<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fruktose und fruktosereichen Sirupen, wobei die Fruktose aus Sacchariden mit Hilfe eines Fruktosepolymeren enthaltenden Substrats gewonnen wird. Es handelt sich dabei um einen neuartigen enzymatischen Weg für die Herstellung von Sirupen mit hohem Fruktosegehalt, der wesentlich höher als derzeit durch Glukoseisomerisierung von Stärkehydrolysaten erhältlich ist, wobei die Notwendigkeit entfällt, das erhaltene Fruktose-Endprodukt physikalisch abzutrennen. Dieses Verfahren ist besonders für die Herstellung von Fruktosesirupen mit über 55% Fruktose anwendbar.
Das erfindungsgemässe Verfahren ergibt eine Reihe von Produkten. Diese umfassen Fruktose oder einen Sirup mit hohem Fruktosegehalt, sowie verschiedene Zwischenprodukte wie das Fruktosepolymere, das das eingesetzte Fruktosepolymere (oder Polysaccharid) enthaltende Substrat, das Substrat, aus welchem das Polymere entfernt wurde, und das Substrat (mit oder ohne das Polymere) nach der Isomerisierung. Jedes dieser Produkte ist in seiner Weise direkt nützlich. Jedes dieser Produkte hat die Eigenschaften üblicher Zucker und Sirupe und kann in dieser Weise verwendet werden. Beispiele für diese Verwendung sind Süssungsmittel für Nahrungsmittel und Rohmaterialien für die Herstellung von Pharmazeutika.
Ausserdem können diese Produkte in üblicher Weise industriell wie Zucker und Sirupe verarbei-
EMI1.1
Weichmacher, Verdickungsmittel usw. verwendet werden.
Zusammengefasst lässt sich also sagen, dass sie im gesamten breiten Spektrum von Verwen- dungen nützlich sind, wo analoge Produkte bereits eingesetzt wurden.
Im folgenden werden einige der hier gebrauchten Bezeichnungen definiert :
Glukose und Dextrose
Diese beiden Namen werden nebeneinander zur Bezeichnung dieses Monosaccharids in jeder
Form in Lösung oder als Trockensubstanz verwendet.
Saccharose
Dieses Disaccharid wird gereinigt oder roh in Lösung oder als Trockensubstanz eingesetzt und kann aus jeder Saccharosequelle, z. B. Zuckerrohr oder Zuckerrüben, gewonnen werden. Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Saccharoseausgangsmaterial typischer- weise in wässerigen Medien eingesetzt.
Fruktose und Laevulose
Auch diese beiden Namen werden gleichzeitig für das Dextroisomere, welches süsser als Dextrose ist, verwendet. Fruktose ist im Honig und in Invertzucker zusammen mit Dextrose zu finden und ist wegen seiner Süsskraft wertvoll. Die Ausdrücke Laevulose und Fruktose werden hier nebeneinander zur Beschreibung des Monosaccharids in jeder Form in Lösung oder als Trockensubstanz verwendet.
Enzympräparat
Dieser Ausdruck wird hier verwendet, um eine beliebige Substanz zu bezeichnen, welche die gewünschte enzymatische Aktivität besitzt. Es kann sich z. B. um lebende ganze Zellen, trockene Zellen, Zellextrakte, gereinigte und konzentrierte Präparate aus Zellen und aus Kulturflüssigkeiten handeln. Die Enzympräparate können erfindungsgemäss als Lösung oder in immobilisierter Form eingesetzt werden.
Isomeraseenzym
Jedes Enzympräparat, das Dextrose zu Laevulose isomerisiert, wird hier als Isomeraseenzym bezeichnet. Diese Enzyme sind dem Fachmann gut bekannt und werden als Dextroseisomerase, Xyloseisomerase und Glukoseisomerase bezeichnet. Diese Enzyme können aus einer Vielzahl geeigneter Mikroorganismen erhalten werden. Beispiele für solche Mikroorganismen umfassen jene der Arten Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium usw.
Das bevorzugte Isomeraseenzym für die Erfindung wird aus Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21713, ATCC Nr. 21714 oder ATCC Nr. 21715 (letzteres ist eine einzelne Kolonie von ATCC Nr. 21713) erhalten, wie in den US-PS Nr. 3, 813, 318 und Nr. 3, 957, 587 beschrieben, insbesondere nach dem Verfahren der US-PS Nr. 3, 770, 589 und Nr. 3, 813, 318.
In jüngerer Zeit wurden Verfahren entwickelt, bei welchen das Isomeraseenzym auf einem
<Desc/Clms Page number 2>
wasserunlöslichen inerten Träger immobilisiert wird. Das immobilisierte Enzym kann dann bei der kontinuierlichen Überführung von Glukose in einen Sirup mit hohem Fruktosegehalt verwendet werden. Beispiele für solche Verfahren sind in den US-PS Nr. 3, 708, 397, Nr. 3, 788, 945, Nr. 3, 850, 751, Nr. 3, 868, 304, Nr. 3,960, 663 und der BE-PS Nr. 819859 beschrieben.
Isomeraseeinheit
Isomeraseeinheit ist definiert als jene Enzymaktivität, die erforderlich ist, um 1 pMol Laevulose/min unter den später beschriebenen Isomerisierungsbedingungen (Bestimmung der Isomeraseaktivität) zu erhalten.
Bestimmung der Isomeraseaktivität
Hiefür wird eine Bestimmungsmethode verwendet, bei welcher spektrophotometrisch unter Standardbedingungen die Menge an aus einer Glukoselösung hergestellter Ketose bestimmt wird.
Eine Ausgangslösung wird in folgender Weise bereitet :
0, 1 M MgSO. 7H20 1 ml
0, 001 M COCI,. 6H2O 1 ml
1 M Natriumphosphatpuffer, PH 7, 5 0, 5 ml wasserfreie D-Glukose 1,44 g destilliertes Wasser auf ein Gesamtvol. von 7,5 ml
Das zur Untersuchung vorgesehene Enzympräparat wird zuerst auf 1 bis 6 Isomeraseeinheiten/ml verdünnt.
Eine enzymatische Isomerisierung wird eingeleitet, indem 1 ml des Enzympräparats zu 3 ml der Ausgangslösung gefügt wird und die Mischung 30 min lang bei 60 C inkubiert wird. Am Ende der Inkubationszeit wird ein Aliquot von 1 ml entnommen und in 9 ml 0, 5 N Perchlorsäure eingegossen. Dann wird auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Für Vergleichszwecke wird in einer Kontrollprobe Glukose eingesetzt, jedoch an Stelle des Enzympräparats am Beginn der Inkubationszeit 1 ml Wasser zugesetzt.
Die Ketose wird dann nach der Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Für die Zwecke dieser Prüfung wird eine Isomeraseeinheit definiert als die Menge Enzymaktivität, die zur Herstellung von 1 j1Mol Laevulose/min unter den beschriebenen Bedingungen erforderlich ist.
Transfruktosylierung
Dieser Ausdruck bezeichnet den Übergang einer Fruktoseeinheit von einem Donor, z. B. Saccharose, an einen Akzeptor, z. B. Polysaccharid.
Fruktosyltransferaseenzym
Darunter ist hier jedes Enzym zu verstehen, welches die Transfruktosylierung katalysiert, einschliesslich des aus Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonym mit Aureobasidium pullulans) erhaltenen Enzyms.
Fruktosyltransferaseeinheit
Eine Fruktosyltransferaseeinheit ist definiert als die Menge Enzymaktivität, die zur Herstellung von 1 j1Mol eines reduzierenden Zuckers, berechnet als Glukose, pro min unter folgenden Bedingungen erforderlich ist :
EMI2.1
Substratkonzentration 60 g Saccharose (Nahrungsmittelqualität) pro 100 ml wässerige Reaktionsmischung
Die Bestimmung eines reduzierenden Zuckers (berechnet als Glukose) wurde unter Verwendung eines"Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York) durchgeführt. Die Analyse wird nach der üblichen Alkaliferricyanid-Methode vorgenommen, wie sie in Analytical Biochemistry 45, Nr. 2, S. 517-524 (1972) beschrieben wurde, adaptiert für die Benutzung des Autoanalyzers II.
Wenn nicht anders angegeben, werden Enzymaktivitätsbestimmungen durch kontinuier-
<Desc/Clms Page number 3>
liche Messung einer Reaktionsmischung der folgenden Zusammensetzung durchgeführt : 7, 5 ml 80% ige (Gew./Vol.) wässerige Saccharoselösung (Nahrungsmittelqualität)
2, 3 ml 0, 1 M Citratpuffer PH 5, 5
0, 2 ml Enzymprobe, enthaltend eine Menge Fruktosyltransferaseenzym, die 5 bis
25 pg reduzierenden Zucker (berechnet als Glukose) pro min und ml
Reaktionsmischung ergibt.
