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der DNS erfolgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Wachstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschliessende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt. Zu diesen gehören ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus enthält.
Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet :
DNS = Desoxyribonukleinsäure
RNS = Ribonukleinsäure cDNS = komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz) mRNS = messenger-RNS tRNS = transfer-RNS dATP = Deoxyadenosintriphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = Deoxycytidintriphosphat
A = Adenin
T = Thymin
G = Guanin C = Cytosin
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ATP = Adenosintriphosphat
TTP = Thymidintriphosphat
Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information. Es ist bekannt, dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt.
Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt. Schliesslich dient die Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.
Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist.
Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder mehrerer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DSN mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.
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Genetischer Code
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<tb>
<tb> Phenylalanin <SEP> (Phe) <SEP> TTK <SEP> Histidin <SEP> (His) <SEP> CAK
<tb> Leucin <SEP> (Leu) <SEP> XTY <SEP> Glutamin <SEP> (Gln) <SEP> CAJ
<tb> Isoleucin <SEP> (Ile) <SEP> ATM <SEP> Asparagin <SEP> (Asn) <SEP> AAK
<tb> Methionin <SEP> (Met) <SEP> ATG <SEP> Lysin <SEP> (Lys) <SEP> AAJ
<tb> Valin <SEP> (Val) <SEP> GTL <SEP> Asparaginsäure <SEP> (Asp) <SEP> GAK
<tb> Serin <SEP> (Ser) <SEP> ORS <SEP> Glutaminsäure <SEP> (Glu) <SEP> CAJ <SEP>
<tb> Prolin <SEP> (Pro) <SEP> CCL <SEP> Cystein <SEP> (Cys) <SEP> TGK
<tb> Threonin <SEP> (Thr) <SEP> ACL <SEP> Tryptophan <SEP> (Try) <SEP> TGG
<tb> Alanin <SEP> (Ala) <SEP> GCL <SEP> Arginin <SEP> (Arg) <SEP> WGZ
<tb> Tyrosin <SEP> (Tyr) <SEP> TAK <SEP> Glycin <SEP> (Gly) <SEP> GGL
<tb> Terminationssignal <SEP> TAJ
<tb> Terminationssignal <SEP> TGA
<tb>
Schlüssel :
Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden :
A = Adenin
G = Guanin C = Cytosin
T = Thymin X = T oder C, falls Y = A oder G X = C, falls Y = C oder T Y = A, G, C oder T, falls X = C Y = A oder G, falls X = T W = C oder A, falls Z = A oder G
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Z = A, G, C oder T, falls W = C
Z = A oder G, falls W = A
QR = TC, falls S = A, G, C oder T
QR = AG, falls S = T oder C S = A, G, C oder T,
falls QR = TC S = T oder C, falls QR = AG J = A oder G
K = T oder C
L = A, T, C oder G M = A, C oder T
Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription. In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose an Stelle der Desoxyribose und Uracil an Stelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär.
Diese RNS wird als messengerRNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle.
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In der Zelle dient die mRNS als Matrize in einem komplexen Vorgang, an dem zahlreiche
Enzyme und Organellen innerhalb der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer
Aminosäuresequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.
Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen
Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung des
Insulins.
Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in den Zellen höherer
Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hiezu gehören z. B. das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon, an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte
Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für technische, medizinische oder Forschungszwecke.
Häufig ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organis- mus zu gewinnen, insbesondere bei Proteinen menschlichen Ursprungs. Es besteht daher ein
Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen ausserhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden. In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhalten.
Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig. Häufig ist es auch schwierig, einen gezüchteten Zellstamm mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften zu erhalten.
Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definierten
Medien gezüchtet werden. Die Fermentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar.
Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Ausserdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen.
Es wäre daher sehr erwünscht, den Transfer eines Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus, der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen. Auf diese Weise könnte das Protein unter gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten werden. Es ist auch möglich, dass die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten. Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz, die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genau bekannter genetischer Struktur eröffnet ausserdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit, zu untersuchen, wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird.
Ferner können isolierte Gene verändert werden, so dass sie Proteinvarianten mit andern therapeutischen oder funktionellen Eigenschaften codieren.
Die Erfindung betrifft Massnahmen, um die genannten Ziele zu erreichen. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschliesslich Enzym-katalysierter Reaktionen, umfasst.
Nachstehend werden die bisherigen Kenntnisse über die Natur dieser Enzymreaktionen skizziert.
Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligo-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nichtcovalente Bindung des Oligo-deoxynucleotid-Primers an das 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Deoxynucleotide, entsprechend der Basenpaarungsregel, an das 3'-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RNS und einen komplementären DNS-Einzelstrang.
Die reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden ; vgl.
Aviv, H., und Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972), und Efstratiadis, A., Kafatos, F. C., Maxam, A. F., und Maniatis, T., Cell. 7, 279 (1976).
Restriktions-Endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppelsträngiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Stranges gespalten wird.
Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt.
Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung
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Zur Illustrierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Wachstumshormon-Gen im einzelnen beschrieben. Das Wachstumshormon wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der
Sicht der Grundlagenforschung. Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von Wachstumshormon-Gen aus andern Organismen, einschliesslich
Menschen, übertragen werden.
Die Möglichkeit, menschliches Wachstumshormon in den Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äusserst erwünscht. Die Herstellung von menschlichem Wachstumshormon in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur Einführung des Wachstumshormon-Gens in Bakterien vorlag. Die Erfindung stellt eine derartige Technik bereit.
Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen
Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man z. B. ein modifiziertes Wachstumshormon herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer wachstumshormonähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Wachstumshormons kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden.
Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus, wie z. B. ein Bakterium, eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung derartiger Proteine. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder zum Ersatz solcher Proteine durch Proteine, welche von erfindungsgemäss veränderten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich z.
B. die Möglichkeit zum Aufbau von Symbiosen zwischen erfindungsgemässen Mikroorganismen und Menschen mit chronischen oder akuten Mangelkrankheiten, wobei die auf erfindungsgemässe Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetische Information enthaltenden Nucleotidsequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirtsorganismus.
Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Gens für Ratten-Wachstumshormon und des Gens für menschliches Wachstumshormon. Danach kann davon ausgegangen werden, dass die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus, wie z. B. eines Wirbeltieres, auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist. Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschliesslich z. B. der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschliesslich Säugetiere, wobei zu letzteren Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören.
Unter einem Mikroorganismus versteht man jeden mikroskopisch lebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und z. B. aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliesslich Hefen, bestehen kann. Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegenwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Stranges erforderlichen vier Deoxynucleosid-triphosphate erfolgt.
Das Produkt dieser ersten Reaktion mit reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz, die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert. Das resultierende Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an
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einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet.
Die resultierende doppeltsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man an beiden Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungs- bzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.
Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-Endonuclease wird mit diesem Enzym behandelt, um den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-komplemen- täre einsträngige Nucleotidsequenzen an den 5'-Enden zu erzeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet. Die wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Bildung eines lebensfähigen, geschlossenen Ringes aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird.
Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht. Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien
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dann gezüchtet, und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend reisoliert. Auf diese Weise können grosse Menge an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, woraus man die spezifische cDNS-Sequenz durch endonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann.
Das erfindungsgemässe Grundverfahren ist auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschliesslich des Menschen, und deren Transfer in einen Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Wert und zur mikrobiologischen Synthese solcher Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde die Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.
Die das erfindungsgemässe Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden :
1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus
Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert : die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst und eine RNS-Übersetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die U. S. A. vorgeschrieben, dass menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vgl.
US-Federal Register, Bd. 41,
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mit der Isolierung der spezifischen mRNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert. Auf diese Weise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tatsache, dass in hochdifferenzierten Organismen, wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Funktion hauptsächlich in der Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegen.
In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der
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Isolierung angewendete Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.
In den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig Verfah- ren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfasst daher zwei Hauptstufen : die Absonderung der Zellen vom Bindegewebe und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen andern im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäss vorgesehenen Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar.
Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann z. B. die Behandlung mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz. Bei der Isolierung von Wachstumshormon-mRNS von Ratten wird durch Behandlung gezüchteter Hypophysenzellen mit Thyroidhormon und Glucocorticoiden der Anteil an Wachstumshormon-mRNS auf synergistische Weise beträchtlich erhöht.
2. Extraktion der mRNS
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS ist ein einsträngiges Polynucleotid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodiesterbindung in der Sequenz würde daher das gesamte Molekül für den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbreitet, aktiv und aussergewöhnlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien.
Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar. Die überraschende Wirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Inselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.
Beim Aufreissen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien RNS angewendet werden, setzt man erfindungsgemäss eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chatropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein.
Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wässerigen
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Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist z. B. Lithium-dijodsalicylat ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0, 1 M, ausserdem ist es relativ teuer. Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt im Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und in wässerigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa 5molaren Lösungen.
Thiolverbindngen, wie das S-Mercaptoäthanol, spalten bekanntlich intramolekulare Disulfid-
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captan u. dgl. Eine wesentliche Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in grossem Überschuss über die intramolekularen Disulfide vorliegen muss, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. ss-Mercaptoäthanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt.
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an Säulen mit Cellulose, an die Oligo-thymidylat gebunden ist, s. Aviv, H., und Leder, P., loc. cit. Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind.
Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig von ihrem Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher Weise ausgeführt werden.
Unter bestimmten Bedingungen, z. B. bei der Verwendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, dass obige Stufe der RNase-Inhibierung nicht erforderlich ist. In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung der RNase-Aktivität ausreichen.
3. Bildung der cDNS
Die Zeichnung ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufen des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werden könnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Stranges auf Grund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist. Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei man die mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosidtriphosphate als Vorläufer des DNS-Stranges einsetzt. Zweckmässig wird eines der Deoxynucleosid-
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tung und Abtrennung, z. B. durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu können ; vgl.
Efstratiadis, A., et. al., loc. cit. Wie aus der
Zeichnung ersichtlich, erhält man als Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase eine doppelsträngige Haarnadelform mit nichtcovalenter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dem DNS-Strang.
Das Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Zweckmässig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid und Ausfällung mit Äthanol.
Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die RNS-Matrize entfernt werden.
Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt. Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch PH-Einstellung leicht gesteuert werden kann.
Nach der alkalischen Hydrolyse und anschliessender Neutralisierung kann die mit P markier- te cDNS durch Aufällung mit Äthanol konzentriert werden, falls dies erwünscht ist.
Die Synthese einer doppelsträngigen haarnadelförmigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, z. B. mit DNS-Polymerase oder reverser Transcriptase.
Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschliesslich der Verwendung eines in a -Stellung mit 32p markierten Nucleosid-triphosphats. Die reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, z. B. aus Vogel-Myeloblastosisvirus (das Virus ist erhältlich von der Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es gemäss einem Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).
Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reaktionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmässig Phenolextraktion, Chromatographieren an einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid und Ausfällung mit Äthanol zur Reinigung des DNS-Produktes und Befreiung von verunreinigendem Protein verwenden.
Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppelsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die Enden komplementärer Stränge verbindet, entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfügung, die eine spezifische hydrolytische Spaltung einsträngiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die Sl-Nuclease aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart, Indiana, bezogen werden). Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Äthanol erfolgen wie vorstehend beschrieben.
Die Verwendung von reverser Transcriptase und Sl-Nuclease bei Synthesen doppelsträngiger cDNS-Übertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis et. al., loc. cit., beschrieben.
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Gegebenenfalls kann man den Anteil an cDNS-Molekülen mit stumpfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate. Die Kombination von Exonuc1ease- und Polymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender 3'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervorstehender 5'-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüp- fungsreaktionen sichergestellt.
Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, dass geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweisen. Die Wahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgründe in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz
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Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-Endo- nuclease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt z. B. eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind
III. Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H. O., und Wilcox, K. W., J. Mol. Biol. 51,379 (1970), gereinigt.
Das Enzym Hae III aus Haemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middleton, J. H., Edgell, M. H., und Hutchinson III, C. A., J. Virol. 10,42 (1972), gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden
Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet.
Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelstranges.
Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in der Zeichnung dargestellte Sequenz, vgl. Heyneker, H. L., et al., und Scheller, R. H., et al., loc. cit. Verschiedene solcher synthetischer Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so dass man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endonucleasen ansprechen.
Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem
Weg erfolgen. Das Verfahren der Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet, A., et al., Biochemistry 12, 5045 (1973), gereinigt worden war. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer
Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc. cit., beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem grossen molaren Überschuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind III-Erkennungssequenz an jedem Ende.
Die Behandlung des Reaktionsprodukts mit Hind III-Endonuc1ease führt zur Spaltung an der Erkennungsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komplementärer 5'-Enden, s. Zeichnung.
4. Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors
Im Prinzip kann eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS zur Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene Weise hergestellten cDNS verwendet werden. Die Grundvoraussetzungen bestehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muss, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdem eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health.
Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Kommittee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht. Geeignete Transfer-Vekto-
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Science 196,161 (1977)] und Derivate des Plasmids col EI [vgl. z. B. Rodriguez, R. L., Bolivar, S., Goodman, H. M., Boyer, H. W., und Betlach, M. N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms
In The Control of Gene Expression, D. P. Nierlich, W. J, Rutter, C. F., Fox.
Eds. (Academic Press, N. Y., 1976), S. 471-477]. Plasmide aus col EI sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Grössenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirtszelle zu veranlassen, dass sie hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col EI sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung.
Zu den geeigneten Derivaten von col EI gehören die Plasmide pMB-9, die das Gen für Tetracyclin-Resistenz tragen, und pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 und pBR-322, die ausser dem Tetracyclin-Resistenz-Gen ein Gen für Ampieillinresistenz besitzen. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmässige Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col EI verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittel-Resistenz-Gen eine Hind III-Erken- nungsstelle besass.
Wie beim Plasmid kann auch die Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde.
Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind ; vgl. Curtiss, III, R., Ann. Rev. Microbiol., 30,507 (1976). E. coli RR-1 kann verwendet werden, wenn P3-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung
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Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkuliert.
Die anschliessend transformierten Zeilen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss dem Stand der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt.
Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewendet. Hiebei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5'-terminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis zu herab.
Das erfindungsgemässe Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die durch DNS-Ligase katalysierte Reaktion stattfindet zwischen einer S'-Phosphat-DNS-Endgruppe und einer 3'-Hydroxyl-DNS- Endgruppe. Wird die terminale 5 r -Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein.
Ist doppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt :
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EMI12.2
<tb>
<tb> Fall <SEP> Reaktionsteilnehmer <SEP> Ligase-Produkt
<tb> 1 <SEP> 3'5'3'5'
<tb> OH <SEP> H203P0-0-P-0- <SEP>
<tb> + <SEP> +2H20
<tb> OPO3H2 <SEP> HO <SEP> 0-P-O--- <SEP>
<tb> 5' <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3'
<tb> II <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3' <SEP> 5'
<tb> --(H <SEP> H2O3PO-- <SEP> --O-P-O--
<tb> --OH <SEP> + <SEP> OH-- <SEP> --OH <SEP> HO--+H2O
<tb> 5'3'5'3'
<tb> III <SEP> 3'5'
<tb> OH <SEP> HO
<tb> + <SEP> keine <SEP> Reaktion
<tb> OH <SEP> HO-
<tb> 5'3'
<tb>
In Tabelle 1 wird die doppelsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wieder- gegeben, wobei die 5'-und 3'-Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen.
Im Fall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden reaktionsfähigen Endgruppen vor, mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden. Im Fall II besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eine terminale 5'-Phosphatgruppe mit dem Ergebnis, dass eine einsträngige covalente Bindung erfolgt, während im andern Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nichtcovalent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül auf Grund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden.
Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5'-Phosphatgruppe, so dass keine Bindungsreaktion eintreten kann.
Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5'-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse.
Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstituieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstituiert werden. Das Enzym DNS-Ligase, das die Ende-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vgl. Sgaramella, V., Van de Sande, J. H., und Khorana, H. G., Proc. Natl. Sci., USA 67,1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coli erhaltene Ligase verwenden, vgl. Modrich, P., und Lehman, I. R., J. Biol.
Chem. 245,3626 (1970).
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cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind
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eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur
Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phosphat- gruppe können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eine 51 -Phosphatgruppe besitzen.
Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsrektion, nämlich die
Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, d. h. hinten-an-vorn statt vorn-an-hin- ten. Andere mögliche Nebenreaktionen, wie Dimerisierung und Cyclisierung, werden nicht verhin- dert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.
Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Wachstumshormon codierende cDNS isoliert und mit einem Plasmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zeilen gewonnene neukombinierte
Plasmid-DNS enthielt ein inseriertes DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukom- binationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurden mit Hind III- oder Hsu I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam, A. M., und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 74, 560 (1977), ermittelt.
Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte Codierungsreaktion für Ratten-Wachstumshormon.
Nach ausgiebiger Replikation in E. coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 Nucleotiden
Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorläuferpeptids und einen Teil der 5'-untranslatierten Region enthielten.
Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten.
Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Wachstumshormongen in E. coli.
Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1 :
In diesem Beispiel wird das Isolieren und Reinigen einer die gesamte Strukturgensequenz von Rattenwachstumshormon besitzenden DNS zusammen mit der Synthese eines das gesamte Strukturgen für Rattenwachstumshormon besitzenden Transfer-Vektors und das Herstellen eines das Gen für Rattenwachstumshormon als Teil seines genetischen Aufbaus enthaltenden Mikroorganismusstammes beschrieben.
Im Zusammenhang mit Genen nichtmenschlichen Ursprungs wird durch die in den U. S. A. geltenden Sicherheitsbestimmungen nicht gefordert, dass die cDNS in ebensoich hohem Ausmass gereinigt wird, wie dies für cDNSen menschlichen Ursprungs gefordert wird. Aus diesem Grunde war es möglich, die das gesamte Strukturgen von Rattenwachstumshormon enthaltende cDNS durch Isolieren elektrophoretisch abgetrennter DNS der zu erwartenden Länge von etwa 800 Basenpaaren (bestimmt aus der bekannten Länge des aus Aminosäuren aufgebauten Rattenwachstumshomons) zu isolieren. Als Quelle für die mRNS des Rattenwachstumshormons wurden kultivierte Zellen von Rattenhypophysen, u. zw. ein Sub-Clon der Zellspezies GH-1, verwendet, wie sie bei ATCC bezogen werden können [vgl. Tashjian, A.
H., et al., Endochrinology 82,342 (1968) ]. In solchen unter formalen Bedingungen gezüchteten Zellen ist die mRNS des Wachstumshormons nur in einer geringen Menge von 1 bis 3% der gesamten Poly-A enthaltenden RNS enthalten, jedoch konnte der Gehalt an mRNS für Wachstumshormon durch synergistische Wirkung von Thyroidhormonen und Glücocorticoiden über jenen von mRNS-Spezies aus Zellgewebe angehoben werden. RNS wurde aus 5. 108 Zellen erhalten, die in Suspensionskultur gezüchtet wurden und vier Tage vor dem Sammeln der Zellen mit 1 mmolarem Dexamethason und 10 nanomolarem L-Trijodthyronin
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zur Erzeugung von Wachstumshormon angeregt worden waren. Aus der aus den kultivierten Zellen stammenden Fraktion der Cytoplasmamembranen wurde polyadenylierte RNS in bekannter Weise
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USA 74,1816 (1977) und Bancroft, F.
C., Wu, G., und Zubay, G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 3646 (1973) ] isoliert.
Die mRNS wurde unter Verwendung von reverser Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus, welche von D. J. Beard, Life Science, Inc., St. Petersburg, Florida, bezogen wurde, in doppelstran-
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markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 500-200 Curie je Mol, 200 ug/ml Oligo-dT (12-18) von Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, 100) ig/ml polyadenylierter RNS und 200 Einheiten/ml reverser Transcriptase vorgenommen. Das Gemisch wird bei 45 C 15 min inkubiert.
Nachdem die Lösung an EDTA-Na 2 25 mmolar gemacht worden war, wurde sie mit dem gleichen Volumen an mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, worauf die wässerige Phases in einer mit Sephadex G-100 gefüllten Kolonne von 0, 3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe unter Verwendung eines Eluiermittels chromatographiert wurde, das in Tris-HCl 10 mmolar (PH 9, 0), an NaCl 100 mmolar und an EDTA 2 mmolar war. Die aus dem Hohlvolumen eluierte Nukleinsäure
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dann in Wasser gelöst. Nach dem Fraktionieren durch Gelelektrophorese konnte ein schwaches, jedoch deutlich sichtbares Band festgestellt werden, welches einer eine Länge von etwa 800 Basenpaaren besitzenden DNS entsprach.
Durch Behandeln der gesamten cDNS, welche aus der mRNS der kultivierten Hypophysenzellen transkribiert worden war, mit HhaI-Endonuclease wurden zwei DNS-Hauptfragmente erhalten.
Diese Hauptfragmente enthielten, nach dem elektrophoretischen Trennen voneinander, etwa 328 Nucleotide (Fragment A) bzw. 240 Nucleotide (Fragment B).
Die Nucleotidsequenz dieser Fragmente A und B wurde dadurch bestimmt, dass die Fragmente entsprechend der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,560 (1977), spezifisch gespalten und der Sequenzanalyse unterworfen wurden. Die Sequenzanalyse zeigte, dass die Fragmente A und B in der Tat Teile des Rattenwachstumshormon codierenden Bereiches darstellten, wie sie durch Vergleich mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz vom Rattenwachstumshormon und durch Vergleich mit der Aminosäuresequenz anderer bekannter Wachstumshormone ergab [vgl. Wallis, M., und Davies, R. V. N., Growth hormone and related Peptides (Eds., Copecile,
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Washington, D. C., 1976) ].
