeigen Infektionskrankheiten gegenwärtig wieder einen starken Anstieg. Dies liegt zum einen daran, dass immer neue, komplexere Infektionskrankheiten auftreten, wie z. B. Hepatitis C, AIDS, hämorrhagische Darmerkrankungen, etc., zum anderen auch daran, dass manche Erreger gegen die etablierten Impfstoffe resistent geworden sind. Gleichzeitig sind auch viele Erreger, die bislang erfolgreich medikamentös behandelt werden konnten, resistent gegen diese Medikamente geworden. Besonders ist hier auf die Behandlung von Lungen- oder Hirnhautentzündungen, Darm- infektionen oder Krankheiten, wie Tuberkulose oder Malaria, hinzuweisen. Vor allem die zuneh- mende Antibiotika-Resistenz bakterieller Krankheitserreger stellt die weltweite Gesundheitspolitik vor grosse Probleme.
Es erscheint daher wünschenswert, gegen diese Infektionskrankheiten wirksame Vakzine zur Verfügung zu stellen. Leider ist das Auffinden von effizienten und sicheren Impfstoffen eine auf- wendige Tätigkeit. Effiziente Vakzine sind meist direkt vom Erreger abgeleitet, beispielsweise durch chemische oder physikalische Inaktivierung oder durch Attenuierung (Abschwächung) des Erregers. Derartige Vakzine steilen aber prinzipiell ein Sicherheitsrisiko dar, da es bei einer unge- nügenden Inaktivierung zu tatsächlichen Infektionen kommen kann. Auf der anderen Seite kann eine zu drastische Inaktivierung zu Denaturierungen führen, die sowohl die Effizienz des Impf- stoffes reduzieren als auch zu Nebenwirkungen führen können.
Die Herstellung von rekombinanten Vakzinen ist zwar prinzipiell einfach, vor allem hinsichtlich der Herstellung grosser Mengen, die für eine weltweite Impfkampagne erforderlich sind, jedoch ist die Effizienz des rekombinant hergestellten Impfstoffes oft nicht mit der Effizienz des biogenen Vakzins vergleichbar. Die Gründe hierfür liegen oft in der nicht-Nativität der rekombinanten Vak- zine, so dass in der vakzinierten Person nicht ganz exakt die Antikörper gebildet werden, die zu einer effizienten Bekämpfung einer Attacke mit dem Pathogen erforderlich wären.
Hierzu werden im Stand der Technik nunmehr aufwendige computerunterstützte Modellie- rungsverfahren vorgeschlagen, mit deren Hilfe rekombinante Vakzine optimiert werden sollen (Rappuoli et al., Spektrum der Wissenschaft, Spezial 6 : Pharmaforschung (1997), Seiten 60-69).
Bedingt durch die Tatsache, dass immer mehr von der genetischen Basis der wichtigsten Krank- heitserreger bekannt wird (von zahlreichen Pathogenen liegt das gesamte Genom bereits vollstän- dig sequenziert vor), erhofft man sich von diesem Ansatz besonders viel. Jedoch ist der Zeit- und Arbeitsaufwand bei derartigen Vakzinen enorm, da nicht nur das prinzipielle gezielte Design durch molekulares Modellieren erforderlich ist, sondern die aufgrund dieser Berechnungen geschaffenen Vakzine oft beim praktischen Einsatz von den vorausgesagten Bindungseigenschaften abweichen und daher zunächst umfangreichen grundlegenden Tests unterzogen werden müssen.
Bei einem anderen Ansatz wird versucht, zunächst über DNS-Vakzine, die aufgrund vorher- gesagter ORFs geschaffen worden sind, in Mäusen eine Immunantwort zu erzeugen und über die Voraussage von HLA-Superfamilien bindenden T-Zell-Epitopen geeignete Vakzin-Kandidaten zu ermitteln (Hoffman et al., Nature Med. 4 (1998), Seiten 1351-1353).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur Herstellung von Vakzinen gegen Pathogene zur Verfügung zu stellen, mit weichem effiziente Vakzine rasch und kostengün- stig entwickelt werden können. Dabei soll möglichst das Wissen um die genetische Information der
Pathogene optimal genutzt werden. Weiters sollen Vakzine geschaffen werden, die vom Immun- system des Geimpften leicht in einen sicheren Schutz gegen das jeweilige Pathogen transformiert werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren zur Selektion und Herstellung
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von Vakzin- und Diagnostika-Präparationen gegen einen bestimmten pathogenen Organismus, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Immunisieren eines nicht-humanen Vertebraten mit einer Präparation des pathogenen
Organismus, - Entnehmen von Proben, die Antikörper gegen die Pathogen-Präparation enthalten, vom immunisierten Vertebraten und gegebenenfalls Aufarbeiten dieser Proben, - Herstellen einer in Wirtszellen exprimierbaren Genbank des Genoms des pathogenen
Organismus, wobei die Pathogen-Polypeptidsequenzen exprimierenden Genbank-Wirts- zellen, hinsichtlich ihrer Bindung zu einem Antikörper selektierbar sind, - Identifizieren von antigenen Polypeptiden durch Kontaktieren der Genbank mit der ent- nommenen,
Antikörper-hältigen Probe und Selektieren der Genbank auf diejenigen Klone, deren exprimierte Polypeptide eine Antikörper-Bindung eingehen, - Isolieren und Fertigstellen der identifizierten antigenen Polypeptide zu einer Vakzin- oder
Diagnostika-Präparation.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es in schneller und effizienter Weise möglich, ein Vakzin oder ein Diagnostikum gegen ein beliebiges Pathogen zu entwickeln, das von einem zu impfenden Organismus optimal zu einer verlässlichen Immunisierung führt. Mit der Selektion der Genbank des Pathogens auf Bindung (= Erkennung) zu einem Antikörper, dessen Bildung durch das (native) Pathogen bereits im infizierten nicht-humanen Vertebraten sichergestellt worden ist, erhält man erfindungsgemäss jedenfalls ein Polypeptid, das natürlicherweise antigen ist, wobei dessen Antigenizität eben durch die Selektion selbst sichergestellt wird.
Die erfindunggemässen Vakzine oder Diagnostika können zur Immunisierung oder Diagnose von beliebigen Tierarten herangezogen werden, jedoch ist die bevorzugte Anwendung im humanen Bereich. Bevorzugte Tierpathogene sind Pathogene für landwirtschaftliche Nutztiere oder für Haus- tiere.
Mit den erfindungsgemässen Diagnostika kann ein verlässliches Nachweissystem für die Infek- tion mit einem bestimmten Pathogen zur Verfügung gestellt werden, das - versehen mit einem geeigneten Marker - zur routinemässigen Testung von potentiell mit diesem Pathogen infizierten Organismen verwendet werden kann.