Alle Teile beziehen sich auf das Gewicht und alle Prozentangaben auf Gew./Vol., wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Sirupe werden unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigkeits- chromatographie nach der folgenden Vorgangsweise analysiert :
Die Komponenten werden durch Elution mit Wasser aus einem Kationenaustauscherharz in der Kalziumform getrennt. Die eluierten Komponenten werden mit einem Differentialrefraktometer festgestellt. Von Dextrose verschiedene Kohlenhydrate werden von einem elektronischen Integrator quantitativ bestimmt, und der Gehalt der Dextrose wird durch Differenzbestimmung erhalten. Die allgemeine Vorgangsweise ist jene, die in "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chroma- tography", Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, S. 43-46 beschrieben ist. Das verwendete Harz ist "Aminex Q" 15-5 in der Kalziumform (hergestellt von Bio Rad Laboratories, Richmond, California).
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Fruktose besteht darin, dass a) Sacchari- de in einer für eine Transfruktosylierung geeigneten Form mit einer für diese Reaktion zur Ver- fügung stehenden Fruktosylgruppe, vorzugsweise Saccharose in einer Konzentration von mindestens etwa 10% (Gew./Vol.), der Wirkung eines Fruktosyltransferaseenzympräparats bei einer Temperatur von 25 bis 65. C und einem PH-Wert von 4, 5 bis 6, 5 ausgesetzt werden, wobei ein Reaktionsprodukt, welches Fruktosepolysaccharide in Dextrose enthält, erhalten wird, und b) das Fruktosepolysaccha- rid und/oder die Dextrose des Reaktionsproduktes durch Hydrolyse des Fruktosepolysaccharids und/ oder durch Isomerisierung der Dextrose in Fruktose umgewandelt wird.
Das Fruktosyltransferase- - Enzympräparat ist imstande, Saccharose zu einem Produkt umzuwandeln, welches eine Mono- saccharidfraktion mit einem überwiegenden Anteil Glukose und einem geringeren Anteil Fruktose und
Fruktosepolysaccharide mit mindestens 66 Gew.-% Fruktosyleinheiten enthält.
Die Fruktosepolysaccharide enthalten alle Fruktose enthaltenden Polymeren (mit Ausnahme von
Saccharose) mit 2 oder mehr Monosaccharideinheiten. Diese Polymeren können auch derart charakte- risiert werden, dass sie Polysaccharide enthalten, in welchen Fruktosyleinheiten durch (2 -l) -ss- - Bindungen verknüpft sind.
Wie später beschrieben wird, können die unter gegebenen Bedingungen der Transfruktosylierung erhaltenen Polysaccharide überwiegend in einem vorherbestimmbaren Bereich liegen. So können z. B. Reaktionsprodukte erhalten werden, in welchen ein Grossteil (z. B. mindestens 60 Mol-%) des Polysaccharids Oligomeren mit 2 bis 10 (d. h. DP 2 bis 10), noch häufiger 3 bis 6 (d. h. DP 3 bis 6), Monosaccharideinheiten sind. Danach kann diese Glukose in Gegenwart von Polysacchariden zur Fruktose isomerisiert werden, wonach die Fruktosepolysaccharide in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert werden. Die Hydrolyse kann enzymatisch unter Verwendung von Invertase oder durch saure Hydrolyse unter milden Bedingungen vorgenommen werden.
Nach einer andern Ausführungsform der Erfindung können die Fruktosepolysaccharide von der Glukose und der Fruktose im Zwischenprodukt abgetrennt und danach wie oben beschrieben hydrolysiert werden, um einen Sirup mit extrem hohem Fruktosegehalt, z. B. von über 66 Gew.-% und vorzugsweise über 90 Gew.-% zu erzeugen, wobei die Notwendigkeit der Isomerisierung der Dextrose in diesem Zwischenprodukt entfällt. Diese Abtrennung kann am besten durch die üblichen physikalischen Trennmethoden auf Basis von Unterschieden in der Molekulargrösse durchgeführt werden, z. B. durch übliche Membrantrennverfahren (z. B. Ultrafiltration oder Dialyse), Lösungsmittelausscheidung, Kohleabsorption, u. dgl.
Beispiele für Membrantrennverfahren finden sich in den US-PS Nr. 3, 173, 867, Re 26, 074 Nr. 3, 541, OO6 und Nr. 3, 691, 068.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Sirup
<Desc/Clms Page number 4>
mit hohem Fruktosegehalt, bei welchem Saccharose der Wirkung eines Fruktosyltransferaseenzyms, wie es z. B. aus Pullularia pullulans (ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL
YB3892, NRRL 3937, ATCC 15223 und NRRL YB3861) gewonnen wird, ausgesetzt wird. Das entstehende
Produkt kann der Wirkung eines Isomeraseenzyms ausgesetzt werden. Danach kann das isomerisier- te Produkt in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert werden.
Das Zwischenprodukt aus der Transfruktosylasereaktion ist in einzigartiger Weise geeignet für eine Isomerisierung und nachfolgende Hydrolyse zur Bildung eines Sirups, der mehr als 55%
Fruktose enthält.
Um einen Sirup mit mehr als 55% Fruktose zu erhalten, enthält das Zwischenprodukt vor- zugsweise (1) 20 bis 60 Gew.-% Monosaccharide, die einen überwiegenden Anteil Glukose und einen kleineren Anteil Fruktose enthalten, und (2) 70 bis 40% Polysaccharide mit mehr als
66 Gew.-% Fruktosyleinheiten. Besonders bevorzugt sind Zwischenprodukte, die aus Saccharose durch Transfruktosylierung in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Fruktosyltransferaseenzyms, erhalten aus einem Stamm von Pullularia pullulans ATCC 9348 bei einer Temperatur von 25 bis
65OC, vorzugsweise von 50 bis 60 C, und bei einem pH-Wert im Bereich von 4, 5 bis 6, 5, vorzugs- weise 5, 4 bis 5, 6, gewonnen wurden. Die verwendeten Konzentrationen in der Ausgangslösung der
Saccharose können nur 10 g/100 ml Wasser betragen.
Bevorzugt wird jedoch eine möglichst hohe
Konzentration an Trockensubstanz, vorzugsweise von 30 bis 60 g/100 ml (für eine maximale Re- aktionsgeschwindigkeit), gegebenenfalls bis zum Sättigungspunkt der Saccharose und sogar darüber, wie später noch dargelegt werden wird.
Mindestens 0, 5 Einheiten Fruktosyltransferase/g Saccharose können erfindungsgemäss ver- wendet werden. Im allgemeinen wird die Menge an verwendetem Enzym 50 Einheiten/g Saccharose aus ökonomischen Erwägungen nicht überschreiten. Besonders bevorzugt zur Herstellung des ge- wünschten Zwischenproduktes in kommerziell annehmbarer Zeit und innerhalb der oben genannten
Verfahrensparameter ist ein Bereich von 2 bis 30 Einheiten/g Saccharose.
Für die Herstellung der erfindungsgemäss verwendeten Fruktosyltransferase können übliche
Fermentationsverfahren angewendet werden, wie z. B. in den US-PS Nr. 3, 565, 756, Nr. 3, 806, 419,
Nr. 3, 535, 123 und in Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963) von S. Ueda et al. beschrieben.
Vorzugsweise werden Massnahmen zur Abtrennung und Reinigung angewendet, die später be- schrieben werden.
Das folgende Beispiel ergibt eine typische Vorgangsweise für die Fermentation zur Herstel- lung des Enzyms aus Pullularia pullulans ATCC 9348 an.
Beispiel 1 : Herstellung von Fruktosyltransferaseenzympräparat auf Celite als Träger
A) Fermentationsverfahren zur Herstellung des Enzyms
Das für die Entwicklung des Inokulums und die Fermentation verwendete Medium zur Herstellung des Enzyms ist folgendes : 0, 5% Dibasisches Kaliumphosphat
0, 1% Natriumchlorid 0, 02% Magnesiumsulfatheptahydrat 0, 06% Diammoniumsulfat
0, 3% Hefeextrakt
7, 5% Saccharose (Nahrungsmittelqualität)
PH-Wert auf 6, 8 eingestellt
500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml sterilem Medium werden aus einer Kultur von Pullularia pullulans inokuliert. Der spezielle verwendete Hefestamm ist ATCC 9348.
Nach Entwicklung auf einer Schüttelvorrichtung im Verlaufe von 48 h bei 32 C wird der Inhalt der Kolben dazu verwendet, in 1 1 Erlenmeyer-Fermentationskolben mit 200 ml des oben beschriebenen Mediums zu inokulieren. Die Konzentration des Inokulums ist dabei 0, 5% (Gew./Vol.). Die Fermentation wird auf (liner Schüttelvorrichtung bei 32 C 7 Tage lang vorgenommen.