Wenn die in der oben beschriebenen Weise elektrophoretisch isolierte und 800 Basenpaare aufweisende doppelstrangige cDNS mit einer Endonuclease behandelt wurde, wurden unter den hauptsächlichen Spaltprodukten zwei Fragmente festgestellt, deren Länge der Länge der Fragmente A und B entsprach.
Da die etwa 800 Basenpaare aufweisende cDNS aus Rattenwachstumshormon nicht durch Behandlung mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt worden war, war es erforderlich, die DNS weiter zu reinigen, um einstrangige, unpaarige Enden zu entfernen. In der Praxis
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von DNS-Polymerase I aus E. coli inkubiert, um alle abstehenden 3'-Enden exonucleolytisch abzuspalten und alle abstehenden 5'-Enden aufzufüllen. DNS-Polymerase I ist bei Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, erhältlich.
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Die etwa 800 Basenpaare enthaltende cDNS wurde durch Zusetzen synthetisch hergestellten Hind III-Verknüpfungsmittels behandelt. Die cDNS aus Rattenwachstumshormon wurde während 30 min bei 22 C in 0, 03 m Natriumacetat, PH 4, 6, 0, 3 m Natriumchlorid und 4, 5 mmolarem ZnC12 mit 30 Einheiten einer eine Aktivität von 1200 Einheiten/ml besitzenden Sl-Nuclease (erhältlich bei Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) und anschliessend noch weitere 15 min bei 100C inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusetzen von Tris in Form der Base zum Erzielen einer Endkonzentration von 0, 1 m, von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25 mmolar und tRNS aus E. coli [hergestellt nach der Methode von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, S. P.
Colowick und N. O. Kaplan, Eds., Band 12a, S. 588 (1967) ] zu 40 I1g/ml abgebrochen. Nach dem Extrahieren des Reaktionsgemisches mit Methanol und dem Chromatographieren an einem dreidimensional vernetz-
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Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen, welche die für die Stumpfendenligation an synthetische Decanucleotide erforderlichen basenpaarigen Enden aufwiesen.
Die Hind III-Decameren wurden nach der von Scheller, R. H., Dickerson, R. E., Boyer, H. W., Riggs, A. D., und Itakura, K., in Science 196,177 (1977), angegebenen Methode hergestellt.
Das Verknüpfen von Hind III-Decameren mit cDNS wurde durch Inkubieren bei 14 C während 1 h in 66 mmolarem Tris-HCl, PH 7, 6, 6, 6 mmolarem MgCl, l mmolarem ATP, 10 mmolarem Dithiothreitol, 3 mmolaren Hind III-Decameren mit 10 cpm/pmol und T4-DNS-Ligase (etwa 500 Einheiten/
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Hsu 1- oder Hind III-Endonuclease während 2 h bei 37 C wurde KCI bis zu einer Endkonzentration von 50 mmolar und EDTA bis zu einer Endkonzentration von 0, 1 mmolar zugesetzt. Hind IIIund Hae II-Endonuclease können im Handel von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, bezogen werden.
Das Reaktionsprodukt wurde durch Gelelektrophorese analysiert, wobei zusätzlich zu den Fragmenten abgespaltener Hind II-Decamerer ein Scheitel beobachtet wurde, welcher etwa 800 Nucleotiden entsprach.
Das Plasmid pBR-322, welches ein Ampicillinresistenzgen und innerhalb des Tetracyclinresistenzgens eine einzige Hind III-Stelle besass, wurde mit Hind II I -Endonuc1ease und alkalischer Phosphatase behandelt. Das Plasmid pBR-322 wurde an der Hind III-Restriktionsstelle mit Hsu IEndonuclease gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0, 1 Einheit/gg enthalten, und das Reaktionsgemisch wurde bei 65 C 30 min in 25 mmolarem Tris-HCl, PH = 8, inkubiert, worauf die Phosphatase mit Phenol extrahiert wurde.
Nach einem mit Äthanol vorgenommenen Fällen wurde die mit Phosphatase behandelte Plasmid-DNS einer 800 Basenpaare enthaltenden cDNS aus Rattenwachstumshormon zugesetzt, welches kohäsive Enden von Hind III in einem Molverhältnis von 3 Mol Plasmid je Mol cDNS enthielt. Das Gemisch wurde sodann 1 h bei 14 C und in Anwesenheit von 50 Einheiten/ml T4-DNSLigase in 66 mmolarem Tris, PH 7, 6, 6, 6 mmolarem MgCl,, 10 mmolarem Dithiothreitol und 1 mmolarer ATP inkubiert.
Dieses Ligase-Reaktionsgemisch wurde zum Transformieren einer Suspension von Zellen
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zu einer Zelldichte von etwa 2. 10 Zellen/ml kultiviert. Die Zellen wurden bei 5 C durch Zentrifugieren bei 5000 g während 5 min abgetrennt, dann in 20 ml einer an NaCl 10 mmolaren Kochsalzlösung erneut suspendiert, anschliessend in der angegebenen Weise zentrifugiert und dann erneut in 20 ml eines Transformationspuffers suspendiert, welcher an CaCl, 75 mmolar, an NaCl 140 mmolar und an Tris (PH 7, 5) 10 mmolar war. Die Suspension wurde dann 5 min in Eis stehengelassen. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und erneut in 0, 5 ml Transformationspuffer
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tet und im Hinblick darauf ausgewählt, dass sie auf einem 20 ig/ml Tetracyclin enthaltenden Nährmedium nicht wuchsen.
Es wurden insgesamt 10 solcher Kolonien erhalten, von welchen jede ein Plasmid enthielt, in das etwa 800 Basenpaare eingeschachtelt waren und das durch Hind III-Spaltung abgespalten wurde.
Die 800 Basenpaare aufweisende DNS aus Rattenwachstumshormon wurde in präparativer Menge aus recombinantem pRGH (RWH)-l-Klon isoliert, worauf deren Nucleotidsequenz nach der oben angegebenen Methode von Maxam und Gilbert bestimmt wurde. In diesem Falle enthielt die Nucleotidsequenz untranslatierte 5'-Bereiche des Rattenwachstumshormons (rgh) und zusätzlich eine 26 Aminosäuren enthaltende Sequenz, wie sie in dem Wachstumshormonvorstufenprotein vor der Sekretion anzutreffen ist. Der von der Gensequenz abgeleitete Messenger (Bote) der mDNS-Sequenz ist in Tabelle II gezeigt.
Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8 gut mit jener partiellen Aminosäuresequenz von Rattenwachstumshormon überein, welche von Wallis und Davies, supra, beschrieben wurde und die Reste 1-43,65-69, 108-113, 133-143 und 150-190 enthält.
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Tabelle II
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<tb>
<tb> Met <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> 5'---GTGGACAGATCACTGAGTGGCG <SEP> ATG <SEP> CCT <SEP> GCA <SEP> GAC <SEP> TCT <SEP> CAG <SEP> ACT <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> CTC <SEP> CTG <SEP> ACC <SEP> TTC <SEP> ACC <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG
<tb> 1 <SEP> 20
<tb> Trp <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Met <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> His <SEP> Leu <SEP> His <SEP> Gln <SEP> Leu
<tb> TGG <SEP> CCT <SEP> CAA <SEP> GAG <SEP> GCT <SEP> GGT <SEP> GCT <SEP> TTA <SEP> CCT <SEP> GCC <SEP> ATG <SEP> CCC <SEP> TTG <SEP>
TCC <SEP> AGT <SEP> CUG <SEP> TTT <SEP> CCC <SEP> AAT <SEP> CCT <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> CCA <SEP> CCC <SEP> CAG <SEP> CAC <SEP> CTG <SEP> CAC <SEP> CAG <SEP> CTG
<tb> 40
<tb> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Phe <SEP> Cys <SEP> Phe
<tb> CCT <SEP> GCT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AAA <SEP> GAG <SEP> TTC <SEP> GAG <SEP> CGT <SEP> GCC <SEP> TAC <SEP> ATT <SEP> CCC <SEP> GAG <SEP> GGA <SEP> CAG <SEP> CGC <SEP> TAT <SEP> TCC <SEP> ATT <SEP> CAG <SEP> AAT <SEP> GCC <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> GCT <SEP> TTC <SEP> TGC <SEP> TTC
<tb> 60 <SEP> 80
<tb> Ser <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP>
Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln
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<tb> 100
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<tb> TCA <SEP> TGG <SEP> CTG <SEP> GGG <SEP> CCC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TTT <SEP> CTC
<SEP> AGC <SEP> AGG <SEP> ATC <SEP> TTT <SEP> ACC <SEP> AAC <SEP> ACC <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> TTT <SEP> GGT <SEP> ACC <SEP> TCG <SEP> GAC <SEP> CGC <SEP> CTC <SEP> TAT <SEP> GAG <SEP> AAA <SEP> CTG <SEP> AAG
<tb> 120 <SEP> 140
<tb> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Asp <SEP> Lys
<tb> GAC <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAG <SEP> GCC <SEP> ATC <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> CAG <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAC <SEP> CGC <SEP> ACC <SEP> CCC <SEP> CGT <SEP> ATT <SEP> GGG <SEP> CAG <SEP> ATC <SEP> CTC <SEP> AAG <SEP> CAA <SEP> ACC <SEP> TAT <SEP> GAC <SEP> AAG
<tb> 160
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<tb> 180
<tb> Tyr <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Met <SEP> Lys <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Cyc <SEP> Ala <SEP> Phe
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<tb> CTGGCAACTGCCACCCCTACACTTTGTCCTAATAAAATTAATGATGCATCATATC <SEP> poly <SEP> (A) <SEP> --- <SEP> 3'
<tb>
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Beispiel 2 :
Im vorliegenden Beispiel wird das Isolieren und Reinigen der gesamten, menschliches Wachstumshormon codierenden Gensequenz zusammen mit der Synthese eines das gesamte Strukturgen für menschliches Wachstumshormon enthaltenden recombinanten Plasmids und die Herstellung eines Mikroorganismus beschrieben, welcher das gesamte Strukturgen für menschliches Wachstumshormon als Teil seines genetischen Aufbaus aufweist.
Das Isolieren von mDNS aus menschlichem Wachstumshormon wird im wesentlichen nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode vorgenommen, wobei jedoch als biologischer Ausgangsstoff Gewebe aus menschlichem Hypophysentumor verwendet wurde. 5 bösartige, menschliche Hypophysentumoren wurden nach dem Entfernen durch einen chirurgischen Eingriff in flüssigem Stickstoff rasch eingefroren. Diese Tumoren besassen ein Gewicht von 0, 4 bis 1, 5 g und wurden zunächst aufgetaut und dann in 4 molarem Guanidiniumthiocyanat, welches an Mercaptoäthanol 1 molar war und einen pH-Wert von 5, 0 besass, bei 4 C homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 1, 2 ml einer 5, 7 molaren Lösung von CsCl überschichtet, welche an EDTA 100 mmolar war,
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Die RNS wanderte zum Boden des Zentrifugenrohres.