Auf diese Weise erhält man mit dem erfindungsgemässen Verfahren Polypeptide, die in der Lage sind, Antikörper in einem Vertebraten zu erzeugen. Für die Herstellung der erfindungsge- mässen Vakzine können dabei die unmittelbar aus der Genbank selektierten Polypeptide heran- gezogen werden, indem beispielsweise diese direkt durch Amplifizieren der Wirtszellen und anschliessender Gewinnung des Polypeptides aus diesen Zellen aufgereinigt werden. Es ist aber auch möglich, aufgrund der selektierten Polypeptide bzw. deren genetischer Information (die Teil der Wirtszellen ist und daher direkt erhalten werden kann) geeignete Vakzine zu designen Beispielsweise können die selektierten Polypeptide im Gesamtgenom des Pathogens lokalisiert und bestimmten Pathogen-Proteinen zugeordnet werden, insbesondere wenn das gesamte Genom bereits sequenziert ist.
Prinzipiell ist diese Vorgangsweise aber auch für Pathogene möglich, von denen nur eine grobe Kartierung vorliegt. Dann können diese Pathogen-Proteine entweder als Ganzes oder in trunkierter Form zur Vakzin-Herstellung herangezogen werden. Welche Teile des Proteins gegebenenfalls trunkiert werden können, richtet sich nach den erfindungsgemäss selek- tierten Polypeptiden, die bevorzugterweise möglichst vollständig in ihrer antigenen Form im herge- stellten Vakzin verbleiben sollten. Falls zwei oder mehrere antigene Polypeptide einem Pathogen- Protein zugeordnet werden können, kann die Kombination zumindest dieser Polypeptide oftmals zu einem besonders vorteilhaften Vakzin führen.
Falls die antigenen Polypeptide im Pathogen-Protein nicht aneinandergrenzend sind, kann es sich auch empfehlen, einen Spacer zwischen den Poly- peptiden vorzusehen, bevor das Vakzin fertiggestellt wird.
Die erfindungsgemässe Isolierung und Fertigstellung der Vakzine oder Diagnostika kann daher die obigen Schritte der Designanpassung mitumfassen. Die Isolierung kann auch ausschliesslich auf DNA-Niveau vorgenommen werden, d. h. dass die genetische Information bezüglich der anti- genen Polypeptide aus den selektierten Wirtszellen beispielsweise in einen weiteren Expressions- vektor übernommen, in pharmazeutisch geeigneten Expressionszellen expnmiert und zu einer pharmazeutischen Präparation aufgearbeitet wird. Auch das Vakzin oder das Diagnostikum selbst kann auf DNA-Niveau zur Verfügung gestellt werden ; die Technologie für DNA-Vakzine ist
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prinzipiell bekannt und entsprechende Träger- oder Verabreichungssysteme, wie z. B. durch Pow- der-Ject-Injektionen, sind beschrieben.
Mit dem erfindungsgemässen System können Vakzine oder Diagnostika gegen alle infektiösen Pathogene entwickelt werden, also beispielsweise gegen Bakterien, Viren, Pilze, Protozoen, etc..
Das erfindungsgemässe Verfahren ist aber besonders gut für Pathogene geeignet, die ein ver- gleichsweise kleines Genom haben, das entweder leicht sequenziert werden kann oder schon voll- ständig sequenziert ist. Demgemäss sind erfindungsgemäss vor allem Vakzine oder Diagnostika gegen bakterielle oder virale Pathogene bevorzugt.
Als nicht-humaner Vertebrat, der erfindungsgemäss mit der Pathogen-Präparation infiziert wird, eignen sich alle Tiere, die auf Infektion mit einem Pathogen eine ausreichende Generierung von Antikörpern zeigen, also z. B. Amphibien, Reptilien, Vögel oder Säugetiere. Dabei kommen bevor- zugt Tiere zum Einsatz, die bereits im immunologischen Labor etabliert sind, wie Frösche (z.B.
Xenopus laevis), Hühner oder Nagetiere, insbesondere Hasen, Ratten oder Mäuse. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-humanes Säugetier mit einer Präparation des pathogenen Organismus immunisiert. In vielen Fällen kann davon ausge- gangen werden, dass es vorteilhaft ist, wenn das Versuchstier dem Organismus, der das erfin- dungsgemässe Vakzin erhalten soll, dem infizierten Tier möglichst nahe verwandt ist, da so die Immunreaktionen weitgehend ähnlich verlaufen.
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird zunächst einem nichthumanen Vertebraten eine Präparation des ausgewählten Pathogens verabreicht, so dass im Vertebraten eine Immunreaktion ausgelöst wird. Wesentlich ist, dass bei dieser Immunreaktion, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung der Einfachheit halber mit "Immunisierung" bezeichnet wird, Antikörper gegen das Pathogen im Vertebraten gebildet werden. Diese Antikörper werden im Anschluss an die Immuni- sierung dem Vertebraten entnommen und gegebenenfalls zu einer gereinigten Antikörper-Präpara- tion mit üblichen Methoden aufgereinigt. Beispielsweise kann dem Vertebraten Serum entnommen werden, woraus die zur Selektion der Genbank verwendete Antikörper-Präparation hergestellt wird.
Die Immunisierung der Vertebraten kann mit subletalen oder mit letalen Dosen durchgeführt werden; die Entnahme der Antikörper kann einmalig, z. B. nach Tötung der Tiere, oder in mehreren Chargen, z. B. nach mehreren Verabreichungen der Pathogen-Präparation, erfolgen.
Vorteilhafterweise werden die Vertebraten derart ausgewählt, dass neben der Bildung von Anti- körpem auch eine Bildung von Antigen-erkennenden Zellen des zellulären Systems des Immun- systems durch die Verabreichung der Pathogen-Präparation verursacht wird. Diese Zellen können dann erfindungsgemäss zur weiteren Selektion der erfindungsgemäss identifizierten Polypeptide herangezogen werden, indem beispielsweise diese Peptide oder die diesen Peptiden zugehö- renden Pathogen-Proteine auf ihre Bindungsfähigkeit gegenüber diesen Zellen getestet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden daher neben Antikörper-enthaltenden Proben zusätzlich Antigen-erkennende Zellen des zellulären Sys- tems des Immunsystems aus dem immunisierten Vertebraten entnommen, mit welchen die identi- fizierten antigenen Polypeptide weiter selektiert werden, indem die identifizierten antigenen Poly- peptide oder die den identifizierten antigenen Polypeptiden zuzuordnenden vollständigen Proteine des Pathogens auf ihre Bindungsfähigkeit zu den Antigen-erkennenden Zellen getestet werden und diejenigen Polypeptide oder Proteine zum Fertigstellen ausgewählt werden, die eine Bindungs- fähigkeit zu den Zellen zeigen.