<Desc/Clms Page number 5>
B) Isolierung des Enzyms aus der Fermentationsbrühe
Die Fermentationsbrühen aus 40 l-Schüttelkolben werden vereinigt und die Kolben mit Wasser gespült, welches danach ebenfalls mit den Brühen vereinigt wird. Das Endvolumen nach Verdünnung beträgt 12 1. Das ursprüngliche Volumen der Brühe ist etwa 8 1. Die 12 1 Fermentationsbrühe werden kontinuierlich durch eine Zentrifuge geleitet, um die Hefezellen und Zellreste zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit, welche eine schwarze viskose Lösung ist, wird dann mit Kalziumchlorid auf eine Konzentration von 0, 5% (Gew./Vol.) versetzt und der PH -Wert der entstehenden Lösung mit Natriumhydroxyd auf 7,0 gebracht. Dann wird nochmals durch die Zentrifuge laufen gelassen, wobei eine viskose überstehende Flüssigkeit mit geringer Färbung erhalten wird.
Der PH-Wert der entfärbten Flüssigkeit wird mit Salzsäure auf 5, 5 eingestellt, worauf 1000 Einheiten (wie in der US-PS Nr. 3, 806, 419 definiert) Pullulanase zugesetzt werden. Die entstehende Brühe wird mit Toluol konserviert (bis zur Sättigung zugesetzt) und die Pullulanase über Nacht bei Umgebungstemperatur wirken gelassen. Danach wird eine l% ige Zubereitung von Celite in die Brühe eingeschlemmt, worauf 2 Volumina (24 l) Aceton zugesetzt werden. Es bildet sich ein Niederschlag, der durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und bei Umgebungstemperatur getrocknet wird. Der gesammelte Filterkuchen enthält die unlöslich gemachten Fruktosyltransferaseenzyme.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Zugabe von Kalziumchlorid zur Fermentationsbrühe und
EMI5.1
615-622 [1962]). Das endgültige Enzymprodukt wird dadurch in Form einer relativ reinen farblosen Substanz erhalten.
Der beschriebene Reinigungsvorgang stellt eine bevorzugte Massnahme im Rahmen der Erfindung dar und erlaubt einfache Techniken, d. h. Zentrifugieren, Filtrieren oder Ausfällen, zur Erzielung des Endproduktes. Würden die Nebenprodukte nicht entfernt, so würden sie nach Zugabe von Lösungsmittel zur Fermentationsbrühe zusammen mit dem Enzym ausfallen.
Als weitere Reinigung des Enzympräparats empfiehlt es sich, das Pullulan-Polysaccharid, welches in der Fermentationsbrühe auf jeden Fall vorliegt, zu entfernen, weil auch dieses nach Zugabe eines Lösungsmittels zur Fermentationsbrühe zusammen mit dem Fruktosyltransferaseenzym ausfallen würde. Die nach der Behandlung mit Kalziumchlorid unter Einstellung des PH-Wertes erhaltene überstehende Flüssigkeit kann daher mit einem gut bekannten Hydrolyseenzym, der Pullulanase, weiter behandelt werden. Das Enzym Pullulanase hydrolysiert das Pullulan an willkürlichen Stellen zu einem Polymeren mit niedrigerem Molekulargewicht, so dass ein Mitausfallen und eine dadurch bedingte Verunreinigung des Fruktosyltransferaseenzyms während der Behandlung mit dem Lösungsmittel (z. B. Aceton, Alkohol u. dgl.) vermieden wird.
Das Fruktosyltransferaseenzym kann auch ohne vorherige Entfernung des Pullulans eingesetzt werden. Die Erfindung kann also auch ohne die Hydrolyse des Pullulans durch Pullulanase ausgeführt werden, in welchem Fall das Pullulan als Träger für das Fruktosyltransferaseenzym dient.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung von Pullulan als Träger.
EMI5.2
als Träger dient, wird kein Celit verwendet. Die Aktivität der Fruktosyltransferase beträgt 677 Einheiten/g Pullulan. Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur durchgeführt, bis die Mischung trüb zu werden beginnt. Eine Probe dieses Materials wird durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei folgende Ergebnisse erhalten werden :
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> Fruktose <SEP> Dextrose <SEP> DP <SEP> DP <SEP> DP4+
<tb> 6, <SEP> 9 <SEP> 40, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Das folgende Beispiel erläutert die Eigenschaften des im Beispiel 1 erhaltenen Enzyms.
Beispiel 3 : Produkte der Enzymwirkung und thermische Stabilität des Enzyms
In Reaktionsflaschen mit Schraubverschluss werden 60 g Sukrose von Nahrungsmittelqualität und ein Fruktosyltransferaseenzympräparat eingebracht. Das Enzympräparat wird aus dem Produkt von Beispiel 1 durch Dispersion geeigneter aliquoter Mengen in abgemessene Mengen Wasser erhalten. Der Celit wird dann durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird dafür verwendet, in der Reaktionsmischung 10,20 bzw. 30 Einheiten/g Sukrosesubstrat einzustellen. Diese Mischungen werden dann jede auf ein Endvolumen von 100 ml mit Wasser verdünnt. Die Umsetzungen werden 66 h lang bei einem PH-Wert von 5, 5 bei 55 oder 60 C durchgeführt. Nach 24,43 und 66 h werden Proben genommen, um das Vorliegen enzymatischer Aktivität durch Bestimmung des reduzierenden Zuckers sicherzustellen.
Nach Durchführung der Bestimmungen des reduzierenden Zuckers an den Proben werden die verbleibenden Reaktionsmischungen eingefroren, um die enzymatische Wirkung zu verhindern, und es wird eine Bestimmung der Kohlenhydratzusammensetzung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie vorgenommen. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten :
Bestimmung reduzierender Zuckerl
EMI6.2
<tb>
<tb> Temperatur <SEP> Enzym- <SEP> reduzierende <SEP> PH <SEP> reduzierende <SEP> PH <SEP> reduzierende
<tb> einheiten2 <SEP> Zucker <SEP> Zucker <SEP> Zucker
<tb> (OC) <SEP> (mg/ml) <SEP> (mg/ml) <SEP> (mg/ml)
<tb> 24 <SEP> h <SEP> 43 <SEP> h <SEP> 66 <SEP> h
<tb> 55 <SEP> 0-5, <SEP> 80-5, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 191 <SEP> 5, <SEP> 40 <SEP> 231 <SEP> 5, <SEP> 25 <SEP> 268
<tb> 20 <SEP> 192 <SEP> 5, <SEP> 40 <SEP> 270 <SEP> 5, <SEP> 25 <SEP> 301
<tb> 30 <SEP> 246 <SEP> 5, <SEP> 35 <SEP> 334 <SEP> 5, <SEP> 15 <SEP> 390
<tb> 60 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 75 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 80 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 200 <SEP> 5, <SEP> 10 <SEP> 243 <SEP> 4, <SEP> 70 <SEP> 270
<tb> 20 <SEP> 219 <SEP> 5, <SEP> 15 <SEP> 288 <SEP> 4, <SEP> 90 <SEP> 346
<tb> 30 <SEP> 282 <SEP> 5,
<SEP> 20 <SEP> 360 <SEP> 4, <SEP> 95 <SEP> 420
<tb>
'Verfahren wie für die Bestimmung der Fruktosyltransferaseeinheit Enzymeinheiten/g Saccharose
<Desc/Clms Page number 7>
Kohlenhydratzusammensetzung
EMI7.1
<tb>
<tb> Enzymein- <SEP> Reaktions- <SEP> Dextrose <SEP> Laevulose <SEP> DP2 <SEP> DP3 <SEP> DP
<tb> heiten <SEP> zeit
<tb> (h)
<tb> Reaktionstemperatur <SEP> 550C
<tb> 10 <SEP> 24 <SEP> 31, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 31, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 34, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 17, <SEP> 9 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 36, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> 35, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 24 <SEP> 33, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> 34, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 7,
<SEP> 9 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP> 38, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 40, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 10, <SEP> 8 <SEP> 36, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 24 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 39, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 41, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 4 <SEP> 34, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 46, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 27, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Reaktionstemperatur <SEP> 600C <SEP>
<tb> 10 <SEP> 24 <SEP> 32, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 3 <SEP> 30, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 9, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 36, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP> 32, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 24 <SEP> 35, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 8,
<SEP> 4 <SEP> 17, <SEP> 1 <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 38, <SEP> 4 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 41, <SEP> 3 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 33, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 24 <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 43, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 30, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 47, <SEP> 8 <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Beispiel 3 : zeigt die thermische Stabilität des Enzyms in Gegenwart von Substrat bei 55 und 60 C im Verlauf von bis zu 66 h bei einem pH-Wert von 5, 5, was die kommerziellen Möglichkeiten des Enzyms zeigt.
