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Somatostatin, das auch als die Somatotropinfreisetzung inhibierender Faktor bekannt ist, ist ein Tetradecapeptid der Formel
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ist die einer Inhibierung der Sekretion von Wachstumshormon (GH), das auch als Somatotropin bekannt ist, vergleiche P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier, und R.
Guillemin, Science, Bd. 179, S. 77 (1973).
Ausserdem finden sich in US-PS Nr. 3, 904, 594 natürliches Somatostatin und eine allgemeine Klasse von andern Verbindungen mit der Dodecapeptidsequenz der Positionen 3 bis 14 des natürlichen Hormons.
Ausserdem ist über die der Einfachheit halber als D-Ala 1 -Somatostatin bezeichnete Verbindung von Ferland et al. in Molecular and Cellular Endocrinology, Bd. 4, S. 79-88 (1976) berichtet wor-
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bei der in-vivo-Inhibierung der Magensäuresekretion nur halb so wirksam wie natürliches Somatostatin. Die Verbindung D-VaI1 -Somatostatin (Formel (I)) unterscheidet sich von D-Alal-Somatostatin durch den Ersatz von zwei Wasserstoffen durch Methylgruppen.
Wenn man hinsichtlich der pharmakologischen Wirksamkeit von D-Val l-Somatostatin überhaupt eine Erwartung anstellen könnte, dann würde man annehmen, dass seine Wirksamkeit der von D-Ala 1 -Somatostatin ähnlich ist ; es würde somit als in-vivo-Inhibitor der Magensäuresekretion weniger wirksam sein als das natürliche Hormon. Überraschenderweise zeigt D-Val l-Somatostatin jedoch eine Wirksamkeit, die etwas grösser ist als die des natürlichen Hormons. Dieser Befund zeigt die Unvorhersehbarkeit des Verhaltens von D-Vall-Somatostatin im Vergleich mit strukturell nahestehenden bekannten Verbindungen.
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines neuen, geradkettigen, als Zwischenprodukt verwendbaren Tetradecapeptids der Formel
H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe- L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH. (III)
Bei diesem Verfahren geht man von einem Tetradecapeptid der allgemeinen Formel
R-D-Val-Gly-L-Cys (Rt)-L-Lys (R )-L-Asn-L-
Phe-L-Phe-L-Trp (Rs)-L-Lys (R )-L-Thr (R )- (II)
L-Phe-L-Thr (R,)-L-Ser (R,)-L-Cys (Rt)-X aus, worin bedeuten :
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R2 Wasserstoff oder eine E-Aminoschutzgruppe, R und R4 Wasserstoff oder Hydroxylschutzgruppen, Rs Wasserstoff oder eine Formylgruppe und
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(.)/'wobei, wenn X eine Hydroxylgruppe ist, Reine a -Aminoschutzgruppe ist.
Ein bevorzugtes Tetradecapeptid der allgemeinen Formel (II) ist folgendes :
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der allgemeinen Formel (II) mit einer Säure, insbesondere mit einer starken Säure, umsetzt.
Die vorstehenden, die Ausgangsprodukte definierenden Formeln enthalten Schutzgruppen für Amino-, Hydroxy-und Thio- (sulfhydryl)-funktionen. Die Merkmale der hier definierten Schutzgruppen sind doppelte : zum einen verhindert die Schutzgruppe, dass eine reaktionsfähige Gruppe, die in einem bestimmten Molekül vorliegt, eine Umsetzung eingeht, während das Molekül Bedingungen unterworfen wird, die zu einer Veränderung oder Zerstörung der andernfalls aktiven Gruppe führen könnten. Zum andern ist die Schutzgruppe so beschaffen, dass sie sich ohne weiteres unter Wiederherstellung der ursprünglich aktiven Gruppe unter Bedingungen entfernen lässt, die andere Teile des Moleküls nicht in Mitleidenschaft ziehen.
Für diese Zwecke, d. h. für den Schutz von Amino-, Hydroxy- und Thiogruppen, brauchbare Gruppen sind allgemein bekannt und jedem Fachmann geläufig. Der ausführlichen Beschreibung von Verfahren, wie solche Gruppen zu verwenden sind, sind voluminöse Werke gewidmet worden. Eines davon ist Protective Groups in Organic Chemistry, J. F. W. McOmie, Herausgeber, Plenum Press, New York, 1973.
In den obigen, die Ausgangsprodukte definierenden Formeln bedeutet R ein a-Aminowasserstoffatom oer eine a-Aminoschutzgruppe. Die für R in Betracht kommenden a-Aminoschutzgruppen sind dem Peptidchemiker geläufig. Viele davon sind in Kapitel 2 der oben angegebenen Literaturstelle im einzelnen angegeben. Beispiele für solche Schutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl, p-Chlor-
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hexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Triphenylmethyl (Trityl) und p-Toluolsulfonyl. Die durch R definierte a-Aminoschutzgruppe ist vorzugsweise t-Butyloxycarbonyl.