Die RND wurde unter Verwendung einer Oligo-dT-Kolonne und durch Saecharosegradientensedi- mentation weiter gereinigt.
Etwa 10% der so isolierten RNS codierten Wachstumshormone, wie beim Einbauen einer radioaktiven Aminosäurevorstufe in ein ausfällbares Material mit Antiwachstumshormonwirkung in einem aus Weizenkeimen gewonnenen zellfreien Translationssystem [vgl. Roberts, B. E., und Patterson, B. M., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70,2330 (1973)] gezeigt werden konnte.
Die menschliches Wachstumshormon codierende cDNS wird im wesentlichen nach den Angaben in Beispiel 1 hergestellt. Die menschliches Wachstumshormon codierende cDNS wird durch Gelelektrophorese fraktioniert, wobei jenes Material für das Klonen ausgewählt wird, welches an eine Stelle wandert, die einer Kettenlänge von etwa 800 Nucleotiden entspricht. Die ausgewählte Fraktion wird mit DNS-Polymerase I behandelt und dann durch End-Addition von Hind III-Verknüpfern behandelt. Die erhaltene cDNS wird sodann unter Verwendung von DNS-Ligase mit mit alkalischer Phosphatase behandeltem Plasmid pBR-322 rekombiniert. E. coli X-1776 wird mit der recombinanten DNS transformiert, wobei ein DNS für menschliches Wachstumshormon enthaltender Stamm ausgewählt wird.
Dieser DNS für menschliches Wachstumshormon enthaltende Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet, worauf die menschliches Wachstumshormon codierende DNS aus dem Mikroorganismus isoliert und ihre Nucleotidsequenz bestimmt wird. Es wurde gefunden, dass die geklonte DNS für menschliches Wachstumshormon Nucleotide enthält, welche die gesamte Aminosäuresequenz menschlichen Wachstumshormons codiert. Die ersten 23 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons sind HN-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu- -His-Gln-Leu. Der Rest der Sequenz ist in der folgenden Tabelle III gezeigt.
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Tabelle III
EMI19.1
<tb>
<tb> 24 <SEP> 34 <SEP> 40 <SEP> 43
<tb> Ala <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Gln
<tb> 5'-----G <SEP> GCC <SEP> TTT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> CAG <SEP> CAG <SEP> TTT <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> GCC <SEP> TAT <SEP> ATC <SEP> CCA <SEP> AAG <SEP> GAA <SEP> CAG <SEP> AAG <SEP> TAT <SEP> TCA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CAG <SEP> AAC <SEP> CCC <SEP> CAG
<tb> 60
<tb> Thr <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Asg <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> ACC <SEP> TCC
<SEP> CTC <SEP> TGT <SEP> TTC <SEP> TCA <SEP> GAG <SEP> TCT <SEP> ATT <SEP> CCG <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> AGG <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> ACA <SEP> CAA <SEP> CAG <SEP> AAA <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> CTC
<tb> 80 <SEP> 100
<tb> Arg <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ser <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Tyr
<tb> CGC <SEP> ATC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> ATC <SEP> CAG <SEP> TCG <SEP> TGG <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> CCC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TTC <SEP> CTC <SEP> AGG <SEP> AGT <SEP> GTG <SEP> TTG <SEP> GCG <SEP> AAC <SEP> AAC <SEP> CTG <SEP> GTG <SEP> TAC
<tb> 120
<tb> Gly <SEP> Ala <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Val <SEP> Tyr
<SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp
<tb> GGC <SEP> GCC <SEP> TCT <SEP> GAC <SEP> AGC <SEP> AAC <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> GAC <SEP> CTC <SEP> CTA <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> GGG <SEP> ATC <SEP> CAA <SEP> ACG <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> GGG <SEP> AGG <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAC
<tb> 140
<tb> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> His <SEP> Asn <SEP> His <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> GGC <SEP> AGC <SEP> CCC <SEP> CGG <SEP> ACT <SEP> GGG <SEP> CAG <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> AAG <SEP> CAG <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AGC <SEP> AAG <SEP>
TTC <SEP> GAC <SEP> ACA <SEP> AAC <SEP> TCA <SEP> CAC <SEP> AAC <SEP> CAT <SEP> CAC <SEP> GCA <SEP> CTA <SEP> CTC
<tb> 160 <SEP> 180
<tb> Lys <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Tyr <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Asp <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Ser
<tb> AAG <SEP> AAC <SEP> TAC <SEP> GGG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TAC <SEP> TGG <SEP> TTC <SEP> AGG <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GAC <SEP> AAG <SEP> CTC <SEP> GAG <SEP> ACA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CGC <SEP> ATG <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TGC <SEP> CGC <SEP> TCT
<tb> 191
<tb> Val <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Phe
<tb> CTG <SEP> GAG <SEP> GGC <SEP> AGC <SEP> TGT <SEP> GGC <SEP> TTC <SEP> TAG <SEP> CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCC <SEP> -----
<SEP> 3' <SEP>
<tb>
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EMI1.1
the DNS takes place. In particular, the invention relates to the isolation of growth hormone genes, their purification, transfer and replication in a microbial host and their subsequent characterization. The invention provides new products. These include a plasmid in which a specific nucleotide sequence originating from a higher organism is inserted, and a new microorganism which contains a specific nucleotide sequence from a higher organism as part of its genetic makeup.
The following symbols and abbreviations are used in this description:
DNS = deoxyribonucleic acid
RNA = ribonucleic acid cDNA = complementary DNA (enzymatically synthesized from an mRNA sequence) mRNA = messenger RNA tRNA = transfer RNA dATP = deoxyadenosine triphosphate dGTP = deoxyguanosine triphosphate dCTP = deoxycytidine triphosphate
A = adenine
T = thymine
G = guanine C = cytosine
EMI1.2
ATP = adenosine triphosphate
TTP = thymidine triphosphate
The biological meaning of the base sequence of DNA is that of storing genetic information. It is known that the base sequence of the DNA is used as a code that determines the amino acid sequence of all proteins produced by the cell.
In addition, parts of the sequence are used for regulatory purposes, to control the time of manufacture and the amount of each protein. The way these controlling elements work is only partially recognized. Finally, the base sequence in each strand serves as a template for the replication of the DNA that accompanies cell division.
The way in which the information from the base sequence of DNA is transferred to the amino acid sequence of proteins is a fundamental process that is universal for all living organisms.
It could be proven that every amino acid usually present in proteins is determined by the sequence of one or more trinucleotides or triplets. Each protein thus corresponds to a segment of the DSN with a triplet sequence that corresponds to the amino acid sequence of the protein. The following table illustrates the genetic code.
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Genetic code
EMI2.1
<tb>
<tb> phenylalanine <SEP> (Phe) <SEP> TTK <SEP> histidine <SEP> (His) <SEP> CAK
<tb> leucine <SEP> (Leu) <SEP> XTY <SEP> glutamine <SEP> (Gln) <SEP> CAJ
<tb> isoleucine <SEP> (Ile) <SEP> ATM <SEP> asparagine <SEP> (Asn) <SEP> AAK
<tb> methionine <SEP> (Met) <SEP> ATG <SEP> lysine <SEP> (Lys) <SEP> AAJ
<tb> valine <SEP> (Val) <SEP> GTL <SEP> aspartic acid <SEP> (Asp) <SEP> GAK
<tb> serine <SEP> (Ser) <SEP> ORS <SEP> glutamic acid <SEP> (Glu) <SEP> CAJ <SEP>
Proline <SEP> (Pro) <SEP> CCL <SEP> cysteine <SEP> (Cys) <SEP> TGK
<tb> threonine <SEP> (Thr) <SEP> ACL <SEP> tryptophan <SEP> (try) <SEP> TGG
<tb> Alanine <SEP> (Ala) <SEP> GCL <SEP> arginine <SEP> (Arg) <SEP> WGZ
<tb> tyrosine <SEP> (Tyr) <SEP> TAK <SEP> glycine <SEP> (Gly) <SEP> EQU
<tb> termination signal <SEP> TAJ
<tb> termination signal <SEP> TGA
<tb>
Key:
Each three-letter triplet represents a trinucleotide of DNA, with a 5 'end on the left and a 3' end on the right. The letters stand for the purine or pyrimidine bases that make up the nucleotide sequence:
A = adenine
G = guanine C = cytosine
T = thymine X = T or C, if Y = A or GX = C, if Y = C or TY = A, G, C or T, if X = CY = A or G, if X = TW = C or A , if Z = A or G
EMI2.2
Z = A, G, C or T if W = C
Z = A or G if W = A
QR = TC if S = A, G, C or T
QR = AG, if S = T or C S = A, G, C or T,
if QR = TC S = T or C, if QR = AG J = A or G
K = T or C
L = A, T, C or G M = A, C or T
The first step in the biological process of translating the nucleotide sequence into an amino acid sequence is the so-called transcription. In this stage, a segment of the DNA with the sequence responsible for the protein to be produced is transferred to an RNA. RNA is a polynucleotide similar to DNA, but with ribose in place of deoxyribose and uracil in place of thymine. The bases of the RNA are capable of the same type of base pairing as the bases of the DNA. The RNA resulting from the transcription of a DNA nucleotide sequence is therefore complementary to this copied sequence.
This RNA is referred to as messenger RNA (mRNA) because of its intermediate position between the genetic apparatus and the apparatus for protein synthesis in the cell.
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In the cell, the mRNA serves as a matrix in a complex process involving numerous
Enzymes and organelles are involved within the cell and are more specific to synthesis
Leads amino acid sequences. This process is called translation.
Often there are other stages that serve from the translation
Amino acid sequence to produce a functional protein. One example is the manufacture of the
Insulin.
Numerous proteins of importance for medicine or research become higher in the cells
Organisms like vertebrates found or manufactured. These include e.g. B. the hormone insulin, other peptide hormones such as growth hormone, involved in the regulation of blood pressure
Proteins and numerous enzymes that are important for technical, medical or research purposes.
It is often difficult to extract these proteins from the organism in usable amounts, especially with proteins of human origin. There is therefore a
Need for techniques by which such proteins are produced in reasonable amounts by cells outside the organism. In some cases it is possible to obtain suitable cell strains using tissue culture techniques.
However, the growth of cells in tissue cultures is slow, the medium is expensive, the conditions have to be carefully controlled and the yields are low. It is also often difficult to obtain a grown cell strain with the desired differentiated properties.
In contrast, microorganisms such as bacteria can be relatively easily defined in chemically
Media are grown. The fermentation technology is already highly developed and easy to control.
The organisms grow rapidly and high yields are possible. In addition, certain microorganisms have already been genetically characterized and are indeed among the best characterized and recognized organisms.
