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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer neuen antibakteriellen Verbindung, die durch das Bakterium Pseudomonas fluorescens gebildet wird, und deren Salzen und Estern.
In der GB-PS Nr. 1, 395, 907 ist ein Verfahren zur Isolierung antibakterieller Verbindungen aus dem Bakterium Pseudomonas fluorescens beschrieben und beansprucht, wobei eine derartige Verbindung Pseudomonsäure genannt wird ; sie besitzt die Formel
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und wird im folgenden als "Pseudomonsäure A" bezeichnet.
Es wurde nun gefunden, dass eine weitere antibakterielle Verbindung aus Pseudomonas fluorescens isoliert werden kann ; diese Verbindung kann aber auch aus Pseudomonsäure A hergestellt werden.
Demgemäss bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel
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und deren pharmazeutisch verwendbaren Salzen und Estern.
Die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung der Formel (II) wird im folgenden"Pseudomon- säure C" bezeichnet. Man nimmt an, dass sie absolute stereochemische Formel
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aufweist, wobei beide Doppelbindungen in trans- oder E-Konfiguration sind.
Geeignete pharmazeutisch verwendbare Salze der Pseudomonsäure C sind Metallsalze, z. B.
Aluminiumsalze, Alkalimetallsalze, wie Natrium- oder Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Kalziumoder Magnesiumsalze, und Ammonium- oder substituierte Ammoniumsalze, beispielsweise jene, die mit nied. Alkylamin, wie Triäthylamin, Hydroxy-nied. alkylaminen, wie 2-Hydroxyäthylamin, Bis- (2- -hydroxyäthyl)-amin oder Tri-(2-hydroxyäthyl)-amin, Cycloalkylaminen, wie Bicyclohexylamin, oder
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b) C 3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit C, 6-Alkyl; c) Aryl ; d) Heterocyclyl.
Der Ausdruck "Aryl" umfasst Phenyl und Naphthyl, gegebenenfalls bis zu fünffach substituiert
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gruppe, insbesondere Methyl, Äthyl, n-oder Isopropyl, n-, sek.-, iso-oder tert. Butyl ; eine Halo- gen- (C )-alkylgruppe, wie Trifluormethyl, 2, 2, 2-Trichloräthyl ; eine Aminoalkylgruppe, wie Aminomethyl, 2-Aminoäthyl ; eine Hydroxymethyl-oder Hydroxyäthylgruppe ; eine Phenylgruppe ; eine substituierte Phenylgruppe oder eine Benzylgruppe sein.
Bevorzugte Ester sind die C, - 6-Alkylester.
Pseudomonsäure C und ihre Salze und Ester weisen antibakterielle Wirksamkeit auf. Insbesondere stark wirksam sind sie gegen Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae und Mycoplasma sp ; sie sind daher wertvoll bei der Behandlung von Atmungs- und venerischen Krankheiten sowie bei mycoplasmainduzierten menschlichen und tierischen Erkrankungen. Weiterhin besitzen die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen gegenüber Pseudomonsäure A den Vorteil, dass sie bei sauren Bedingungen stabil und bei alkalischen Bedingungen stabiler sind.
Bei Menschen sind die Infektionen, gegen welche Pseudomonsäure C und deren Salze und Ester besonders nützlich sind, venerische Krankheiten. Da es sich bei den erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen nicht um ein ss-Lactamantibiotikum handelt, sind sie gegen ss-lactamasebildende Stämme von N. gnorrhoeae, gegen welche Standardbehandlungen mit Penicillin- und Cephalosporinantibiotika nicht zweckmässig sind, wirksam. Pseudomonsäure C kann auch wirksam bei der Behandlung von Atmungsinfektionen, wie chronischer Bronchitis und bakterieller Meningitis, nichtspezifischer Urethritis und Pneumonie sein. Bei Tieren kann sie im allgemeinen als Wachstumsförderer oder zur Behandlung von Mastitis bei Rindern sowie zur Behandlung von Mycoplasmainfektionen bei Tieren, wie Truthähnen, Hühnern und Schweinen, verwendet werden.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen werden somit zur Herstellung von pharmazeutischen oder Veterinärzusammensetzungen verwendet, die Pseudomonsäure C oder ein Salz oder einen Ester hievon zusammen mit einem pharmazeutisch oder veterinär geeigneten Träger oder Exzipienten enthalten.
Die Zusammensetzungen können für jede Verabreichung formuliert werden und hängen von der behandelten Krankheit ab. Sie können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Lutschtabletten oder flüssigen Präparaten, wie oralen oder sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, sein.
Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in Einheitsdosisform sein und herkömmliche Exzipienten, wie Bindemittel, z. B. Sirup, Akaziengummi, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon ; Füllstoffe, z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Kalziumphosphat, Sorbit oder Glycin ; Schmiermittel, z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyäthylenglykol oder Kieselerde ; Desintegriermittel, z. B. Kartoffelstärke ; oder annehmbare Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten.
Die Tabletten können nach bekannten pharmazeutischen Standardverfahren überzogen werden. Orale flüssige Präparate können beispielsweise in Form von wässerigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups oder Elixieren sein oder sie können als Trockenprodukt für die Rekonstitution mit Wasser oder einem andern geeigneten Träger vor der Verwendung hergestellt werden.