R 1 bedeutet das Wasserstoffatom der Sulfhydrylgruppe des Cysteins oder eine Schutzgruppe für diese Sulfhydrylgruppe. Viele solcher Schutzgruppen sind in der oben angegebenen Literaturstelle in Kapitel 7 beschrieben. Beispiele für solche Schutzgruppen sind p-Methoxybenzyl, Benzyl, p-Toluyl, Benzhydryl, Acetamidomethyl, Trityl, p-Nitrobenzyl, t-Butyl, Isobutyloxymethyl sowie die verschiedenen Tritylderivate. Bezüglich weiterer Gruppen vergleiche beispielsweise Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, "Synthese von Peptiden", Bd. 15/1 und 15/2, (1974), Stuttgart.
Die durch R, definierte Sulfhydrylschutzgruppe ist vorzugsweise die p-Methoxybenzylgruppe.
R2 bedeutet entweder ein Wasserstoffatom an der c-Aminoschutzgruppe des Lysinrestes oder eine c-Aminoschutzgruppe. Beispielhaft für solche Gruppen sind die oben in Verbindung mit der a-Aminoschutzgruppe genannten. Hiezu gehören vor allem die folgenden Gruppen : Benzyloxycarbonyl,
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oxycarbonyl, Isorpopyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl und p-Toluolsulfonyl.
Wie aus den folgenden Ausführungen ersichtlich, umfasst das Verfahren zur Herstellung des als Ausgangsmaterial eingesetzten Tetradecapeptids der Formel (II) die Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe der jeweiligen terminalen Aminosäure der Peptidkette. Die einzige Bedingung, die die e-Aminoschutzgruppe an dem Lysinrest erfüllen muss, ist daher die, dass sie unter den Bedingungen, die zur selektiven Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe angewendet werden,. nicht abgespalten wird. Die geeignete Wahl der a-Amino-und c-Amino-Schutzgruppen ist auf dem Gebiet der Peptidchemie allgemein bekannt und hängt von der relativen Leichtigkeit ab, mit der eine bestimmte Schutzgruppe abgespalten werden kann.
So sind Gruppen wie 2- (p-Biphenylyl) -isopropyloxycarbonyl (BpOC) und Trityl sehr labil und können schon in Gegenwart einer schwachen Säure abgespalten
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werden. Für die Abspaltung anderer Gruppen, z. B. von t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl, sind mässig starke Säuren, wie Salzsäure, Trifluoressigsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure erforderlich. Noch stärker saure Bedingungen müssen angewendet werden, um die Abspaltung anderer Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl und Isopropyloxycarbonyl, zu bewirken. Die Abspaltung dieser letztgenannten Gruppen erfordert drastisch saure Bedingungen, z.
B. die Verwendung von Bromwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure oder Bortrifluoracetat in Trifluoressigsäure. Unter den stärker sauren Bedingungen werden selbstverständlich alle labileren Gruppen gleichfalls abgespalten. Zu der geeigneten Auswahl von Aminoschutzgruppen gehört somit die Verwendung einer Gruppe für die a-Aminofunktion, die labiler ist als die Gruppe,
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führen.R : vorzugsweise die o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder Cyclopentyloxycarbonylgruppe, und in Verbindung damit ist die a-Aminoschutzgruppe der Wahl jede an die Peptidkette angereihten Aminosäure, vorzugsweise die t-Butyloxycarbonylgruppe.
R3 und R 4 bedeuten den Wasserstoff der Hydroxylgruppe oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin. Viele derartige Schutzgruppen sind in Kapitel 3 der oben genannten Literaturstelle beschrieben. Einzelne Beispiele für solche Schutzgruppen sind Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie die Methyl-, Äthyl- und t-Butylgruppe, die Benzylgruppe, substituierte Benzylgruppen, wie p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl und o-Chlorbenzyl, Alkanolylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie die Formyl-, Acetyl- und Propionylgruppe sowie die Triphenylmethyl (trityl) -gruppe. Wenn R : und R Schutzgruppen darstellen, dann sind sie vorzugsweise Benzylgruppen.
R 5 bedeutet Wasserstoff oder die Formylgruppe und befindet sich in der > NRs -Gruppe des Tryptophanrestes. Die Formylgruppe dient als Schutzgruppe. Die Verwendung einer solchen Schutzgruppe ist nicht unbedingt erforderlich, weshalb R 5 Wasserstoff (N-ungeschützt) oder die Formylgruppe (N-geschützt) sein kann.
Die Gruppe X steht am Carboxylende der Tetradecapeptidkette. Sie kann eine Hydroxylgruppe sein, womit sich dann eine freie Carboxylgruppe ergibt. Ausserdem kann X der feste Harzträger sein, an den die terminale Carboxylgruppe des Peptids während seiner Synthese gebunden ist.
Dieses feste Harz ist durch die Formel
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wiedergegeben.
