AT401773B - New side-chain labelled alpha-aminoacid derivs. - detectable by fluorescence or absorption spectroscopy, used to prepare new specifically labelled proteins or peptides - Google Patents
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Abstract
Description
AT 401 773 BAT 401 773 B
Die Erfindung betrifft markierte »-Aminosäuren, die eine Carboxylgruppe, eine α-Aminogruppe und eine funktionelle Seitengruppe aufweisen, zur Verwendung zur Synthese von Peptiden, sowie neue Peptide und Proteine.The invention relates to labeled amino acids which have a carboxyl group, an α-amino group and a functional side group for use in the synthesis of peptides, and also new peptides and proteins.
In der biochemischen Forschung und Diagnostik werden markierte Aminosäuren und Proteine routinemäßig verwendet. Radioaktiv markierte Aminosäuren und daraus hergestellte Proteine werden beispielsweise verwendet, um'Reaktionsmechanismen oder Metabolismen aufzuklären. Weiters ist bekannt, Proteine mit fluoreszenzspektroskopisch oder absorptionsspektroskopisch detektierbaren Gruppen zu markieren. Derartige Gruppen, sogenannte "Labels", werden als fluorophore bzw. Chromophore Gruppen bezeichnet.Labeled amino acids and proteins are routinely used in biochemical research and diagnostics. Radioactively labeled amino acids and proteins made from them are used, for example, to elucidate reaction mechanisms or metabolisms. It is also known to label proteins with groups which can be detected by fluorescence spectroscopy or absorption spectroscopy. Such groups, so-called "labels", are referred to as fluorophoric or chromophore groups.
In der Diagnostik finden Peptide Verwendung, die entweder am Aminoterminus oder am Carboxyltermi-nus markiert sind. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, diese Labels an Stellen im Inneren von Peptiden einzuführen, indem z.B. reaktive Verbindungen, die diese Labels enthalten, z.B. mit Aminosäuren in der Peptidkette umgesetzt werden, die Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen an der Seitengruppe tragen. Dies hat allerdings den Nachteil, daß eine gezielte Markierung an bestimmten Stellen des Proteins dann nicht möglich ist, wenn mehrere Aminosäuren mit den genannten Funktionen im Protein anwesend sind, da in diesem Fall ungewollt eine Markierung an mehreren Stellen der Peptidkette vorgenommen wird. Dies hat weiters eine zeitaufwendige Reinigung und Identifizierung der für Diagnosezwecke verwendeten markierten Peptide und Proteine zur Folge.In diagnostics, peptides are used which are marked either on the amino terminus or on the carboxyl terminus. However, there is also the possibility of introducing these labels at sites inside peptides, e.g. by reactive compounds containing these labels, e.g. be reacted with amino acids in the peptide chain which carry thiol, hydroxyl, amino or carboxyl groups on the side group. However, this has the disadvantage that targeted labeling at certain points on the protein is not possible if several amino acids with the functions mentioned are present in the protein, since in this case labeling is inadvertently carried out at several points in the peptide chain. This also results in time-consuming cleaning and identification of the labeled peptides and proteins used for diagnostic purposes.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, Peptide und Proteine zur Verfügung zu stellen, die an einer oder mehreren ganz bestimmten Stellen zur fluoreszenz- oder absorptionsspektroskopischen Detektion spezifisch markiert sind.The object of the invention is to provide peptides and proteins which are specifically marked at one or more very specific locations for fluorescence or absorption spectroscopic detection.
Diese Aufgabe wird mit markierten α-Aminosäuren gelöst, die eine Carboxylgruppe, eine »-Aminogrup-pe und eine funktionelle Seitengruppe aufweisen, welche α-Aminosäuren dadurch gekennzeichnet sind, daß an die Seitengruppe eine fluoreszenz- oder absorptionsspektroskopisch detektierbare Gruppe gebunden ist, die bei der Synthese der Peptide nicht abgespalten wird und somit im Peptid vorhanden ist. Diese markierten »-Aminosäuren können verwendet werden, um im Rahmen der herkömmlichen Proteinsynthese in ein Protein eingebaut zu werden. Erfindungsgemäß wird somit nicht das fertige Protein markiert, sondern die erfindungsgemäße markierte Aminosäure an gewünschter Stelle in das Protein eingebaut, das auf diese Weise spezifisch markiert ist. So wird das Problem der unspezifischen oder uneinheitlichen Markierung überwunden.This problem is solved with labeled α-amino acids, which have a carboxyl group, a »-amino group and a functional side group, which α-amino acids are characterized in that a fluorescence or absorption spectroscopically detectable group is attached to the side group, which at the synthesis of the peptides is not split off and is therefore present in the peptide. These labeled »amino acids can be used to be incorporated into a protein in the context of conventional protein synthesis. According to the invention, the finished protein is thus not labeled, but rather the labeled amino acid according to the invention is incorporated into the protein at the desired location, which is specifically labeled in this way. The problem of non-specific or inconsistent marking is thus overcome.
Die erfindungsgemäßen Aminosäuren können in jedem herkömmlichen Verfahren zur Protein- bzw. Peptidsynthese eingesetzt werden. Als besonders geeignet hat sich die Peptidsynthese an festen Trägern, auch "Festphasen-Peptid-Synthese" bezeichnet, erwiesen. Nach diesem bekannten Verfahren wird die erste Aminosäure des C-Terminus kovalent an einem festen Träger immobilisiert. Die verwendeten Aminosäuren sind dabei an der α-Aminogruppe durch eine temporäre Schutzgruppe (Fmoc, tBOC etc.) und eventuell vorhandene funktionelle Gruppen an der Seitenkette durch permanente Schutzgruppen blockiert. Nach jedem Verlängerungsschritt wird die α-Aminoschutzgruppe entfernt und die wachsende Peptidkette mit der nächsten geschützten Aminosäure umgesetzt. Zu einer gewünschten Stelle wird dann eine erfindungsgemäße »-Aminosäure in die Peptidkette eingebaut. Das fertige Peptid bzw. Protein wird damit spezifisch markiert. Schließlich wird das Peptid durch geeignete Spaltreagenzien vom Trägerharz abgespalten und auch die an den Seitenketten befindlichen Schutzgruppen entfernt.The amino acids according to the invention can be used in any conventional method for protein or peptide synthesis. Peptide synthesis on solid supports, also "solid phase peptide synthesis", has proven to be particularly suitable. designated, proven. According to this known method, the first amino acid of the C-terminus is immobilized covalently on a solid support. The amino acids used are blocked on the α-amino group by a temporary protective group (Fmoc, tBOC etc.) and any functional groups on the side chain are blocked by permanent protective groups. After each extension step, the α-amino protecting group is removed and the growing peptide chain is reacted with the next protected amino acid. An amino acid according to the invention is then incorporated into the peptide chain at a desired location. The finished peptide or protein is thus specifically labeled. Finally, the peptide is cleaved from the carrier resin by means of suitable cleavage reagents and the protective groups on the side chains are also removed.
Es versteht sich von selbst, daß als Labels der erfindungsgemäßen Aminosäuren nur solche Gruppen verwendet werden können, die so stabil an die Seitenkette gebunden sind, daß sie gegenüber den sich stets wiederholenden Abspaltungsbedingungen für den »-Aminoschutz als auch die nachfolgende Abspaltung des Peptids vom Trägerharz und auch der Seitenkettenschutzgruppen ausreichend stabil sind.It goes without saying that only those groups can be used as labels of the amino acids according to the invention which are bound to the side chain in such a stable manner that they are resistant to the constantly repeated cleavage conditions for the »-amino protection and the subsequent cleavage of the peptide from the carrier resin and also the side chain protection groups are sufficiently stable.
Bevorzugte Vertreter der erfindungsgemäßen α-Aminosäuren sind dadurch gekennzeichnet, daß die a-Aminogruppe und/oder die Carboxylgruppe chemisch geschützt sind.Preferred representatives of the α-amino acids according to the invention are characterized in that the a-amino group and / or the carboxyl group are chemically protected.
Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen α-Aminosäuren speziell nach dem Verfahren von L. Carpino (1971) sehr gut eingebaut werden können, welches »-Aminosäuren anwendet, deren »-Aminogruppe mit einer Fluorenylmethoxycarbonylgruppe (Fmoc) geschützt ist. Besonders bevorzugte Vertreter der erfindungsgemäßen »-Aminosäuren sind daher dadurch gekennzeichnet, daß die α-Aminogruppe mit einer Fluorenylmethoxycarbonylgruppe oder mit einer tert.Butyloxycarbonylgruppe geschützt ist.It has been shown that the α-amino acids according to the invention can be incorporated very well, in particular by the method of L. Carpino (1971), which uses »-amino acids whose» -amino group is protected with a fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc). Particularly preferred representatives of the »-amino acids according to the invention are therefore characterized in that the α-amino group is protected with a fluorenylmethoxycarbonyl group or with a tert-butyloxycarbonyl group.
Mit den erfindungsgemäßen α-Aminosäuren können Peptide und Proteine hergestellt werden, die mit einer fluoreszenz- oder absorptionsspektroskopisch detektierbaren Gruppe spezifisch markiert sind.The α-amino acids according to the invention can be used to produce peptides and proteins which are specifically labeled with a group which can be detected by fluorescence or absorption spectroscopy.
Die Erfindung betrifft auch Peptide und Proteine, die mit einer fluoreszenz- oder absorptionsspektroskopisch detektierbaren Gruppe spezifisch markiert sind.The invention also relates to peptides and proteins which are specifically labeled with a group which can be detected by fluorescence or absorption spectroscopy.