Derartige flüssige Präparate können herkömmliche Additive, wie Suspendiermittel, z. B. Sorbit, Sirup, Methylzellulose, Glucosesirup, Gelatine, hydrierte essbare Fette ; Emulgiermittel, wie Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Akaziengummi ; nichtwässerige Träger (die essbare öle einschliessen können), z. B. Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester, wie Glycerin, Propylenglykol oder Äthyl-
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alkohol ; Konservierungsmittel, z. B. Methyl-oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure, und gegebenenfalls Geschmacks- und Farbstoffe, enthalten.
Suppositorien enthalten herkömmliche Suppositoriengrundstoffe, z. B. Kakaobutter oder ein anderes Glycerid.
Für die parenterale Verabreichung werden flüssige Einheitsdosierungsformen hergestellt, wobei die Verbindung und ein steriler Träger verwendet werden ; Wasser wird bevorzugt. Die Verbindung kann je nach dem Träger und der angewendeten Konzentration im Träger entweder suspendiert oder gelöst werden. Bei der Herstellung von Lösungen kann die Verbindung in Wasser für die Injektion gelöst und vor dem Einfüllen in eine geeignete Phiole oder Ampulle und Verschliessen derselben durch Filtrieren sterilisiert werden. Vorteilhafterweise werden Hilfsstoffe, wie Lokalanästhetika, Konservierungsmittel und Pufferstoffe im Träger gelöst. Um die Stabilität der Zusammensetzung zu erhöhen, kann diese nach dem Einfüllen in die Phiole gefroren und das Wasser unter Vakuum entfernt werden. Das gefriergetrocknete Pulver wird dann in der Phiole versiegelt.
Parenterale Suspensionen werden praktisch auf die gleiche Weise hergestellt, wobei jedoch die Verbindung, an Stelle im Träger gelöst zu werden, in diesem suspendiert wird ; dabei kann die Sterilisierung nicht durch Filtration erfolgen. Die Verbindung kann dadurch sterilisiert werden, dass man sie vor dem Suspendieren im sterilen Träger Äthylenoxyd aussetzt. Vorteilhafterweise wird der Zusammensetzung ein oberflächenaktives Mittel oder ein Netzmittel zugesetzt, um die gleichförmige Verteilung der Verbindung zu erleichtern.
Die Zusammensetzungen können 0, 1 bis 99 %-Masse, vorzugsweise 10 bis 60 %-Masse, der aktiven Verbindung, je nach Art der Verabreichung, enthalten. Wenn die Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheiten vorliegen, enthält jede Einheit vorzugsweise 50 bis 500 mg des aktiven Bestandteiles. Die Dosis für einen erwachsenen Menschen beträgt vorzugsweise 100 mg bis 3 g täglich, beispielsweise 250 mg bis 2 g täglich, je nach der Art und der Häufigkeit der Verabreichung.
Anderseits kann Pseudomonsäure C oder ein Salz oder ein Ester hievon als Teil der Gesamtnahrung verabreicht werden. In diesem Fall kann die Menge der verwendeten Verbindung weniger als 1 %-Masse der Nahrung, vorzugsweise nicht mehr als 0, 5 %-Masse, betragen. Die Nahrung für Tiere kann aus normalen Futtermitteln bestehen, welchen die Verbindung zugesetzt worden ist, oder sie kann zu einer Vormischung zugegeben werden.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen werden dadurch hergestellt, dass man Pseudomonas fluerescens NCIB 10586 unter aeroben Bedingungen auf oder in einem Kulturmedium, das anorganische Salze und Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und Stickstoffs enthält, züchtet, bis das Kulturmedium zumindest feststellbare antibakterielle Wirksamkeit zeigt, das Kulturmedium ansäuert, mit einem organischen Lösungsmittel für die im Kulturmedium gelösten aktiven Materialien extrahiert, gegebenenfalls Pseudomonsäure A durch fraktionierte Kristallisation entfernt und danach (i) Pseudomonsäure C oder ein Salz hievon von andern aktiven Materialien abtrennt und gegebenenfalls danach die abgetrennte Säure verestert oder (ii) die aktiven Materialien verestert,
einen Ester der Pseudomonsäure C von Estern anderer aktiver Materialien abtrennt und gegebenenfalls danach den abgetrennten Ester unter
Bildung der Pseudomonsäure C oder eines Salzes hievon hydrolysiert.
Beim erfindungsgemässen Verfahren erfolgt die Kultivierung, bei der Pseudomonas fluorescens NCIB 10586 (NCIB = National Collection of Industrial Bacterial) gezüchtet wird, in konventioneller Weise. Es sei bemerkt, dass jeder Stamm dieses Organismus verwendet werden kann.
Nach Beendigung der Fermentation werden die aktiven Materialien, einschliesslich Pseudomonsäure C, vom angesäuerten wässerigen Kulturmedium in ein geeignetes Lösungsmittel extrahiert.
Vorzugsweise besteht die Extraktion in der Extraktion des Kulturmediums nach Ansäuerung
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lischer Pufferlösung und einschliesslich Rückextraktion der letzteren nach Ansäuerung mit einem organischen Lösungsmittel. Geeignete Lösungsmittel können durch Versuche gefunden werden ; Beispiele sind Isobutylmethylketon, Chloroform und vorzugsweise Äthylacetat.