Es werden die folgenden Abkürzungen, von denen die meisten allgemein bekannt sind und üblicherweise benutzt werden, verwendet :
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<tb>
<tb> Ala-Alanin <SEP> Val-Valin <SEP>
<tb> Asn-Asparagin <SEP> DCC-N, <SEP> N'-Dicyclohexylcarbodiimid <SEP>
<tb> Cys-Cystein <SEP> DMF-N, <SEP> N-Dimethylformamid <SEP>
<tb> Gly-Glycin <SEP> BOC <SEP> -t-Butyloxycarbonyl <SEP>
<tb> Lys-Lysin <SEP> PMB-p-Methoxybenzyl <SEP>
<tb> Phe-Phenylalanin <SEP> CBzOC-o-Chlorbenzyloxycarbonyl <SEP>
<tb> Ser <SEP> - <SEP> Serin <SEP> CPOC <SEP> - <SEP> Cyclopentyloxycarbonyl <SEP>
<tb> Thr <SEP> - <SEP> Threonin <SEP> Bzl <SEP> - <SEP> Benzyl <SEP>
<tb> Tpr <SEP> - <SEP> Tryptophan <SEP> For <SEP> - <SEP> Formyl <SEP>
<tb> BpOC-2- <SEP> (p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl <SEP>
<tb>
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Wie bereits erwähnt,
liegt die Auswahl der bei der Herstellung der Ausgangsverbindung der
Formel (II) zu verwendenden Schutzgruppen im Rahmen des allgemeinen Fachwissens auf dem Gebiet der Peptidsynthesen, doch ist zu beachten, dass die auszuführende Reihenfolge von Reaktionen eine
Wahl bestimmter Schutzgruppen bedingt. In andern Worten, die Schutzgruppe der Wahl muss eine
Gruppe sein, die gegenüber den angewendeten Reagenzien und unter den angewendeten Bedingungen bei den nachfolgenden Stufen der Reaktionsfolge stabil ist. So muss, wie bereits oben erwähnt, die im einzelnen verwendete Schutzgruppe eine Gruppe sein, die unter den Bedingungen intakt bleibt, die zur Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe des terminalen Aminosäurerestes des Peptid- fragments zur Vorbereitung der Anknüpfung des nächstfolgenden Aminosäurefragments an die Peptid- kette angewendet werden.
Ausserdem kommt es darauf an, als Schutzgruppe eine Gruppe zu wählen, die während des Aufbaus der Peptidkette intakt bleibt und die sich nach Beendigung der Synthese des gewünschten Tetradecapeptids leicht entfernen lässt. Mit all diesen Bedingungen ist der durch- schnittliche Peptidchemiker wohlvertraut.
Wie sich aus der vorstehenden Diskussion ergibt, kann das Tetradecapeptid der Formel (II) durch Festphasensynthese hergestellt werden. Bei dieser Synthese wird die Peptidkette vom C-termi- nalen Ende des Peptids angefangen, stufenweise aufgebaut. So wird zunächst Cystein mit seiner
Carboxylfunktion in der Weise an das Harz gebunden, dass ein amino-geschütztes, S-geschütztes
Cystein mit einem chlormethylierten Harz oder einem hydroxymethylierten Harz umgesetzt wird. Die
Herstellung eines Hydroxymethylharzes ist von Bodanszky et al., in Chem. Ind. (London), Bd. 38,
S. 1597-1598 (1966) beschrieben. Das chlormethylierte Harz ist im Handel erhältlich (Lab Systems,
Inc., San Mateo, California, V. St. A.).
Bei der Durchführung der Bindung des C-terminalen Cysteins an das Harz wird das geschützte
Cystein zuerst in sein Cäsiumsalz übergeführt. Dieses Salz wird dann nach dem von B. F. Gisin in Helv. Chim. Acta, Bd. 56, S. 1476 (1973) beschriebenen Verfahren mit dem Harz umgesetzt.
Statt dessen kann das Cystein aber auch durch Aktivierung seiner Carboxylfunktion nach an sich bekannten Methoden mit dem Harz verknüpft werden. Beispielsweise kann die Umsetzung des Cysteins mit dem Harz in Gegenwart einer Carboxylgruppen aktivierenden Verbindung, wie N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), durchgeführt werden.
Nach der Verknüpfung des Cysteins mit seiner freien Carboxylgruppe mit dem Harzträger besteht der übrige Teil der Peptidaufbaufolge in der stufenweisen Anreihung der einzelnen Aminosäuren an den N-terminalen Teil der Peptidkette. Die jeweilige Stufe umfasst daher notwendigerweise eine Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe der Aminosäure, die den N-terminalen Teil des Peptidfragments darstellt, und anschliessend die Anknüpfung des nächstfolgenden Aminosäurerestes an die nunmehr freie und reaktionsfähige N-terminale Aminosäure. Die Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe kann in Gegenwart einer Säure, z. B. Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure und Essigsäure unter Bildung des entsprechenden Säureadditionssalzes als Produkt erfolgen.