Für diese Ausführungsform werden bevorzugterweise Vertebraten vorgesehen, bei welchen die zellulären Komponenten des Immunsystems leicht zu entnehmen und handzuhaben sind. Dazu gehören besonders Vögel und Säugetiere, die mit Thymus, Milz, (Bursa) und Lymphknoten leicht zu entnehmende Quellen für derartige Zellen haben, deren Entnahme seit langem etabliert ist.
Bevorzugterweise werden T-Zellen als Antigen-erkennende Zellen des zellulären Systems des Immunsystems aus dem immunisierten Vertebraten entnommen. Erfindungsgemäss können daher vorzugsweise dem immunisierten Vertebraten Milz und Lymphknoten entnommen werden, woraus eine Antigen-erkennende Zellen-hältige Suspension hergestellt wird, mit der die Bindungsfähigkeit der identifizierten Polypeptide oder der zugeordneten Proteine gegenüber den Antigen-erkennen- den Zellen getestet wird.
Bei der weiteren Selektion der identifizierten antigenen Polypeptide unter Verwendung der
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Antigen-erkennenden Zellen kann entweder die Bindungsfähigkeit der Polypeptide selbst gegen- über diesen Zellen untersucht werden, oder es kann getestet werden, ob bestimmte andere Berei- che des Pathogen-Proteins, dem das Polypeptid zugeordnet werden kann, Bindungsfähigkeit gegenüber diesen Zellen aufweisen. Oft sind nämlich jene Bereiche des Pathogen-Proteins, die eine humorale Immunantwort auslösen können, nicht mit jenen identisch, die eine Bindungsfähig- keit zur zellulären Immunantwort aufweisen. Hierbei können daher Teile oder das gesamte Patho- gen-Protein, welchem ein oder mehrere identifizierte antigene Polypeptide zugeordnet werden können, dem Bindungstest gegenüber den Antigen-erkennenden Zellen zugrundegelegt werden.
Die Auswahl der Teilsequenzen wird daher praktischerweise anhand der bekannten oder vorher- gesagten Proteinstruktur derart vorgenommen, dass antigene Motive möglichst vollständig erhalten bleiben. Ein bevorzugtes Verfahren zeichnet sich daher dadurch aus, dass eine Kombination aus Teilsequenzen des den antigenen Polypeptiden zugeordneten vollständigen Pathogen-Proteinen der Selektion hinsichtlich der Bindungsfähigkeit zugrunde gelegt werden
Vorteilhafterweise wird zur einleitenden Infektion des Vertebraten eine Pathogen-Präparation eingesetzt, die das vollständige Pathogen enthält. Damit kann der Vertebrat eine Immunantwort produzieren, die ganz auf das native Pathogen gerichtet ist und daher gewährleistet, dass die erfin- dungsgemäss aufgefundenen Vakzine einen verlässlichen Impfschutz gegen das native Pathogen verleihen.
Oft ist aber die Infektion des Vertebraten mit dem Gesamt-Pathogen nicht möglich, z. B. wenn es den Vertebraten tötet, bevor eine ausreichende zelluläre und humorale Immunantwort aufgetre- ten ist, so dass ein weiteres erfindungsgemässes Vorgehen nicht stattfinden kann. Dann muss von einer inaktivierten Präparation des Pathogens ausgegangen werden. In dieser Hinsicht hat sich erfindungsgemäss bewährt, ein Homogenisat des Pathogens zum initialen Immunisieren des Vertebraten einzusetzen. Es hat sich gezeigt, dass auch hierbei ein effizienter Schutz gegen das native Pathogen erzielt werden kann, insbesondere, wenn bei der Homogenisierung darauf geach- tet wird, die Pathogene nicht mit denaturierenden Methoden zu behandeln.
Auch fixiertes pathogenes Material (z.B. inaktiviertes oder cross-linked Material) ist erfindungs- gemäss zur Immunisierung des Vertebraten verwendbar. Diese Vorgangsweise kann sich z. B. bei sehr infektiösen Pathogenen, deren Handhabung umständlich und gefährlich ist, empfehlen.
Eine besonders effiziente Immunantwort kann bei Vertebraten ausgelöst werden, wenn die zum Immunisieren eingesetzte Pathogen-Präparation ein Adjuvans umfasst. Vorteilhafterweise werden organische Polykationen oder eine Mischung organischer Kationen als Adjuvantien einge- setzt. Besonders bevorzugte Adjuvantien sind basische Polypeptide, insbesondere Polyarginin oder Polylysin.
Mit der vorliegenden Erfindung können wie erwähnt Vakzine und Diagnostika gegen eine Viel- zahl von Pathogenen hergestellt werden. Bevorzugterweise werden allerdings Vakzine gegen Human-Pathogene zur Verfügung gestellt, für die keine oder nur eine unzureichende Immunisie- rungsalternative vorhanden ist und/oder bei denen Resistenzen bei vorhandenen chemischen oder immunologischen Behandlungen auftreten. Bevorzugte Pathogene, die im Rahmen der vorliegen- den Erfindung bekämpft werden sollen, können daher aus der Gruppe Borrelia burgdorferi, Chlamydia spp., Gruppe A-Streptokokken, Nicht-typisierbare Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumomae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylokokkus aureus, Pseudo- monas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Shigella spp., Toxoplasma gondi, oder Treponema palli- dum ausgewählt werden.
Weitere bevorzugte Pathogene sind pathogene Aspergillus-, Candida-, Mycobacterium-, Rhizo- pus-, Trichophyton-, Microsporum-, Trypanosoma-, Pneumocystis-, Plasmodium-, Meningokokkus- und Chlostridien-Stämme sowie Retroviren oder hämatogene Viren.
Da bei der zellulären Erkennung der pathogenen Proteine die exakte native räumliche Struktur nicht erheblich ist, werden bevorzugterweise dem Test zur Bindungsfähigkeit gegenüber den Anti- gen-erkennenden Zellen Polypeptide zugrundegelegt, die mit einem Polypeptid-Sequenzer herge- stellt worden sind.
Die Wahl der Genbank oder der Wirtszellen kann beliebig erfolgen ; ist, dass die Genbank-Wirtszellen aufgrund der Bindung der exprimierten Polypeptide zu den dem Vertebraten entnommenen Antikörper selektiert werden. Demgemäss sollten einfacherweise die exprimierten Polypeptide an der Aussenseite der Zellen präsentiert werden, etwa als Teil einer äusseren Domäne
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eines Membranproteins. Die Länge der exprimierten Polypeptide wird dann anhand der jeweiligen Erfordernisse des Genbank/Wirtszell-Systems gewählt, liegt aber oft im Bereich zwischen 10 und 200 Aminosäuren, insbesondere zwischen 20 und 100 Aminosäuren.