Die Pseudomonsäure C kann dann von andern, bei der Fermentation gebildeten aktiven Materialien entweder direkt (obige Stufe a) oder durch Verestern der Mischung und Abtrennen des Esters der Pseudomonsäure C (obige Stufe b) getrennt werden.
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Das beim erfindungsgemässen Verfahren ausser Pseudomonsäure C am meisten gebildete Material ist Pseudomonsäure A.
Wenn diese letztere in wesentlichen Mengen vorhanden ist, wird vorzugsweise der Grossteil durch Kristallisation von Pseudomonsäure A, gegebenenfalls mit Animpfen, aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Diäthyläther, entfernt.
Wenn die Alternative (i) durchgeführt wird, kann Pseudomonsäure C direkt durch Chromato- graphie von der verbliebenen Mischung entweder als freie Säure selbst oder als Salz hievon abgetrennt werden. Bei Chromatographie auf Silikagel wird Pseudomonsäure C leicht vor Pseudomonsäure A eluiert und die Fraktionen können demnach identifiziert werden.
Die abgetrennte Pseudomonsäure C oder ein Salz hievon kann wie folgt verestert werden :
Die Veresterung kann beispielsweise durch Umsetzen der Säure oder eines Salzes hievon a) mit dem geeigneten Halogen, Sulfat oder Alkansulfonat des Alkohols in Anwesenheit eines
Lösungsmittels, wie Aceton, Dimethylsulfid oder Dimethylsulfoxyd und Kalzium- oder Ka- liumcarbonat oder mit dem Halogenid in Anwesenheit von Hexamethylphosphoramid ; oder b) durch Phasenübertragungs-Katalysemethoden mit dem Halogenid und/oder Sulfat des Alko- hols in wässeriger und/oder organischer Lösung in Anwesenheit eines quaternären Ammo- niumsalzes, wie Tetrabutylammoniumbisulfat oder-halogenid oder Benzyltrimethylammonium- halogenid ; oder c) mit einem Diazoalkan, erfolgen.
Die Hydrolyse eines Esters der Pseudomonsäure C kann eine chemische Hydrolyse, beispielsweise selektive alkalische Hydrolyse, oder enzymatische Hydrolyse, beispielsweise durch Verwendung von Bakers-Hefe, sein.
Wenn die Alternative (ii) durchgeführt wird, wird die Mischung der aktiven Materialien zuerst verestert, vorzugsweise nach Entfernen des Grossteiles der Pseudomonsäure A durch Kristallisation. Es kann jede oben beschriebene Veresterungsmethode angewendet werden. Es ist zweckmässig, Cl -. -Alkylester der Verbindungen in der Mischung, vorzugsweise Methylester, zu bilden.
Die erhaltene Estermischung kann dann chromatographiert und der gewünschte Ester der Pseudomonsäure C dadurch abgetrennt werden. Wenn die freie Säure oder ein Salz hievon gewünscht wird, können diese durch chemische oder enzymatische Hydrolyse des abgetrennten Esters gebildet werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese hierauf beschränkt sein soll.
Beispiel 1 : Pseudomonsäure C durch Fermentation a) Fermentation
Pseudomonas fluorescens, Stamm NCIB 10586, wurde auf Schrägagar kultiviert und mit sterilem Wasser überschwemmt. Zu dem folgenden Samenmedium wurde eine Probe zugesetzt :
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<tb>
<tb> Oxoid-Hefeextrakt <SEP> 2 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Glucose <SEP> 0, <SEP> 11% <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Dinatriumhydrogenorthophosphat <SEP> 0,26% <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Kaliumdihydrogenorthophosphat <SEP> 0,24% <SEP> (Masse/Vol.)
<tb>
Dieses wurde über Nacht bei 280C gezüchtet und dann zum Animpfen des folgenden Produktionsmediums verwendet :
EMI4.2
<tb>
<tb> Getreideweiche <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Glucose <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Glycerin <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.) <SEP>
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.) <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Kaliumdihydrogenorthophosphat <SEP> 0,04 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Dinatriumhydrogenorthophosphat <SEP> 0,065 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Manganchlorid <SEP> R <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 0003% <SEP> (Masse/Vol. <SEP> )
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> % <SEP> (Masse/Vol.)
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 0375% <SEP> (Masse/Vol. <SEP> )
<tb> P2000 <SEP> zum <SEP> Vermindern <SEP> des <SEP> Schäumens.
<tb>
Die Fermentation wurde während 48 h bei 25 C durchgeführt, als die Produktion praktisch beendet war. Nach Abzentrifugieren der Zellen wurde die überstehende Flüssigkeit in Äthylacetat bei PH 3 verteilt. Die Äthylacetatlösung wurde getrocknet (MgS04) und auf ein kleines Volumen eingedampft, worauf Äther zugesetzt und Pseudomonsäure A kristallisieren gelassen wurde. b) Isolierung von Pseudomonsäure C
Die Mutterlaugen aus der obigen Kristallisation wurden zu einem Öl eingedampft und auf präparativen 20 x 20 cm Silikageldünnschichtchromatographieplatten chromatographiert, wobei mit Chloroform : Isopropanol : Essigsäure (80 : 20 : 0, 5) entwickelt wurde. Die Bande oberhalb Pseudomonsäure A vom Rf 0, 65 wurde entfernt und wie oben wieder chromatographiert, wobei Pseudomonsäure C erhalten wurde.