Ausserdem wird gezeigt, dass das Zwischenprodukt nach der enzymatischen Umwandlung von Sukrose mit dem Fruktosyltransferasepräparat ein wertvolles Produkt darstellt, das für die Herstellung von Sirup mit hohem Fruktosegehalt geeignet ist, weil die überwiegenden Bestandteile Dextrose und Polymeren sind, die nach Hydrolyse Fruktose als vorwiegendes Monosaccharid ergeben. Dieses Beispiel zeigt ferner, dass das neue Enzym bei einer Konzentration an Saccharose von 60% (Gew./Vol.) wirksam ist und auch in Gegenwart hoher Glukosekonzentrationen wirkt.
Beispiel 4 : Wirkung der Temperatur auf die Enzymaktivität
Die Wirkung der Temperatur auf die Reaktionsgeschwindigkeit von Fruktosyltransferaseenzym wird unter Verwendung eines Technicon Autoanalyzer II wie folgt bestimmt :
Die Reaktionsmischung besteht aus 7, 5 ml 80%iger (Gew. /Vol.) Saccharoselösung, 2, 3 ml
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
Proben werden bei den nachfolgend genannten Temperaturen gehalten und 10 min lang auf dem Autoanalyzer untersucht.
Bei 400C ergibt sich eine Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms, die um 1, 89mal grösser als jene bei 300C ist ; bei SOIC ist sie 1, 29mal grösser als bei 40 C ; und bei 60 C ist sie 1, 48mal so gross wie bei 50 C. Dies zeigt eine mit steigender Temperatur steigende Reaktionsgeschwindigkeit.
Beispiel 5 : Die Michaelis-Menten-Konstante (Km) des Fruktosyltransferaseenzyms
Der Km-Wert eines Enzyms gibt die Substratkonzentration an, bei welcher die Geschwindigkeit der Produktbildung die Hälfte der Maximalgeschwindigkeit beträgt.
Zur Bestimmung des Km-Wertes vom Fruktosyltransferaseenzym wurde folgende Vorgangsweise angewendet :
Unter Verwendung einer 90% igen (Gew./Vol.) Saccharoselösung, eingestellt auf einen PH-Wert von 5, 5 mit 0, 1 M Citratpuffer, wurden die geeigneten Konzentrationen an Saccharose in 9, 8 ml- - Aliquoten eingestellt, um in einem Endvolumen von 10 ml Konzentrationen an Saccharose von 5, 10,20, 30,40, 50,60 und 75% zu ergeben. Eine Enzymlösung in einer Menge von 0, 2 ml, enthaltend 1, 1 Einheiten Fruktosyltransferaseenzym, wird den Proben zugefügt. Dann werden die Proben sofort bei 55 C in einem Technicon Autoanalyzer II wie oben beschrieben untersucht. Ein Glukosestandard wird als Kontrolle verwendet.
Nachfolgend wird die Geschwindigkeit der Glukosebildung in pg/ml. min bei verschiedenen Substratkonzentrationen und einer konstanten Menge an Fruktosyltransferaseenzym (1, 1 Einheiten), hergestellt gemäss Beispiel 1, angegeben :
EMI8.2
<tb>
<tb> % <SEP> Substrat <SEP> pg/ml. <SEP> min <SEP> pg/m1.
<SEP> mina) <SEP>
<tb> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 15, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 17, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 40 <SEP> 18, <SEP> 6 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 50 <SEP> 19, <SEP> 2 <SEP> 17, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 17, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 70 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
a) Neuerliche Prüfung am nächsten Tag mit einer
Saccharoselösung mit 60%
Der Km-Wert liegt bei einer 0, 27 molaren Saccharoselösung. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit tritt bei einer Substratkonzentration entsprechend einer 1, 374 molaren Saccharoselösung bei einem PH-Wert von 5, 5 und einer Temperatur von 55 C auf.
Beispiel 6 : Herstellung und Isomerisierung von Zwischenprodukt aus Saccharose
A) Herstellung des Zwischenproduktes
600 g Saccharose von Nahrungsmittelqualität werden in Wasser auf ein Volumen von 800 ml gelöst. Der PH-Wert dieser Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf 5, 5 eingestellt. Ein trockenes Celite-Enzym-Präparat mit einer Aktivität von 550 Einheiten/g, hergestellt gemäss Beispiel 1, wird in einer Menge von 11 g in 100 ml Wasser aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird im Vakuum durch ein Whatman-Filter Nr. 1 in einem Büchner-Trichter filtriert. Der Filterkuchen wird mit weiteren 100 ml Wasser gewaschen. Die 200 ml Filtrat werden dann der Saccharoselösung zugesetzt, welche sich in einer 2 1-Flasche mit Schraubverschluss befindet.
Die Flasche wird dann in ein
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> Zwischenprodukt <SEP> (A) <SEP> Endprodukt <SEP> (B)
<tb> Fruktose <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 32, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP, <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP>
<tb> DP3 <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP4+ <SEP> 31, <SEP> 3 <SEP> 31, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Diese Ergebnisse zeigen, dass 42, 38% der freien Dextrose im Zwischenprodukt in der Kolonne zu Fruktose isomerisiert wurden. Die im Zwischenprodukt enthaltenen Fruktosepolymeren scheinen nicht beeinflusst zu werden oder die Isomerisierung von Dextrose zu Fruktose zu beeinflussen. Es ist beachtenswert, dass die Gesamtverteilung an Monosacchariden im Endprodukt 45% Fruktose und 55% Dextrose aufweist.
Im folgenden Beispiel werden zwei Wege angewendet, um die im Zwischenprodukt vorliegenden Polysaccharide zu spalten und die Isomerisierungsprodukte davon zu trennen. Der eine Weg ist enzymatisch, der andere wendet eine Hydrolyse durch Säure bei milden Bedingungen an.
Beispiel 7 : Herstellung eines Sirups mit hohem Fruktosegehalt durch Hydrolyse
A) Enzymatische Hydrolyse
100 ml des Produktes B von Beispiel 6 werden mit 10 mg gereinigter Invertase aus Candida utilis versetzt. Diese Mischung (stabilisiert mit Toluol) wird über Nacht bei Umgebungstemperatur reagieren gelassen, wonach eine Probe entnommen und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert wird.
Das verbleibende Produkt B wird weitere 6 Tage reagieren gelassen, wonach eine zweite Probe nach der gleichen Prüfmethode untersucht wird : Die Ergebnisse sind folgende :
EMI10.2
<tb>
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> Nach <SEP> Invertase-Nach <SEP> weiteren
<tb> (Produkt <SEP> B) <SEP> wirkung <SEP> 6 <SEP> Tagen
<tb> Fruktose <SEP> 15, <SEP> 7% <SEP> 41, <SEP> 9% <SEP> 62, <SEP> 4% <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 18, <SEP> 9% <SEP> 29, <SEP> 4% <SEP> 36, <SEP> 2% <SEP>
<tb> DP, <SEP> 11, <SEP> 0% <SEP> 1, <SEP> 9% <SEP> 0
<tb> DP3 <SEP> 22, <SEP> 9% <SEP> 12, <SEP> 9% <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP>
<tb> DP <SEP> 31, <SEP> 5% <SEP> 13, <SEP> 9% <SEP> 0, <SEP> 9% <SEP>
<tb>
Die eingesetzte Invertase hatte eine Aktivität von 123 Einheiten/mg,
wobei eine Einheit Invertase die Spaltung von Saccharose unter Bildung von 1 pMol Glukose und 1 pMol Fruktose/min unter speziellen Bedingungen katalysiert.
B) Saure Hydrolyse von Produkt B
Die saure Hydrolyse einer Probe von Produkt B von Beispiel 6 wurde durch Zugabe von Schwefelsäure auf eine Konzentration von 0, 05 N und Erhitzen auf 75 bis 800C durchgeführt. Nach 1 und 2 h werden Proben entnommen und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert.
Die Ergebnisse sind :
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h <SEP>
<tb> (Produkt <SEP> B)
<tb> Fruktose <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 60, <SEP> 3 <SEP> 59, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 18, <SEP> 9 <SEP> 38, <SEP> 7 <SEP> 37, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP, <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> DPa <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> DP4+ <SEP> 31. <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Die Ergebnisse von Verfahrensvariante A zeigen eine überwiegende Steigerung des Fruktosegehaltes und eine geringere Steigerung der Glukoseausbeute zusammen mit einem entsprechenden Abfall der Mengen an DP2, DP3 und DP., wodurch die Anwesenheit eines Fruktosepolymeren demonstriert wird.
Die Ergebnisse der sauren Hydrolyse der Verfahrensvariante B sind in Übereinstimmung mit jenen der Verfahrensvariante A, zeigen also auch die Spaltung des Fruktosepolymeren.