Es liegt auf der Hand, daß die Reinigung der unter Verwenung der erfindungsgemäßen Aminosäuren hergestellten Peptide sehr einfach ist. 2It is obvious that the purification of the peptides produced using the amino acids according to the invention is very simple. 2nd
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Die erfindungsgemäßen Peptide und Proteine können in sogenannten "Kompetitiven Elisas" eingesetzt werden, wie z.B. Peptidhormon-Elisa, bei denen das Substrat entsprechend monofluoreszenzmarkiert werden kann. Eine Reinigung dieser gelabelten Produkte ist wesentlich einfacher, da es zu keiner Mehrfachmarkierung kommt. Gleichzeitig ist auch die Reproduzierbarkeit dieser Produkte gegeben.The peptides and proteins according to the invention can be found in so-called " Competitive Elisas " are used, e.g. Peptide hormone Elisa, in which the substrate can be labeled accordingly monofluorescence. Cleaning these labeled products is much easier since there is no multiple marking. At the same time, the reproducibility of these products is given.
Weiters können Prohormon-Releasing Studien durch lokalisierte Markierungen mit unterschiedlichen Markern erfolgen, die auch eine bessere Unterscheidung der einzelnen Spaltproduke ermöglichen.Furthermore, prohormone-releasing studies can be carried out using localized markers with different markers, which also enable a better differentiation of the individual fission products.
Der gezielte Einbau von Fluorphormolekülen und Quenchern in Enzymsubstrate bietet weiters die Möglichkeit für die Entwicklung neuartiger Screening-Methoden (low-resonance energy-transfer). Das fluoreszenzinaktive Fluorogen zeigt erst nach enzymatischer Spaltung die entsprechende Fluoreszenz.The targeted incorporation of fluoromorph molecules and quenchers in enzyme substrates also offers the opportunity for the development of new screening methods (low-resonance energy transfer). The fluorescence-inactive fluorogen only shows the corresponding fluorescence after enzymatic cleavage.
Auch in der Immunologie stellt das Labeling von Peptiden eine immer häufiger verwendete Methode dar: Bestimmung von Antigen, Antikörper-Reaktionen oder z.B. für T-Zell Epitop Bindungsstudien.The labeling of peptides is also an increasingly common method in immunology: determination of antigen, antibody reactions or e.g. for T cell epitope binding studies.
Da die meisten Fluorphore mit vielen funktionellen Gruppen speziell der Seitenketten des zu markierenden Peptides reagieren, kommt es zu unreinen Produkten, die aufgrund sterischer Hinderung oft verminderte biologische Aktivität, verglichen mit dem nativen Produkt, aufweisen. Aufgrund der lokalen Markierung und der Kleinheit eines monomarkierten Produktes wurden keine unerwünschten Aktivitätshemmungen beobachtet und wurden Bindungsaffinitäten ähnlich jenen des nativen Produktes erhalten.Since most fluorophores react with many functional groups, especially the side chains of the peptide to be labeled, there are impure products which, due to steric hindrance, often have reduced biological activity compared to the native product. Due to the local labeling and the small size of a mono-labeled product, no undesired inhibitions of activity were observed and binding affinities similar to those of the native product were obtained.
Bevorzugte Vertreter der erfindungsgemäßen α-Aminosäuren sind nachstehend angegeben. Die folgende Darstellung zeigt die genannten Vertreter (dargestellt im Kreis). Die Reste R1 und R2 beziehen sich auf die Schutzgruppen und aktivierenden Gruppen. R3 bezeichnet funktionelle Gruppen der Aminosäure, über die die fluoreszenz- und absorptionsspektroskopisch detektierbaren Gruppen über die Gruppen R4 oder R5 gebunden werden. 3Preferred representatives of the α-amino acids according to the invention are given below. The following illustration shows the representatives mentioned (shown in a circle). The residues R1 and R2 refer to the protective groups and activating groups. R3 denotes functional groups of the amino acid via which the groups which can be detected by fluorescence and absorption spectroscopy are bound via the groups R4 or R5. 3rd
AT 401 773 B R4 -COOH. CH2COOH, - COCI. - CH2COCl,-S03H, -S02CI, -CHg-Br, -CHs-J, -NH2, -CH3i -CH2-CONH-CHrCHrNH2, -CO-CH2-Br, -NH-CH^H^H* -CH=CH2, R5 - N(CH3}2> -N(C2H6)2. - S03H, - OCH3, -J, -Br, -COCH3, - CH3, -NH2AT 401 773 B R4 -COOH. CH2COOH, - COCI. - CH2COCl, -S03H, -S02CI, -CHg-Br, -CHs-J, -NH2, -CH3i -CH2-CONH-CHrCHrNH2, -CO-CH2-Br, -NH-CH ^ H ^ H * -CH = CH2, R5 - N (CH3} 2> -N (C2H6) 2. - S03H, - OCH3, -J, -Br, -COCH3, - CH3, -NH2
\-yO °\ -yO °
RR
- H. - Fmoc, - tBOC, - Z R2 - H, - Pfp, - Dhbt, - Np- H. - Fmoc, - tBOC, - Z R2 - H, - Pfp, - Dhbt, - Np
R3 - NH2, - NH-C(NH)NH2, - COOH, - SHR3 - NH2, - NH-C (NH) NH2, - COOH, - SH
Mit den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung noch näher erläutert. 4The invention is explained in more detail with the following examples. 4th
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Beispiel 1: S-[7-Methoxy-Cumaryl-4-Methyl-]-Cystein S-[methoxy-2-0xo-2H-1-ben2opyran-4-yl-]-methyl-cysteinExample 1: S- [7-methoxy-cumaryl-4-methyl -] - cysteine S- [methoxy-2-0xo-2H-1-ben2opyran-4-yl -] - methyl-cysteine
ΝΗ3ΌΝΗ3Ό
COOH 2 Aquiv. KOH RT, 1/2 Std.COOH 2 Aquiv.KOH RT, 1/2 hour
MeOMeO
COO 'COO '
Synthese :Synthesis:
Das Cumarinderivat (1 mol) wird in THF unter leichtem Erwärmen gelöst. Nach Zugabe einiger ml Wasser wird Cystein.Hydrochlorid (1 mol) zugegeben. Anschließend werden 2 Äquivalente wässrige KOH zugetropft. Die Lösung verfärbt sich dabei leicht gelb. Der pH Wert der Lösung ist nach Zugabe der KOH neutral.The coumarin derivative (1 mol) is dissolved in THF with gentle warming. After adding a few ml of water, cysteine hydrochloride (1 mol) is added. Then 2 equivalents of aqueous KOH are added dropwise. The solution turns slightly yellow. The pH of the solution is neutral after adding the KOH.
Nach rd, 15 Min. wird mit Wasser versetzt und das THF abgezogen. Kaltgestellt, fällt relativ bald das Produkt in weißen Schuppen aus. Absaugen und mit Wasser waschen.After about 15 minutes, water is added and the THF is stripped off. Chilled, the product falls out in white scales relatively soon. Vacuum and wash with water.
Ausbeute: 66 % d. Theorie) m.p. 180 * C (Z)Yield: 66% of theory Theory) m.p. 180 * C (Z)
Durch Lösen in verd. HCl und abfiltrieren unlöslicher Bestandteile, erhält man nach Neutralisation unter Kühlung analysenreines Produkt.By dissolving in dil. HCl and filtering off insoluble constituents, one obtains pure product after cooling with neutralization.
Ausbeute: 66 % d. TheorieYield: 66% of theory theory
m.p. 188*Cm.p. 188 * C
Analytische Daten :Analytical data:
Summenformel: CmHisNOsS MW: 309.1 mp: 188 * C (Z) 5Molecular formula: CmHisNOsS MW: 309.1 mp: 188 * C (Z) 5
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CHN: theor.: 4.89 H; 54.36 C: 4.53 N gef.: 4.91 H; 53.44 C; 4.57 N UV: \max 328 nm (1 N HCl) Flu: Exs. 390 nm (1 N HCl) Em.max 443 nm DC: Cellulose auf Alufolie Laufmittel: n-BuOH:Aceton:AcOH:H20 (35:35:7:2: Rf.: 0.58 HPLC: Bedingungen: A: Waters Resolve C-18 5 um 150 x 3.9 H20 (0.1 % TFA) B: MeCN (0.1 % TFA) Gradient: 10 % B auf 90% in 30 Min. Fluß: 1 ml/Min. UV: 328 nm Ret.: 15.40 min.CHN: theor .: 4.89 H; 54.36 C: 4.53 N Found: 4.91 H; 53.44 C; 4.57 N UV: \ max 328 nm (1 N HCl) Flu: Exs. 390 nm (1N HCl) Em.max 443 nm TLC: cellulose on aluminum foil solvent: n-BuOH: acetone: AcOH: H20 (35: 35: 7: 2: ref .: 0.58 HPLC: conditions: A: Waters Resolve C -18 5 um 150 x 3.9 H20 (0.1% TFA) B: MeCN (0.1% TFA) gradient: 10% B to 90% in 30 min. Flow: 1 ml / min. UV: 328 nm ret .: 15.40 min.