Die Selektion der Zellen kann dabei beispielsweise über ein System erfolgen, bei welchem durch die Bindung des Antikörpers an das exprimierte Polypeptid die Bindungsstelle für ein Selektions-Agens oder ein Transport-Kanal für das Selektions-Agens blockiert wird. Ein besonders vorteilhaftes System für eine derartige Selektion ist in der WO 99/30151 A beschrieben, deren Inhalt hiermit in die vorliegende Anmeldung inkludiert wird. Vorzugsweise werden daher die exprimierten Polypeptide als Teil eines Membran- proteins der Genbank-Wirtszellen nach aussen präsentiert. Weiters ist ein Selektions-System bevor- zugt, bei welchem die Genbank-Wirtszellen aufgrund der Bindung eines Antikörpers zum expri- mierten Polypeptid gegen ein Selektions-Agens resistent werden.
Besonders bewährt in diesem bevorzugten System haben sich diejenigen Ausführungsformen, bei welchen die Selektion durch ein virales Agens erzielt wird, das für die Genbank-Wirtszellen pathogen ist. Hierbei kann der Virus-Rezeptor in den Zellen derart konstruiert werden, dass dieser durch die Bindung des Antikörpers zum exprimierten Polypeptid blockiert wird, beispielsweise durch intermolekulare Wechselwirkung oder durch sterische Blockierung. Vorzugsweise weisen derartige Genbank-Wirtszellen ein OmpA-, LamB- oder FhuA-Selektionssystem auf.
Wenn durch die Genbank-Selektion ein oder mehrere Polypeptide identifiziert worden sind, die eine Bindung zu einem der im Vertebraten gebildeten Antikörpern eingehen, können diese im Genom des Pathogens lokalisiert und bestimmten Pathogen-Proteinen (oder ORFs) zugeordnet werden. Voraussetzung ist dabei natürlich, dass bereits zumindest eine grobe Genkartierung des Pathogens vorliegt. Besonders vorteilhaft ist allerdings, wenn bereits die vollständige Gensequenz des Pathogens vorliegt. Bevorzugterweise werden demgemäss die selektierten antigenen Polypep- tide unter Zugrundelegen einer Genomanalyse des pathogenen Organismus definierten Proteinen dieses pathogenen Organismus zugeordnet werden und diejenigen antigenen Polypeptide, die demselben Protein zugeordnet worden sind, kombiniert.
Diese Polypeptid-Kombinationen können dann dem Bindungstest gegenüber Antigen-erken- nenden Zellen zugrunde gelegt werden, gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Teilsequen- zen des zugeordneten Pathogen-Proteins (oder auch als Gesamtprotein)
Die Bestimmung der Bindungseigenschaft kann mit einer Vielzahl von Tests vorgenommen werden. Die derzeit gebräuchlichsten sind in Romero et al. (Mol.Med.Today 4 (1998), Seiten 305-312) beschrieben, darunter auch der Elisspot-Assay, mit welchem T-Zellen, die eine Bindung mit einem (MHC-II-präsentierten) Antigen eingehen, aufgrund ihrer Cytokin-Ausschüttung (zumeist Interferon-y) identifiziert werden können.
Dieser Test ist nicht nur etabliert, standardisierbar und einfach handhabbar, er ist auch überaus empfindlich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, insbesondere da für diesen Test keinerlei zelluläre in vitro Proliferation erforderlich ist. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird daher die Bindungs- fähigkeit gegenüber den entnommenen Antigen-erkennenden Zellen unter Verwendung des Elisspot-Assays bestimmt.
Bevorzugterweise umfasst die Fertigstellung der erfindungsgemässen Vakzine oder Diagnostika das Zumischen eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers sowie weiterer Hilfs-Komponenten.
Die initiale Immunisierung ist für den Gegenstand der vorliegenden Erfindung nicht auf nicht- humane Vertebraten beschränkt. Gemäss einer bevorzugten Variante des Gegenstandes der vorlie- genden Erfindung werden sowohl die Antikörper als auch gegebenenfalls die Antigen-erkennenden Zellen aus Menschen gewonnen und dem erfindungsgemässen Selektions- und Herstellungsver- fahren unterzogen. In diesem Fall wird die primäre Immunisierung allerdings entweder der Natur überlassen, d. h. es werden Antikörper und T-Zellen aus bereits immunisierten Patienten entnom- men, oder aber es wird mit nicht-infektiösen Pathogen-Präparationen gearbeitet.
Speziell für die
Herstellung von effizienten Vakzinen gegen Human-Pathogene stellt die Entnahme von Antikör- pern und T-Zellen aus Menschen, die bereits erfolgreich eine Infektion mit diesem Pathogen über- standen und einen ausreichenden zellulären und humoralen Schutz aufgebaut haben, eine beson- ders bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ebenfalls eine Verfahrensvariante, bei welcher anstelle des Schrittes "immunisieren eines nicht-humanen Vertebraten" der Verfahrensschritt "Auswählen einer Person, die eine Infektion mit dem bestimmten Pathogen überstanden und Antikörper sowie
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Antigen-erkenende Zellen gebildet hat" gesetzt wird. Bei der Entnahme von Antikörpern oder Antigen-erkennenden Zellen muss selbstverständlich darauf Bedacht genommen werden, dass diese nach etablierten Methoden der Human-Medizin erfolgt und keine gravierenden Folgen für die Spenderperson hat.
Aus dem obigen ergibt sich, dass ein derartiges Verfahren für die Spender- person weder ein therapeutisches noch ein diagnostisches oder chirurgisches Verfahren darstellt, da diese Spenderperson bereits als immunisiert gilt und durch die Entnahme keinerlei therapeuti- schen Effekt erfährt.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Vakzin-Präparation, ent- haltend ein ausgewähltes Polypeptid oder ein dieses Polypeptid enthaltendes Protein oder die DNA derselben, hergestellt oder erhältlich durch das erfindungsgemässe Verfahren.
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung eine Diagnostika-Präparation, enthaltend ein ausge- wähltes Polypeptid, hergestellt oder erhältlich durch das erfindungsgemässe Verfahren, welches einen Marker zum Nachweisen des Polypeptids aufweist.
Als Marker, die zum Nachweis des Polypeptids verwendet werden können, kommen alle zum Nachweis von Bindungen zweier Substanzen in Betracht, vorzugsweise werden aber radioaktive, fluoreszente, chromogene oder amplifizierbare Marker an das erfindungsgemässe Diagnostikum gekoppelt. Die Diagnose kann sich - wie die Vakzinierung - auch auf Nukleinsäure-Niveau abspie- len. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Diagnose-Set, umfassend eine erfindungsgemässe Diagnostika-Präparation und Nachweisreagenzien für den Marker.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Set zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens umfassend - eine Genbank des Genoms des pathogenen Organismus, - Wirtszellen, in welchen die Genbank exprimierbar ist, wobei die Pathogen-Polypeptid- sequenzen exprimierenden Genbank-Wirtszellen, hinsichtlich ihrer Bindung zu einem Anti- körper selektierbar sind, und - ein Selektions-Agens.