Die bisherigen Ausführungen bezogen sich auf eine Transfruktosylierung unter Verwendung eines Ausgangssubstrats, dessen Trockensubstanzgehalt an Saccharose unter den gegebenen Reaktionsbedingungen den Sättigungspunkt nicht überschritt. Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines Ausgangssubstrats mit einer Saccharoseausgangskonzentration über dem Sättigungspunkt, welches, wenn es der Wirkung des Fruktosyltransferaseenzyms ausgesetzt wird, ein
EMI11.2
im Zwischenprodukt im Vergleich zur Konzentration in Abwesenheit von Fruktosyltransferaseenzym. Ausserdem wird gezeigt, dass bei Steigerung der Konzentration an Trockensubstanz im Ausgangssubstrat der Polymerisationsgrad des Fruktosepolymeren im Zwischenprodukt sinkt und DP 4+ -Ma- terialien in geringeren Mengen vorliegen.
Dies steht in deutlichem Kontrast zu den in den vorherigen Beispielen unter Verwendung von Saccharosesubstrat unterhalb der Sättigung erhaltenen Ergebnissen. In jenen Beispielen ist das DP.-Material das Hauptprodukt.
Beispiel 8 : Herstellung von Zwischenprodukt aus Saccharoseaufschlämmungen oberhalb der
Sättigung
Saccharose von Nahrungsmittelqualität wird in 200 g-Mengen in 600 ml-Flaschen mit Schraubverschluss gefüllt. Zur Kontrolle werden in eine Flasche 50 ml Wasser gegeben, in die andern Flaschen werden jeweils 50 ml Wasser mit steigenden Mengen an Fruktosyltransferaseenzym auf Celit (hergestellt gemäss Beispiel 1) gegeben. Jede Flasche wird verschlossen und in ein bewegtes Wasserbad von 54 bis 55. C eingebracht. Die Flaschen werden 24 h lang mit gelegentlichem manuellem Vermischen geschüttelt. Eine Probe überstehender Flüssigkeit wird aus jeder Flasche genommen und in einem verschlossenen Reaktionsröhrchen in ein siedendes Wasserbad gegeben, um das Enzym zu inaktivieren.
Diese Proben werden dann durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert, und es werden Bestimmungen des Trockensubstanzgehaltes der überstehenden Flüssigkeit nach dem K. Fischer-Verfahren mit folgenden Ergebnissen gemacht.
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb>
Flasche <SEP> Saccharose <SEP> Enzymein-Trockensubstanz <SEP> Kohlenhydratzusammensetzung <SEP> (%) <SEP>
<tb> Nr. <SEP> (g) <SEP> heiten' <SEP> (Gew.-%) <SEP> Fruktose <SEP> Dextrose <SEP> DP2 <SEP> DP, <SEP> DP4+ <SEP>
<tb> 1 <SEP> 200 <SEP> 100 <SEP> 74, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 9, <SEP> 6 <SEP> 80, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 9 <SEP> ND2 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 200 <SEP> 200 <SEP> 75, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 12, <SEP> 7 <SEP> 72, <SEP> 2 <SEP> 13, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 200 <SEP> 300 <SEP> 76, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 14, <SEP> 5 <SEP> 66, <SEP> 8 <SEP> 16, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 200 <SEP> 400 <SEP> 77, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 62, <SEP> 6 <SEP> 19, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 200 <SEP> 500 <SEP> 77, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 17, <SEP> 3 <SEP> 58, <SEP> 5 <SEP> 21,
<SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 200 <SEP> 600 <SEP> 78, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 56, <SEP> 0 <SEP> 21, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 200 <SEP> 700 <SEP> 78, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 18, <SEP> 8 <SEP> 53, <SEP> 9 <SEP> 23, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 200 <SEP> 800 <SEP> 80, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 19, <SEP> 3 <SEP> 52, <SEP> 2 <SEP> 24, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 200 <SEP> 900 <SEP> 79, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 19, <SEP> 9 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 200 <SEP> 1000 <SEP> 79, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 20, <SEP> 6 <SEP> 48, <SEP> 6 <SEP> 25, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kontr.
<SEP> 200 <SEP> 0 <SEP> 72, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> ND2 <SEP> 99, <SEP> 7 <SEP> ND2 <SEP> ND2 <SEP>
<tb>
1 Gesamteinheiten an Fruktosyltransferaseenzym in 50 ml Wasser 2 ND = nicht bestimmt
<Desc/Clms Page number 13>
Es ist bemerkenswert, dass im obigen Beispiel die Kontrollprobe beim Kühlen auf Umgebungstemperatur (etwa 25 C) auskristallisierte, während das enzymatisch hergestellte Zwischenprodukt in Lösung bleibt und ohne Kristallisation eine ausgezeichnete Lagerfähigkeit aufweist.
Obwohl in Beispiel 8 200 g Saccharose/50 ml Wasser eingesetzt werden, d. h. eine 80 gew.-% ige Lösung, kann die Konzentration an Trockensubstanz des Saccharoseausgangsmaterials noch weiter gesteigert werden.
Obzwar. der Transfruktosylierungsschritt der Erfindung hier für ansatzweises Arbeiten beschrieben wurde, ist es für den Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich, dass ebenso kontinuierliche Vorgangsweisen angewendet werden können. Dabei wird das Transfruktosylaseenzym günstigerweise unter Verwendung der oben erwähnten Techniken immobilisiert und die beschriebene Vorgangsweise gewählt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Fruktose und fruktosereichen Sirupen, dadurch gekennzeichnet, dass a) Saccharide in einer für eine Transfruktosylierung geeigneten Form mit einer für diese
Reaktion zur Verfügung stehenden Fruktosylgruppe, vorzugsweise Saccharose in einer
EMI13.1
von 4, 5 bis 6, 5 ausgesetzt werden, wobei ein Reaktionsprodukt, welches Fruktosepoly- saccharide und Dextrose enthält, erhalten wird, und b) das Fruktosepolysaccharid und/oder Dextrose des Reaktionsproduktes durch Hydrolyse des Fruktosepolysaccharids und/oder durch Isomerisierung der Dextrose in Fruktose umgewandelt wird.
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to a method for producing fructose and fructose-rich syrups, the fructose being obtained from saccharides with the aid of a substrate containing fructose polymers. It is a novel enzymatic route for the production of high fructose syrups which is much higher than is currently available by glucose isomerization of starch hydrolysates, eliminating the need to physically separate the final fructose product obtained. This process is particularly applicable for the production of fructose syrups with over 55% fructose.
The method according to the invention results in a number of products. These include fructose or a high fructose syrup, as well as various intermediates such as the fructose polymer, the substrate containing the fructose polymer (or polysaccharide) used, the substrate from which the polymer was removed, and the substrate (with or without the polymer) after Isomerization. Each of these products is directly useful in its own way. Each of these products has the properties of common sugar and syrups and can be used in this way. Examples of this use are sweeteners for food and raw materials for the manufacture of pharmaceuticals.
In addition, these products can be processed industrially in the usual way, such as sugar and syrups.
EMI1.1
Plasticizers, thickeners, etc. can be used.
In summary, it can be said that they are useful in the entire broad spectrum of uses where analog products have already been used.
Some of the terms used here are defined below:
Glucose and dextrose
These two names are used next to each other to refer to this monosaccharide
Form used in solution or as a dry substance.
Sucrose
This disaccharide is purified or used raw in solution or as a dry substance and can be obtained from any sucrose source, e.g. B. sugar cane or sugar beet can be obtained. When carrying out the process according to the invention, the sucrose starting material is typically used in aqueous media.
Fructose and levulose
These two names are also used simultaneously for the dextro isomer, which is sweeter than dextrose. Fructose can be found in honey and invert sugar together with dextrose and is valuable because of its sweetness. The terms laevulose and fructose are used here side by side to describe the monosaccharide in any form in solution or as a dry substance.
Enzyme preparation
This term is used here to refer to any substance that has the desired enzymatic activity. It can e.g. B. live whole cells, dry cells, cell extracts, purified and concentrated preparations from cells and from culture fluids. According to the invention, the enzyme preparations can be used as a solution or in immobilized form.
Isomerase enzyme
Every enzyme preparation that isomerizes dextrose to laevulose is referred to here as isomerase enzyme. These enzymes are well known to those skilled in the art and are referred to as dextrose isomerase, xylose isomerase and glucose isomerase. These enzymes can be obtained from a variety of suitable microorganisms. Examples of such microorganisms include those of the species Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium, etc.
The preferred isomerase enzyme for the invention is obtained from Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21713, ATCC No. 21714 or ATCC No. 21715 (the latter is a single colony of ATCC No. 21713) as described in U.S. Patent No. 3,813. 318 and No. 3, 957, 587, in particular according to the process of US Pat. No. 3, 770, 589 and No. 3, 813, 318.
More recently, methods have been developed in which the isomerase enzyme is on a
<Desc / Clms Page number 2>
water-insoluble inert carrier is immobilized. The immobilized enzyme can then be used in the continuous conversion of glucose into a syrup with a high fructose content. Examples of such processes are described in U.S. Patent Nos. 3, 708, 397, 3, 788, 945, 3, 850, 751, 3, 868, 304, 3,960, 663 and BE -PS No. 819859.