Beispiel 2:Example 2:
Na-FMOC-S-[7-Methoxy-Cumaryl-4-Methyl-]-CysteinNa-FMOC-S- [7-methoxy-cumaryl-4-methyl -] - cysteine
Na-(9-H-Fluoren-9-yl)-methoxycarbonyl-S-[methoxy-2-oxo-2H-1-benzopyran-4-yl-]-methyl-cysteinNa- (9-H-fluoren-9-yl) methoxycarbonyl-S- [methoxy-2-oxo-2H-1-benzopyran-4-yl -] - methyl-cysteine
Synthese: ( 472 mg, 1.5 mmol ) S-(7-methoxy-2-oxo-2H-1-benzopyran-4-yl-)-methyl-cystein wird in 3.7 ml 10 % NaiC03- Lsg. (3 mmol) und 5 ml Dioxan gelöst. Unter Eiskühlung wird ( 395 mg, 1.5 mmol) FMOC-CI gelost in 5 ml Dioxan zugetropft. Es entsteht rasch eine weiße gallertartige Masse. Nach 2 Std. wird mittels DC auf vollständigen Umsatz überprüft.Synthesis: (472 mg, 1.5 mmol) S- (7-methoxy-2-oxo-2H-1-benzopyran-4-yl -) - methyl-cysteine is dissolved in 3.7 ml 10% NaiC03 solution (3 mmol) and 5 ml of dioxane dissolved. With ice cooling (395 mg, 1.5 mmol) FMOC-CI dissolved in 5 ml of dioxane is added dropwise. A white gelatinous mass quickly develops. After 2 hours, it is checked for complete conversion by means of DC.
Nach Zugabe von 60 ml Wasser wird mit 2 x 30 ml Ether extrahiert.After adding 60 ml of water, the mixture is extracted with 2 x 30 ml of ether.
Die wässrige Lösung wird nun unter Kühlung mit HCIconz. auf pH = 2-3 gestellt. Der Niederschlag wird mit 3 x 30 ml Essigester extrahiert. Die Esterphase mit Wasser gewaschen und über NasSOi getrocknet. Filtriert und einrotiert bleibt eine gelbliche ölige Masse zurück, welche über Nacht fest wird. Kann aus Petrolether Essigester umkristallisiert werden.The aqueous solution is now cooled with HCIconz. set to pH = 2-3. The precipitate is extracted with 3 x 30 ml of ethyl acetate. The ester phase washed with water and dried over NasSOi. Filtered and evaporated, a yellowish oily mass remains, which solidifies overnight. Can be recrystallized from petroleum ether ethyl acetate.
C29 H25 NO7 S MW: 531.58C29 H25 NO7 S MW: 531.58
Ausbeute: ( 81 %Yield: (81%
mp: 96 "Cmp: 96 " C
CHN: ber.: 4.74 H; 65.53 C; 2.63 N gef.: 4.91 H; 63.38 C; 2.55 N 6CHN: calc .: 4.74 H; 65.53 C; 2.63 N Found: 4.91 H; 63.38 C; 2.55 N 6
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Beispiel 3: N5-Arg(Dabsyl)-OH bzw. N°-Z-Arg(Dabcyl)-OH Schritt 1:Example 3: N5-Arg (Dabsyl) -OH or N ° -Z-Arg (Dabcyl) -OH Step 1:
Ci 4H20N4 O4 MW. 308.34 wurde gemäß der Vorschrift L.Zervas, Ber. d. Dt.Chem.Ges. 65, (1932), 1192 hergestellt. 62 % d. Theorie 140 ’C BuOH/Aceton/AcOH/Wasser ( 35/ 35 / 7 / 23 v/v) Rf.: 0.74Ci 4H20N4 O4 MW. 308.34 was according to the regulation L.Zervas, Ber. d. Ger.Chem.Ges. 65, (1932), 1192. 62% d. Theory 140 ’C BuOH / acetone / AcOH / water (35/35/7/23 v / v) ref .: 0.74
Na-Z-Arg-OHNa-Z-Arg-OH
Das Produkt Ausbeute : mp.: DC.The product yield: mp .: DC.
Schritt 2:Step 2:
Dabsyl-Na : Arbeitsvorschrift aus Gattermann/Wieland, Praxis d. Org. Chemikers 43.Aufl. (1982), 606. mp.: 181,5 "C DC: CHCb / AcOH / MeOH ( 5/1/3 ) Rf.: 0.4Dabsyl-Na: Working instructions from Gattermann / Wieland, practice d. Org. Chemikers 43rd ed. (1982), 606. mp .: 181.5 " C DC: CHCb / AcOH / MeOH (5/1/3) ref .: 0.4
Dabcyl-Na . Die Synthese erfolgte noch der Vorschrift Organikum, 18-Auflage, S. 539 / S. 549. Ausbeute: 88.4 % d. Th.Dabcyl-Na. The synthesis was carried out according to the specification Organic, 18 edition, p. 539 / p. 549. Yield: 88.4% of theory. Th.
mp.: 242 *C DC: Toluol/MeOH/Aceton/AcOH (70/20/5/5 v/v) Rf.: 0.54mp .: 242 * C DC: toluene / MeOH / acetone / AcOH (70/20/5/5 v / v) ref .: 0.54
Schritt 3:Step 3:
Dabsyl-ClDabsyl-Cl
Das Säurechlorid wurde gemäß der Vorschrift aus Anal. Biochem. 131, (1983), 419-425 synthetisiert. Ausbeute: 66.9 % d. Th.The acid chloride was obtained from Anal. Biochem. 131, (1983), 419-425. Yield: 66.9% of theory. Th.
mp.: 195.2 *C DC 1; CHCb AcOH / MeOH (77.5/7.5/15) Rf.: 0.92mp .: 195.2 * C DC 1; CHCb AcOH / MeOH (77.5 / 7.5 / 15) Ref .: 0.92
Dabcyl-Cl: Analogvorschrift zu Dabsyl-Cl.Dabcyl-Cl: analogous to Dabsyl-Cl.
Ausbeute: 50.5 % d. Th.Yield: 50.5% of theory. Th.
mp.: 181 ’C DC: Toluol Aceton (5/1 v/v) Rf.: 0.86 CHN: Ber.: C 62.61; H 4.92; N 14.64 Gef.: C 62.55; H 4.94; N 14.52mp .: 181 ’C DC: toluene acetone (5/1 v / v) ref .: 0.86 CHN: calc .: C 62.61; H 4.92; N 14.64 Found: C 62.55; H 4.94; N 14.52
Schritt 4:Step 4:
Na-Z-Arg(Dabcyl)-OH C29H3N70s MW 559.63 230 mg Arginin werden in DMF gelöst und 300 wl Triethylamin zugesetzt. Nach Zugabe von 220 mg Dabcyl-Cl in DMF wird die Lösung 2 Std. bei 30-40 *C gerührt. Anschließend 24 Std. bei RT weiterrühren. Die Umsatzrate kann mittels DC-1 überprüft werden.Na-Z-Arg (Dabcyl) -OH C29H3N70s MW 559.63 230 mg arginine are dissolved in DMF and 300 wl triethylamine are added. After adding 220 mg of Dabcyl-Cl in DMF, the solution is stirred at 30-40 * C for 2 hours. Then continue stirring at RT for 24 hours. The turnover rate can be checked using DC-1.
Anschließend mit Wasser versetzen. Es fällt ein roter Niederschlag aus. Abfiltrieren und mit wenig Petrolether waschen und trocknen.Then add water. There is a red precipitate. Filter off and wash with a little petroleum ether and dry.
Ausbeute: 88.4 % d.Th.Yield: 88.4% of theory
mp.: 160 *C DC-1: CHCb/MeOH/AcoH ( 90,8/2 v/v)mp .: 160 * C DC-1: CHCb / MeOH / AcoH (90.8 / 2 v / v)
Eine Reinigung über eine Kieselgel säule (Eluens DC-1) ist möglich. 7It can be cleaned using a silica gel column (Eluens DC-1). 7
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Die Umsetzung mit DabsyUCl zum Ns-Z-Arg(Dabsyl)-OH erfolgt analog Beispiel 4:The reaction with DabsyUCl to the Ns-Z-Arg (Dabsyl) -OH takes place analogously to Example 4:
N^-Fmoc-Arg(Dabsyl)-OH bzw. Na-tBOC-Arg(Dabsyl)-OHN ^ -Fmoc-Arg (Dabsyl) -OH or Na-tBOC-Arg (Dabsyl) -OH
Eine Variante ist die hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe und anschließende Einführung der Fmoc- bzw. tBOC Schuttgruppe in das N6-acyiierte Produkt.A variant is the hydrogenolytic cleavage of the Z protective group and subsequent introduction of the Fmoc or tBOC rubble group into the N6-acyiated product.
Es ist aber auch die Synthese über die N'-tBOC geschützte Aminosäure möglich wie nachfolgendes Beispiel demonstriert:However, synthesis via the N'-tBOC-protected amino acid is also possible, as the following example demonstrates:
Schritt 1 :Step 1 :
Ne-tBOC-Arg-OH Cuh^NsO* MW. 260.31Ne-tBOC-Arg-OH Cuh ^ NsO * MW. 260.31
Vorschrift: Keller, Org.Synthesis, 63, (1985), 160-170Regulation: Keller, Org.Synthesis, 63, (1985), 160-170
Ausbeute: 78 % d. Th.Yield: 78% of theory Th.
mp.: 130 “C DC: CHCI3 / MeOH / AcOH ( 5 3 / 1 v/v ) Rf.: 0 54mp .: 130 “C DC: CHCI3 / MeOH / AcOH (5 3/1 v / v) ref .: 0 54
Schritt 2:Step 2:
Na-tBOC-Arg(Dabsyl)-OH C25H35N7O6S· MW 561.65 100 mg BOC-Arg-OH (0.3 mmol) werden in 3 ml 80 %igem wässrigen Aceton unter Eiskühlung eingebracht. Noch Zugabe einiger Tropfen 4 N NaOH löst sich die Aminosäure vollständig. 200 mg Dabsyl-Cl ( aus Aceton umkristallisert) ( 0.6 mmol) wird in Aceton/Dioxan gelöst und langsam zugetropft. Der pH-Wert der Lösung muß dabei ständig auf pH 12.5 gehalten werden.Na-tBOC-Arg (Dabsyl) -OH C25H35N7O6SMW 561.65 100 mg of BOC-Arg-OH (0.3 mmol) are introduced into 3 ml of 80% aqueous acetone while cooling with ice. The addition of a few drops of 4 N NaOH completely dissolves the amino acid. 200 mg of Dabsyl-Cl (recrystallized from acetone) (0.6 mmol) is dissolved in acetone / dioxane and slowly added dropwise. The pH of the solution must always be kept at pH 12.5.