Bei einer andern Methode zur Abspaltung der Aminoschutzgruppe wird Bortrifluorid verwendet. Beispielsweise wird durch Bortrifluoriddiäthylätherat in Eisessig das Peptidfragment mit geschützter Aminogruppe in einen Bu ;,-Komplex übergeführt, der dann durch Behandlung mit einer Base, wie wässerigem Kaliumbicarbonat, in das entblockierte Peptidfragment übergeführt werden kann. Jede dieser Methoden kann angewendet werden, solange darauf geachtet wird, dass die im Einzelfall gewählte zu einer Abspaltung der N-terminalen a-Aminoschutzgruppe führt, ohne andere an der Peptidkette vorhandene Schutzgruppen in Mitleidenschaft zu ziehen. In dieser Hinsicht ist es bevorzugt, die Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe unter Verwendung von Trifluoressigsäure durchzuführen.
Im allgemeinen wird die Spaltung bei einer Temperatur von etwa 0 C bis Zimmertemperatur durchgeführt.
Nach der N-terminalen Spaltung liegt das gebildete Produkt normalerweise in Form des Säureadditionssalzes der Säure vor, die für die Abspaltung der Schutzgruppe verwendet worden ist.
Dieses Produkt kann dann durch Behandlung mit einer schwachen Base, z. B. einem tertiären Amin, wie Pyridin oder Triäthylamin, in die freie terminale Aminoverbindung übergeführt werden.
Die Peptidkette liegt nun in einem für die Umsetzung mit der nächstfolgenden Aminosäure bereiten Zustand vor. Diese Umsetzung kann nach einer von mehreren allgemein bekannten Arbeitsweisen durchgeführt werden. Für die Anreihung der nächstfolgenden Aminosäure an die N-terminale
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Peptidkette wird eine Aminosäure verwendet, die eine freie Carboxylgruppe aufweist, aber an der a-Aminofunktion sowie an jeder andern reaktionsfähigen Gruppe geschützt ist. Die Aminosäure wird dann Bedingungen unterworfen, die die Carboxylfunktion für die Verknüpfungsreaktion aktiv machen. Eine bei dieser Synthese anwendbare Aktivierungsmethode ist die Überführung der Aminosäure in ein gemischtes Anhydrid.
Dabei wird die freie Carboxylfunktion der Aminosäure durch Umsetzung mit einer andern Säure, beispielsweise einer Carbonsäure in Form ihres Säurechlorids, aktiviert. Beispiele für zur Ausbildung des gemischten Anhydrids verwendbare Säurechloride sind Chlorameisensäureäthyl-,-phenyl-,-sek. butyl- und isobutylester und Pivaloylchlorid.
Eine andere Methode zur Aktivierung der Carboxylfunktion der Aminosäure für die Verknüpfung besteht in der Überführung der Aminosäure in ein aktives Esterderivat. Beispiele für derartige aktive Ester sind : 2,4, 5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, p-Nitrophenylester, Ester mit 1-Hydroxybenztriazol und Ester mit N-Hydroxysuccinimid. Eine weitere Methode zur Verknüpfung der C-terminalen Aminosäure mit dem Peptidfragment besteht in der Durchführung der Verknüpfungsreaktion in Gegenwart wenigstens einer äquimolaren Menge- N'-Dicyclohexylcarbodi- imid (DCC).
Die letztgenannte Methode ist für die Herstellung des Tetradecapeptids der Formel (II), worin X die Gruppe
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sation durch drei Behandlungen von je 3 min mit 10 ml/g Harz 3%igem Triäthylamin in Methylenchlorid, (26) drei Wäschen von je 3 min mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), (27) drei Wäschen von je 3 min mit einer Mischung aus 90% t-Butylalkohol und 10% t-Amylalkohol (10 ml/g Harz) und (28) drei Wäschen von je 3 min mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz).
Mit Ausnahme des Glycin-und Asparaginrests wird jede Aminosäure durch die vorstehend beschriebenen Folgen von Massnahmen eingeführt. Zur Anfügung des Glycinrestes werden nur die Stufen 1 bis 18 angewendet. Der Asparaginrest wird über seinen aktiven p-Nitrophenylester eingeführt. Dabei wird die Stufe 11 folgendermassen modifiziert : (a) drei Wäschen von je 3 min mit DMF (10 ml/g Harz), (b) Zugabe von 1, 0 mMol g Harz des p-Nitrophenylesters von N-t-Butyloxycarbonyl- - L-asparagin in 10 ml/g Harz einer 1 : 3-Mischung von DMF mit Methylenchlorid und anschliessendes Mischen während 720 min und (c) drei Wäschen von je 3 min mit DMF (10 ml/g Harz).
Die Stufe (20) wird in der Weise abgeändert, dass der p-Nitrophenylester von N-t-Butyloxycarbonyl-L-aspa- ragin in einer 3 : 1-Mischung von DMF mit Methylenchlorid verwendet und anschliessend 720 min gemischt wird.
