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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids, welches Luliberinagonisteigenschaften aufweist. Luliberin ist der international übliche Trivialname für LH-RF (luteinising hormone releasing factor) (J. Biol. Chem., [1975], 250,3215).
Es ist bekannt (Dutta, Furr, Giles und Morley, Clinical Endocrinology, [1976], 5, Ergänzung, S. 291s bis 298s), dass der Einbau von C1-Aza-aminosäuren an der 6- oder 10-Stellung von Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) aus der Hypophyse weniger wirksam sind als das Ausgangsmolekül. Es wurde nun gefunden, dass der Einbau von Azaglycin an der 10-Stellung in Verbindung mit dem Einbau von verschiedenen D-a-Aminosäuren an der 6-Stellung in Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon aktiver sind als Luliberin.
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für Leu oder MeLeu steht, in Form eines pharmazeutisch oder veterinär verwendbaren Säureadditionssalzes.
In der Formel (I) und in der gesamten Beschreibung werden die Aminosäurereste durch ihre Standardabkürzungen (Pure and Applied Chemistry, [1974], 40,317 bis 331) bezeichnet. Ein a-Aza- - aminosäurerest ist ein solcher, in welchem das a-CH einer Aminosäure durch Stickstoff ersetzt worden ist. Die Abkürzung für eine o-Aza-aminosäure leitet sich von der entsprechenden Aminosäure durch Hinzufügung der Vorsilbe"Az"ab. Somit steht Azgly für Azaglycin.
Wenn die Konfiguration einer bestimmten Aminosäure nicht angegeben ist, dann besitzt diese Aminosäure (ausser der a-Aza-aminosäure, die benachbart zur Carboxygruppe kein asymmetrisches Zentrum enthält) die natürliche L-Konfiguration.
Eine spezielle Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist :
Verbindungen, in welchen A für D-Tyr (Me), D-Ser, D-Ser (But), D-Phe, D-Ala oder D-Trp und B für Leu oder MeLeu steht.
Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist jene, in welcher A für D-Tyr (Me), D-Ser (But) oder D-Phe steht und B für Leu oder MeLeu steht.
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dung der allgemeinen Formel
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mit einer Verbindung der allgemeinen Formel
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worin ein Aktivester ist, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel
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in Gegenwart von N, N 1 -Dicyclohexylcarbodiimid umsetzt.
Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können aus bekannten Verbindungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, Standardpeptidschutzreaktionen und Standardpeptidschutzgruppenabspaltungsreaktionen hergestellt werden, wie sie Fachleuten, auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind und wie sie in den Beispielen 1 bis 8 bzw. im Schema angegeben sind.
Wie bereits oben festgestellt, besitzen die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen Luliberinagonisteigenschaften, d. h., dass sie ähnliche Wirkungen wie Luliberin aufweisen, ein vom Hypothalamus sekretiertes natürliches Hormon, das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulierungshormon (FSH) veranlasst. Diese beiden Hypophysenhormone spielen bei reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres, nämlich FSH, in den Ovarien eine Förderung der Reifung der Follikeln bewirkt und ersteres, nämlich LH, die Ovulation induziert. Die Verbindungen der Formel (I) sind in unerwarteter Weise hinsichtlich des Vermögens der Freisetzung von LH wesentlich wirksamer als Luliberin und eignen sich deshalb für die Beeinflussung und/oder Verbesserung der Vermehrung bei Tieren.
Sie eignen sich insbesondere für die Züchtung von grossen Haustieren während eines Anöstrusses und bei jeder künstlich beeinflussten Züchtung zur genauen Bestimmung der Ovulation. Sie eignen sich auch für die Heilung von Unfruchtbarkeitszuständen bei Mann und Frau.
Der Luliberinagonisteffekt der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen kann beispielsweise durch das Vermögen demonstriert werden, eine Ovulation bei mit Androgen sterilisierten Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren oder LH und FSH (gemessen durch doppelten Antikörperradioimmunotest) in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten oder in das Blutplasma von anöstrischen oder diöstrischen Mutterschaften abzugeben.
Der obige Test an mit Androgen sterilisierten Ratten wird wie folgt ausgeführt :
Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3., 4. und 5. Tag ihres Lebens mit 100 [ig Testosteronpropionat präpariert worden sind, zeigen einen beständigen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatorische Follikeln in den Ovarien. Die Verabreichung von Luliberin und aktiven Analogen verursacht die Abgabe eines ovulierenden Anstiegs an LH und FSH, der durch die Anwesenheit von Eiern in den Fallopischen Tuben und frischen Corpora lutea in den Ovarien bestimmt werden kann.
Alle hier beispielsweise genannten Verbindungen sind hinsichtlich ihres Vermögens, eine Ovulation bei Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren, aktiver als Luliberin und zeigen ausserdem keine giftigen Wirkungen, wenn sie in mindestens der 4fachen Dosis ihrer minimal aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere sind die erfindungsgemäss erhältlichen bevorzugten Verbindungen, die in den Beispielen 4,6 und 7 beschrieben sind, annähernd 100mal so aktiv wie Luliberin. Sie zeigen ausserdem keinerlei toxische Effekte, wenn sie in der 100fachen Menge ihrer minimalen effektiven Dosis verabreicht werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können in Form eines pharmazeutischen oder veterinär medizinischen Präparates verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert.