Isomerase unit
Isomerase unit is defined as the enzyme activity that is required to obtain 1 pmol of levulose / min under the isomerization conditions described later (determination of the isomerase activity).
Determination of isomerase activity
A determination method is used for this, in which the amount of ketosis produced from a glucose solution is determined spectrophotometrically under standard conditions.
A starting solution is prepared in the following way:
0.1M MgSO4. 7H20 1 ml
0.001 M COCI. 6H2O 1 ml
1 M sodium phosphate buffer, pH 7.5, 5 ml anhydrous D-glucose 1.44 g distilled water to a total volume. of 7.5 ml
The enzyme preparation intended for the test is first diluted to 1 to 6 isomerase units / ml.
Enzymatic isomerization is initiated by adding 1 ml of the enzyme preparation to 3 ml of the starting solution and incubating the mixture at 60 C for 30 min. At the end of the incubation period, an aliquot of 1 ml is removed and poured into 9 ml of 0.5 N perchloric acid. Then diluted to a total volume of 250 ml. For comparison purposes, glucose is used in a control sample, but 1 ml of water is added instead of the enzyme preparation at the beginning of the incubation period.
The ketosis is then determined using the cysteine-sulfuric acid method. For the purposes of this test, one isomerase unit is defined as the amount of enzyme activity required to produce 1 μl mol of levulose / min under the conditions described.
Transfructosylation
This term designates the transition of a fructose unit from a donor, e.g. B. sucrose, to an acceptor, e.g. B. polysaccharide.
Fructosyltransferase enzyme
This means any enzyme that catalyzes the transfructosylation, including the enzyme obtained from Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonymous with Aureobasidium pullulans).
Fructosyltransferase unit
A fructosyltransferase unit is defined as the amount of enzyme activity required to produce 1 μlmol of a reducing sugar, calculated as glucose, per min under the following conditions:
EMI2.1
Substrate concentration 60 g sucrose (food grade) per 100 ml aqueous reaction mixture
The determination of a reducing sugar (calculated as glucose) was carried out using a "Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). The analysis is carried out according to the usual alkali ferricyanide method, as described in Analytical Biochemistry 45, No. 2, pp. 517-524 (1972), adapted for use with the autoanalyzer II.
Unless otherwise stated, enzyme activity determinations are carried out by continuous
<Desc / Clms Page number 3>
Measurement of a reaction mixture of the following composition was carried out: 7.5 ml of 80% (w / v) aqueous sucrose solution (food grade)
2.3 ml 0.1 M citrate buffer PH 5.5
0.2 ml enzyme sample containing an amount of fructosyltransferase enzyme which is 5 to
25 pg of reducing sugar (calculated as glucose) per min and ml
Reaction mixture results.
All parts refer to weight and all percentages to w / v, unless expressly stated otherwise.
The syrups obtained according to the invention are analyzed using high pressure liquid chromatography according to the following procedure:
The components are separated in the calcium form by elution with water from a cation exchange resin. The eluted components are determined with a differential refractometer. Carbohydrates other than dextrose are quantified by an electronic integrator, and the content of the dextrose is obtained by difference determination. The general procedure is that described in "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, pp. 43-46. The resin used is "Aminex Q" 15-5 in the calcium form (manufactured by Bio Rad Laboratories, Richmond, California).
The process according to the invention for producing fructose consists in that a) saccharide in a form suitable for transfructosylation with a fructosyl group available for this reaction, preferably sucrose in a concentration of at least about 10% (w / v) .), the action of a fructosyltransferase enzyme preparation at a temperature of 25 to 65 ° C and a pH of 4.5 to 6.5, whereby a reaction product containing fructose polysaccharides in dextrose is obtained, and b) the fructose polysaccha - rid and / or the dextrose of the reaction product is converted into fructose by hydrolysis of the fructose polysaccharide and / or by isomerization of the dextrose.
The fructosyltransferase - enzyme preparation is able to convert sucrose to a product which contains a monosaccharide fraction with a predominant proportion of glucose and a smaller proportion of fructose and
Fructose polysaccharides containing at least 66 wt .-% fructosyl units.
The fructose polysaccharides contain all fructose-containing polymers (except for
Sucrose) with 2 or more monosaccharide units. These polymers can also be characterized in such a way that they contain polysaccharides in which fructosyl units are linked by (2 -l) -ss- bonds.
As will be described later, the polysaccharides obtained under the given conditions of the transfructosylation can predominantly be in a predeterminable range. So z. B. Reaction products are obtained in which a large part (e.g. at least 60 mol%) of the polysaccharide oligomers with 2 to 10 (ie DP 2 to 10), more often 3 to 6 (ie DP 3 to 6), monosaccharide units are. This glucose can then be isomerized to fructose in the presence of polysaccharides, after which the fructose polysaccharides are hydrolyzed in the absence of active isomerase enzyme. The hydrolysis can be carried out enzymatically using invertase or by acid hydrolysis under mild conditions.
According to another embodiment of the invention, the fructose polysaccharides can be separated from the glucose and fructose in the intermediate and then hydrolyzed as described above to give an extremely high fructose syrup, e.g. B. of over 66 wt .-% and preferably over 90 wt .-%, whereby the need for isomerization of the dextrose in this intermediate product is eliminated. This separation can best be carried out by the usual physical separation methods based on differences in molecular size, e.g. B. by conventional membrane separation processes (z. B. Ultrafiltration or dialysis), solvent separation, carbon absorption, and. the like
Examples of membrane separation processes can be found in US Pat. Nos. 3, 173, 867, Re 26, 074, No. 3, 541, OO6 and No. 3, 691, 068.
A preferred embodiment of the invention is a method of making syrup
<Desc / Clms Page number 4>
with high fructose content, in which sucrose the effect of a fructosyltransferase enzyme, such as. B. from Pullularia pullulans (ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL
YB3892, NRRL 3937, ATCC 15223 and NRRL YB3861). The emerging
Product can be exposed to the action of an isomerase enzyme. The isomerized product can then be hydrolyzed in the absence of active isomerase enzyme.
The intermediate from the transfructosylase reaction is uniquely suitable for isomerization and subsequent hydrolysis to form a syrup that is more than 55%
Contains fructose.
In order to obtain a syrup with more than 55% fructose, the intermediate product preferably contains (1) 20 to 60% by weight monosaccharides, which contain a predominant proportion of glucose and a minor proportion of fructose, and (2) 70 to 40% Polysaccharides with more than
66% by weight fructosyl units. Intermediates obtained from sucrose by transfructosylation in the presence of an effective amount of a fructosyltransferase enzyme obtained from a strain of Pullularia pullulans ATCC 9348 at a temperature of 25 to are particularly preferred
65OC, preferably from 50 to 60 C, and at a pH in the range from 4.5 to 6.5, preferably 5.4 to 5.6. The concentrations used in the starting solution of the
Sucrose can only be 10 g / 100 ml of water.
However, the highest possible is preferred
Concentration of dry matter, preferably from 30 to 60 g / 100 ml (for a maximum reaction rate), optionally up to the saturation point of the sucrose and even above, as will be explained later.
At least 0.5 units of fructosyl transferase / g of sucrose can be used according to the invention. In general, the amount of enzyme used will not exceed 50 units / g sucrose for economic reasons. Particularly preferred for the production of the desired intermediate in a commercially acceptable time and within the above
Process parameters range from 2 to 30 units / g sucrose.
For the preparation of the fructosyl transferase used according to the invention, conventional
Fermentation processes are applied, such as. U.S. Patent Nos. 3,556,756, 3,806,419,
No. 3, 535, 123 and in Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963) by S. Ueda et al. described.
Measures for separation and cleaning, which will be described later, are preferably used.
The following example shows a typical procedure for the fermentation for the production of the enzyme from Pullularia pullulans ATCC 9348.
Example 1: Preparation of fructosyltransferase enzyme preparation on Celite as a carrier
A) Fermentation process for the production of the enzyme
The medium used for the development of the inoculum and the fermentation for the production of the enzyme is the following: 0.5% dibasic potassium phosphate
0.1% sodium chloride 0.02% magnesium sulfate heptahydrate 0.06% diammonium sulfate
0.3% yeast extract
7.5% sucrose (food grade)
PH value set to 6, 8
500 ml Erlenmeyer flasks with 100 ml sterile medium are inoculated from a culture of Pullularia pullulans. The special yeast strain used is ATCC 9348.
After development on a shaker for 48 h at 32 C, the contents of the flask are used to inoculate in 1 1 Erlenmeyer fermentation flask with 200 ml of the medium described above. The concentration of the inoculum is 0.5% (w / v). The fermentation is carried out on a liner shaker at 32 C for 7 days.