Berechnet für CHO, : C 64, 4, H 9, 2% gefunden : C 64,0, H 9, 3%. vmax (CHClg) : 3430 (breit), 1710,1650, 1220 (breit), 1153,1110, 1050 und 977 cm-'
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(ÄtOH) :25, 9 (C7'), 24, 7 (C3'), 20, 4 (C14), 19,2 (C15), 16,7 (C17).
Beispiel 2 : Isolierung von Methylpseudomonat C
Das restliche Öl von den Mutterlaugen von Beispiel 1 a) (zirka 5 g) wurde in 50 ml Methanol gelöst und mit 50 ml Wasser verdünnt, worauf der PH-Wert mit wässerigem Natriumhydroxyd auf 7 eingestellt wurde. Nach Eindampfen zur Trockne wurde eine Lösung des Rückstandes in 50 ml Dimethylformamid, 5 Tropfen Hexamethylphosphoramid und 5 ml Methyljodid über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand zwischen 50 ml Äthylacetat und 20 ml Wasser aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit gesättigter Kochsalzlösung, wässerigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO..) und zu einem Öl eingedampft, aus welchem etwas Methylpseudomonat A kristallisierte.
Das verbleibende Öl wurde zweimal auf Kieselerde (20 g und dann 15 g, Type 60) chromatographiert, wobei mit einem Gradienten von 0 bis 4% Methanol/Chloroform eluiert wurde. Fraktionen, die praktisch reines Methylpseudomonat C enthielten (Rf 0,46, Kieselerde-Dünnschichtchromatographie, Chloroform/Methanol 9 : 1, Methylpseudomonat A, Rf 0, 42) wurden vereinigt und auf 4 g Kieselerde (Type 60) unter An- wendung eines Gradienten von 0 bis 3% Methanol/Chloroform chromatographiert (destilliert aus Phosphorpentoxyd). Die Fraktionen, die reines Methylpseudomonat C enthielten (durch Dünnschichtchromatographie) wurden vereinigt und zu einem Öl (50 mg) eingedampft, das sich als Methylpseudomonat C erwies.
Dünnschichtchromatographie in Chloroform/Methanol (9 : 1) zeigte eine Komponente bei Rf = 0, 46 und ein einziges Peak durch Hochdruckflüssigchromatographie, vmax (chia) : 3400, 2900,2850, 1720, 1710, 1650,1150 und 980 cm-1 ;
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m/e (relative Intensität) : 499 (100%, M+ +1 durch C. I.).
Beispiel 3 : Pseudomonsäure C aus Methylpseudomonat C
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230 mg Methylpseudomonat C aus Beispiel 2 wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und mit 120 ml Q, 05M Phosphatpuffer verdünnt und dann über Nacht mit 6 g Baker-Hefe gerührt. Die Mischung wurde filtriert, zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 50 ml Äthylacetat und 50 ml Wasser gelöst. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und die vereinigten wässerigen Schichten mit 5M HC1 auf PH 3 angesäuert und mehrere Male mit Äthylacetat extrahiert. Nach Trocknen wurden die vereinigten Extrakte zu einem Öl eingedampft.
Chromatographie auf 8 g Silikagel H (Type 60) unter Eluieren mit einem Gradienten von 0 bis 6% Methanol/Chloroform ergab 150 mg (67%) Pseudomonsäure C, die chromatographisch und spektroskopisch mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Material identisch war.
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:Kaliumcarbonat und 21 ml Methyljodid bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, dann in Äthylacetat/Wasser aufgenommen und wie im Beispiel 2 aufgearbeitet, wobei Methylpseudomonat C erhalten wurde.
Der Methylester kann wie in Beispiel 3 hydrolysiert werden.
Beispiel 5 : Natriumpseudomonat C (Natrium-10,11-deoxypseudomonat A)
Eine Lösung von 0, 330 g Methylpseudomonat C in 20 ml destilliertem Tetrahydrofuran und 20 ml 10N Natriumhydroxydlösung wurde 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Tetrahydrofuran wurde im Vakuum entfernt, wobei eine trübe wässerige Lösung erhalten wurde, die mit Äther-Äthylacetat gewaschen wurde, um nichtumgesetzten Ester zu entfernen. Die wässerige Schicht wurde mit Natriumchlorid gesättigt, mit Äthylacetat bedeckt und mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1, 5 angesäuert. Die Äthylacetatschicht wurde abgetrennt, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4) und zur Trockne eingedampft. Die erhaltene Pseudomonsäure C wurde in Wasser/Tetrahydrofuran suspendiert und 10N Natriumhydroxydlösung wurde bis zu einem PH-Wert von 7, 5 zugesetzt.
Die erhaltene wässerige Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml trockenem Methanol gelöst und filtriert und überschüssiger trockener Äther wurde dem Filtrat unter Rühren zugesetzt. Der erhaltene weisse Niederschlag von Natriumpseudomonat C wurde gesammelt und im Vakuum getrocknet ; Ausbeute 0, 153 g. Die Verbindung war durch Dünnschichtchromatographie und Hochdruckflüssigchromatographie homogen ;
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Beispiel 6 : Natriumpseudomat C
1 g Methylpseudomonat C wurde in 50 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Wasser gelöst und der
PH-Wert auf 12 eingestellt und 2 1/2 h lang dabei gehalten. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, zur Trockne eingedampft und dann in 30 ml Wasser wieder gelöst und mit Äthylacetat gewaschen.