Nach Beendigung der Zugabe wird bei RT noch 1 Std. nachgerührt. Mit 2 N HCl neutralisieren. Die Acetonphase wird abrotiert und nach Zugabe von 5 ml Wasser die Lösung 2 x mit 5 ml Ether extrahiert.After the addition has ended, the mixture is stirred at RT for a further 1 hour. Neutralize with 2N HCl. The acetone phase is spun off and, after adding 5 ml of water, the solution is extracted twice with 5 ml of ether.
Die wässrige Phase wird nun unter Eiskühlung mit 2 N HCl vorsichtig auf pH = 2.0 gestellt.The aqueous phase is now carefully adjusted to pH = 2.0 with ice cooling with 2N HCl.
Die wässrige Phase wird nun mit Essigester oder Dichlormethan mehrmals extrahiert. Die vereinigte organische Phase 1 x mit Wasser rückgewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abfiltrieren und einrotieren bleibt ein roter klebriger Niederschlag zurück der nach Anreiben mit Petrolether und etwas Chloroform fest wird.The aqueous phase is then extracted several times with ethyl acetate or dichloromethane. The combined organic phase is washed back once with water and dried over sodium sulfate. After filtering off and spinning in, a red sticky precipitate remains which, after rubbing with petroleum ether and a little chloroform, becomes solid.
Das Rohprodukt wird über eine Kieselgelsäule gereinigt. ( Eluens CHCb / MeOH AcOH 77.5 / 15.5 . 7.5 v/v).The crude product is purified on a silica gel column. (Eluens CHCb / MeOH AcOH 77.5 / 15.5. 7.5 v / v).
Ausbeute : 53 % d. Th.Yield: 53% of theory Th.
mp.: 103 ’ C DC-1: CHCb/'i-Prop ’ AcOH ( 17 1 / 1 v/v ) Rf: 0.16 DC-2: CHCb / MeOH / AcOH ( 77.5 15.5 7.5 v/v ) Rf.: 0.86mp .: 103 'C DC-1: CHCb /' i-Prop 'AcOH (17 1/1 v / v) Rf: 0.16 DC-2: CHCb / MeOH / AcOH (77.5 15.5 7.5 v / v) Rf .: 0.86
Schritt 3: H-Arg(Dabsyl)-OH · TFA C2oH27N70*Si MW 461.54 500 mg N’-tBOC-Arg(Dabsyl)-OH werden bei RT mit 10 ml einer 50 %igen Mischung von Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan versetzt. Nach einer 1/2 Stunde wird einrotiert. Es bildet sich ein öliger Rückstand, der nach Anreiben mit Ether hart wird.Step 3: H-Arg (Dabsyl) -OH · TFA C2oH27N70 * Si MW 461.54 500 mg of N'-tBOC-Arg (Dabsyl) -OH are added at RT with 10 ml of a 50% mixture of trifluoroacetic acid (TFA) in dichloromethane . After half an hour, the mixture is evaporated. An oily residue forms, which hardens after rubbing with ether.
Ausbeute: 98 % d. Th. mp.: 78 · C (Z) DC: n-BuOH ' AcOH Wasser ( 3 / 1 / 1 v/v) Rf.: 0.4 ( Ninhydrin pos.) 8Yield: 98% of theory Th. Mp .: 78C (Z) DC: n-BuOH 'AcOH water (3/1/1 v / v) Ref .: 0.4 (ninhydrin pos.) 8
AT 401 773 BAT 401 773 B
Schritt 4:Step 4:
Na-Fmoc-Arg(Dabsyl)-OH C35H37N7O6S1 MW 683.78 158 mg H-Arg(Dabsyl)-OH · TFA (0.27 mmol) wird zu einer Mischung aus 8.2 ml Dioxan und 14 ml Wasser gegeben. Nach Zugabe von 1.31 ml I0%iger Natriumcarbonatlösung löst sich die Aminosäure vollständig. Unter Eiskühlung tropf man nun 77 mg Fmoc-Cl (0.29) gelöst in 3 ml Dioxan zu. Die Reaktionszeit beträgt 1 Stunde. Nach Zugabe von 20 ml Wasser wird mit 2 x 15 ml Ether extrahiert. Die wässrige Phase nun unter Kühlung mit 2 N HCl auf pH = 2.0 gestellt und mehrmals mit Essigester extrahiert. Über Natriumsulfat getrocknet, filtiret und einrotiert bleibt ein öliger rotbrauner Rückstand der in etwas Chloroform aufgenommen und mit Petrolether verrieben wird.Na-Fmoc-Arg (Dabsyl) -OH C35H37N7O6S1 MW 683.78 158 mg H-Arg (Dabsyl) -OH · TFA (0.27 mmol) is added to a mixture of 8.2 ml dioxane and 14 ml water. After adding 1.31 ml of 10% sodium carbonate solution, the amino acid dissolves completely. With ice cooling, 77 mg of Fmoc-Cl (0.29) dissolved in 3 ml of dioxane are then added dropwise. The response time is 1 hour. After adding 20 ml of water, the mixture is extracted with 2 x 15 ml of ether. The aqueous phase is then adjusted to pH = 2.0 with cooling with 2 N HCl and extracted several times with ethyl acetate. Dried over sodium sulfate, filtered and evaporated, an oily red-brown residue remains which is taken up in a little chloroform and triturated with petroleum ether.
Die Reinigung erfolgt über eine Kieselgelsäule.The cleaning is carried out on a silica gel column.
Eluens: CHCI3 / MeOH / AcOH (85/10/5 v/v )Eluens: CHCI3 / MeOH / AcOH (85/10/5 v / v)
Ausbeute; 89 % d. Th.Yield; 89% of Th.
mp.; 104 *C DC: n-BuOH AcOH Wasser (3/1/1 v/v) Rf.: 084mp .; 104 * C DC: n-BuOH AcOH water (3/1/1 v / v) ref .: 084
Diese Vorschriften gelten auch für die Synthese der analogen Dabcyl-DerivateThese regulations also apply to the synthesis of the analog dabcyl derivatives
Beispiel 5: N»-Fmoc-Asp(1,8-Edans)-OH CsiH^NaOgSi MW 603.65 N2-(9H-Fluoren-9-yl)-methoxycarbonyl-aspatic acid- 4-[2-(1 -sulfonyl-8-naphtyl) -amino-ethylamide] Schritt 1: N°-Fmoc-Asp(1,8-Edans)-OtBu N2-(9H-Fuoren-9-yl)-methoxycarbonyl-C’-1,1'-dimethylethyl-aspartate-4-[ 2-(1-sulfonyl- -8-naphty!) -amino-ethylamide] C35 H37N3 Os Si MW 659.75 274 mg Edans-Na-Salz ( 1.3 mmol) werden in 5 ml Dichlormethan (DCM) und 0.5 ml DMF suspendiert. Dieser Suspension wird noch 1 Äqv. N-Methylmorpholin (NMM) zugesetzt. Es wird eine Lösung bereitet, bestehend aus: 350 mg Fmoc-Asp(OH) -OtBu (0.85 mmol), 130 mg Hydroxybenzotriazol (HOBt) 0.85 mmol, 263 ul N,N-Diisopropylcarbodiimid (DCI) 1.7 mmol, und 10.4 mg 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) 0.085 mmol gelöst in 3 ml DCM. Dioese Lösung wird unter Rühren zu der Suspension getropft.Example 5: N »-Fmoc-Asp (1,8-Edans) -OH CsiH ^ NaOgSi MW 603.65 N2- (9H-Fluoren-9-yl) -methoxycarbonyl-aspatic acid- 4- [2- (1 -sulfonyl- 8-naphthyl) amino-ethylamide] Step 1: N ° -Fmoc-Asp (1,8-Edans) -OtBu N2- (9H-Fuoren-9-yl) -methoxycarbonyl-C'-1,1'-dimethylethyl -aspartate-4- [2- (1-sulfonyl- -8-naphthy!) -amino-ethylamide] C35 H37N3 Os Si MW 659.75 274 mg Edans Na salt (1.3 mmol) are in 5 ml dichloromethane (DCM) and 0.5 ml DMF suspended. This suspension is 1 equiv. N-methylmorpholine (NMM) added. A solution is prepared consisting of: 350 mg Fmoc-Asp (OH) -OtBu (0.85 mmol), 130 mg hydroxybenzotriazole (HOBt) 0.85 mmol, 263 μl N, N-diisopropylcarbodiimide (DCI) 1.7 mmol, and 10.4 mg 4 -Dimethylaminopyridine (DMAP) 0.085 mmol dissolved in 3 ml DCM. This solution is added dropwise to the suspension with stirring.
Reaktionszeit: 2 12 StundenResponse time: 2 to 12 hours
Anschließend wird Unlösliches abfiltriert und die Lösung einrotiert. Der Rückstand mit Ether verrieben. Dieser Rückstand wird nochmals in Aceton gelöst. Unösliches abfiltriert und einrotiert.Insolubles are then filtered off and the solution is spun in. The residue triturated with ether. This residue is redissolved in acetone. Insoluble is filtered off and evaporated.