Das Potential der Antigen-Selektion der vorliegenden Erfindung ist aber nicht auf Vakzine und Diagnostika gegen bestimmte Pathogene beschränkt. Es hat sich gezeigt, dass das erfindungsge- mässe Verfahren auch zur Herstellung von effizienten Tumor-Antigenen geeignet ist. Insbesondere mit der erfindungsgemäss bevorzugten Kombination aus humoraler und zellulärer Selektion können besonders geeignete Tumor-Antigene aufgefunden werden. Mit den erfindungsgemäss aufgefun- denen Tumor-Antigenen lassen sich besonders wirkungsvolle Tumor-Vakzinierungen vornehmen.
Anstelle der Immunisierung des nicht-humanen Vertebraten mit der Pathogen-Präparation wird allerdings der Vertebrat mit einer Präparation der jeweiligen Tumor-Zelle immunisiert oder Antikör- per und gegebenenfalls Antigen-erkennende Zellen aus einem humanen Tumor-Patienten entnom- men.
Die Erfindung wird anhand des nachfolgenden Schema-Beispiels sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert.
Es zeigen : das erfindungsgemässe Verfahren zur Identifizierung von Antigenen (schematisch); Fig.2 : Konstruktion einer Genbank für ein mikrobielles Genom ; Fig.3 und 4 : Selektion der Antikörper-bindenden Zellen durch OmpA oder LamB-Selektion; Fig. 5 und 6 die Zuordnung der identifizierten Polypeptide zu Pathogen-Proteinen via Genomics; Fig.7: die Generierung von über- lappenden Peptid-Fragmenten zur weiteren Charakterisierung mittels T-Zell-Bindungstest; und Fig.8: das Screenen der Antigen-bindenden Polypeptide mittels Elisspot-Assay.
Beispiel :
Eine Maus wird mit einer homogenisierten pathogenen Mikrobe immunisiert, wobei dem Homo- genisat Polyarginin zugesetzt worden ist. Nach erfolgter Immunisierung wird der Maus Serum entnommen, sowie Milz und Lymphknoten entfernt. Das Serum wird zur Identifizierung von Anti- genen, die von den Antikörpern im Serum erkannt werden, verwendet; aus Milz und Lymphknoten wird eine Suspension von T-Zellen hergestellt (Fig. 1).
Eine Expressionsgenbank wird gemäss der WO 99/30151 A hergestellt, wobei das mikrobielle Genom auf etwa 150 bp lange Fragmente verdaut und in geeignete Selektions-/Expressions- Vektoren eingesetzt wird. Mit diesen Expressions-Vektoren werden Wirtszellen transformiert, wobei
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eine selektierbare Genbank generiert wird (Fig.2).
Die der Maus entnommenen Antikörper werden mit den Genbankwirtszellen versetzt, wobei die Antikörper an geeignete exprimierte Strukturen binden können (Fig.3). Fig. 4 zeigt ein System, bei welchem mit Phagen selektiert wird. Durch Bindung des Antikörpers an das exprimierte Polypeptid an der Aussenseite der Zellen kommt es zu einer sterischen Blockierung der Phagen-Bindungs- stelle. Dadurch kann die Zelle nicht mit dem normalerweise letalen Phagen infiziert werden und wird positiv selektiert, womit es zu einer Anreicherung (z. B. um den Faktor 103 bis 106; höhere oder niedrigere Anreicherungen je nach Selektionssystem) derjenigen Klone, die antigene mikrobielle Peptide aufweisen.
Aufgrund der Sequenz des exprimierten Polypeptids wird über eine genomische Datenbank des mikrobiellen Pathogens die Lokalisation des Polypeptids im Pathogen-Genom vorgenommen und das Polypeptid einem bestimmten Protein oder ORF zugeordnet (Fig.5). Da humorale und zelluläre Antigene oft getrennte Strukturen auf einem Protein sind (Fig.6), werden überlappende Peptid-Fragmente der über die genomische Datenbank aufgefundene Gesamt-Proteinsequenz generiert, z. B. durch automatisierte Peptid-Synthesizer (Fig.7).
Die identifizierten antigenen Polypeptide und die generierten Proben werden mit einem Elis- spot-Assay auf ihre Bindung zu T-Zellen untersucht. Dabei werden die Polypeptid-Proben in einem geeigneten Reaktionsgefäss, z.B. einer Mikrotiterplatte, die mit einem Cytokin-spezifischen Anti- körper gecoated ist, vorgesehen und mit der Milz- und Lymphknoten-Suspension aus der Maus versetzt. T-Zellen, die an ein Antigen binden (das ihnen beispielsweise durch MHC-II-tragende Antigen-präsentierende Zellen präsentiert wird), geben bei Bindung an das Antigen Cytokine ab, z. B. Interferon-y. Dieses bindet an den immobilisierten Antikörper und kann z. B. durch einen mar- kierten sekundär-Antikörper detektiert werden. Diejenigen Näpfchen in der Mikrotiter-Platte, bei welchen eine T-Zell-Bindung erfolgt ist, zeigt eine positive Cytokin-Reaktion.
Es zeigt sich, dass mit der vorliegenden Erfindung ein besonders effizientes High-Throughput- Verfahren zum Auffinden und Herstellen von geeigneten, stark immunogenen Vakzinen und ver- lässlichen Diagnostika für Infektionen mit Pathogenen zur Verfügung gestellt wird.
Mit diesem System können in kurzer Zeit ganze Genome pathogener Organismen hinsichtlich ihrer ganz besonders antigenen Proteine oder Polypeptidsequenzen durchsucht werden, wodurch umgehend geeignete antigene Vakzin-Kandidaten für die praktische Anwendung erschlossen wer- den können.
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The invention relates to a method for the selection and production of vaccine and diagnostic preparations against pathogens of all kinds.
With the systematic introduction of vaccinations, many serious infectious diseases could be suppressed in our century. Diseases such as polio, tetanus, diphtheria, smallpox and meningitis, which previously had fatal consequences, have lost their terror through targeted, comprehensive vaccination programs. Smallpox could even be declared extinct by the WHO in 1980. With the introduction of recombinant DNA technology, it was also possible to develop vaccines that were previously possible in principle, but whose widespread use could not be achieved due to the small amount of vaccine material. Examples include the vaccine against the hepatitis B virus and whooping cough (caused by Bordetella pertussis).
Unfortunately, infectious diseases are currently showing a sharp increase again. On the one hand, this is due to the fact that new, more complex infectious diseases appear, such as B. hepatitis C, AIDS, hemorrhagic bowel diseases, etc., on the other hand because some pathogens have become resistant to the established vaccines. At the same time, many pathogens that have so far been successfully treated with drugs have become resistant to these drugs. Particular attention should be drawn to the treatment of inflammation of the lungs or meninges, intestinal infections or diseases such as tuberculosis or malaria. Above all, the increasing antibiotic resistance of bacterial pathogens poses major problems for global health policy.