It would therefore be very desirable to be able to transfer a gene code for a protein of medical importance from an organism that normally produces the protein to a suitable microorganism. In this way, the protein could be produced by the microorganism under controlled growth conditions and obtained in desired amounts. It is also possible that the total cost of producing the desired protein could be significantly reduced by such a process. The ability to isolate and transfer the gene sequence that determines the production of a specific protein into a microorganism of precisely known genetic structure also opens up valuable opportunities for research to investigate how the synthesis of such a protein is controlled and how the protein after synthesis is processed.
Isolated genes can also be modified so that they encode protein variants with other therapeutic or functional properties.
The invention relates to measures to achieve the stated goals. A method is disclosed that involves several steps, including enzyme-catalyzed reactions.
Knowledge of the nature of these enzyme reactions is outlined below.
Reverse transcriptase catalyzes the synthesis of the DNA complementary to an RNA template in the presence of the RNA template, an oligo-deoxynucleotide primer and the four deoxynucleoside triphosphates dATP, dGTP, dCTP and TTP. The reaction is initiated by the non-covalent binding of the oligo deoxynucleotide primer to the 3 'end of the mRNA, followed by the stepwise addition of the appropriate deoxynucleotides, according to the base pairing rule, to the 3' end of the growing chain. The molecule obtained as a product can be described as hairpin-shaped, it contains the starting RNA and a complementary single strand of DNA.
Reverse transcriptase can also catalyze a similar reaction in which a single strand of DNA acts as a template, in which case the product is a hairpin-shaped double strand of DNA with a single strand of DNA connecting a pair of ends; see.
Aviv, H., and Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972), and Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.F., and Maniatis, T., Cell. 7, 279 (1976).
Restriction endonucleases are enzymes that are capable of hydrolysing phosphodiester bonds in double-stranded DNA, whereby the sequence of the DNA strand is cleaved.
If the DNA is in the form of a closed loop, it is converted into a linear form.
The main feature of an enzyme of this type is that it has hydrolytic effects
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EMI4.1
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To illustrate the practice of the invention, the isolation and transfer of growth hormone gene are described in detail. The growth hormone was chosen in this case because of its central importance from the perspective of clinical medicine and from the
Basic research perspective. The method disclosed can be readily understood by one of ordinary skill in the art to isolate growth hormone gene from other organisms, including
People to be transferred.
The possibility of producing human growth hormone in quantities that would meet the requirements would therefore be extremely desirable. The production of human growth hormone in bacteria is a technique that could be used to achieve this goal. However, progress in this direction has so far been thwarted by the lack of a technique for introducing the growth hormone gene into bacteria. The invention provides such a technique.
The ability to create a DNA with a specific sequence that matches the genetic
Providing code for a specific protein allows the nucleotide sequence to be modified by chemical or biological means in such a way that the protein ultimately produced is also modified. In this way you could e.g. B. produce a modified growth hormone that is tailored to special medical needs. The genetic ability to produce a growth hormone-like amino acid sequence with the essential functional properties of growth hormone can therefore be transferred to a microorganism.
The ability to transfer the genetic code for a certain protein, which is required in the normal metabolism of a higher organism, into a microorganism, e.g. B. a bacterium, opens up new possibilities for the production of such proteins. This also gives rise to the possibility of multiplying or replacing such proteins by proteins which have been produced by microorganisms modified according to the invention where the ability of the higher organism to produce these proteins in a normal manner has been damaged.
B. the possibility of building symbioses between microorganisms according to the invention and people with chronic or acute deficiency diseases, the genetically modified microorganisms according to the invention being implanted or otherwise incorporated in order to compensate for the pathological metabolic errors.
The invention relates to a method for isolating a specific nucleotide sequence containing genetic information, the synthesis of DNA with this specific nucleotide sequence and the transfer of the DNA into a host organism.
The invention is illustrated using the example of specific DNA sequences which are transferred into a bacterium, namely the gene for rat growth hormone and the gene for human growth hormone. Thereafter, it can be assumed that the method is based on the transfer of any DNA sequence of a higher organism, such as. B. a vertebrate, is well applicable to any microorganism. A higher organism is defined here as any eucaryotic organism with differentiated tissues, including e.g. B. insects, mollusks, plants, vertebrates, including mammals, the latter being cattle, pigs, primates and humans.
A microorganism is understood to mean any microscopic organism that falls under the name Protist, being procaryotic or eucaryotic and z. B. from a bacterium, protozone, algae and fungi, including yeast. In the present method, a selected cell population is first isolated using a new method. Intact mRNA is extracted from the cells by a method in which practically all RNase activity is suppressed. The intact messenger RNA from the extract is purified by column chromatography and then subjected to the action of reverse transcriptase, this action taking place in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates required for the synthesis of a complementary (cDNA) strand.
The product of this first reverse transcriptase reaction is further processed in a process that selectively removes the ribonucleotide sequence. The remaining deoxynucleotide sequence, which is complementary to the starting mRNA, is incubated in a second reaction with reverse transcriptase or DNA polymerase in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates. The resulting product is a double cDNA structure, the complementary strands of which
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one end are connected by a single-strand loop. This product is then treated with single stranded nuclease that cleaves the single stranded loop.
The resulting double-stranded cDNA is then extended by adding a specific DNA at both ends, which has the sequence of a recognition or cleavage site of a restriction enzyme. The addition is catalyzed by a DNA ligase. The extended cDNA is then treated with a restriction endonuclease, self-complementary single-stranded ends being formed at the 5 'ends of each strand of the double helix.
A plasmid DNA with a recognition site for the same restriction endonuclease is treated with this enzyme in order to cleave the polynucleotide strand and to generate self-complementary single-stranded nucleotide sequences at the 5 'ends. The 5'-terminal phosphate groups on the single-stranded ends are removed to prevent the plasmid from forming a ring structure capable of transforming a host cell. The cDNA prepared as described above and the plasmid DNA are then incubated together in the presence of DNA ligase. Under the reaction conditions described, a viable, closed ring can only be formed from plasmid DNA if a segment of the cDNA is inserted.
The plasmid containing the cDNA sequence is then placed in a suitable host cell. Cells that have taken up a viable plasmid can be recognized by the appearance of colonies
EMI6.1
then grown, and the newly combined plasmid is then reisolated. In this way, a large amount of recombinant plasmid DNA can be produced, from which the specific cDNA sequence can be isolated again by endonucleolytic cleavage with the corresponding restriction enzyme.
The basic method according to the invention is applicable to the isolation of any nucleotide sequence from a higher organism, including humans, and its transfer into a microorganism as a host. The method proves useful for transferring a genetic code for a specific protein of medical or technical value and for the microbiological synthesis of such proteins. To illustrate the invention, the nucleotide sequence coding for growth hormone was isolated from rats, transferred into bacteria and replicated there.
The invention comprises a method for isolating a DNA molecule with a specific nucleotide sequence and its transfer into a microorganism, the original nucleotide sequence of the DNA being found in the microorganism after the multiplication.
The stages that make up the process according to the invention can be divided into four general categories:
1. The isolation of a desired cell population from a higher organism
There are two sources for a genetic sequence encoding a specific protein: the DNA of the underlying organism itself and an RNA translation of the DNA. According to the current safety regulations of the National Institutes of Health, it is stipulated for the USA that human genes of all kinds can only be introduced into recombined DNA and then into bacteria after they have been cleaned very carefully, or if they are in specially equipped (P4) facilities works, cf.
U.S. Federal Register, Vol. 41,
EMI6.2
isolating the specific mRNA that has a nucleotide sequence encoding the desired protein. In this way, one has the further advantage that the mRNA can be purified more easily than DNA extracted from cells. In particular, one can also take advantage of the fact that in highly differentiated organisms, such as vertebrates, it is possible to identify a specific cell population of special localization in the organism, the function of which mainly consists in the production of the protein in question. Such a population can also be present during a temporary stage of development of the organism.
In such cell populations, a large proportion of the mRNA isolated from the cells has the desired nucleotide sequence. The choice of the cell population to be isolated and that at
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Isolation processes can be essential with regard to the initial purity of the mRNA.
In most tissues, glands and organs, the cells are held together by a generally fibrous network of connective tissue, which consists mainly of collagen, but which may also contain other structural proteins, polysaccharides and mineral deposits. The isolation of cells of a certain tissue inevitably requires methods for releasing the cells from the connective tissue matrix. The isolation and purification of a specific differentiated cell type therefore comprises two main stages: the separation of the cells from the connective tissue and the separation of the desired cells from all other cell types present in the tissue. The procedures provided according to the invention are applicable to the isolation of numerous cell types from different tissues.
Often the proportion of desired mRNA can be increased if the cell responses to stimuli from the environment are used correctly. So z. B. treatment with a hormone can lead to increased production of the desired mRNA. Other methods include growing at a certain temperature or in the presence of a specific nutrient medium or other chemical substance. When rat growth hormone mRNA is isolated, treatment of cultured pituitary cells with thyroid hormone and glucocorticoids significantly increases the level of growth hormone mRNA in a synergistic manner.
2. Extraction of the mRNA
An essential feature of the invention is the practically complete removal of the RNase activity in the cell extract. The mRNA to be extracted is a single-stranded polynucleotide, unpaired with a complementary strand. The hydrolytic cleavage of a single phosphodiester bond in the sequence would therefore render the entire molecule unusable for the purpose of transferring an intact genetic sequence into a microorganism. As already mentioned, the RNase enzyme is widespread, active and exceptionally stable. It is found on the skin, survives the usual rinsing processes for glass equipment and occasionally contaminates the stocks of organic chemicals.
The difficulties are particularly acute when working with extracts from pancreatic cells, since the thyroid is a source of digestive enzymes and is therefore rich in RNase. However, the problem of RNase contamination arises in all tissues and the method disclosed herein for removing RNase activity is applicable to all tissues. The surprising effectiveness of the method is described using the example of successfully isolating intact mRNA from isolated islet cells of the pancreas.
When the cells are torn open and in all the processes which are used to isolate the RNA which is practically free of protein, a combination of a chaotropic anion, a chatropic cation and a disulfide bond-releasing agent is used according to the invention.
The choice of suitable chaotropic ions is based on their solubility in aqueous
EMI7.1
Salts formed by combining such cations and anions depend in part on their solubility. So z. B. lithium diiodosalicylate is a stronger denaturing agent than guanidinium thiocyanate, but it has a solubility of only about 0.1 M, and it is also relatively expensive. The preferred combination of cation and anion is in guanidinium thiocyanate, since this salt is easily accessible and readily soluble in aqueous media, up to about 5 molar solutions.
As is well known, thiol compounds, such as S-mercaptoethanol, cleave intramolecular disulfide
EMI7.2
captan u. The like. An essential property is the solubility in water, since the thiol compound must be present in a large excess over the intramolecular disulfides in order to complete the exchange reaction. ss-mercaptoethanol is preferred because of its availability and low price.