Die Reinigung erfolgt über mit einer Kieselgelsäule. Eluens: CHCI3 / MeOH 7 AcOH ( 85 / 10 - 5 v/v ) Ausbeute: 67.8 % d. Th. mp.: 55 * C (Schmeizbereich) DC: CHCb MeOH 7 AcOH ( 85 10 5 v/v ) Rf.: 0.76 HPLC: Lichrospher 60 RP-Select B 5 um A: Wasser (0.1 % TFA ) B: Acetonitril ( 0.1 % TFA ) Gradient 10% B auf 90 % in 45 min. 215 nm, 1 ml ' min.The cleaning is done with a silica gel column. Eluent: CHCI3 / MeOH 7 AcOH (85/10 - 5 v / v) Yield: 67.8% of theory Th. Mp .: 55 * C (melting range) DC: CHCb MeOH 7 AcOH (85 10 5 v / v) Rf .: 0.76 HPLC: Lichrospher 60 RP-Select B 5 um A: water (0.1% TFA) B: acetonitrile (0.1% TFA) gradient 10% B to 90% in 45 min. 215 nm, 1 ml 'min.
Ret. t: 24.02 min.Ret. d: 24.02 min.
Schritt 2:Step 2:
Na-Fmoc-Asp(1,8-Edans)-OH N2-(9H-Fluoren-9-yl)-methoxycarbonyl- aspatic acid- 4-[ 2-(1-sulfonyl-8-naphty! ) -amino-ethylamide] C3- H29N308S· MW 603.65 260 mg Na-Fmoc-Asp(OH)-OtBu werden in einer 50 % Mischung aus TFA in DCM 1/2 Std, bei RT gerührt. Die Lösung wird einrotiert und der ölige Rückstand mit Petrolether angerieben. Mit Ether gewaschen und 9Na-Fmoc-Asp (1,8-Edans) -OH N2- (9H-fluoren-9-yl) -methoxycarbonyl-aspatic acid- 4- [2- (1-sulfonyl-8-naphty!) Amino-ethylamide ] C3-H29N308S · MW 603.65 260 mg Na-Fmoc-Asp (OH) -OtBu are stirred in a 50% mixture of TFA in DCM for 1/2 hour at RT. The solution is spun in and the oily residue is rubbed with petroleum ether. Washed with ether and 9
AT 401 773 B getrocknet.AT 401 773 B dried.
Ausbeute : 95 % d. Th. mp.: 130 " C (Z.) HPLC: Lichrospher 60 RP-Select B 5 um A: Wasser (0.1 % TFA) B: Acetonitril( 0.1 % TFA) Gradient 10 % B auf 90 % in 45 min. 215 nm, 1 ml / min.Yield: 95% of theory Th. Mp .: 130 " C (Z.) HPLC: Lichrospher 60 RP-Select B 5 um A: water (0.1% TFA) B: acetonitrile (0.1% TFA) gradient 10% B to 90% in 45 min. 215 nm, 1 ml / min.
Ret. t: 18.85 min.Ret. d: 18.85 min.
Beispiel 6:Example 6:
Na-BOC-Arg (Dansyl)-OH C23H33N506S MW 507.6 N1 2 3 4 5 6 7 8-(1,1-dimethyl-ethoxycarbonyl - N9-[5-N-dimethylamino-naphtalin-1-sulfonyl]-arginin. 5 mmol BOC-Arginin.HCI werden in 20 ml 80 % Aceton gelöst und unter Kühlung mit 5 ml 4 N NaOH versetzt. Nun wird eine Lösung aus 6 mmol Dansylchlorid in Aceton portionsweise zugetropft. Die Kühlung wird entfernt und bei RT 2 Std. gerührt. Nachdem mit Wasser verdünnt und mit Ether extrahiert wurde, wird die wässrige Lösung unter Eiskühlung mit KHS04 auf pH = 2 gestellt. Diese wird mehrmals mit Essigester extrahiert, und die Esterphase mit Wasser säurefrei gewaschen. Die getrocknete Lösung wird einrotiert, das entstandene Öl in iso-Propanol aufgenommen und mit Wasser verdünnt lyophilisiert.Na-BOC-Arg (Dansyl) -OH C23H33N506S MW 507.6 N1 2 3 4 5 6 7 8- (1,1-dimethylethoxycarbonyl - N9- [5-N-dimethylamino-naphthalene-1-sulfonyl] arginine. 5 mmol of BOC-arginine.HCI are dissolved in 20 ml of 80% acetone and 5 ml of 4 N NaOH are added with cooling, then a solution of 6 mmol of dansyl chloride in acetone is added dropwise in portions, the cooling is removed and the mixture is stirred at RT for 2 hours. After dilution with water and extraction with ether, the aqueous solution is adjusted to pH = 2 with ice-cooling with KHS04, which is extracted several times with ethyl acetate, and the ester phase is washed acid-free with water, the dried solution is evaporated in a rotary evaporator and the resulting oil is isolated -Propanol taken up and diluted with water, lyophilized.
Ausbeute: 35 % d. Theor. DC: CHCls / MeOH / AcOH (85/10/5) Rf.: 0.36 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 8.23 min.Yield: 35% of theory Theor. TLC: CHCls / MeOH / AcOH (85/10/5) Ref .: 0.36 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 8.23 min.
Beispiel 7:Example 7:
Na-FMOC-Arg (Dansyl)-OH C^HssNsOsS MW 749.84 N2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl - N9-[5-N-dimethylamino-naphtalin-1 -sulfonylj-arginin.Na-FMOC-Arg (Dansyl) -OH C ^ HssNsOsS MW 749.84 N2- (9H-fluoren-9yl) methoxycarbonyl - N9- [5-N-dimethylamino-naphthalene-1 -sulfonylj-arginine.
Schritt 1: H-Arg(Dansyl)-OH. TFA-Salz: C28H2SN5O4S MW 407.55 1 mmol BOC-Arginin (Dansyl)-OH wird bei RT mit 10 ml 50 % TFA/DCM versetzt. Anschließend wird Lösung einrotiert, das entstandene ölige Produkt mit Ether verrieben und abfiltriert.Step 1: H-Arg (Dansyl) -OH. TFA salt: C28H2SN5O4S MW 407.55 1 mmol BOC-arginine (dansyl) -OH is mixed with 10 ml 50% TFA / DCM at RT. The solution is then spun in, the resulting oily product is triturated with ether and filtered off.
Ausbeute: 95 % d. Theor. DC: n-BuOH AcOH H20 (3/1/1) Rf.: 0.24 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 3.21 min.Yield: 95% of theory Theor. TLC: n-BuOH AcOH H20 (3/1/1) Ref .: 0.24 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 3.21 min.
Schritt 2:Step 2:
Na-FMOC-Arg(Dansyl)-OH: 10 1 mmol H-Arginin (Dansyl)-OH wird in 1.7 Äquiv. 10 % Na2COs-Lösung gelöst und nach Zugabe von 5 2 ml Dioxan gekühlt. Zur Lösung wird eine Lösung von 1.05 mmol FMOC-CI in Dioxan ( 5 ml) Zugetropft. Der 3Na-FMOC-Arg (dansyl) -OH: 10 1 mmol H-arginine (dansyl) -OH is dissolved in 1.7 equiv. 10% Na2COs solution dissolved and cooled after the addition of 5 2 ml of dioxane. A solution of 1.05 mmol FMOC-CI in dioxane (5 ml) is added dropwise to the solution. The 3rd
Umsatz wird mittels DC überprüft. Nach Zugabe von weiteren 10 ml Wasser wird mit 5 ml Ether extrahiert 4 und der pH-Wert der Lösung unter Kühlung mit verd. Salzsäure auf pH2.0 gestellt. Der enstandene 5Sales are checked by means of DC. After adding a further 10 ml of water, the mixture is extracted with 5 ml of ether 4 and the pH of the solution is adjusted to pH 2.0 with cooling with dilute hydrochloric acid. The resulting 5th
Niederschlag wird in Essigester aufgenommen mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet. 6Precipitation is taken up in ethyl acetate, washed neutral with water and dried. 6
Ausbeute: 73 % d. Theor. 7 DC: CHCI3 / MeOH - AcOH (85 10 5) Rf.: 0.37 8 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % 9 TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml ; min. Ret.Zeit. 13.18 min.Yield: 73% of theory Theor. 7 TLC: CHCI3 / MeOH - AcOH (85 10 5) Ref .: 0.37 8 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% 9 TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml; min. Ret.time. 13.18 min.
AT 401 773 BAT 401 773 B
Beispiel 8:Example 8:
Na-BOC-Lys (Dabsyl)-OH C25H35N5O6S MW 533.64 N2-(1,1 -dimethyl-ethoxycarbonyl - N6-[4-N-dimethylamino-azobenzol-4'-sulfonyl]-Lysin. 0.5 mmol BOC-Lysin werden in 3 ml Na2CC>3 (1.5 mmol) gelöst und mit 3 ml Dioxan verdünnt. Unter Kühlung wird eine Lösung aus 0.75 mmol Dabsylchlorid in Dioxan portionsweise zugetropft. Die Kühlung wird entfernt und bei RT 16 Std. gerührt. Nachdem mit 10 ml Wasser verdünnt und mit Ether extrahiert wurde, wird die wässrige Lösung unter Eiskühlung mit KHS04 auf pH = 2 gestellt. Die Lösung wird mit Essigester extrahiert, und diese mit Wasser säurefrei gewaschen. Die getrocknete Lösung wird einrotiert, das entstandene Öl mit Petrolether verrieben und filtriert.Na-BOC-Lys (Dabsyl) -OH C25H35N5O6S MW 533.64 N2- (1,1-dimethyl-ethoxycarbonyl - N6- [4-N-dimethylamino-azobenzene-4'-sulfonyl] -lysine. 0.5 mmol of BOC-lysine are added 3 ml of Na2CC > 3 (1.5 mmol) dissolved and diluted with 3 ml of dioxane. A solution of 0.75 mmol of dabsyl chloride in dioxane is added dropwise in portions with cooling. The cooling is removed and the mixture is stirred at RT for 16 hours. Then diluted with 10 ml of water and was extracted with ether, the aqueous solution is adjusted to pH = 2 with ice-cooling with KHS04, the solution is extracted with ethyl acetate, and the latter is washed free of acid with water, the dried solution is spun in, the resulting oil is triturated with petroleum ether and filtered.