Die wässerige Fraktion wurde auf einen PH-Wert von 2 angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Nach Trocknen (MgSO 4) wurden die vereinigten Extrakte im Vakuum eingedampft.
Das erhaltene Öl (0, 55 g) wurde mit 95 mg (1 Äquivalent) Natriumbicarbonat in 20 ml Wasser/20 ml Methanol behandelt und zur Trockne eingedampft. Das Natriumsalz wurde in Äthanol (Minimum) gelöst und tropfenweise zu 300 ml Äther zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert (0, 58 g, 57%) ;
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smal(C3'-C8'), 20,3 (C14), 19,4 (C15), 16, 6 (C17).
Berechnet für C26H43O8Na.H2O: C 59, 5, H 8, 6, Na 4, 4% gefunden : C 59, 4, H 8, 4, Na 4, 9%.
Biologische Daten
1. Antibakterielle Wirksamkeit - menschliche Organismen
Tabelle I zeigt das antibakterielle Spektrum von Natriumpseudomonat C und Methylpseudomonat C, ausgedrückt als minimale Hemmungskonzentration (pg/ml), gemessen durch Serienverdünnung in Nähragar enthaltend 5% mit Schokolade versetztes Pferdeblut.
Tabelle I
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> minimale <SEP> Hemmungskonzentration <SEP> (ug/ml)
<tb> Natriumpseudo- <SEP> Methylpseudomonat <SEP> C <SEP> monat <SEP> C <SEP>
<tb> E. <SEP> coli <SEP> NCTC <SEP> 10418 <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP>
<tb> E. <SEP> coli <SEP> ESS <SEP> 1,0 <SEP> 2,5
<tb> P. <SEP> mirabilis <SEP> 889 <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP>
<tb> K.
<SEP> aerogenes <SEP> A <SEP> > 100 <SEP> > 100
<tb> Ps <SEP> aeruginosa <SEP> NCTC <SEP> 10701 <SEP> > 100 <SEP> > 100
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 1633 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Haemophilus <SEP> infl <SEP> uenzae <SEP> Ql <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> < 0, <SEP> 2
<tb> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> Wy <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,5
<tb> Neisseria <SEP> flavescens <SEP> 6633 <SEP> 0,2 <SEP> 0,5
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> < 0, <SEP> 2
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 9755 <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> Oxford <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> < 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Staph.
<SEP> aureus <SEP> Russell <SEP> 0,2 <SEP> 0,5
<tb>
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Tabelle I (Fortsetzung)
EMI8.1
<tb>
<tb> Organismus <SEP> minimale <SEP> Hemmungskonzentration <SEP> (pg/ml)
<tb> Natriumpseudo-Methylpseudomonat <SEP> C <SEP> monat <SEP> C <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 1517 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> I <SEP> 100 <SEP> > 100
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> A <SEP> 64/848 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> B <SEP> 2788 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> C <SEP> 2761 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> pneumoniae <SEP> CN33 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
2.
Antimycoplasmawirksamkeit
Methylpseudomonat C besitzt in vitro gegen Mycoplasmen von menschlichen und veterinären Quellen gute Antimycoplasmawirksamkeit, wie in Tabelle Il gezeigt.
Methode :
Die minimalen Hemmungskonzentrationen (MIC) von Methylpseudomonat C wurden in Mikrotiterplatten durch eine Modifikation des metabolischen Hemmungstests (Taylor-Robinson, 1967) bestimmt.
Die Verbindungen wurden serienmässig in sterilem entionisiertem Wasser verdünnt, um einen Konzentrationsbereich von 250 bis 0, 5 pg/ml zu erhalten. Mycoplasmabrühe, enthaltend 1% (Masse/Vol. ) Glucose und 0, 005% (Masse/Vol. ) Phenolrot, wurde in einer Stärke zugesetzt, um dessen Verdünnung durch die wässerige Heilmittellösung zu kompensieren. Etwa 104 kolonienbildende Einheiten an Mycoplasma wurden zu jeder Konzentration des Heilmittels zugesetzt. Heilmittelfreie infizierte, nichtinfizierte und PH-Kontrollöcher wurden in jeder Platte angebracht. Die Platten wurden mit einem Zellophanband verschlossen und 7 Tage lang bei 370C bebrütet. Die minimale Hemmungskonzentration war die niedrigste Konzentration der Verbindung, die eine Farbänderung in der Mycoplasmabrühe verhinderte, bewirkt durch den Metabolismus.
Bezug : Taylor-Robinson, 1967. Mycoplasmas of varios hosts and their antibiotic sensitivities ; Post. Grad. Med. J., Suppl. (Maroh), 100.
Tabelle II
EMI8.2
<tb>
<tb> Mycoplasma <SEP> MIC <SEP> (pg/ml) <SEP>
<tb> M. <SEP> gallisepticum <SEP> S. <SEP> 6 <SEP> 62,5
<tb> M. <SEP> synoviae <SEP> 25204 <SEP> < 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> M. <SEP> Pulmonis <SEP> JB <SEP> < 0, <SEP> 5
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> Läber <SEP> < 0,5
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> 427a <SEP> 1,0
<tb> M. <SEP> fermentans <SEP> MW <SEP> KL4 <SEP> < 0, <SEP> 5
<tb>
Die Tabelle III zeigt MIC-Werte für Natriumpseudomonat C und Methylpseudomonat C gegen weitere Mycoplasmaarten, bestimmt in einer Friis-Brühe unter Verwendung der Mikrotitermethode.