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on columns with cellulose to which oligothymidylate is bound, see Aviv, H., and Leder, P., loc. cit. The above methods provide essentially pure, intact mRNA from starting materials that are rich in RNase.
The purification of the mRNA and the subsequent stages carried out in vitro can be carried out in practically the same way with any mRNA, regardless of its organism of origin.
Under certain conditions, e.g. B. when using cells from tissue cultures as the source of the mRNA, the contamination with RNase can be so low that the above step of RNase inhibition is not required. In these cases, the prior art methods for reducing RNase activity may be sufficient.
3. Formation of the cDNA
The drawing is a schematic representation of the remaining stages of the process. The first step is to create a DNA sequence that is complementary to the purified mRNA. Reverse transcriptase is chosen as the enzyme for this reaction, although in principle any enzyme could be used which is capable of forming a complementary DNA strand on the basis of the mRNA used as a template. The reaction can be carried out under the known conditions, using the mRNA as a template and a mixture of the four deoxynucleoside triphosphates as a precursor of the DNA strand. One of the deoxynucleoside
EMI9.1
tion and separation, e.g. B. by chromatography and electrophoresis, control and quantitative yield information; see.
Efstratiadis, A., et. al., loc. cit. As from the
As can be seen in the drawing, the product of the reaction with the reverse transcriptase is a double-stranded hairpin shape with a non-covalent bond between the RNA strand and the DNA strand.
The product of the reaction with the reverse transcriptase is obtained from the reaction mixture using standard methods. A combination of phenol extraction, chromatography on a three-dimensionally cross-linked polysaccharide and precipitation with ethanol are expediently used.
Once the cDNA is enzymatically synthesized, the RNA template can be removed.
Numerous methods for the selective degradation of RNA in the presence of DNA are known. The preferred method is alkaline hydrolysis, which is highly selective and can be easily controlled by pH adjustment.
After the alkaline hydrolysis and subsequent neutralization, the P-labeled cDNA can be concentrated by precipitation with ethanol, if this is desired.
The synthesis of a double-stranded hairpin-shaped cDNA is carried out using the appropriate enzyme, e.g. B. with DNA polymerase or reverse transcriptase.
The reaction conditions are similar to those described above, including the use of a 32p-labeled nucleoside triphosphate in the a position. Reverse transcriptase is available from various sources, e.g. B. from avian myeloblastosis virus (the virus is available from Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, which produces it under a contract with the National Institutes of Health).
After the formation of the cDNA hairpin, it may be advisable to recover the DNA from the reaction mixture. Here, too, one can expediently use phenol extraction, chromatography on a three-dimensionally crosslinked polysaccharide and precipitation with ethanol to purify the DNA product and to remove contaminating protein.
The hairpin structure can be converted to a conventional double-stranded DNA by removing the single-stranded loop that connects the ends of complementary strands. Various enzymes are available for this purpose, which bring about a specific hydrolytic cleavage of single-stranded DNA regions. An enzyme suitable for this purpose is the Sl nuclease from Aspergillus oryzae (the enzyme can be obtained from Miles Research Products, Elkhart, Indiana). Treatment of the hairpin-shaped DNA with S1 nuclease leads to cDNA molecules with base-paired ends in high yields. Extraction, chromatography and precipitation with ethanol are carried out as described above.
The use of reverse transcriptase and S1 nuclease in the synthesis of double-stranded cDNA transmissions from mRNA was described by Efstratiadis et. al., loc. cit.
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If necessary, the proportion of blunt-ended cDNA molecules can be increased by treatment with E. coli DNA polymerase I in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates. The combination of exonuclease and polymerase activity of the enzyme results in the removal of all protruding 3 'ends and the filling in of all protruding 5' ends. In this way, the participation of the majority of the cDNA molecules in the following linkage reactions is ensured.
The next step in the process is to treat the ends of the cDNA product so that there are appropriate sequences at each end that have a recognition site for a restriction endonuclease. The choice of the DNA fragment to be added to the ends is determined by reasons of expediency in handling. The sequence to add to the ends
EMI10.1
Plasmid should have at least one site that responds to restriction endonuclease cleavage. The plasmid pMB9 has e.g. B. a recognition site for the enzyme Hind
III. Hind III is isolated from Hemophilus influenza and purified by the method of Smith, H.O. and Wilcox, K.W., J. Mol. Biol. 51,379 (1970).
The Hae III enzyme from Haemophilus aegyptious is synthesized by the method of Middleton, J.H., Edgell, M.H., and Hutchinson III, C.A., J. Virol. 10.42 (1972). An enzyme from Hemophilus suis, called Hsu I, catalyzes the hydrolysis at the same recognition sites as Hind III. These two
Enzymes are therefore considered to be functionally interchangeable.
It is expedient to use a chemically synthesized double-stranded decanucleotide with the recognition sequence for Hind III for binding to the ends of the cDNA double strand.
The double-stranded decanucleotide has the sequence shown in the drawing, cf. Heyneker, H.L., et al., And Scheller, R.H., et al., Loc. cit. Various such synthetic sequences with recognition sites are available today so that the ends of the double DNA can be prepared in such a way that they respond to the action of one of the numerous restriction endonucleases.
Binding of the recognition site sequence to the ends of the cDNA can be done in a known manner
Way. The method of choice is a reaction called "blunt end linkage" and catalyzed by a DNA ligase purified by the method of Panet, A., et al., Biochemistry 12, 5045 (1973) . The reaction of the link blunt
Ends was published by Sgaramella, V., et al., Loc. cit. The product of linking a blunt-ended cDNA with a large molar excess of a double-stranded decanucleotide to a Hind III endonuclease recognition site is a cDNA with this Hind III recognition sequence at each end.
Treatment of the reaction product with Hind III endonuclease leads to cleavage at the recognition site and formation of single-stranded self-complementary 5 'ends, see. Drawing.
4. Formation of a recombined DNA transfer vector
In principle, a large number of viral and plasmid DNA can be used for recombining with the cDNA produced in the manner described above. The basic prerequisites are that the DNA transfer vector must be capable of entering a host cell, that it replicates in the host cell, and that it also has a genetic determinant that makes it possible to separate out the host cells that have taken up the vector . For public security reasons, the selection range should be limited to those transfer vector types that appear suitable for the respective experiments, in accordance with the guidelines of the National Institutes of Health mentioned above.
The list of approved DNA transfer vectors is constantly expanding as new vectors are developed and approved by the relevant committee of the National Institutes of Health. According to the invention, the use of any viral and plasmid DNA is naturally provided which has the abilities described, including those which are still to be approved. Suitable transfer vector
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Science 196, 161 (1977)] and derivatives of the plasmid col EI [cf. e.g. B. Rodriguez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer, H.W., and Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms
In The Control of Gene Expression, D.P. Nierlich, W.J., Rutter, C.F., Fox.
Eds. (Academic Press, N.Y., 1976), pp. 471-477]. Plasmids from col EI are relatively small, they have molecular weights in the order of a few million and have the property that the number of copies of plasmid DNA per host cell can be increased from 20 to 40 under normal conditions to 1000 or more if the host cell treated with chloramphenicol. The ability to increase the amount of genes in the host cell, under certain circumstances, allows the host cell, under the control of the experimenter, to mainly produce proteins encoded by the genes on the plasmid. Such derivatives of col EI are therefore preferred transfer vectors according to the invention.
Suitable derivatives of col EI include plasmids pMB-9, which carry the gene for tetracycline resistance, and pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 and pBR-322, which in addition to tetracycline resistance -Gen have a gene for ampule resistance. The presence of drug resistance genes is a convenient way to select the cells that have been successfully infested by the plasmid, since colonies of these cells grow in the presence of the active substances, while cells without the plasmid do not grow or do not form colonies. In the examples of this description, a plasmid from col EI was always used which, in addition to the drug resistance gene, had a Hind III recognition site.
As with the plasmid, the choice of a suitable host can be made from a very wide range, although the range has been narrowly limited for reasons of public security.
An E. coli strain, designated X-1776, was developed and approved by the National Institutes of Health for procedures of the type described, requiring P2 facilities; see. Curtiss, III, R., Ann. Rev. Microbiol., 30, 507 (1976). E. coli RR-1 can be used when P3 facilities are present. As in the case of the plasmids, the invention of course provides for the use of strains of any host cells for the purposes of accommodation
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Plasmid DNA mixed with cDNA, both containing end groups treated in the same way. In order to keep the possibility that cDNA segments enter into combinations with one another to a minimum, the plasmid DNA is used in molar excess over the cDNA. This procedure has so far resulted in the majority of the plasmids circulating without an inserted cDNA fragment.
The subsequently transformed lines then mainly contain plasmid and no plasmids recombined with cDNA. The result is a very tedious and time-consuming selection process. According to the prior art, this problem has been solved by trying to produce DNA vectors with a recognition site for the restriction endonuclease in the middle of an appropriate labeling gene such that the insertion of the cDNA divides the gene, causing loss of the function encoded by the gene entry.
A method of reducing the number of colonies to be examined for recombined plasmids is preferably used. In this case, plasmid DNA, which was cut off with the restriction endonuclease, is treated with alkaline phosphatase (commercial enzyme). Treatment with alkaline phosphatase removes the 5'-terminal phosphate groups from the ends of the plasmid generated with the endonuclease and prevents self-assembly of the plasmid DNA. Ring formation and transformation thus depend on the insertion of a DNA fragment which has 5'-phosphorylated ends. This procedure reduces the relative frequency of transformations from less than 1 down to no recombination.
The method according to the invention is based on the fact that the reaction catalyzed by DNA ligase takes place between an S'-phosphate-DNA end group and a 3'-hydroxyl-DNA end group. If the terminal 5 r phosphate group is removed, no binding reaction occurs.
If double-stranded DNS is to be connected, two situations are possible, as shown in Table 1:
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EMI12.2
<tb>
<tb> case <SEP> reactant <SEP> ligase product
<tb> 1 <SEP> 3'5'3'5 '
<tb> OH <SEP> H203P0-0-P-0- <SEP>
<tb> + <SEP> + 2H20
<tb> OPO3H2 <SEP> HO <SEP> 0-P-O --- <SEP>
<tb> 5 ' <SEP> 3 ' <SEP> 5 ' <SEP> 3 '
<tb> II <SEP> 3 ' <SEP> 5 ' <SEP> 3 ' <SEP> 5 '
<tb> - (H <SEP> H2O3PO-- <SEP> --O-P-O--
<tb> --OH <SEP> + <SEP> OH-- <SEP> --OH <SEP> HO - + H2O
<tb> 5'3'5'3 '
<tb> III <SEP> 3'5 '
<tb> OH <SEP> HO
<tb> + <SEP> none <SEP> reaction
<tb> OH <SEP> HO-
<tb> 5'3 '
<tb>
In Table 1, the double-stranded DNA is shown schematically by two parallel lines, the 5 'and 3' end groups having hydroxyl or phosphate groups, depending on the type.