Das fertige Peptid-Harz-Produkt wird im Vakuum getrocknet. Ein Teil des Produkts wird durch Erwärmen mit einer Mischung aus Salzsäure und Dioxan zum Sieden unter Rückfluss während 72 h hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse des Produkts unter Verwendung von Lysin als Standard
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:2, 00, Trp 0, 75.
Tryptophan wird durch 21stündige Hydrolyse in Gegenwart von Dimethylsulfoxyd und Thioglykolsäure ermittelt. Cystein wird nicht bestimmt, da es durch die Analysenmethode zerstört wird.
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Zu einer Mischung aus 5 ml Anisol und 5 ml Äthylmercaptan werden 2, 828 g (bei einem Substitutionswert von 0, 150 mMol/g) des nach Vorschrift 2 erhaltenen geschützten Tetradecapeptidharzes gegeben. Die Mischung wird in flüssigem Stickstoff gekühlt, und 56 ml flüssiger Fluorwasserstoff werden eindestilliert. Die so erhaltene Mischung wird sich auf 0 C erwärmen gelassen und 2 h gerührt. Dann wird der Fluorwasserstoff abdestilliert und Äther zu der hinterbleibenden Mischung gegeben. Die Mischung wird auf 0 C abgekühlt, und der gebildete Feststoff wird abfiltriert und mit Äther gewaschen.
Das Produkt wird getrocknet, und das von Schutzgruppen befreite Tetradecapeptid wird unter Verwendung von 1 m Essigsäure und einer kleinen Menge Eisessig von dem Harz extrahiert. Die Essigsäurelösung wird dann sofort im Dunkeln gefriergetrocknet. Die so erhaltene weisse Substanz wird in einer Mischung aus 10 ml entgaster 0, 2 m Essigsäure und 4 ml Eisessig suspendiert. Die Suspension wird erwärmt, wobei der Feststoff jedoch nicht vollständig in Lösung geht. Der unlösliche Anteil wird abfiltriert, und das etwas getrübte farblose Filtrat wird auf eine Säule aus Sephadex G-25 F (ein vernetztes Dextran mit einem Glukoseskelett, Porengrö- sse 25, feine Sorte, das von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Schweden, erhältlich ist), aufgebracht.
Bedingungen der Chromatographie : Lösungsmittel, entgaste 0, 2 m Essigsäure, Säulengrösse 7, 5 x 150 cm, Temperatur 26 C, Strömungsgeschwindigkeit 629 ml/h, Fraktionsvolumen 22, 0 ml.
Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 mp gegen die Nummern der Fraktion wird ein grosser Spitzenwertbereich mit einer anschliessenden Schulter erhalten. Die UV-Spektroskopie zeigt, dass der Spitzenwertbereich dem Produkt entspricht. Die Fraktionen, die vereinigt werden, und ihre Austrittsvolumina sind die folgenden :
Fraktionen 224 bis 240 (4906 bis 5280 ml, Spitze = 5054 ml). Diese Vereinigung von Frak- : ionen umfasst nicht die anschliessende Schulter. Die UV-Spektroskopie zeigt, dass 175 mg des Produkts vorliegen (Ausbeute = 24, 8%). Eine Ellman-Titration einer Probe ergibt einen Gehalt an freiem Sulfhydryl von 93, 6% der Theorie.
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Somatostatin, also known as the somatotropin release inhibiting factor, is a tetradecapeptide of the formula
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is an inhibition of growth hormone (GH) secretion, also known as somatotropin, see P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier, and R.
Guillemin, Science, Vol. 179, p. 77 (1973).
In addition, U.S. Patent No. 3,904,594 contains natural somatostatin and a general class of other compounds with the dodecapeptide sequence of positions 3 through 14 of the natural hormone.
In addition, the compound of Ferland et al., Designated D-Ala 1 somatostatin for the sake of simplicity. Molecular and Cellular Endocrinology, Vol. 4, pp. 79-88 (1976).
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only half as effective as natural somatostatin in inhibiting gastric acid secretion in vivo. The compound D-VaI1-somatostatin (formula (I)) differs from D-Alal-somatostatin in that two hydrogens are replaced by methyl groups.
If one could expect anything at all from the pharmacological efficacy of D-Val l-somatostatin, one would assume that its efficacy is similar to that of D-Ala 1-somatostatin; it would thus be less effective than the natural hormone as an in vivo inhibitor of gastric acid secretion. Surprisingly, however, D-Val l-somatostatin shows an activity that is somewhat greater than that of the natural hormone. This finding shows the unpredictability of the behavior of D-Vall somatostatin in comparison with structurally related known compounds.
The invention relates to the production of a new, straight-chain tetradecapeptide of the formula which can be used as an intermediate
HD-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe- L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser- L-Cys-OH. (III)
This process is based on a tetradecapeptide of the general formula
R-D-Val-Gly-L-Cys (Rt) -L-Lys (R) -L-Asn-L-
Phe-L-Phe-L-Trp (Rs) -L-Lys (R) -L-Thr (R) - (II)
L-Phe-L-Thr (R,) - L-Ser (R,) - L-Cys (Rt) -X from, in which mean:
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R2 is hydrogen or an E-amino protecting group, R and R4 are hydrogen or hydroxyl protecting groups, Rs is hydrogen or a formyl group and
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(.) / 'where, when X is a hydroxyl group, is pure a -amino protecting group.