It therefore appears desirable to provide vaccines that are effective against these infectious diseases. Unfortunately, finding efficient and safe vaccines is a time-consuming task. Efficient vaccines are usually derived directly from the pathogen, for example by chemical or physical inactivation or by attenuation (weakening) of the pathogen. In principle, however, such vaccines pose a safety risk, since inadequate inactivation can lead to actual infections. On the other hand, too drastic inactivation can lead to denaturations, which both reduce the efficiency of the vaccine and can lead to side effects.
The production of recombinant vaccines is in principle simple, especially with regard to the production of large quantities that are required for a worldwide vaccination campaign, but the efficiency of the recombinantly produced vaccine is often not comparable to the efficiency of the biogenic vaccine. The reasons for this often lie in the non-nativity of the recombinant vaccine, so that in the vaccinated person the antibodies are not formed exactly, which would be necessary to efficiently combat an attack with the pathogen.
To this end, the prior art now proposes complex computer-aided modeling methods with the aid of which recombinant vaccines are to be optimized (Rappuoli et al., Spectrum of Science, Special 6: Pharmaceutical Research (1997), pages 60-69).
Due to the fact that more and more of the genetic basis of the most important pathogens is known (the entire genome is already completely sequenced from numerous pathogens), one hopes a lot from this approach. However, the time and effort involved in such vaccines is enormous, since not only the basic targeted design through molecular modeling is required, but the vaccines created on the basis of these calculations often deviate from the predicted binding properties in practical use and therefore first have to be subjected to extensive basic tests .
In another approach, an attempt is first made to generate an immune response in mice using DNA vaccines which have been created on the basis of predicted ORFs, and to determine suitable vaccine candidates by predicting HLA superfamily-binding T cell epitopes ( Hoffman et al., Nature Med. 4 (1998), pages 1351-1353).
It is therefore an object of the present invention to provide a method for producing vaccines against pathogens, with which efficient vaccines can be developed quickly and inexpensively. Knowledge of the genetic information of the
Pathogens can be used optimally. Furthermore, vaccines are to be created which can be easily transformed by the immune system of the vaccinated person into a safe protection against the respective pathogen.
According to the invention, this object is achieved by a method for selection and production
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vaccine and diagnostic preparations against a specific pathogenic organism, which is characterized by the following steps: - immunizing a non-human vertebrate with a preparation of the pathogenic
Organism, - taking samples containing antibodies against the pathogen preparation from the immunized vertebrate and, if appropriate, processing these samples, - producing a gene bank of the pathogen genome which can be expressed in host cells
Organism, wherein the gene bank host cells expressing pathogen polypeptide sequences can be selected with regard to their binding to an antibody, - Identification of antigenic polypeptides by contacting the gene bank with the removed,
Antibody-containing sample and selection of the gene bank for those clones whose expressed polypeptides enter into antibody binding, isolating and finishing the identified antigenic polypeptides into a vaccine or
Diagnostic preparation.
With the method according to the invention, it is possible in a quick and efficient manner to develop a vaccine or a diagnostic agent against any pathogen which optimally leads to reliable immunization of an organism to be vaccinated. With the selection of the gene bank of the pathogen for binding (= recognition) to an antibody, the formation of which has already been ensured by the (native) pathogen in the infected non-human vertebrate, according to the invention, a polypeptide which is naturally antigen is obtained, whereby its Antigenicity is ensured by the selection itself.
The vaccines or diagnostic agents according to the invention can be used for the immunization or diagnosis of any animal species, but the preferred application is in the human field. Preferred animal pathogens are pathogens for farm animals or for domestic animals.
With the diagnostics according to the invention, a reliable detection system for infection with a specific pathogen can be provided, which - provided with a suitable marker - can be used for routine testing of organisms potentially infected with this pathogen.
In this way, the method according to the invention gives polypeptides which are able to produce antibodies in a vertebrate. For the production of the vaccine according to the invention, the polypeptides selected directly from the gene bank can be used, for example, by purifying them directly by amplifying the host cells and then extracting the polypeptide from these cells. However, it is also possible to use the selected polypeptides or their genetic information (which is part of the host cells and can therefore be obtained directly) to design suitable vaccines. For example, the selected polypeptides can be localized in the entire genome of the pathogen and assigned to specific pathogen proteins. especially if the entire genome is already sequenced.
In principle, this procedure is also possible for pathogens, of which only a rough mapping is available. Then these pathogen proteins can be used either as a whole or in truncated form for the production of vaccines. Which parts of the protein can possibly be truncated depends on the polypeptides selected according to the invention, which should preferably remain as completely as possible in their antigenic form in the vaccine produced. If two or more antigenic polypeptides can be assigned to a pathogen protein, the combination of at least these polypeptides can often lead to a particularly advantageous vaccine.
If the antigenic polypeptides in the pathogen protein are not contiguous, it may also be advisable to provide a spacer between the polypeptides before the vaccine is finished.
The isolation and completion of the vaccine or diagnostics according to the invention can therefore include the above steps of design adaptation. The isolation can also be carried out exclusively at the DNA level, i.e. H. that the genetic information relating to the antigenic polypeptides is transferred from the selected host cells, for example, into a further expression vector, is expressed in pharmaceutically suitable expression cells and is processed into a pharmaceutical preparation. The vaccine or the diagnostic agent itself can also be made available at the DNA level; is the technology for DNA vaccine
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known in principle and corresponding carrier or administration systems, such as. B. by Pow-Ject injections are described.
With the system according to the invention, vaccines or diagnostic agents can be developed against all infectious pathogens, for example against bacteria, viruses, fungi, protozoa, etc.
However, the method according to the invention is particularly well suited for pathogens which have a comparatively small genome which can either be easily sequenced or has already been completely sequenced. Accordingly, according to the invention, vaccines or diagnostic agents against bacterial or viral pathogens are particularly preferred.
Suitable as a non-human vertebrate, which is infected according to the invention with the pathogen preparation, are all animals which show sufficient generation of antibodies upon infection with a pathogen, ie, for. B. amphibians, reptiles, birds or mammals. It is preferred to use animals that are already established in the immunological laboratory, such as frogs (e.g.
Xenopus laevis), chickens or rodents, especially rabbits, rats or mice. According to a preferred embodiment of the present invention, a non-human mammal is immunized with a preparation of the pathogenic organism. In many cases it can be assumed that it is advantageous if the test animal is as closely related as possible to the organism that is to receive the vaccine according to the invention, to the infected animal, since the immune reactions are largely similar.