<Desc / Clms Page number 5>
B) Isolation of the enzyme from the fermentation broth
The fermentation broths from 40 l shake flasks are combined and the flasks are rinsed with water, which is then also combined with the broths. The final volume after dilution is 12 1. The original volume of the broth is about 8 1. The 12 1 fermentation broth is continuously passed through a centrifuge to remove the yeast cells and cell debris. The supernatant liquid, which is a black viscous solution, is then mixed with calcium chloride to a concentration of 0.5% (w / v) and the pH of the resulting solution is brought to 7.0 with sodium hydroxide. Then it is run through the centrifuge again, whereby a viscous supernatant liquid with little color is obtained.
The pH of the decolorized liquid is adjusted to 5.5 with hydrochloric acid, after which 1000 units (as defined in US Pat. No. 3,806,419) are added to pullulanase. The resulting broth is preserved with toluene (added until saturated) and the pullulanase is left to act overnight at ambient temperature. Then a 1% preparation of Celite is slurried into the broth, whereupon 2 volumes (24 l) of acetone are added. A precipitate forms which is collected by filtration, washed with acetone and dried at ambient temperature. The collected filter cake contains the insolubilized fructosyltransferase enzymes.
It should be noted that the addition of calcium chloride to the fermentation broth and
EMI5.1
615-622 [1962]). The final enzyme product is thereby obtained in the form of a relatively pure colorless substance.
The cleaning process described is a preferred measure within the scope of the invention and allows simple techniques, i. H. Centrifuging, filtering or precipitating to obtain the final product. If the by-products were not removed, they would precipitate together with the enzyme after adding solvent to the fermentation broth.
As a further purification of the enzyme preparation, it is advisable to remove the pullulan polysaccharide, which is in any case present in the fermentation broth, because this would also precipitate together with the fructosyltransferase enzyme after adding a solvent to the fermentation broth. The supernatant liquid obtained after treatment with calcium chloride with adjustment of the pH can therefore be further treated with a well-known hydrolysis enzyme, the pullulanase. The pullulanase enzyme hydrolyzes the pullulan at arbitrary sites to a lower molecular weight polymer so that co-precipitation and consequent contamination of the fructosyltransferase enzyme during treatment with the solvent (e.g. acetone, alcohol and the like) is avoided.
The fructosyltransferase enzyme can also be used without prior removal of the pullulan. The invention can thus also be carried out without the hydrolysis of the pullulan by pullulanase, in which case the pullulan serves as a carrier for the fructosyltransferase enzyme.
The following example illustrates the use of Pullulan as a carrier.
EMI5.2
serves as a carrier, no Celite is used. The activity of the fructosyltransferase is 677 units / g pullulan. The reaction is carried out at ambient temperature until the mixture begins to become cloudy. A sample of this material is analyzed by high pressure liquid chromatography with the following results:
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> fructose <SEP> dextrose <SEP> DP <SEP> DP <SEP> DP4 +
<tb> 6, <SEP> 9 <SEP> 40, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
The following example explains the properties of the enzyme obtained in Example 1.
Example 3: Products of the enzyme action and thermal stability of the enzyme
60 g food grade sucrose and a fructosyltransferase enzyme preparation are placed in reaction bottles with a screw cap. The enzyme preparation is obtained from the product of Example 1 by dispersing suitable aliquots in measured amounts of water. The celite is then removed by filtration. The filtrate is used to set 10.20 or 30 units / g of sucrose substrate in the reaction mixture. These mixtures are then each diluted to a final volume of 100 ml with water. The reactions are carried out at pH 5, 5 at 55 or 60 C for 66 h. Samples are taken after 24, 43 and 66 hours to ensure the presence of enzymatic activity by determining the reducing sugar.
After the determinations of the reducing sugar on the samples have been carried out, the remaining reaction mixtures are frozen in order to prevent the enzymatic action, and the carbohydrate composition is determined by means of high pressure liquid chromatography. The following results were obtained:
Determination of reducing sugar
EMI6.2
<tb>
<tb> temperature <SEP> enzyme <SEP> reducing <SEP> PH <SEP> reducing <SEP> PH <SEP> reducing
<tb> units2 <SEP> sugar <SEP> sugar <SEP> sugar
<tb> (OC) <SEP> (mg / ml) <SEP> (mg / ml) <SEP> (mg / ml)
<tb> 24 <SEP> h <SEP> 43 <SEP> h <SEP> 66 <SEP> h
<tb> 55 <SEP> 0-5, <SEP> 80-5, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 191 <SEP> 5, <SEP> 40 <SEP> 231 <SEP> 5, <SEP> 25 <SEP> 268
<tb> 20 <SEP> 192 <SEP> 5, <SEP> 40 <SEP> 270 <SEP> 5, <SEP> 25 <SEP> 301
<tb> 30 <SEP> 246 <SEP> 5, <SEP> 35 <SEP> 334 <SEP> 5, <SEP> 15 <SEP> 390
<tb> 60 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 75 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 80 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 200 <SEP> 5, <SEP> 10 <SEP> 243 <SEP> 4, <SEP> 70 <SEP> 270
<tb> 20 <SEP> 219 <SEP> 5, <SEP> 15 <SEP> 288 <SEP> 4, <SEP> 90 <SEP> 346
<tb> 30 <SEP> 282 <SEP> 5,
<SEP> 20 <SEP> 360 <SEP> 4, <SEP> 95 <SEP> 420
<tb>
'Method as for the determination of the fructosyltransferase unit enzyme units / g sucrose
<Desc / Clms Page number 7>
Carbohydrate composition
EMI7.1
<tb>
<tb> enzyme <SEP> reaction <SEP> dextrose <SEP> Laevulose <SEP> DP2 <SEP> DP3 <SEP> DP
<tb> <SEP> time
<tb> (h)
<tb> reaction temperature <SEP> 550C
<tb> 10 <SEP> 24 <SEP> 31, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 31, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 34, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 17, <SEP> 9 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 36, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> 35, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 24 <SEP> 33, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> 34, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 7,
<SEP> 9 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP> 38, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 40, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 10, <SEP> 8 <SEP> 36, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 24 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 39, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 41, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 4 <SEP> 34, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 46, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 27, <SEP> 9 <SEP>
<tb> reaction temperature <SEP> 600C <SEP>
<tb> 10 <SEP> 24 <SEP> 32, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 3 <SEP> 30, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 9, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 36, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP> 32, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 24 <SEP> 35, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 8,
<SEP> 4 <SEP> 17, <SEP> 1 <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 38, <SEP> 4 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 41, <SEP> 3 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 33, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 24 <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 43, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 30, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 47, <SEP> 8 <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Example 3: shows the thermal stability of the enzyme in the presence of substrate at 55 and 60 C over a period of up to 66 h at a pH of 5.5, which shows the commercial possibilities of the enzyme.
In addition, it is shown that the intermediate product after the enzymatic conversion of sucrose with the fructosyltransferase preparation is a valuable product which is suitable for the production of syrups with a high fructose content, because the predominant constituents are dextrose and polymers which, after hydrolysis, give fructose as the predominant monosaccharide . This example further shows that the new enzyme is effective at a concentration of sucrose of 60% (w / v) and also works in the presence of high glucose concentrations.
Example 4: Effect of temperature on enzyme activity
The effect of temperature on the reaction rate of fructosyltransferase enzyme is determined using a Technicon Autoanalyzer II as follows:
The reaction mixture consists of 7.5 ml of 80% (w / v) sucrose solution, 2.3 ml
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
Samples are kept at the following temperatures and examined on the autoanalyzer for 10 minutes.
At 400C there is a reaction rate of the enzyme that is 1.89 times faster than that at 300C; with SOIC it is 1.29 times larger than at 40 C; and at 60 C it is 1.48 times as large as at 50 C. This shows an increasing reaction rate with increasing temperature.
Example 5: The Michaelis-Menten constant (Km) of the fructosyltransferase enzyme
The Km value of an enzyme indicates the substrate concentration at which the rate of product formation is half the maximum rate.
The following procedure was used to determine the Km value of the fructosyltransferase enzyme:
Using a 90% (w / v) sucrose solution, adjusted to pH 5.5 with 0.1 M citrate buffer, the appropriate concentrations of sucrose in 9, 8 ml aliquots were adjusted to in to give a final volume of 10 ml concentrations of sucrose of 5, 10.20, 30.40, 50.60 and 75%. An enzyme solution in an amount of 0.2 ml containing 1.1 units of fructosyl transferase enzyme is added to the samples. Then the samples are immediately examined at 55 C in a Technicon Autoanalyzer II as described above. A glucose standard is used as a control.
The rate of glucose formation in pg / ml is shown below. min at different substrate concentrations and a constant amount of fructosyltransferase enzyme (1.1 units), prepared according to Example 1:
EMI8.2
<tb>
<tb>% <SEP> substrate <SEP> pg / ml. <SEP> min <SEP> pg / m1.