A preferred tetradecapeptide of the general formula (II) is as follows:
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of the general formula (II) with an acid, in particular with a strong acid.
The above formulas defining the starting products contain protective groups for amino, hydroxyl and thio (sulfhydryl) functions. The characteristics of the protective groups defined here are twofold: on the one hand, the protective group prevents a reactive group which is present in a particular molecule from undergoing conversion, while the molecule is subjected to conditions which could lead to a change or destruction of the otherwise active group . On the other hand, the protective group is designed in such a way that it can easily be removed by restoring the originally active group under conditions which do not affect other parts of the molecule.
For these purposes, i.e. H. Groups useful for protecting amino, hydroxy and thio groups are generally known and familiar to any person skilled in the art. Voluminous works have been devoted to the detailed description of methods of how such groups are to be used. One of them is Protective Groups in Organic Chemistry, J.F. W. McOmie, Editor, Plenum Press, New York, 1973.
In the above formulas defining the starting products, R represents an a-amino hydrogen atom or an a-amino protecting group. The a-amino protecting groups that are suitable for R are familiar to the peptide chemist. Many of these are detailed in Chapter 2 of the above reference. Examples of such protective groups are benzyloxycarbonyl, p-chloro
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hexyloxycarbonyl, cycloheptyloxycarbonyl, triphenylmethyl (trityl) and p-toluenesulfonyl. The a-amino protecting group defined by R is preferably t-butyloxycarbonyl.
R 1 represents the hydrogen atom of the sulfhydryl group of cysteine or a protective group for this sulfhydryl group. Many of such protective groups are described in Chapter 7 of the literature cited above. Examples of such protective groups are p-methoxybenzyl, benzyl, p-toluyl, benzhydryl, acetamidomethyl, trityl, p-nitrobenzyl, t-butyl, isobutyloxymethyl and the various trityl derivatives. For further groups, see, for example, Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, "Synthesis of Peptides", Vol. 15/1 and 15/2, (1974), Stuttgart.
The sulfhydryl protecting group defined by R 1 is preferably the p-methoxybenzyl group.
R2 means either a hydrogen atom on the c-amino protecting group of the lysine residue or a c-amino protecting group. Examples of such groups are those mentioned above in connection with the a-amino protecting group. Above all, the following groups belong to this group: benzyloxycarbonyl,
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oxycarbonyl, isorpopyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, cycloheptyloxycarbonyl and p-toluenesulfonyl.
As can be seen from the following explanations, the process for the preparation of the tetradecapeptide of the formula (II) used as the starting material comprises the cleavage of the a-amino protective group of the respective terminal amino acid of the peptide chain. The only condition that the e-amino protecting group must meet on the lysine residue is therefore that they are under the conditions used for the selective cleavage of the a-amino protecting group. is not split off. The appropriate choice of a-amino and c-amino protecting groups is well known in the field of peptide chemistry and depends on the relative ease with which a particular protecting group can be removed.
Groups such as 2- (p-biphenylyl) isopropyloxycarbonyl (BpOC) and trityl are very unstable and can be split off in the presence of a weak acid
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will. For the splitting off of other groups, e.g. B. of t-butyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl, moderately strong acids such as hydrochloric acid, trifluoroacetic acid or boron trifluoride in acetic acid are required. Even more acidic conditions must be used to effect cleavage of other protecting groups such as benzyloxycarbonyl, halobenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, cycloalkyloxycarbonyl and isopropyloxycarbonyl. The elimination of these latter groups requires drastically acidic conditions, e.g.
B. the use of hydrobromic acid, hydrofluoric acid or boron trifluoroacetate in trifluoroacetic acid. Of course, all the more labile groups are also split off under the more acidic conditions. The appropriate selection of amino protective groups therefore includes the use of a group for the a-amino function which is more labile than the group
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R: preferably the o-chlorobenzyloxycarbonyl or cyclopentyloxycarbonyl group, and in connection with this the a-amino protecting group of choice is any amino acid attached to the peptide chain, preferably the t-butyloxycarbonyl group.
R3 and R4 represent the hydrogen of the hydroxyl group or a protective group for the alcoholic hydroxyl group of threonine and serine. Many such protecting groups are described in Chapter 3 of the above-mentioned literature. Individual examples of such protective groups are alkyl radicals with 1 to 4 carbon atoms, such as the methyl, ethyl and t-butyl group, the benzyl group, substituted benzyl groups, such as p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl, p-chlorobenzyl and o-chlorobenzyl, with alkanolyl groups 1 to 3 carbon atoms, such as the formyl, acetyl and propionyl group and the triphenylmethyl (trityl) group. When R: and R are protecting groups, they are preferably benzyl groups.