In den Beispielen bezieht sich Rf auf die aufsteigende Dünnschichtchromatographie (t. 1. c) auf Silicagelplatten (Kieselgel G). Die in dieser Chromatographie verwendeten Lösungsmittelsysteme
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Ninhydrin und Chlor-Stärke-Jodid-Reagentien behandelt. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann bedeuten die angegebenen Rp-Werte, dass ein einziger Fleck durch diese Verfahren bestimmt wurde.
Beispiele 1 bis 6 : Synthese von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-T-tyrosyl-A- - L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid.
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amin neutralisiert. Ein auf-20 C vorgekühltes Gemisch von 0, 1 mMol L-Leucyl-L-arginyl-L- prolyl- - azaglycinamid-dihydrochlorid [erhalten durch Hydrogenolyse des N-Benzyloxycarbonylderivats in 80%igen (V IV) wässerigem Methanol mit einem Gehalt an zwei Äquivalenten Chlorwasserstoff über einem 5% eigen (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator während 16 h] und aus 0, 1 mMol Triäthylamin in 1 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei 4 C gerührt. Dimethylformamid wurde im Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde chromato-
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Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen, die nach dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurden, sind als Beispiele 1 bis 6 in der folgenden Tabelle angeführt.
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Ausbeute <SEP> % <SEP> Papierelektrophorese <SEP> R <SEP> F
<tb> Nr.
<SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin) <SEP> RfA <SEP>
<tb> RfA
<tb> pH <SEP> 2,1 <SEP> pH <SEP> 6,5
<tb> 1 <SEP> D-Ala <SEP> Leu <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP>
<tb> 2 <SEP> D-Phe <SEP> Leu <SEP> 40 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 71 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP>
<tb> 3 <SEP> D-Trp <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP>
<tb> 4 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 5 <SEP> D-Ser <SEP> (But) <SEP> Leu <SEP> 31 <SEP> 0,94 <SEP> 0,96 <SEP> 0,25
<tb> 6 <SEP> D-Tyr(Me) <SEP> MeLeu <SEP> 26 <SEP> 0,87 <SEP> 0,90 <SEP> 0,34
<tb>
Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können so erhalten werden, wie es in dem folgenden Schema beschrieben ist.
In diesem Schema wurden die folgenden Abkürzungen verwendet :
Bzl = Benzyl
Z = Benzyloxycarbonyl
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Papierelektrophorese <SEP> Rf
<tb> Nr. <SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin) <SEP> Rf <SEP> A <SEP>
<tb> pH <SEP> 2,1 <SEP> pH <SEP> 6, <SEP> 5
<tb> 7D-Ser <SEP> Leu0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 8 <SEP> D-Phe <SEP> MeLeu <SEP> 0, <SEP> 84 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP>
<tb>
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The invention relates to a method for producing a new polypeptide which has luliberin agonist properties. Luliberin is the common international name for LH-RF (luteinising hormone releasing factor) (J. Biol. Chem., [1975], 250,3215).
It is known (Dutta, Furr, Giles and Morley, Clinical Endocrinology, [1976], 5, Supplement, pp. 291s to 298s) that the incorporation of C1-aza-amino acids at the 6- or 10-position of luliberin compounds results that are less effective than the parent molecule in releasing luteinizing hormone (LH) from the pituitary gland. It has now been found that incorporation of azaglycine at the 10-position in conjunction with incorporation of various D-a-amino acids at the 6-position in luliberin results in compounds which are more active than luliberin in releasing luteinizing hormone.
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represents Leu or MeLeu, in the form of a pharmaceutically or veterinarily usable acid addition salt.
In formula (I) and throughout the description, the amino acid residues are designated by their standard abbreviations (Pure and Applied Chemistry, [1974], 40.317 to 331). An a-aza - amino acid residue is one in which the a-CH of an amino acid has been replaced by nitrogen. The abbreviation for an o-aza-amino acid is derived from the corresponding amino acid by adding the prefix "Az". Azgly stands for Azaglycin.
If the configuration of a particular amino acid is not specified, then this amino acid (except for the a-aza-amino acid, which does not contain an asymmetric center adjacent to the carboxy group) has the natural L configuration.
A special group of compounds obtainable according to the invention is:
Compounds in which A is D-Tyr (Me), D-Ser, D-Ser (But), D-Phe, D-Ala or D-Trp and B is Leu or MeLeu.
A preferred group of compounds obtainable according to the invention is that in which A represents D-Tyr (Me), D-Ser (But) or D-Phe and B represents Leu or MeLeu.
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general formula
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with a compound of the general formula
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wherein is an active ester, or with a compound of the general formula
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in the presence of N, N 1 -dicyclohexylcarbodiimide.