Ausbeute: 83 % d. Theor. mp.: 80°C (Zers.) DC: CHCI3 / MeOH , AcOH (90/8/2) Rf.: 0.60 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 16.28 min.Yield: 83% of theory Theor. mp .: 80 ° C (dec.) TLC: CHCl3 / MeOH, AcOH (90/8/2) Rf .: 0.60 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 16.28 min.
Beispiel 9:Example 9:
Na-FMOC-Lys (Dabsyl)-OH C35H37N5OSS MW 655.77 N2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl - N6-[4-N-dimethylamino-azobenzol-4'-sulfonyl]-lysin. Schritt 1: H-Lys(Dabsyl)-OH. TFA-Salz: C2CH27N5O4S MW 433.52 1 mmol BOC-Lysin (Dabsyl)-OH wird bei RT mit 10 ml 50 % TFA/DCM versetzt. Nach 2 Stunden wird die Lösung einrotiert und das entstandene ölige Produkt mit Petrolether verrieben und abfiltriert.Na-FMOC-Lys (Dabsyl) -OH C35H37N5OSS MW 655.77 N2- (9H-fluoren-9yl) methoxycarbonyl - N6- [4-N-dimethylamino-azobenzene-4'-sulfonyl] lysine. Step 1: H-Lys (Dabsyl) -OH. TFA salt: C2CH27N5O4S MW 433.52 1 mmol BOC-lysine (Dabsyl) -OH is mixed with 10 ml 50% TFA / DCM at RT. After 2 hours, the solution is spun in, and the resulting oily product is triturated with petroleum ether and filtered off.
Ausbeute: 96 % d. Theor. DC: n-BuOH - AcOH/ H20 (3/1 1) Rf.: 0.37 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient Von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml ' min. Ret.Zeit: 10.61 min.Yield: 96% of theory Theor. TLC: n-BuOH - AcOH / H20 (3/1 1) Ref .: 0.37 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml 'min. Ret. Time: 10.61 min.
Schritt 2:Step 2:
Na-FMOC-Lys (Dabsyl)-OH: 1 mmol H-Lysin (Dansyl)-OH wird in 1.7 Äquiv. 10 % Na2C03-Lösung gelöst und nach Zugabe von 5 ml Dioxan gekühlt. Zur Lösung wird eine Lösung von 1.05 mmol FMOC-CI in Dioxan ( 5 ml) zugetropft. Reaktionszeit 14 Stunden. Nach Verdopplung der Wassermenge wird mit Ether extrahiert und der pH-Wert der Lösung unter Kühlung mit verd. Salzsäure auf pH = 2.0 gestellt. Die Wasserphase wird mit Essigester extrahiert. Diese wird mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet und einrotiert.Na-FMOC-Lys (Dabsyl) -OH: 1 mmol H-lysine (Dansyl) -OH is in 1.7 equiv. 10% Na2C03 solution dissolved and cooled after adding 5 ml of dioxane. A solution of 1.05 mmol FMOC-CI in dioxane (5 ml) is added dropwise to the solution. Response time 14 hours. After doubling the amount of water, the mixture is extracted with ether and the pH of the solution is adjusted to pH = 2.0 while cooling with dilute hydrochloric acid. The water phase is extracted with ethyl acetate. This is washed neutral with water and dried and evaporated.
Ausbeute: 49 % d. Theor. DC: CHCI3 / MeOH AcOH (85 10/5) Rf.: 0.61 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 18.87 min.Yield: 49% of theory Theor. TLC: CHCI3 / MeOH AcOH (85 10/5) Ref .: 0.61 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 18.87 min.
Beispiel 10:Example 10:
Na-BOC-Lys (Dabcyl)-OH C25H35N5O5 MW 497.6 N2-(1,1-dimethyl-ethoxycarbonyl - N5-[4-N-dimethylamino-azobenzol-4'-carbonyl]-Lysin. 0.42 mmol BOC-Lysin werden in 2 ml Na2CÜ3 (1.0 mmol) gelost und mit 0.5 ml Dioxan verdünnt. Unter Kühlung wird eine Lösung aus 0.73 mmol Dabcylchlorid in Dioxan zugetropft. Die Kühlung wird entfernt und bei RT 4 Std. gerührt. Nachdem mit 5 ml Wasser verdünnt und mit Ether extrahiert wurde, wird die wässrige Lösung unter Eiskühlung mit KHS04 auf pH = 2 gestellt. Die Lösung wird mit Essigester extrahiert, und diese mit Wasser säurefrei gewaschen. Die ge trocknete Lösung wird einrotiert, das 11Na-BOC-Lys (Dabcyl) -OH C25H35N5O5 MW 497.6 N2- (1,1-dimethyl-ethoxycarbonyl - N5- [4-N-dimethylamino-azobenzene-4'-carbonyl] -lysine. 0.42 mmol BOC-lysine are added in 2 ml of Na2CÜ3 (1.0 mmol) were dissolved and diluted with 0.5 ml of dioxane. A solution of 0.73 mmol of dabcyl chloride in dioxane was added dropwise with cooling. The cooling was removed and the mixture was stirred at RT for 4 hours. Then diluted with 5 ml of water and extracted with ether , the aqueous solution is adjusted to pH = 2 with KHS04 while cooling with ice. The solution is extracted with ethyl acetate and washed with water until it is acid-free. The dried solution is spun in, the 11th
AT 401 773 B entstandene Öl mit Petrolether verrieben und filtriert.Das Rohprodukt wurde über eine Silicagelsäule chrommatographisch gereinigt. Eluens: CHCb / MeOH . AcOH (90/8/2)The oil formed in AT 401 773 B was triturated with petroleum ether and filtered. The crude product was purified by chromatography using a silica gel column. Eluens: CHCb / MeOH. AcOH (90/8/2)
Ausbeute: 43 % d. Theor. DC: CHCb / MeOH / AcOH (90/8/2) Rf.: 0.58 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % IFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 15.26 min.Yield: 43% of theory Theor. TLC: CHCb / MeOH / AcOH (90/8/2) Ref .: 0.58 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% IFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 15.26 min.
Beispiel 11:Example 11:
Na-FMOC-Lys (Dabcyl)-OH C36H37N5O5 MW 619.72 N2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl - N6-[4-N-dimethylamino-azobenzol-4'-carbonyl]-lysin.Na-FMOC-Lys (Dabcyl) -OH C36H37N5O5 MW 619.72 N2- (9H-fluoren-9yl) methoxycarbonyl - N6- [4-N-dimethylamino-azobenzene-4'-carbonyl] -lysine.
Schritt 1: H-Lys(Dabcyl)-QH. TFA-Salz: C21H27N5O3 MW 397.47 0.03 mmol BOC-Lysin (Dabcyl)-OH wird bei RT mit 2 ml 50 % TF A/DCM versetzt. Nach 2 Stunden wird die Lösung einrotiert und das entstandene ölige Produkt mit Petrolether verrieben und abfiltriert. Ausbeute: 90 % d. Theor. DC: n-BuOH AcOH H20 (3-1 Ί) Rf.: 0.34 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 9.40 min.Step 1: H-Lys (Dabcyl) -QH. TFA salt: C21H27N5O3 MW 397.47 0.03 mmol BOC-lysine (dabcyl) -OH is added at RT with 2 ml 50% TF A / DCM. After 2 hours, the solution is spun in, and the resulting oily product is triturated with petroleum ether and filtered off. Yield: 90% of theory Theor. TLC: n-BuOH AcOH H20 (3-1 Ί) Ref .: 0.34 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 9.40 min.
Schritt 2:Step 2:
Na-FMOC-Lys (Dabcyl)-OH: 75 umol H-Lysin (Dabcyl)-OH wird in 3 Äquiv. 10 % Na2C03-Lösung gelöst und nach Zugabe von 1 ml Dioxan mit einer Lösung von 89 umol FMOC-CI in Dioxan ( 1 ml) versetzt. Reaktionszeit 14 Stunden. Nach Zugabe von 6 mlWasser wird mit Ether extrahiert und der pH-Wert der Lösung unter Kühlung mit verd. Salzsäure auf pH * 2.0 gestellt. Die Wasserphase wird mit Essigester extrahiert. Diese wird mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet und einrotiert.Na-FMOC-Lys (Dabcyl) -OH: 75 µmol H-lysine (Dabcyl) -OH is in 3 equiv. 10% Na2C03 solution dissolved and after the addition of 1 ml of dioxane, a solution of 89 µmol FMOC-CI in dioxane (1 ml) was added. Response time 14 hours. After adding 6 ml of water, the mixture is extracted with ether and the pH of the solution is adjusted to pH * 2.0 with cooling with dilute hydrochloric acid. The water phase is extracted with ethyl acetate. This is washed neutral with water and dried and evaporated.