In case I there are 5'-phosphate groups on both reactive end groups, with the result that both strands are covalently bound. In case II, only one of the strands to be connected has a terminal 5'-phosphate group, with the result that a single-stranded covalent bond takes place, while there is discontinuity in the other strand. The non-covalently linked strand remains connected to the molecule in a known manner due to hydrogen bonds between complementary base pairs on the opposite strands.
In case III, none of the ends of the reactants has a 5'-phosphate group, so that no binding reaction can occur.
Undesired binding reactions can therefore be prevented by treating corresponding ends of the reactants whose connection is to be prevented by removing the 5'-phosphate groups. Any method of removing 5'-phosphate groups that do not otherwise damage the DNA can be used. Hydrolysis catalyzed by the enzyme alkaline phosphatase is preferred.
The method described above is also useful when a linear DNA molecule has to be cleaved into two sub-fragments, typically with a restriction endonuclease, and then reconstituted in the original sequence. The sub-fragments can be cleaned separately and the desired sequence can be reconstituted by reconnecting the sub-fragments. The enzyme DNA ligase, which catalyzes the end-to-end linkage of DNA fragments, can be used for this purpose, cf. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H., and Khorana, H.G., Proc. Natl. Sci., USA 67, 1468 (1970). If the sequences to be joined are not blunt, the ligase obtained from E. coli can be used, cf. Modrich, P., and Lehman, I.R., J. Biol.
Chem. 245, 3626 (1970).
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cDNA is removed with a restriction endonuclease prior to cleavage of the homogeneous cDNA. Alkaline phosphatase is preferably used again. The 5'-terminal phosphate groups are
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a structural precondition for the later binding effect of the DNA ligase, which
Reconstitution of the split sub-fragments is used. Ends without a 5'-terminal phosphate group cannot therefore be bound covalently. The DNA sub-fragments can only be bound at those ends that have a 51 -phosphate group.
This procedure prevents the most important undesirable binding reaction, namely the
Connection of two fragments with reverse sequence, i. H. back-to-front instead of front-to-back. Other possible side reactions, such as dimerization and cyclization, are not prevented, since these take place in a type II reaction according to Table 1. These side reactions are less disadvantageous because they lead to physically separable and identifiable products, which is not the case when recombining in the wrong direction.
To illustrate the method described above, cDNA encoding growth hormone was isolated and recombined with a plasmid. The DNA molecules were used to transform E. coli X-1776. The cells to be transformed were selected by growth on a medium containing tetracycline. A recombined one obtained from transformed lines
Plasmid DNA contained an inserted DNA fragment approximately 410 nucleotides in length. Other new combinations that had been isolated in the same way were also analyzed. The inserted fragments were released from the plasmid with Hind III or Hsu I endonuclease and the DNA sequence was determined according to the method of Maxam, A.M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 74, 560 (1977).
The nucleotide sequences of the inserted DNA fragments were overlapped and contained the entire coding reaction for rat growth hormone.
After extensive replication in E. coli, a nucleotide sequence of approximately 800 nucleotides was found
Length isolated that contained the entire coding sequence for rat growth hormone and parts of the precursor peptide and part of the 5'-untranslated region.
The described method is generally applicable to the isolation and purification of a gene from a higher organism, including human genes, its transfer into a microorganism and replication in the microorganism. New recombined plasmids which contain all or part of the isolated gene are also described. Furthermore, previously unknown new microorganisms are described which contain a gene from a higher organism as part of their genetic makeup.
The following examples describe in detail the process used for the isolation, purification and transfer of growth hormones in E. coli.
The invention is explained in more detail below by means of exemplary embodiments.
Example 1 :
This example describes the isolation and purification of a DNA having the entire structural sequence of rat growth hormone together with the synthesis of a transfer vector possessing the entire structural gene for rat growth hormone and the production of a microorganism strain containing the gene for rat growth hormone as part of its genetic makeup.
In connection with genes of non-human origin, the safety regulations in the U.S. do not require that the cDNA be purified to the same extent as is required for cDNAs of human origin. For this reason, it was possible to isolate the cDNA containing the entire structural gene of rat growth hormone by isolating electrophoretically separated DNA of the expected length of about 800 base pairs (determined from the known length of the rat growth homon composed of amino acids). Cultured cells from rat pituitary gland have been used as the source of the rat growth hormone mRNA. between a sub-clone of the cell species GH-1 used, as can be obtained from ATCC [cf. Tashjian, A.
H., et al., Endochrinology 82, 342 (1968)]. In such cells grown under formal conditions, the growth hormone mRNA is only present in a small amount of 1 to 3% of the total RNA containing poly-A, but the growth hormone content of mRNA could be increased due to the synergistic effect of thyroid hormones and glucocorticoids over that of mRNA - Species to be raised from cellular tissue. RNS was obtained from 5.108 cells grown in suspension culture and four days before collecting the cells with 1 mmolar dexamethasone and 10 nanomolar L-triiodothyronine
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had been stimulated to produce growth hormone. The fraction of the cytoplasmic membranes originating from the cultivated cells became polyadenylated RNA in a known manner
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USA 74, 1816 (1977) and Bancroft, F.
C., Wu, G., and Zubay, G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 3646 (1973)] isolated.
The mRNA was duplexed using avian myeloblastosis virus reverse transcriptase obtained from D. J. Beard, Life Science, Inc., St. Petersburg, Florida.
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labeled deoxynucleoside triphosphate, specific activity 500-200 Curie per mole, 200 µg / ml oligo-dT (12-18) from Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, 100) ig / ml polyadenylated RNA and 200 units / ml reverse transcriptase. The mixture is incubated at 45 C for 15 min.
After the solution was made 25 mmolar of EDTA-Na 2, it was extracted with the same volume of phenol saturated with water, and the aqueous phases were placed in a column filled with Sephadex G-100, 0.3 cm in diameter and 10 cm in height was chromatographed using an eluent that was 10 mmolar (pH 9.0) in Tris-HCl, 100 mmolar on NaCl and 2 mmolar on EDTA. The nucleic acid eluted from the hollow volume
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then dissolved in water. After fractionation by gel electrophoresis, a weak but clearly visible band was identified, which corresponded to a DNA that was approximately 800 base pairs in length.
By treating the entire cDNA transcribed from the mRNA of the cultured pituitary cells with HhaI endonuclease, two major DNA fragments were obtained.
These main fragments contained, after electrophoretic separation from one another, approximately 328 nucleotides (fragment A) and 240 nucleotides (fragment B).
The nucleotide sequence of these fragments A and B was determined by the fragments according to the method of Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,560 (1977), were specifically cleaved and subjected to sequence analysis. Sequence analysis showed that fragments A and B were in fact parts of the rat growth hormone coding region as obtained by comparison with the published amino acid sequence of rat growth hormone and by comparison with the amino acid sequence of other known growth hormones [cf. Wallis, M., and Davies, R.V.N., Growth hormone and related peptides (Eds., Copecile,
EMI14.4
Washington, D.C., 1976)].
When the double stranded cDNA electrophoretically isolated and 800 base pairs as described above was treated with an endonuclease, two fragments were found among the main cleavage products, the length of which corresponded to the length of fragments A and B.
Because the approximately 800 base pair rat growth hormone cDNA had not been treated by restriction endonuclease treatment, it was necessary to further purify the DNA to remove single-stranded, unpaired ends. In practice
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incubated by DNA polymerase I from E. coli to exonucleolytically cleave off all 3 'ends and fill in all 5' ends. DNA polymerase I is available from Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana.
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The cDNA containing about 800 base pairs was treated by adding synthetically produced Hind III linkers. The rat growth hormone cDNA was exposed to 0.03 M sodium acetate, PH 4, 6, 0, 3 M sodium chloride and 4.5 mmolar ZnC12 with 30 units of an activity of 1200 units / ml of Sl nuclease ( available from Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) and then incubated for a further 15 min at 100C. The reaction was carried out by adding Tris in the form of the base to achieve a final concentration of 0.1 m, from EDTA to a final concentration of 25 mmolar and tRNA from E. coli [prepared by the method of Ehrenstein, G., Methods in Enzymology , SP
Colowick and N.O. Kaplan, Eds., Vol. 12a, p. 588 (1967)] at 40 Ig / ml. After extracting the reaction mixture with methanol and chromatographing on a three-dimensional cross-linked
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This treatment led to a high yield of cDNA molecules which had the base-paired ends required for stump end ligation to synthetic decanucleotides.
The Hind III decamers were prepared by the method given by Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. and Itakura, K., in Science 196, 1977 (1977).
Linking of Hind III decamers to cDNA was accomplished by incubating at 14 C for 1 h in 66 mmolar Tris-HCl, PH 7, 6, 6, 6 mmolar MgCl, 1 mmolar ATP, 10 mmolar dithiothreitol, 3 mmolar Hind III decamers with 10 cpm / pmol and T4 DNA ligase (about 500 units /
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Hsu 1 or Hind III endonuclease for 2 h at 37 C, KCI was added to a final concentration of 50 mmolar and EDTA to a final concentration of 0.1 mmolar. Hind III and Hae II endonucleases are commercially available from New England Biolabs, Beverly, Massachusetts.
The reaction product was analyzed by gel electrophoresis, a crest corresponding to approximately 800 nucleotides being observed in addition to the fragments of cleaved Hind II decamerers.
The plasmid pBR-322, which had an ampicillin resistance gene and a single Hind III site within the tetracycline resistance gene, was treated with Hind II I endonuclease and alkaline phosphatase. The plasmid pBR-322 was cleaved at the Hind III restriction site with Hsu Indonuclease and then treated with alkaline phosphatase. The enzyme was contained in the reaction mixture in an amount of 0.1 unit / gg, and the reaction mixture was incubated at 65 C for 30 min in 25 mmolar Tris-HCl, pH = 8, whereupon the phosphatase was extracted with phenol.
After a case of ethanol, the phosphatase-treated plasmid DNA was added to a 800 base pair cDNA from rat growth hormone which contained cohesive ends of Hind III in a molar ratio of 3 moles of plasmid per mole of cDNA. The mixture was then incubated for 1 h at 14 C and in the presence of 50 units / ml T4-DNA ligase in 66 mmolar Tris, PH 7, 6, 6, 6 mmolar MgCl ,, 10 mmolar dithiothreitol and 1 mmolar ATP.
This ligase reaction mixture was used to transform a suspension of cells
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cultivated to a cell density of about 2. 10 cells / ml. The cells were separated at 5 C by centrifugation at 5000 g for 5 min, then resuspended in 20 ml of a 10 mmol sodium chloride solution in NaCl, then centrifuged in the stated manner and then resuspended in 20 ml of a transformation buffer which was added to CaCl, 75 mmolar, 140 mmolar on NaCl and 10 mmolar on Tris (PH 7, 5). The suspension was then left in ice for 5 minutes. The cells were then centrifuged and again in 0.5 ml of transformation buffer
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and selected with a view to not growing on a culture medium containing 20 µg / ml tetracycline.