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Tabelle III
EMI9.1
<tb>
<tb> Organismus <SEP> MIC <SEP> (ug/ml) <SEP>
<tb> Methylpseudo- <SEP> Natriumpseudo- <SEP>
<tb> monat <SEP> C <SEP> monat <SEP> C <SEP>
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> Str. <SEP> 11 <SEP> > 10 <SEP> > 10
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> J2206/183b <SEP> > 10 <SEP> 10
<tb> M. <SEP> dispar <SEP> H225 <SEP> 10 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP>
<tb> M. <SEP> dispar <SEP> NCTC <SEP> 10125 <SEP> 50 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> 427a <SEP> > 10 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 15492 <SEP> 10 <SEP> - <SEP>
<tb> M. <SEP> fermentans <SEP> MWKL4 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP> < 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> M. <SEP> pulmonis <SEP> JB <SEP> 0, <SEP> 312 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to a method for producing a new antibacterial compound, which is formed by the bacterium Pseudomonas fluorescens, and their salts and esters.
GB-PS No. 1, 395, 907 describes and claims a process for isolating antibacterial compounds from the bacterium Pseudomonas fluorescens, such a compound being called pseudomonic acid; it has the formula
EMI1.1
and is referred to below as "pseudomonic acid A".
It has now been found that a further antibacterial compound can be isolated from Pseudomonas fluorescens; however, this compound can also be prepared from pseudomonic acid A.
Accordingly, the invention relates to a process for the preparation of the compound of formula
EMI1.2
and their pharmaceutically usable salts and esters.
The compound of the formula (II) obtainable according to the invention is hereinafter referred to as "pseudomonic acid C". It is believed that it is an absolute stereochemical formula
EMI1.3
has, wherein both double bonds are in trans or E configuration.
Suitable pharmaceutically usable salts of pseudomonic acid C are metal salts, e.g. B.
Aluminum salts, alkali metal salts such as sodium or potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium or magnesium salts, and ammonium or substituted ammonium salts, for example those associated with low. Alkylamine such as triethylamine, hydroxy-nied. alkylamines, such as 2-hydroxyethylamine, bis (2- hydroxyethyl) amine or tri- (2-hydroxyethyl) amine, cycloalkylamines, such as bicyclohexylamine, or
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<Desc / Clms Page number 2>
b) C 3-7 cycloalkyl, optionally substituted with C, 6-alkyl; c) aryl; d) heterocyclyl.
The term "aryl" includes phenyl and naphthyl, optionally substituted up to five times
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group, in particular methyl, ethyl, n- or isopropyl, n-, sec-, iso- or tert. Butyl; a halogen (C) alkyl group such as trifluoromethyl, 2, 2, 2-trichloroethyl; an aminoalkyl group such as aminomethyl, 2-aminoethyl; a hydroxymethyl or hydroxyethyl group; a phenyl group; be a substituted phenyl group or a benzyl group.
Preferred esters are the C 1-6 alkyl esters.
Pseudomonic acid C and its salts and esters have antibacterial activity. They are particularly potent against Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae and Mycoplasma sp; they are therefore valuable in the treatment of respiratory and venereal diseases as well as in mycoplasma-induced human and animal diseases. Furthermore, the compounds obtainable according to the invention have the advantage over pseudomonic acid A that they are stable under acidic conditions and more stable under alkaline conditions.
In humans, the infections against which pseudomonic acid C and its salts and esters are particularly useful are venereal diseases. Since the compounds obtainable according to the invention are not an ss-lactam antibiotic, they are active against ss-lactamase-forming strains of N. gnorrhoeae, against which standard treatments with penicillin and cephalosporin antibiotics are not appropriate. Pseudomonic acid C can also be effective in the treatment of respiratory infections such as chronic bronchitis and bacterial meningitis, non-specific urethritis and pneumonia. In animals, it can generally be used as a growth promoter or for the treatment of mastitis in cattle and for the treatment of mycoplasma infections in animals such as turkeys, chickens and pigs.
The compounds obtainable according to the invention are thus used for the production of pharmaceutical or veterinary compositions which contain pseudomonic acid C or a salt or an ester thereof together with a pharmaceutically or veterinarily suitable carrier or excipient.
The compositions can be formulated for each administration and depend on the disease being treated. They can be in the form of tablets, capsules, powders, granules, lozenges or liquid preparations, such as oral or sterile parenteral solutions or suspensions.
Tablets and capsules for oral administration can be in unit dosage form and conventional excipients such as binders, e.g. B. syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinylpyrrolidone; Fillers, e.g. B. lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine; Lubricants, e.g. B. magnesium stearate, talc, polyethylene glycol or silica; Disintegrant, e.g. B. potato starch; or acceptable wetting agents such as sodium lauryl sulfate.
The tablets can be coated according to known standard pharmaceutical methods. Oral liquid preparations can be, for example, in the form of aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or elixirs, or they can be prepared as a dry product for reconstitution with water or other suitable vehicle before use.