<SEP> mina) <SEP>
<tb> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 15, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 17, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 40 <SEP> 18, <SEP> 6 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 50 <SEP> 19, <SEP> 2 <SEP> 17, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 17, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 70 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
a) Another exam the next day with a
Sucrose solution with 60%
The Km value is a 0.27 molar sucrose solution. The maximum reaction rate occurs at a substrate concentration corresponding to a 1,374 molar sucrose solution at a pH of 5.5 and a temperature of 55 ° C.
Example 6: Preparation and isomerization of intermediate product from sucrose
A) Preparation of the intermediate
600 g of food grade sucrose are dissolved in water to a volume of 800 ml. The pH of this solution is adjusted to 5.5 with dilute hydrochloric acid. A dry Celite enzyme preparation with an activity of 550 units / g, prepared according to Example 1, is slurried in an amount of 11 g in 100 ml of water. The slurry is vacuum filtered through a Whatman # 1 filter in a Buchner funnel. The filter cake is washed with another 100 ml of water. The 200 ml of filtrate are then added to the sucrose solution, which is in a 2 1 bottle with a screw cap.
The bottle is then in a
<Desc / Clms Page number 9>
EMI9.1
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> intermediate <SEP> (A) <SEP> end product <SEP> (B)
<tb> fructose <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP>
<tb> dextrose <SEP> 32, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP, <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP>
<tb> DP3 <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP4 + <SEP> 31, <SEP> 3 <SEP> 31, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
These results show that 42.38% of the free dextrose in the intermediate was isomerized to fructose in the column. The fructose polymers contained in the intermediate do not appear to be affected or to affect the isomerization of dextrose to fructose. It is worth noting that the total distribution of monosaccharides in the final product is 45% fructose and 55% dextrose.
The following example uses two ways to cleave the polysaccharides present in the intermediate and to separate the isomerization products from them. One is enzymatic, the other uses acid hydrolysis under mild conditions.
Example 7: Preparation of a high fructose syrup by hydrolysis
A) Enzymatic hydrolysis
100 ml of product B from Example 6 are mixed with 10 mg of purified invertase from Candida utilis. This mixture (stabilized with toluene) is allowed to react overnight at ambient temperature, after which a sample is taken and analyzed by high pressure liquid chromatography.
The remaining product B is left to react for a further 6 days, after which a second sample is tested using the same test method: the results are as follows:
EMI10.2
<tb>
<tb> source material <SEP> After <SEP> Invertase-Nach <SEP> others
<tb> (product <SEP> B) <SEP> effect <SEP> 6 <SEP> days
<tb> fructose <SEP> 15, <SEP> 7% <SEP> 41, <SEP> 9% <SEP> 62, <SEP> 4% <SEP>
<tb> dextrose <SEP> 18, <SEP> 9% <SEP> 29, <SEP> 4% <SEP> 36, <SEP> 2% <SEP>
<tb> DP, <SEP> 11, <SEP> 0% <SEP> 1, <SEP> 9% <SEP> 0
<tb> DP3 <SEP> 22, <SEP> 9% <SEP> 12, <SEP> 9% <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP>
<tb> DP <SEP> 31, <SEP> 5% <SEP> 13, <SEP> 9% <SEP> 0, <SEP> 9% <SEP>
<tb>
The invertase used had an activity of 123 units / mg,
where one unit of invertase catalyzes the cleavage of sucrose to form 1 pmol glucose and 1 pmol fructose / min under special conditions.
B) Acid hydrolysis of product B
Acid hydrolysis of a sample of Product B from Example 6 was carried out by adding sulfuric acid to a concentration of 0.05 N and heating to 75 to 800 ° C. Samples are taken after 1 and 2 hours and analyzed by high pressure liquid chromatography.
The results are:
<Desc / Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> source material <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h <SEP>
<tb> (product <SEP> B)
<tb> fructose <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 60, <SEP> 3 <SEP> 59, <SEP> 1 <SEP>
<tb> dextrose <SEP> 18, <SEP> 9 <SEP> 38, <SEP> 7 <SEP> 37, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP, <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> DPa <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> DP4 + <SEP> 31. <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
The results of process variant A show a predominant increase in the fructose content and a smaller increase in the glucose yield together with a corresponding decrease in the amounts of DP2, DP3 and DP., Thereby demonstrating the presence of a fructose polymer.
The results of the acid hydrolysis of process variant B are in agreement with those of process variant A, and therefore also show the cleavage of the fructose polymer.
The previous statements relate to transfructosylation using a starting substrate, the dry matter content of sucrose under the given reaction conditions did not exceed the saturation point. The following example illustrates the use of a starting substrate with a starting sucrose concentration above the saturation point, which when exposed to the action of the fructosyltransferase enzyme
EMI11.2
in the intermediate compared to the concentration in the absence of fructosyltransferase enzyme. In addition, it is shown that when the concentration of dry substance in the starting substrate increases, the degree of polymerization of the fructose polymer in the intermediate product drops and that DP 4+ materials are present in smaller quantities.
This is in marked contrast to the results obtained in the previous examples using sucrose substrate below saturation. In those examples, the DP. Material is the main product.
Example 8: Preparation of intermediate from sucrose slurries above
saturation
Food-grade sucrose is filled in 200 g quantities in 600 ml bottles with screw caps. As a control, 50 ml of water are added to one bottle, 50 ml of water with increasing amounts of fructosyltransferase enzyme on Celite (prepared according to Example 1) are added to the other bottles. Each bottle is closed and placed in a moving water bath at 54 to 55 ° C. The bottles are shaken for 24 hours with occasional manual mixing. A sample of the supernatant liquid is taken from each bottle and placed in a sealed reaction tube in a boiling water bath to inactivate the enzyme.
These samples are then analyzed by high pressure liquid chromatography and determinations of the dry matter content of the supernatant liquid are made according to the K. Fischer method with the following results.
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb>
bottle <SEP> sucrose <SEP> Enzyme dry matter <SEP> carbohydrate composition <SEP> (%) <SEP>
<tb> No. <SEP> (g) <SEP> units' <SEP> (% by weight) <SEP> fructose <SEP> dextrose <SEP> DP2 <SEP> DP, <SEP> DP4 + <SEP>
<tb> 1 <SEP> 200 <SEP> 100 <SEP> 74, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 9, <SEP> 6 <SEP> 80, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 9 <SEP> ND2 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 200 <SEP> 200 <SEP> 75, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 12, <SEP> 7 <SEP> 72, <SEP> 2 <SEP> 13, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 200 <SEP> 300 <SEP> 76, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 14, <SEP> 5 <SEP> 66, <SEP> 8 <SEP> 16, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 200 <SEP> 400 <SEP> 77, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 62, <SEP> 6 <SEP> 19, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 200 <SEP> 500 <SEP> 77, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 17, <SEP> 3 <SEP> 58, <SEP> 5 <SEP> 21,
<SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 200 <SEP> 600 <SEP> 78, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 56, <SEP> 0 <SEP> 21, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 200 <SEP> 700 <SEP> 78, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 18, <SEP> 8 <SEP> 53, <SEP> 9 <SEP> 23, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 200 <SEP> 800 <SEP> 80, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 19, <SEP> 3 <SEP> 52, <SEP> 2 <SEP> 24, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 200 <SEP> 900 <SEP> 79, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 19, <SEP> 9 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 200 <SEP> 1000 <SEP> 79, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 20, <SEP> 6 <SEP> 48, <SEP> 6 <SEP> 25, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP>
<tb> contr.
<SEP> 200 <SEP> 0 <SEP> 72, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> ND2 <SEP> 99, <SEP> 7 <SEP> ND2 <SEP> ND2 <SEP>
<tb>
1 total units of fructosyltransferase enzyme in 50 ml water 2 ND = not determined
<Desc / Clms Page number 13>
It is noteworthy that in the example above the control sample crystallized out on cooling to ambient temperature (about 25 ° C.), while the enzymatically produced intermediate product remains in solution and has an excellent shelf life without crystallization.
Although 200 g sucrose / 50 ml water are used in Example 8, i. H. an 80% by weight solution, the concentration of dry matter of the sucrose starting material can be increased still further.
Although. As the transfructosylation step of the invention has been described here for batch work, it will be understood by those skilled in the art that continuous procedures can also be used. The transfructosylase enzyme is advantageously immobilized using the techniques mentioned above and the procedure described is chosen.
PATENT CLAIMS:
1. A process for the production of fructose and fructose-rich syrups, characterized in that a) saccharides in a form suitable for transfructosylation with one for them
Reaction available fructosyl group, preferably sucrose in one
EMI13.1
from 4, 5 to 6, 5, whereby a reaction product containing fructose polysaccharides and dextrose is obtained, and b) the fructose polysaccharide and / or dextrose of the reaction product by hydrolysis of the fructose polysaccharide and / or by isomerization of the dextrose into fructose is converted.