R 5 denotes hydrogen or the formyl group and is located in the> NRs group of the tryptophan residue. The formyl group serves as a protective group. The use of such a protective group is not absolutely necessary, which is why R 5 can be hydrogen (N-unprotected) or the formyl group (N-protected).
Group X is at the carboxyl end of the tetradecapeptide chain. It can be a hydroxyl group, which then results in a free carboxyl group. In addition, X can be the solid resin support to which the terminal carboxyl group of the peptide is attached during its synthesis.
This solid resin is through the formula
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reproduced.
The following abbreviations, most of which are well known and commonly used, are used:
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<tb>
<tb> Ala-Alanine <SEP> Val-Valin <SEP>
<tb> Asn-asparagine <SEP> DCC-N, <SEP> N'-dicyclohexylcarbodiimide <SEP>
<tb> Cys-cysteine <SEP> DMF-N, <SEP> N-dimethylformamide <SEP>
<tb> Gly-Glycine <SEP> BOC <SEP> -t-Butyloxycarbonyl <SEP>
<tb> Lys-lysine <SEP> PMB-p-methoxybenzyl <SEP>
<tb> Phe-phenylalanine <SEP> CBzOC-o-chlorobenzyloxycarbonyl <SEP>
<tb> Ser <SEP> - <SEP> Serine <SEP> CPOC <SEP> - <SEP> Cyclopentyloxycarbonyl <SEP>
<tb> Thr <SEP> - <SEP> threonine <SEP> Bzl <SEP> - <SEP> benzyl <SEP>
<tb> Tpr <SEP> - <SEP> Tryptophan <SEP> For <SEP> - <SEP> Formyl <SEP>
<tb> BpOC-2- <SEP> (p-biphenylyl) isopropyloxycarbonyl <SEP>
<tb>
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As already mentioned,
lies the selection of the in the preparation of the starting compound
Protecting groups to be used in formula (II) within the general knowledge in the field of peptide synthesis, but it should be noted that the sequence of reactions to be carried out is one
Conditional on the choice of certain protective groups. In other words, the protecting group of choice must be one
Group that is stable to the reagents used and under the conditions used in the subsequent stages of the reaction sequence. Thus, as already mentioned above, the protective group used in detail must be a group which remains intact under the conditions which are necessary for the cleavage of the a-amino protective group of the terminal amino acid residue of the peptide fragment in preparation for the attachment of the next amino acid fragment to the peptide chain be applied.
It is also important to choose a protecting group which remains intact during the construction of the peptide chain and which can be easily removed after the synthesis of the desired tetradecapeptide has ended. The average peptide chemist is familiar with all of these conditions.
As is evident from the discussion above, the tetradecapeptide of formula (II) can be prepared by solid phase synthesis. In this synthesis, the peptide chain is started from the C-terminal end of the peptide and built up step by step. This is how cysteine with its
Carboxyl function bound to the resin in such a way that an amino-protected, S-protected
Cysteine is reacted with a chloromethylated resin or a hydroxymethylated resin. The
Preparation of a hydroxymethyl resin is described by Bodanszky et al., In Chem. Ind. (London), vol. 38,
Pp. 1597-1598 (1966). The chloromethylated resin is commercially available (Lab Systems,
Inc., San Mateo, California, V. St. A.).
When performing the binding of the C-terminal cysteine to the resin, the protected
Cysteine was first converted to its cesium salt. This salt is then processed according to the method described by B. F. Gisin in Helv. Chim. Acta, Vol. 56, p. 1476 (1973) implemented with the resin.
Instead, the cysteine can also be linked to the resin by activating its carboxyl function using methods known per se. For example, the reaction of the cysteine with the resin can be carried out in the presence of a carboxyl group activating compound such as N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC).
After the cysteine has been linked with its free carboxyl group to the resin support, the remaining part of the peptide construction sequence consists in the stepwise arrangement of the individual amino acids at the N-terminal part of the peptide chain. The respective stage therefore necessarily includes cleavage of the a-amino protecting group of the amino acid, which is the N-terminal part of the peptide fragment, and then linking the next amino acid residue to the now free and reactive N-terminal amino acid. The a-amino protecting group can be split off in the presence of an acid, e.g. B. hydrobromic acid, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, p-toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid and acetic acid to form the corresponding acid addition salt as a product.
Another method of cleaving the amino protecting group uses boron trifluoride. For example, boron trifluoride diethyl etherate in glacial acetic acid converts the peptide fragment with protected amino group into a Bu, complex, which can then be converted into the unblocked peptide fragment by treatment with a base, such as aqueous potassium bicarbonate. Each of these methods can be used as long as care is taken to ensure that the one selected in the individual case leads to a cleavage of the N-terminal a-amino protective group without affecting other protective groups present on the peptide chain. In this regard, it is preferred to cleave the N-terminal protecting group using trifluoroacetic acid.
In general, the cleavage is carried out at a temperature of about 0 C to room temperature.
After the N-terminal cleavage, the product formed is usually in the form of the acid addition salt of the acid used to deprotect.