The starting materials for the process according to the invention can be prepared from known compounds by standard peptide coupling reactions, standard peptide protection reactions and standard peptide protecting group depletion reactions as are known to those skilled in the art in this field and as are given in Examples 1 to 8 or in the scheme.
As already stated above, the compounds produced according to the invention have luliberin agonist properties, i.e. that is, they have effects similar to luliberin, a natural hormone secreted by the hypothalamus that acts on the pituitary gland, causing it to release luteinizing hormone (LH) and follicle stimulating hormone (FSH). These two pituitary hormones play a role in reproductive processes, the latter, namely FSH, promoting the maturation of the follicles in the ovaries and the former, LH, which induces ovulation. The compounds of formula (I) are unexpectedly much more effective than luliberin in terms of the ability to release LH and are therefore suitable for influencing and / or improving the reproduction in animals.
They are particularly suitable for the breeding of large pets during an oestrus and with any artificially influenced breeding for the precise determination of ovulation. They are also suitable for curing infertility conditions in men and women.
The luliberin agonist effect of the compounds prepared according to the invention can be demonstrated, for example, by the ability to induce ovulation in androgen-sterilized rats with constant estrus or LH and FSH (measured by double antibody radioimmunoassay) in the blood plasma of immature male rats or in the blood plasma of anestri or donate to diustrial motherhoods.
The above test on androgen-sterilized rats is carried out as follows:
Female rats sterilized with androgen, which had been prepared by treatment on the 3rd, 4th and 5th day of their life with 100% testosterone propionate, show a constant oestric vaginal mucus and numerous pre-ovulatory follicles in the ovaries. The administration of luliberin and active analogs causes the release of an ovulating increase in LH and FSH, which can be determined by the presence of eggs in the fallopian tubes and fresh corpora lutea in the ovaries.
All of the compounds mentioned here, for example, are more active than luliberin with regard to their ability to induce ovulation in rats with constant oestrus and, moreover, show no toxic effects if they are administered in at least 4 times the dose of their minimally active dose. In particular, the preferred compounds obtainable according to the invention, which are described in Examples 4, 6 and 7, are approximately 100 times as active as luliberin. In addition, they show no toxic effects if they are administered in 100 times their minimum effective dose.
The compounds produced according to the invention can be used in the form of a pharmaceutical or veterinary medicinal preparation.
The invention is illustrated by the following examples, to which, however, it is not restricted.
In the examples, Rf refers to the ascending thin layer chromatography (t. 1. c) on silica gel plates (silica gel G). The solvent systems used in this chromatography
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Treated ninhydrin and chlorine starch iodide reagents. Unless otherwise stated, the Rp values indicated mean that a single spot was determined by these methods.
Examples 1 to 6: Synthesis of L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-T-tyrosyl-A- - L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamide.
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neutralized amine. A mixture of 0.1 mmol of L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl- - azaglycinamide-dihydrochloride [precooled to −20 ° C. [obtained by hydrogenolysis of the N-benzyloxycarbonyl derivative in 80% (V IV) aqueous methanol containing two equivalents of hydrogen chloride over a 5% (w / w) palladium-on-charcoal catalyst during 16 h] and from 0.1 mmol of triethylamine in 1 ml of dimethylformamide were added and the reaction mixture was stirred at 4 C for 24 h. Dimethylformamide was evaporated in vacuo and the residue was chromato-
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The compounds obtainable according to the invention, which were prepared by the above process, are listed as Examples 1 to 6 in the following table.
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<tb> Example <SEP> A <SEP> B <SEP> Yield <SEP>% <SEP> Paper Electrophoresis <SEP> R <SEP> F
<tb> No.
<SEP> (relative <SEP> to <SEP> luliberin) <SEP> RfA <SEP>
<tb> RfA
<tb> pH <SEP> 2.1 <SEP> pH <SEP> 6.5
<tb> 1 <SEP> D-Ala <SEP> Leu <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP>
<tb> 2 <SEP> D-Phe <SEP> Leu <SEP> 40 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 71 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP>
<tb> 3 <SEP> D-Trp <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP>
<tb> 4 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 5 <SEP> D-Ser <SEP> (But) <SEP> Leu <SEP> 31 <SEP> 0.94 <SEP> 0.96 <SEP> 0.25
<tb> 6 <SEP> D-Tyr (Me) <SEP> MeLeu <SEP> 26 <SEP> 0.87 <SEP> 0.90 <SEP> 0.34
<tb>
The starting materials for the process according to the invention can be obtained as described in the following scheme.
The following abbreviations have been used in this scheme:
Bzl = benzyl
Z = benzyloxycarbonyl
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<tb> Example <SEP> A <SEP> B <SEP> paper electrophoresis <SEP> Rf
<tb> No. <SEP> (relative <SEP> to <SEP> luliberin) <SEP> Rf <SEP> A <SEP>
<tb> pH <SEP> 2.1 <SEP> pH <SEP> 6, <SEP> 5
<tb> 7D-Ser <SEP> Leu0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 8 <SEP> D-Phe <SEP> MeLeu <SEP> 0, <SEP> 84 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP>
<tb>