Such liquid preparations can be conventional additives such as suspending agents, e.g. B. sorbitol, syrup, methyl cellulose, glucose syrup, gelatin, hydrogenated edible fats; Emulsifiers such as lecithin, sorbitan monooleate or acacia; non-aqueous vehicles (which may include edible oils), e.g. B. almond oil, fractionated coconut oil, oily esters such as glycerin, propylene glycol or ethyl
<Desc / Clms Page number 3>
alcohol; Preservatives, e.g. B. methyl or propyl p-hydroxybenzoate or sorbic acid, and optionally flavorings and colors.
Suppositories contain conventional suppository base materials, e.g. B. cocoa butter or another glyceride.
For parenteral administration, liquid unit dosage forms are made using the compound and a sterile vehicle; Water is preferred. Depending on the carrier and the concentration used, the compound can either be suspended or dissolved in the carrier. In the preparation of solutions, the compound can be dissolved in water for injection and sterilized by filtering before filling into a suitable vial or ampoule and closing the same. Auxiliaries such as local anesthetics, preservatives and buffer substances are advantageously dissolved in the carrier. To increase the stability of the composition, it can be frozen after filling in the vial and the water removed under vacuum. The freeze-dried powder is then sealed in the vial.
Parenteral suspensions are prepared practically in the same way, except that the compound, instead of being dissolved in the carrier, is suspended in the carrier; sterilization cannot be carried out by filtration. The compound can be sterilized by exposing it to ethylene oxide before suspending it in the sterile vehicle. A surfactant or wetting agent is advantageously added to the composition to facilitate uniform distribution of the compound.
The compositions can contain 0.1 to 99% by mass, preferably 10 to 60% by mass, of the active compound, depending on the mode of administration. When the compositions are in unit dose form, each unit preferably contains 50 to 500 mg of the active ingredient. The dose for an adult human is preferably 100 mg to 3 g daily, for example 250 mg to 2 g daily, depending on the type and frequency of administration.
On the other hand, pseudomonic acid C or a salt or an ester thereof can be administered as part of the total diet. In this case, the amount of the compound used can be less than 1% by weight of the food, preferably not more than 0.5% by weight. Animal food may consist of normal feed to which the compound has been added, or may be added to a premix.
The compounds obtainable according to the invention are prepared by cultivating Pseudomonas fluerescens NCIB 10586 under aerobic conditions on or in a culture medium which contains inorganic salts and sources of assimilable carbon and nitrogen until the culture medium exhibits at least detectable antibacterial activity, acidifies the culture medium extracted an organic solvent for the active materials dissolved in the culture medium, optionally removing pseudomonic acid A by fractional crystallization and then (i) separating pseudomonic acid C or a salt thereof from other active materials and optionally then esterifying the separated acid or (ii) esterifying the active materials ,
separates an ester of pseudomonic acid C from esters of other active materials and, if appropriate, thereafter the separated ester under
Formation of pseudomonic acid C or a salt thereof hydrolyzed.
In the method according to the invention, the cultivation in which Pseudomonas fluorescens NCIB 10586 (NCIB = National Collection of Industrial Bacterial) is grown is carried out in a conventional manner. It should be noted that any strain of this organism can be used.
After the fermentation has ended, the active materials, including pseudomonic acid C, are extracted from the acidified aqueous culture medium into a suitable solvent.
The extraction preferably consists in the extraction of the culture medium after acidification
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buffer solution and including back extraction of the latter after acidification with an organic solvent. Suitable solvents can be found by experiment; Examples are isobutyl methyl ketone, chloroform and preferably ethyl acetate.
The pseudomonic acid C can then be separated from other active materials formed during the fermentation either directly (step a above) or by esterifying the mixture and separating the ester of pseudomonic acid C (step b above).
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In addition to pseudomonic acid C, the material most formed in the process according to the invention is pseudomonic acid A.
If the latter is present in substantial amounts, the major part is preferably removed from a suitable solvent, for example diethyl ether, by crystallization of pseudomonic acid A, if appropriate with inoculation.
If alternative (i) is carried out, pseudomonic acid C can be separated off directly from the remaining mixture either by chromatography as either the free acid itself or as a salt thereof. Chromatography on silica gel elutes pseudomonic acid C slightly before pseudomonic acid A and the fractions can therefore be identified.
The separated pseudomonic acid C or a salt thereof can be esterified as follows:
The esterification can be carried out, for example, by reacting the acid or a salt thereof a) with the appropriate halogen, sulfate or alkanesulfonate of the alcohol in the presence of a
Solvents such as acetone, dimethyl sulfide or dimethyl sulfoxide and calcium or potassium carbonate or with the halide in the presence of hexamethylphosphoramide; or b) by phase transfer catalytic methods with the halide and / or sulfate of the alcohol in aqueous and / or organic solution in the presence of a quaternary ammonium salt, such as tetrabutylammonium bisulfate or halide or benzyltrimethylammonium halide; or c) with a diazoalkane.
The hydrolysis of an ester of pseudomonic acid C can be chemical hydrolysis, for example selective alkaline hydrolysis, or enzymatic hydrolysis, for example by using Bakers yeast.