This product can then be treated with a weak base, e.g. B. a tertiary amine, such as pyridine or triethylamine, are converted into the free terminal amino compound.
The peptide chain is now in a state ready for reaction with the next amino acid. This implementation can be carried out according to one of several generally known working methods. For connecting the next amino acid to the N-terminal
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Peptide chain uses an amino acid that has a free carboxyl group, but is protected on the a-amino function as well as on any other reactive group. The amino acid is then subjected to conditions that make the carboxyl function active for the linking reaction. One activation method that can be used in this synthesis is the conversion of the amino acid into a mixed anhydride.
The free carboxyl function of the amino acid is activated by reaction with another acid, for example a carboxylic acid in the form of its acid chloride. Examples of acid chlorides which can be used to form the mixed anhydride are chloroformic acid ethyl, phenyl, sec. butyl and isobutyl esters and pivaloyl chloride.
Another method of activating the carboxyl function of the amino acid for the linkage is to convert the amino acid into an active ester derivative. Examples of such active esters are: 2,4,5-trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, p-nitrophenyl ester, ester with 1-hydroxybenzotriazole and ester with N-hydroxysuccinimide. Another method of linking the C-terminal amino acid to the peptide fragment is to carry out the linking reaction in the presence of at least one equimolar amount of N'-dicyclohexylcarbodimide (DCC).
The latter method is for the preparation of the tetradecapeptide of formula (II), wherein X is the group
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sation by three treatments of 3 minutes each with 10 ml / g resin of 3% triethylamine in methylene chloride, (26) three washes of 3 minutes each with methylene chloride (10 ml / g resin), (27) three washes of 3 minutes each a mixture of 90% t-butyl alcohol and 10% t-amyl alcohol (10 ml / g resin) and (28) three washes of 3 minutes each with methylene chloride (10 ml / g resin).
With the exception of the glycine and asparagine residue, each amino acid is introduced by the above-described series of measures. Only stages 1 to 18 are used to add the glycine residue. The asparagine residue is introduced via its active p-nitrophenyl ester. Step 11 is modified as follows: (a) three washes of 3 min each with DMF (10 ml / g resin), (b) addition of 1.0 mmol of resin of the p-nitrophenyl ester of Nt-butyloxycarbonyl- - L- asparagin in 10 ml / g resin of a 1: 3 mixture of DMF with methylene chloride and subsequent mixing for 720 min and (c) three washes of 3 min each with DMF (10 ml / g resin).
Stage (20) is changed in such a way that the p-nitrophenyl ester of N-t-butyloxycarbonyl-L-asparagine is used in a 3: 1 mixture of DMF with methylene chloride and then mixed for 720 min.
The finished peptide-resin product is dried in vacuo. Part of the product is hydrolyzed by heating with a mixture of hydrochloric acid and dioxane at reflux for 72 h. Amino acid analysis of the product using lysine as the standard
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: 2, 00, Trp 0, 75.
Tryptophan is determined by hydrolysis for 21 hours in the presence of dimethyl sulfoxide and thioglycolic acid. Cysteine is not determined because it is destroyed by the analytical method.
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2.828 g (with a substitution value of 0.150 mmol / g) of the protected tetradecapeptide resin obtained according to regulation 2 are added to a mixture of 5 ml of anisole and 5 ml of ethyl mercaptan. The mixture is cooled in liquid nitrogen and 56 ml of liquid hydrogen fluoride are distilled in. The mixture thus obtained is allowed to warm to 0 ° C. and stirred for 2 h. Then the hydrogen fluoride is distilled off and ether is added to the remaining mixture. The mixture is cooled to 0 C, and the solid formed is filtered off and washed with ether.
The product is dried and the deprotected tetradecapeptide is extracted from the resin using 1M acetic acid and a small amount of glacial acetic acid. The acetic acid solution is then immediately freeze-dried in the dark. The white substance thus obtained is suspended in a mixture of 10 ml degassed 0.2 m acetic acid and 4 ml glacial acetic acid. The suspension is heated, but the solid does not completely dissolve. The insoluble portion is filtered off and the somewhat cloudy colorless filtrate is placed on a column of Sephadex G-25 F (a cross-linked dextran with a glucose skeleton, pore size 25, fine grade, which is available from Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) ), applied.
Chromatography conditions: solvent, degassed 0.2 m acetic acid, column size 7.5 x 150 cm, temperature 26 C, flow rate 629 ml / h, fraction volume 22.0 ml.
By plotting the absorption of each fraction at 280 mp against the numbers of the fraction, a large peak value range with a subsequent shoulder is obtained. UV spectroscopy shows that the peak value range corresponds to the product. The fractions that are pooled and their exit volumes are as follows:
Fractions 224 to 240 (4906 to 5280 ml, tip = 5054 ml). This union of fractions does not include the subsequent shoulder. UV spectroscopy shows that 175 mg of the product are present (yield = 24.8%). Ellman titration of a sample gives a free sulfhydryl content of 93.6% of theory.