A total of 10 such colonies were obtained, each of which contained a plasmid in which about 800 base pairs were nested and which was cleaved by Hind III cleavage.
The 800 base-pair DNA from rat growth hormone was isolated in a preparative amount from recombinant pRGH (RWH) -l clone, after which its nucleotide sequence was determined according to the method given above by Maxam and Gilbert. In this case, the nucleotide sequence contained untranslated 5 'regions of the rat growth hormone (rgh) and additionally a sequence containing 26 amino acids as found in the growth hormone precursor protein before secretion. The messenger (messenger) of the mDNA sequence derived from the gene sequence is shown in Table II.
With the exception of positions 1 and 8, the predicted amino acid sequence agrees well with that partial amino acid sequence of rat growth hormone described by Wallis and Davies, supra, and residues 1-43, 65-69, 108-113, 133-143 and 150 Contains -190.
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Table II
EMI17.1
<tb>
<tb> Met <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> 5 '--- GTGGACAGATCACTGAGTGGCG <SEP> ATG <SEP> CCT <SEP> GCA <SEP> GAC <SEP> TCT <SEP> CAG <SEP> ACT <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> CTC <SEP> CTG <SEP> ACC <SEP> TTC <SEP> ACC <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG
<tb> 1 <SEP> 20
<tb> Trp <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Met <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> His <SEP> Leu <SEP> His <SEP> Gln <SEP> Leu
<tb> TGG <SEP> CCT <SEP> CAA <SEP> GAG <SEP> GCT <SEP> GGT <SEP> GCT <SEP> TTA <SEP> CCT <SEP> GCC <SEP> ATG <SEP> CCC <SEP> TTG <SEP>
TCC <SEP> AGT <SEP> CUG <SEP> TTT <SEP> CCC <SEP> AAT <SEP> CCT <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> CCA <SEP> CCC <SEP> CAG <SEP> CAC <SEP> CTG <SEP> CAC <SEP> CAG <SEP> CTG
<tb> 40
<tb> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Phe <SEP> Cys <SEP> Phe
<tb> CCT <SEP> GCT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AAA <SEP> GAG <SEP> TTC <SEP> GAG <SEP> CGT <SEP> GCC <SEP> TAC <SEP> ATT <SEP> CCC <SEP> GAG <SEP> GGA <SEP> CAG <SEP> CGC <SEP> TAT <SEP> TCC <SEP> ATT <SEP> CAG <SEP> AAT <SEP> GCC <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> GCT <SEP> TTC <SEP> TGC <SEP> TTC
<tb> 60 <SEP> 80
<tb> Ser <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP>
Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln
<tb> TCA <SEP> GAG <SEP> ACC <SEP> ATC <SEP> CCA <SEP> GCC <SEP> CCC <SEP> ACC <SEP> GGC <SEP> AAG <SEP> GAG <SEP> GAG <SEP> GCG <SEP> CAG <SEP> CAG <SEP> AGA <SEP> ACT <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GAA <SEP> TTG <SEP> CTT <SEP> CGC <SEP> TTC <SEP> TCG <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> ATC <SEP> CAG
<tb> 100
<tb> Ser <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Phe <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Leu <SEP> Lys
<tb> TCA <SEP> TGG <SEP> CTG <SEP> GGG <SEP> CCC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TTT <SEP> CTC
<SEP> AGC <SEP> AGG <SEP> ATC <SEP> TTT <SEP> ACC <SEP> AAC <SEP> ACC <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> TTT <SEP> GGT <SEP> ACC <SEP> TCG <SEP> GAC <SEP> CGC <SEP> CTC <SEP> TAT <SEP> GAG <SEP> AAA <SEP> CTG <SEP> AAG
<tb> 120 <SEP> 140
<tb> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Asp <SEP> Lys
<tb> GAC <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAG <SEP> GCC <SEP> ATC <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> CAG <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAC <SEP> CGC <SEP> ACC <SEP> CCC <SEP> CGT <SEP> ATT <SEP> GGG <SEP> CAG <SEP> ATC <SEP> CTC <SEP> AAG <SEP> CAA <SEP> ACC <SEP> TAT <SEP> GAC <SEP> AAG
<tb> 160
<tb> Phe <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Met <SEP> Arg
<SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> His <SEP> Lys <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Thr
<tb> TTT <SEP> GAC <SEP> GCC <SEP> AAC <SEP> ATG <SEP> CGG <SEP> AGC <SEP> GAT <SEP> GAG <SEP> GGT <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> AAA <SEP> AAG <SEP> TAT <SEP> GGG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TCC <SEP> TGC <SEP> TTG <SEP> AAG <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> CTG <SEP> CAC <SEP> AAG <SEP> GCA <SEP> GAG <SEP> ACC
<tb> 180
<tb> Tyr <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Met <SEP> Lys <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Cyc <SEP> Ala <SEP> Phe
<tb> TAC <SEP> CTG <SEP> CGG <SEP> GTC <SEP> ATG <SEP> AAG <SEP> TGT <SEP> CGC <SEP> CGC <SEP> TTT <SEP> GCG <SEP> GAA <SEP> AGC <SEP> ACC <SEP> TGT <SEP> GCT <SEP> TTC <SEP>
DAY <SEP> GCACACACTGGTGTCTCTCGCGGCACTCCCCCGTTACCCCCCTGTACT
<tb> CTGGCAACTGCCACCCCTACACTTTGTCCTAATAAAATTAATGATGCATCATATC <SEP> poly <SEP> (A) <SEP> --- <SEP> 3 '
<tb>
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Example 2:
In the present example, the isolation and purification of the entire gene sequence coding for human growth hormone is described together with the synthesis of a recombinant plasmid containing the entire structural gene for human growth hormone and the production of a microorganism which has the entire structural gene for human growth hormone as part of its genetic makeup.
The isolation of mDNA from human growth hormone is carried out essentially according to the method described in Example 1, but tissue from human pituitary tumor was used as the biological starting material. 5 malignant human pituitary tumors were quickly frozen in liquid nitrogen after surgery. These tumors had a weight of 0.4 to 1.5 g and were first thawed and then homogenized at 4 C in 4 molar guanidinium thiocyanate, which was 1 molar in mercaptoethanol and had a pH of 5.0. The homogenate was overlaid with 1.2 ml of a 5.7 molar solution of CsCl which was 100 mmolar of EDTA,
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The RNS moved to the bottom of the centrifuge tube.
The RND was further purified using an oligo-dT column and saecharose gradient sedimentation.
About 10% of the RNA coded growth hormones isolated in this way, as when incorporating a radioactive amino acid precursor in a precipitable material with anti-growth hormone activity in a cell-free translation system obtained from wheat germ [cf. Roberts, B.E., and Patterson, B.M., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 2330 (1973)].
The cDNA encoding human growth hormone is produced essentially as described in Example 1. The cDNA encoding human growth hormone is fractionated by gel electrophoresis, selecting the material for cloning that migrates to a site corresponding to a chain length of approximately 800 nucleotides. The selected fraction is treated with DNA polymerase I and then treated by end addition of Hind III linkers. The cDNA obtained is then recombined using alkaline phosphatase-treated plasmid pBR-322 using DNA ligase. E. coli X-1776 is transformed with the recombinant DNA, selecting a DNA for strain containing human growth hormone.
This strain containing human growth hormone DNA is grown in preparative amounts, whereupon the DNA encoding human growth hormone is isolated from the microorganism and its nucleotide sequence is determined. The cloned DNA for human growth hormone was found to contain nucleotides encoding the entire amino acid sequence of human growth hormone. The first 23 amino acids of human growth hormone are HN-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu- -His-Gln-Leu. The rest of the sequence is shown in Table III below.
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Table III
EMI19.1
<tb>
<tb> 24 <SEP> 34 <SEP> 40 <SEP> 43
<tb> Ala <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Gln
<tb> 5 '----- G <SEP> GCC <SEP> TTT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> CAG <SEP> CAG <SEP> TTT <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> GCC <SEP> TAT <SEP> ATC <SEP> CCA <SEP> AAG <SEP> GAA <SEP> CAG <SEP> AAG <SEP> TAT <SEP> TCA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CAG <SEP> AAC <SEP> CCC <SEP> CAG
<tb> 60
<tb> Thr <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Asg <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> ACC <SEP> TCC
<SEP> CTC <SEP> TGT <SEP> TTC <SEP> TCA <SEP> GAG <SEP> TCT <SEP> ATT <SEP> CCG <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> AGG <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> ACA <SEP> CAA <SEP> CAG <SEP> AAA <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> CTC
<tb> 80 <SEP> 100
<tb> Arg <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ser <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Tyr
<tb> CGC <SEP> ATC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> ATC <SEP> CAG <SEP> TCG <SEP> TGG <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> CCC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TTC <SEP> CTC <SEP> AGG <SEP> AGT <SEP> GTG <SEP> TTG <SEP> GCG <SEP> AAC <SEP> AAC <SEP> CTG <SEP> GTG <SEP> TAC
<tb> 120
<tb> Gly <SEP> Ala <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Val <SEP> Tyr
<SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp
<tb> GGC <SEP> GCC <SEP> TCT <SEP> GAC <SEP> AGC <SEP> AAC <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> GAC <SEP> CTC <SEP> CTA <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> GGG <SEP> ATC <SEP> CAA <SEP> ACG <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> GGG <SEP> AGG <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAC
<tb> 140
<tb> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> His <SEP> Asn <SEP> His <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> GGC <SEP> AGC <SEP> CCC <SEP> CGG <SEP> ACT <SEP> GGG <SEP> CAG <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> AAG <SEP> CAG <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AGC <SEP> AAG <SEP>
TTC <SEP> GAC <SEP> ACA <SEP> AAC <SEP> TCA <SEP> CAC <SEP> AAC <SEP> CAT <SEP> CAC <SEP> GCA <SEP> CTA <SEP> CTC
<tb> 160 <SEP> 180
<tb> Lys <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Tyr <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Asp <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Ser
<tb> AAG <SEP> AAC <SEP> TAC <SEP> GGG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TAC <SEP> TGG <SEP> TTC <SEP> AGG <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GAC <SEP> AAG <SEP> CTC <SEP> GAG <SEP> ACA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CGC <SEP> ATG <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TGC <SEP> CGC <SEP> TCT
<tb> 191
<tb> Val <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Phe
<tb> CTG <SEP> GAG <SEP> GGC <SEP> AGC <SEP> TGT <SEP> GGC <SEP> TTC <SEP> DAY <SEP> CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCC <SEP> -----
<SEP> 3 ' <SEP>
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