In the method according to the invention, a preparation of the selected pathogen is first administered to a non-human vertebrate, so that an immune reaction is triggered in the vertebrate. It is essential that this immune reaction, which for the purposes of the present invention is simply called "immunization", produces antibodies against the pathogen in the vertebrate. Following the immunization, these antibodies are removed from the vertebrate and, if necessary, purified to a purified antibody preparation using customary methods. For example, serum can be taken from the vertebrate, from which the antibody preparation used to select the gene bank is produced.
The vertebrates can be immunized with sublethal or lethal doses; the antibodies can be removed once, e.g. B. after killing the animals, or in several batches, e.g. B. after several administrations of the pathogen preparation.
The vertebrates are advantageously selected such that, in addition to the formation of antibodies, the formation of antigen-recognizing cells of the cellular system of the immune system is also caused by the administration of the pathogen preparation. These cells can then be used according to the invention for further selection of the polypeptides identified according to the invention, for example by testing these peptides or the pathogen proteins belonging to these peptides for their ability to bind to these cells.
In a preferred embodiment of the method according to the invention, therefore, in addition to antibody-containing samples, antigen-recognizing cells of the cellular system of the immune system are also removed from the immunized vertebrate, with which the identified antigenic polypeptides are further selected by the identified antigenic polypeptides. peptides or the complete proteins of the pathogen which are to be assigned to the identified antigenic polypeptides are tested for their ability to bind to the antigen-recognizing cells and those polypeptides or proteins are selected for completion which show a binding ability to the cells.
For this embodiment, vertebrates are preferably provided, in which the cellular components of the immune system are easy to remove and to handle. These include, in particular, birds and mammals, which, with thymus, spleen, (bursa) and lymph nodes, have easily removable sources for such cells, the removal of which has long been established.
T cells are preferably removed from the immunized vertebrate as antigen-recognizing cells of the cellular system of the immune system. According to the invention, spleen and lymph nodes can therefore preferably be removed from the immunized vertebrate, from which an antigen-recognizing cell-containing suspension is produced, with which the binding ability of the identified polypeptides or the associated proteins to the antigen-recognizing cells is tested.
In the further selection of the identified antigenic polypeptides using the
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Antigen-recognizing cells can either be tested for the binding ability of the polypeptides themselves to these cells, or it can be tested whether certain other areas of the pathogen protein to which the polypeptide can be assigned have binding ability to these cells. In fact, those areas of the pathogen protein that can trigger a humoral immune response are often not identical to those that can bind to the cellular immune response. Here, parts or all of the pathogen protein, to which one or more identified antigenic polypeptides can be assigned, can be used as the basis for the binding test against the antigen-recognizing cells.
The selection of the partial sequences is therefore conveniently made on the basis of the known or predicted protein structure in such a way that antigenic motifs are retained as completely as possible. A preferred method is therefore characterized in that a combination of partial sequences of the complete pathogen proteins assigned to the antigenic polypeptides is used as the basis for the selection with regard to the binding capacity
A pathogen preparation containing the complete pathogen is advantageously used for the initial infection of the vertebrate. The vertebrate can thus produce an immune response which is directed entirely towards the native pathogen and therefore ensures that the vaccines found according to the invention provide reliable vaccination protection against the native pathogen.
Often, however, infection of the vertebrate with the total pathogen is not possible, e.g. B. if it kills the vertebrate before a sufficient cellular and humoral immune response has occurred, so that a further procedure according to the invention cannot take place. Then an inactivated preparation of the pathogen must be assumed. In this regard, it has proven useful according to the invention to use a homogenate of the pathogen for the initial immunization of the vertebrate. It has been shown that efficient protection against the native pathogen can also be achieved here, in particular if care is taken during the homogenization not to treat the pathogens with denaturing methods.
Fixed pathogenic material (e.g. inactivated or cross-linked material) can also be used according to the invention for the immunization of the vertebrate. This procedure can z. B. for very infectious pathogens, the handling of which is cumbersome and dangerous, recommend.
A particularly efficient immune response can be triggered in vertebrates if the pathogen preparation used for the immunization comprises an adjuvant. Organic polycations or a mixture of organic cations are advantageously used as adjuvants. Particularly preferred adjuvants are basic polypeptides, in particular polyarginine or polylysine.
As mentioned, the present invention can be used to produce vaccines and diagnostic agents against a large number of pathogens. However, vaccines against human pathogens are preferably made available for which there is no or only an inadequate immunization alternative and / or for which resistance occurs with existing chemical or immunological treatments. Preferred pathogens to be controlled within the scope of the present invention can therefore be selected from the group Borrelia burgdorferi, Chlamydia spp., Group A streptococci, non-typable Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumomae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aure Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Shigella spp., Toxoplasma gondi, or Treponema pallidum can be selected.
Further preferred pathogens are pathogenic Aspergillus, Candida, Mycobacterium, Rhizopus, Trichophyton, Microsporum, Trypanosoma, Pneumocystis, Plasmodium, Meningococcus and Chlostridien strains as well as retroviruses or hematogenic viruses.
Since the exact native spatial structure is not significant in the cellular recognition of the pathogenic proteins, the test for binding ability to the antigen-recognizing cells is preferably based on polypeptides which have been produced using a polypeptide sequencer.
The choice of the gene bank or the host cells can be made arbitrarily; is that the Genbank host cells are selected on the basis of the binding of the expressed polypeptides to the antibodies taken from the vertebrate. Accordingly, the expressed polypeptides should simply be presented on the outside of the cells, for example as part of an outer domain
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of a membrane protein. The length of the expressed polypeptides is then selected on the basis of the respective requirements of the gene bank / host cell system, but is often in the range between 10 and 200 amino acids, in particular between 20 and 100 amino acids.
The cells can be selected, for example, using a system in which the binding site for a selection agent or a transport channel for the selection agent is blocked by the binding of the antibody to the expressed polypeptide. A particularly advantageous system for such a selection is described in WO 99/30151 A, the content of which is hereby included in the present application. The expressed polypeptides are therefore preferably presented to the outside as part of a membrane protein of the Genbank host cells. Furthermore, a selection system is preferred in which the Genbank host cells become resistant to a selection agent due to the binding of an antibody to the expressed polypeptide.
Those embodiments in which the selection is achieved by a viral agent which is pathogenic for the Genbank host cells have proven particularly useful in this preferred system. The virus receptor in the cells can be constructed in such a way that it is blocked by the binding of the antibody to the expressed polypeptide, for example by intermolecular interaction or by steric blocking. Genbank host cells of this type preferably have an OmpA, LamB or FhuA selection system.
If one or more polypeptides that bind to one of the antibodies formed in the vertebrate have been identified by the Genbank selection, these can be localized in the genome of the pathogen and assigned to certain pathogen proteins (or ORFs). The prerequisite is, of course, that at least a rough gene mapping of the pathogen is already available. However, it is particularly advantageous if the complete gene sequence of the pathogen is already available. Accordingly, the selected antigenic polypeptides are preferably assigned to defined proteins of this pathogenic organism on the basis of a genome analysis of the pathogenic organism and those antigenic polypeptides that have been assigned to the same protein are combined.