Ausbeute: 76 % d. Theor. DC: CHCb MeOH AcOH (85/10/5) Rf.: 0.48 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml min. Ret.Zeit: 17.83 min.Yield: 76% of theory Theor. TLC: CHCb MeOH AcOH (85/10/5) Ref .: 0.48 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml min. Ret. Time: 17.83 min.
Beispiel 12:Example 12:
Na-BOC-Lys (Dansyl)-OH CasHssNsOsS MW 479.59 N2-(1,1-dimethyl-ethoxycarbonyl - N&-[4-N-dimethylamino-naphthalinl-4'-sulfonyl]-Lysin. 0.25 mmol BOC-Lysin werden in 1 ml Na2C03 (0.56 mmol) gelöst und mit 0.3 ml Dioxan verdünnt. Unter Kühlung wird eine Lösung aus 0.37 mmol Dansylchlorid in Dioxan zugetropft. Die Kühlung wird entfernt und bei RT 4 Std. gerührt. Nach DC-Überprüfung wird mit 4 ml Wasser verdünnt und mit Ether extrahiert. Die wässrige Lösung wird unter Eiskühlung mit KHSOt auf pH = 2 gestellt. Mit Essigester extrahiert, und diese mit Wasser säurefrei gewaschen. Die ge trocknete Lösung wird einrotiert, das entstandene Öl in Isopropanol und Wasser gelöst und lyophilisiert und säulenchromatographisch gereinigt Ausbeute: 87 % d. Theor.Na-BOC-Lys (Dansyl) -OH CasHssNsOsS MW 479.59 N2- (1,1-dimethyl-ethoxycarbonyl - N & - [4-N-dimethylamino-naphthalene-4'-sulfonyl] -lysine. 0.25 mmol BOC-lysine dissolved in 1 ml of Na2C03 (0.56 mmol) and diluted with 0.3 ml of dioxane. A solution of 0.37 mmol of dansyl chloride in dioxane is added dropwise with cooling. The cooling is removed and the mixture is stirred at RT for 4 hours. After checking with TLC, 4 ml of water are added diluted and extracted with ether, the aqueous solution is adjusted to pH = 2 with KHSOt while cooling with ice, extracted with ethyl acetate and washed with acid-free water, the dried solution is spun in, the resulting oil is dissolved in isopropanol and water and lyophilized and column chromatographed purified yield: 87% of theory.
mp.: 115-120 °C DC: CHCb MeOH AcOH (90 82) Rf.. 0.70 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml ' min. Ret.Zeit: 11.12 min. 12mp .: 115-120 ° C TLC: CHCb MeOH AcOH (90 82) Rf .. 0.70 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml 'min. Ret. Time: 11.12 min. 12th
AT 401 773 BAT 401 773 B
Beispiel 13: N*-FMOC-Lys (Dansyl)-OH C33H35N3O6S MW 601.72 N2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl - N6-[4-N-dimethylamino-naphthalin-4'-sulfonyl]-lysin. Schritt 1: H-Lys(Dansyl)-OH. TFA-Salz: Ci8H25N3O4SMW 379.47 0.2 mmol BOC-Lysin (Dansyl)-OH wird bei RT mit 3 ml 50 % TF A/DCM versetzt. Nach 4 Std. wird die Lösung einrotiert und das entstandene ölige Produkt in Wasser angenommen und lyophilisiert.Example 13: N * -FMOC-Lys (Dansyl) -OH C33H35N3O6S MW 601.72 N2- (9H-fluorene-9yl) methoxycarbonyl - N6- [4-N-dimethylamino-naphthalene-4'-sulfonyl] -lysine. Step 1: H-Lys (Dansyl) -OH. TFA salt: Ci8H25N3O4SMW 379.47 0.2 mmol BOC-lysine (dansyl) -OH is added at RT with 3 ml 50% TF A / DCM. After 4 hours, the solution is spun in and the resulting oily product is taken up in water and lyophilized.
Ausbeute: 98 % d. Theor. DC: n-BuOH / AcOH / H20 (3/1/1) Rf.: 0.19 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 3.21 min.Yield: 98% of theory Theor. TLC: n-BuOH / AcOH / H20 (3/1/1) Ref .: 0.19 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 3.21 min.
Schritt 2:Step 2:
Na-FMOC-Lys (Dansyl)-OH: 0.18 mmol H-Lysin (Dansyl)-OH werden in 0.72 mmol 10 % Na2C03-Lösung gelöst und nach Zugabe von 4 ml Dioxan mit einer Lösung von 0.185 mmol FMOC-Cl in Dioxan versetzt. Reaktionszeit 4 Stunden. Nach Zugabe von 5 ml Wasser wird mit Ether extrahiert und der pH-Wert der Lösung unter Kühlung mit verd. Salzsäure auf pH = 2.0 gestellt. Der entstandene Niederschlag wird in Essigester aufgenommen, neutral gewaschen, getrocknet und einrotiert.Na-FMOC-Lys (dansyl) -OH: 0.18 mmol H-lysine (dansyl) -OH are dissolved in 0.72 mmol 10% Na2C03 solution and after adding 4 ml dioxane a solution of 0.185 mmol FMOC-Cl in dioxane is added . Response time 4 hours. After adding 5 ml of water, the mixture is extracted with ether and the pH of the solution is adjusted to pH = 2.0 with cooling with dilute hydrochloric acid. The resulting precipitate is taken up in ethyl acetate, washed neutral, dried and evaporated.
Ausbeute: 70 % d. Theor. DC: CHCI3 / MeOH / AcOH (85/10/5) Rf.: 0.78 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 30 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml ; min. Ret.Zeit: 9.09 min.Yield: 70% of theory Theor. TLC: CHCI3 / MeOH / AcOH (85/10/5) Ref .: 0.78 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 30% B to 90% in 30 min .; 1 ml; min. Ret. Time: 9.09 min.
Beispiel 14:Example 14:
Na-FMOC-Cys [Bimane]-OH C36H37N5O5 MW 619.72 N2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl - S- [4-methylen-(3,6,7-trimethyl - 1,5-diazabi-cyclo [3.3.0]-octa-3,6-diene-2,8-dione-)]l-cystein.Na-FMOC-Cys [Bimane] -OH C36H37N5O5 MW 619.72 N2- (9H-fluorene-9yl) methoxycarbonyl - S- [4-methylene- (3,6,7-trimethyl-1,5-diazabi-cyclo [3.3 .0] -octa-3,6-diene-2,8-dione -)] l-cysteine.
Schritt 1: H-Cys(Bimane)-OH: C,3H,7N304S MW 311.36 74 umol Cystein-Hydrochlorid wird in einer Losung aus 25 mg NH4HCO3 in 3 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wird 25 mg Monobromobimane ( mBrM) gegeben und die Reaktionslösung 3 Stunden bei RT lichtgeschützt gerührt. Die gelbe Lösung wird mir Essigester extrahiert.. Die wässrige Phase mit verd. Salzsäure angesäuert und lyophilisiert.Step 1: H-Cys (Bimane) -OH: C, 3H, 7N304S MW 311.36 74 µmol cysteine hydrochloride is dissolved in a solution of 25 mg NH4HCO3 in 3 ml water. 25 mg of monobromobimane (mBrM) are added to this solution and the reaction solution is stirred for 3 hours at RT, protected from light. The yellow solution is extracted with ethyl acetate. The aqueous phase is acidified with dil. Hydrochloric acid and lyophilized.
Ausbeute: 93 % d. Theor. HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml min. Ret.Zeit: 3.03 min.Yield: 93% of theory Theor. HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml min. Ret. Time: 3.03 min.
Schritt 2: N--FMOC-Cys (Bimane)-OH: 70 umol H-Cystein S-(Bimane)-OH wird zu 1 ml 0.236 mmol Na2C03-Lösung gegeben und nach Zugabe von 0.5 ml Dioxan mit einer Losung von 96 umol FMOC-Cl in Dioxan ( 1 ml) versetzt. Reaktionszeit 16 Stunden. Nach Zugabe von 6 ml Wasser wird mit Ether extrahiert und der pH-Wert der Lösung unter Kühlung mit verd. Salzsäure auf pH = 2.0 gestellt. Die Wasserphase wird mit Essigester extrahiert. Diese 13Step 2: N - FMOC-Cys (Bimane) -OH: 70 µmol H-Cysteine S- (Bimane) -OH is added to 1 ml 0.236 mmol Na2C03 solution and after adding 0.5 ml dioxane with a solution of 96 µmol FMOC-Cl in dioxane (1 ml) added. Response time 16 hours. After adding 6 ml of water, the mixture is extracted with ether and the pH of the solution is adjusted to pH = 2.0 while cooling with dilute hydrochloric acid. The water phase is extracted with ethyl acetate. This 13th
AT 401 773 B wird mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet und einrotiert.AT 401 773 B is washed neutral with water and dried and evaporated.
Ausbeute: 44 % d. Theor. mp.: 120 °C Zers. DC: CHCb / MeOH / AcOH {85 10 5) Rf.: 0.33 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 15.11 min.Yield: 44% of theory Theor. mp .: 120 ° C dec. TLC: CHCb / MeOH / AcOH {85 10 5) Ref .: 0.33 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 15.11 min.