These polypeptide combinations can then be used as the basis for the binding test against antigen-recognizing cells, if appropriate in combination with further partial sequences of the assigned pathogen protein (or as a total protein)
The binding property can be determined using a large number of tests. The currently most common are in Romero et al. (Mol.Med.Today 4 (1998), pages 305-312), including the Elisspot assay, in which T cells that bind to an (MHC-II-presented) antigen, due to their cytokine Distribution (mostly interferon-y) can be identified.
This test is not only established, standardizable and easy to use, it is also extremely sensitive for the purposes of the present invention, in particular since no cellular in vitro proliferation is required for this test. According to a preferred embodiment of the method according to the invention, the binding ability to the removed antigen-recognizing cells is therefore determined using the Elisspot assay.
The completion of the vaccines or diagnostic agents according to the invention preferably comprises the admixing of a pharmaceutically acceptable carrier and further auxiliary components.
For the subject of the present invention, the initial immunization is not restricted to non-human vertebrates. According to a preferred variant of the subject matter of the present invention, both the antibodies and optionally the antigen-recognizing cells are obtained from humans and subjected to the selection and production process according to the invention. In this case, however, the primary immunization is either left to nature, i.e. H. Antibodies and T cells are taken from patients who have already been immunized, or non-infectious pathogen preparations are used.
Especially for the
The production of efficient vaccines against human pathogens is a particularly preferred variant of the removal of antibodies and T cells from people who have already successfully survived an infection with this pathogen and have built up sufficient cellular and humoral protection present invention.
The present invention therefore also relates to a method variant in which instead of the step "immunizing a non-human vertebrate" the method step "selecting a person who has survived an infection with the particular pathogen and antibodies and
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Antigen-recognizing cells has formed ". When taking antibodies or antigen-recognizing cells it must of course be taken into account that this is done according to established methods of human medicine and has no serious consequences for the donor.
It follows from the above that such a method is neither a therapeutic nor a diagnostic or surgical method for the donor person, since this donor person is already considered to be immunized and has no therapeutic effect due to the removal.
According to a further aspect, the present invention relates to a vaccine preparation containing a selected polypeptide or a protein containing this polypeptide or the DNA thereof, produced or obtainable by the method according to the invention.
Furthermore, the present invention relates to a diagnostic preparation containing a selected polypeptide, produced or obtainable by the method according to the invention, which has a marker for detecting the polypeptide.
As markers which can be used for the detection of the polypeptide, all are suitable for the detection of bonds of two substances, but preferably radioactive, fluorescent, chromogenic or amplifiable markers are coupled to the diagnostic agent according to the invention. Like vaccination, the diagnosis can also be made at the nucleic acid level. Another aspect of the present invention therefore relates to a diagnostic set comprising a diagnostic preparation according to the invention and detection reagents for the marker.
According to a further aspect, the present invention relates to a set for carrying out the method according to the invention comprising - a gene bank of the genome of the pathogenic organism, - host cells in which the gene bank can be expressed, the gene bank host cells expressing pathogen polypeptide sequences with regard to their binding can be selected for an antibody, and - a selection agent.
However, the potential of the antigen selection of the present invention is not limited to vaccines and diagnostics against certain pathogens. It has been shown that the method according to the invention is also suitable for the production of efficient tumor antigens. Particularly suitable tumor antigens can be found in particular with the combination of humoral and cellular selection preferred according to the invention. With the tumor antigens found according to the invention, particularly effective tumor vaccinations can be carried out.
Instead of immunizing the non-human vertebrate with the pathogen preparation, however, the vertebrate is immunized with a preparation of the respective tumor cell or antibodies and possibly antigen-recognizing cells are removed from a human tumor patient.
The invention is explained in more detail with reference to the following schematic example and the drawing figures, to which it is of course not restricted.
The figures show: the method according to the invention for identifying antigens (schematic); Fig. 2: Construction of a gene bank for a microbial genome; 3 and 4: Selection of the antibody-binding cells by OmpA or LamB selection; 5 and 6 show the assignment of the identified polypeptides to pathogen proteins via genomics; 7: the generation of overlapping peptide fragments for further characterization by means of a T cell binding test; and FIG. 8: the screening of the antigen-binding polypeptides by means of an Elisspot assay.
For example:
A mouse is immunized with a homogenized pathogenic microbe, with polyarginine being added to the homogenate. After the immunization has been completed, serum is removed from the mouse and the spleen and lymph nodes are removed. The serum is used to identify antigens that are recognized by the antibodies in the serum; a suspension of T cells is produced from the spleen and lymph nodes (FIG. 1).
An expression gene bank is produced in accordance with WO 99/30151 A, the microbial genome being digested to fragments of approximately 150 bp in length and used in suitable selection / expression vectors. With these expression vectors, host cells are transformed, whereby
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a selectable gene bank is generated (Fig. 2).
The genebank host cells are added to the antibodies taken from the mouse, the antibodies being able to bind to suitable expressed structures (FIG. 3). Fig. 4 shows a system in which selection is made with phages. Binding of the antibody to the expressed polypeptide on the outside of the cells results in steric blocking of the phage binding site. As a result, the cell cannot be infected with the normally lethal phage and is selected positively, which leads to an enrichment (e.g. by a factor of 103 to 106; higher or lower enrichments depending on the selection system) of those clones which have antigenic microbial peptides .
Based on the sequence of the expressed polypeptide, the localization of the polypeptide in the pathogen genome is carried out via a genomic database of the microbial pathogen and the polypeptide is assigned to a specific protein or ORF (FIG. 5). Since humoral and cellular antigens are often separate structures on a protein (FIG. 6), overlapping peptide fragments of the total protein sequence found via the genomic database are generated, e.g. B. by automated peptide synthesizers (Fig.7).
The identified antigenic polypeptides and the generated samples are examined for their binding to T cells using an Elisspot assay. The polypeptide samples are placed in a suitable reaction vessel, e.g. a microtiter plate which is coated with a cytokine-specific antibody and provided with the spleen and lymph node suspension from the mouse. T cells that bind to an antigen (presented to them, for example, by MHC-II-bearing antigen-presenting cells) release cytokines, e.g. B. Interferon-y. This binds to the immobilized antibody and can e.g. B. can be detected by a marked secondary antibody. Those cells in the microtiter plate in which T cell binding has taken place show a positive cytokine reaction.
It has been shown that the present invention provides a particularly efficient high-throughput method for finding and producing suitable, highly immunogenic vaccines and reliable diagnostics for infections with pathogens.
With this system, entire genomes of pathogenic organisms can be searched for their very particularly antigenic proteins or polypeptide sequences in a short time, which means that suitable antigenic vaccine candidates for practical use can be tapped immediately.