Beispiel 15:Example 15:
Na-FMOC-Cys (1,8-AEDANS)-OH C32H3,N308S2 MW 617.67 N2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbony l-S [8 (1 -sulfonato) naphthylamino-(2-ethylaminocarboxymethylen-]-cysteinNa-FMOC-Cys (1,8-AEDANS) -OH C32H3, N308S2 MW 617.67 N2- (9H-fluoren-9yl) -methoxycarbony l-S [8 (1 -sulfonato) naphthylamino- (2-ethylaminocarboxymethylene -] - cysteine
Schritt 1: 1,8-Jod-AEDANS CuHishbCU MW 434.25 N-(Jodacetylaminoethyl)-8-naphthylamin-1-sulfonsäure Wird durch Acetylierung von N-Aminoethyl-8-naphtylamin-1-Sulfonsäure mit Jodessigsäure hergestellt.Step 1: 1,8-iodine-AEDANS CuHishbCU MW 434.25 N- (iodoacetylaminoethyl) -8-naphthylamine-1-sulfonic acid Is produced by acetylation of N-aminoethyl-8-naphthylamine-1-sulfonic acid with iodoacetic acid.
Schritt 2: H-Cys(1,8-AEDANS)-OH: Ci7H20N3O8S2 MW 426.50 0.4 mmol Cystein-Hydrochlorid wird in Wasser Aceton mit 3 Äquivalenten Na2C03 versetzt. Unter Kühlung wird 0.5 mmol 1,8-IAEDANS zugegeben und die Lösung lichtgeschützt 3 Std. bei RT gerührt. Die hellgelbe Lösung wird filtriert und lyophilisiert.Das Rohprodukt wird Säulen chrommatographisch gereinigt. Silicagel mit Ethanol als Eluenten.Step 2: H-Cys (1,8-AEDANS) -OH: Ci7H20N3O8S2 MW 426.50 0.4 mmol of cysteine hydrochloride is mixed with 3 equivalents of Na2C03 in water acetone. 0.5 mmol of 1,8-IAEDANS is added with cooling and the solution is stirred for 3 hours at RT, protected from light. The light yellow solution is filtered and lyophilized. The crude product is purified by column chromatography. Silica gel with ethanol as eluent.
Ausbeute: 78 % d. Theor. DC: Ethanol Rf.: 0.2 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm: UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA, B: Acetonitril 0.00 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml min. Ret.Zeit: 4.46 minYield: 78% of theory Theor. TLC: ethanol ref .: 0.2 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm: UV 215 nm; A: water 0.1% TFA, B: acetonitrile 0.00% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml min. Ret. Time: 4.46 min
Schritt 2:Step 2:
Na-FMOC-Cys (1,8-AEDANS)-OH: 0.3 mmol H-Cystein S-(1,8-AEDANS)-OH wird in einer Lösung aus 10 %iger Na2C03*Lösung 0.54 ml und 3 ml Dioxan gelöst. Unter Kühlung wird mit einer Lösung von 0.3 mmol FMOC-CI in Dioxan ( 1 ml) versetzt. Reaktionszeit 15 Std.. Nach Zugabe von 6 ml Wasser wird mit Ether extrahiert und der pH-Wert der Lösung unter Kühlung mit verd. Salzsäure auf pH = 2.0 gestellt. Die Wasserphase wird mit Essigester extrahiert. Diese wird mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet und einrotiert.Na-FMOC-Cys (1,8-AEDANS) -OH: 0.3 mmol H-cysteine S- (1,8-AEDANS) -OH is dissolved in a solution of 10% Na2C03 * solution 0.54 ml and 3 ml dioxane. A solution of 0.3 mmol FMOC-CI in dioxane (1 ml) is added with cooling. Reaction time 15 hours. After adding 6 ml of water, the mixture is extracted with ether and the pH of the solution is adjusted to pH = 2.0 while cooling with dilute hydrochloric acid. The water phase is extracted with ethyl acetate. This is washed neutral with water and dried and evaporated.
Ausbeute: 65 % d. Theor. DC: CHCI3 MeOH · AcOH (85 10 5) Rf.: 0.19 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 13.70 min.Yield: 65% of theory Theor. TLC: CHCI3 MeOH · AcOH (85 10 5) Ref .: 0.19 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 13.70 min.
Beispiel 16:Example 16:
Na-FMOC-Asp (EDABS)-OH C35H36N8O7S MW 648.77 N2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl-4-[2-(4-dimethylamino-azobenzol-4,-sulfonamido)-ethylamido]- asparaginsäure. 14Na-FMOC-Asp (EDABS) -OH C35H36N8O7S MW 648.77 N2- (9H-fluoren-9yl) methoxycarbonyl-4- [2- (4-dimethylamino-azobenzene-4, -sulfonamido) ethylamido] aspartic acid. 14
AT 401 773 BAT 401 773 B
Schritt 1: EDABS Ci 6 H21 Ns 02 S MW 347.44 4-Dimethylamino-azobenzol-4'-sulfonamid N (2 aminoethyl)Step 1: EDABS Ci 6 H21 Ns 02 S MW 347.44 4-dimethylamino-azobenzene-4'-sulfonamide N (2 aminoethyl)
Wird durch Monoacetylierung von Ethylendiamin mit Dabsyl Chlorid hergestellt.Prepared by monoacetylation of ethylenediamine with dabsyl chloride.
Schritt 2; FMOC-Asp(EDABS) OtBu: CasHuNsC^S MW 740.87 0.1 mmol FMOC Asp-OtBu und 0.15 mmol EDABS werde in 3 ml DCM gelöst. Unter Kühlung wird eine Lösung aus 0.2 mmol Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI), 0.1 mmol Hydroxybenzotriazol, 0.1 mmol N Methyl Morpholin sowie 0.01 mmol Dimethylaminopyridin in Methylenchlorid zugetropft. Diese Mischung wird bei RT 8 Std. gerührt und einrotiert. Der Rückstand wird mit einer Kieselgelsäule gereinigt. Eluens: Toluol: Aceton 2:1.Step 2; FMOC-Asp (EDABS) OtBu: CasHuNsC ^ S MW 740.87 0.1 mmol FMOC Asp-OtBu and 0.15 mmol EDABS are dissolved in 3 ml DCM. A solution of 0.2 mmol diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), 0.1 mmol hydroxybenzotriazole, 0.1 mmol N methyl morpholine and 0.01 mmol dimethylaminopyridine in methylene chloride is added dropwise with cooling. This mixture is stirred at RT for 8 hours and evaporated. The residue is purified using a silica gel column. Eluent: toluene: acetone 2: 1.
Ausbeute: 81 % d. Theor.Yield: 81% of theory Theor.
mp.: 185 °C DC: Toluol/Aceton (2:1) Rf.: 0.49 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.; 1 ml / min. Ret.Zeit: 20.88 min.mp .: 185 ° C TLC: toluene / acetone (2: 1) Ref .: 0.49 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .; 1 ml / min. Ret. Time: 20.88 min.
Schritt 2: N--FMOC-Asp(EDABS)-OH:Step 2: N - FMOC-Asp (EDABS) -OH:
Der tert.-Butylester wird in bekannterweise in 50 %iger Trifluoressigsäure/Dichlormethan bei RT 1 12 Std. gerührt. Anschlißend wird einrotiert und der Rückstand mit Petrolether verrieben. Dies Rückstand wurde in Isoprpopanol aufgenommen mit Wasser versetzt und lyophilisiert.The tert-butyl ester is known to be stirred in 50% trifluoroacetic acid / dichloromethane at RT 1 for 12 hours. The mixture is then evaporated in a rotary evaporator and the residue is triturated with petroleum ether. The residue was taken up in isoprpopanol, water was added and the mixture was lyophilized.
Ausbeute: 95 % d. Theor. mp.: 120° C (Zers.) DC: CHCI3 / MeOH . AcOH (85/10/5) Rf.: 0.48 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: Wasser 0.1 %TFA; B: Acetonitril 0.08 % TFA Gradient von 10 % B auf 90 % in 30 min.: 1 ml / min. Ret.Zeit; 17.15 min.Yield: 95% of theory Theor. mp .: 120 ° C (dec.) TLC: CHCI3 / MeOH. AcOH (85/10/5) Ref .: 0.48 HPLC: Spherisorb ODS 125 x 4 mm; UV 215 nm; A: water 0.1% TFA; B: Acetonitrile 0.08% TFA gradient from 10% B to 90% in 30 min .: 1 ml / min. Ret.time; 17.15 min.
StrukturformelnStructural formulas
Beispiel 14 Ν-α-Fmoc-Cys (Bimane) - OH N-2-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl-S-[4-methylen(3,6,7-trimethyl-1,5-diazabicyclo [3.3.0]-octa-3,6- dien-2,8-dion-]-cysteinExample 14 Ν-α-Fmoc-Cys (Bimane) - OH N-2- (9H-Fluoren-9yl) methoxycarbonyl-S- [4-methylene (3,6,7-trimethyl-1,5-diazabicyclo [3.3 .0] -octa-3,6-diene-2,8-dione -] - cysteine
1515
Claims (5)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT114093A AT401773B (en) | 1993-06-11 | 1993-06-11 | New side-chain labelled alpha-aminoacid derivs. - detectable by fluorescence or absorption spectroscopy, used to prepare new specifically labelled proteins or peptides |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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AT114093A AT401773B (en) | 1993-06-11 | 1993-06-11 | New side-chain labelled alpha-aminoacid derivs. - detectable by fluorescence or absorption spectroscopy, used to prepare new specifically labelled proteins or peptides |
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ATA114093A ATA114093A (en) | 1996-04-15 |
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AT114093A AT401773B (en) | 1993-06-11 | 1993-06-11 | New side-chain labelled alpha-aminoacid derivs. - detectable by fluorescence or absorption spectroscopy, used to prepare new specifically labelled proteins or peptides |
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WO2001004623A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Fritz Andreae | Optical sensor for potassium ions |
US20160334393A1 (en) * | 2007-07-27 | 2016-11-17 | Life Technologies Corporation | Use of Novel Coumarins as Glutathione and Thiol Labels |
Also Published As
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ATA114093A (en) | 1996-04-15 |
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