When alternative (ii) is carried out, the mixture of active materials is first esterified, preferably after the majority of pseudomonic acid A has been removed by crystallization. Any esterification method described above can be used. It is appropriate to Cl -. -Alkyl ester of the compounds in the mixture, preferably methyl ester, to form.
The ester mixture obtained can then be chromatographed and the desired ester of pseudomonic acid C can thereby be separated off. If the free acid or a salt thereof is desired, these can be formed by chemical or enzymatic hydrolysis of the separated ester.
The following examples are intended to explain the invention in more detail, without any intention that it should be limited thereto.
Example 1: Pseudomonic acid C by fermentation a) fermentation
Pseudomonas fluorescens, strain NCIB 10586, was cultivated on slanting agar and flooded with sterile water. A sample was added to the following seed medium:
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<tb>
<tb> Oxoid yeast extract <SEP> 2 <SEP>% <SEP> (mass / vol.)
<tb> glucose <SEP> 0, <SEP> 11% <SEP> (mass / vol.)
<tb> disodium hydrogen orthophosphate <SEP> 0.26% <SEP> (mass / vol.)
<tb> Potassium dihydrogen orthophosphate <SEP> 0.24% <SEP> (mass / vol.)
<tb>
This was grown overnight at 280C and then used to inoculate the following production medium:
EMI4.2
<tb>
<tb> grain soft <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>% <SEP> (mass / vol.)
<tb> glucose <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>% <SEP> (mass / vol.)
<tb> Glycerin <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>% <SEP> (mass / vol.)
<tb> Ammonium sulfate <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>% <SEP> (mass / vol.) <SEP>
<tb> Calcium carbonate <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>% <SEP> (mass / vol.) <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
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<tb>
<tb> Potassium dihydrogen orthophosphate <SEP> 0.04 <SEP>% <SEP> (mass / vol.)
<tb> disodium hydrogen orthophosphate <SEP> 0.065 <SEP>% <SEP> (mass / vol.)
<tb> Manganese chloride <SEP> R <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 0003% <SEP> (mass / vol. <SEP>)
<tb> Potassium chloride <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>% <SEP> (mass / vol.)
<tb> Magnesium sulfate <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 0375% <SEP> (mass / vol. <SEP>)
<tb> P2000 <SEP> for <SEP> reducing <SEP> of <SEP> foaming.
<tb>
The fermentation was carried out at 25 C for 48 h when the production was practically ended. After centrifuging off the cells, the supernatant was distributed in ethyl acetate at PH 3. The ethyl acetate solution was dried (MgS04) and evaporated to a small volume, whereupon ether was added and pseudomonic acid A was allowed to crystallize. b) isolation of pseudomonic acid C
The mother liquors from the above crystallization were evaporated to an oil and chromatographed on preparative 20 x 20 cm silica gel thin layer chromatography plates, developing with chloroform: isopropanol: acetic acid (80: 20: 0, 5). The band above pseudomonic acid A from Rf 0.65 was removed and chromatographed again as above, pseudomonic acid C being obtained.
Calculated for CHO,: C 64.4, H 9.2% found: C 64.0, H 9.3%. vmax (CHClg): 3430 (wide), 1710.1650, 1220 (wide), 1153.1110, 1050 and 977 cm- '
EMI5.2
(EtOH): 25, 9 (C7 '), 24, 7 (C3'), 20, 4 (C14), 19.2 (C15), 16.7 (C17).
Example 2: Isolation of methyl pseudomonate C.
The remaining oil from the mother liquors of Example 1 a) (approximately 5 g) was dissolved in 50 ml of methanol and diluted with 50 ml of water, whereupon the pH was adjusted to 7 with aqueous sodium hydroxide. After evaporation to dryness, a solution of the residue in 50 ml of dimethylformamide, 5 drops of hexamethylphosphoramide and 5 ml of methyl iodide was stirred overnight at room temperature. The solution was evaporated to dryness and the residue was partitioned between 50 ml of ethyl acetate and 20 ml of water. The organic layer was washed with saturated saline, aqueous sodium bicarbonate and brine, dried (MgSO ..) and evaporated to an oil from which some methyl pseudomonate A crystallized.
The remaining oil was chromatographed twice on silica (20 g and then 15 g, type 60), eluting with a gradient of 0 to 4% methanol / chloroform. Fractions containing practically pure methyl pseudomonate C (Rf 0.46, silica thin-layer chromatography, chloroform / methanol 9: 1, methyl pseudomonat A, Rf 0, 42) were combined and on 4 g of silica (type 60) using a gradient chromatographed from 0 to 3% methanol / chloroform (distilled from phosphorus pentoxide). The fractions containing pure methyl pseudomonate C (by thin layer chromatography) were pooled and evaporated to an oil (50 mg) which turned out to be methyl pseudomonate C.
Thin layer chromatography in chloroform / methanol (9: 1) showed a component at Rf = 0.46 and a single peak by high pressure liquid chromatography, vmax (chia): 3400, 2900, 2850, 1720, 1710, 1650, 1150 and 980 cm-1;
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m / e (relative intensity): 499 (100%, M + +1 by C.I.).
Example 3: Pseudomonic acid C from methyl pseudomonate C.
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230 mg of methyl pseudomonate C from Example 2 were dissolved in 25 ml of dimethylformamide and diluted with 120 ml of Q.05M phosphate buffer and then stirred overnight with 6 g of Baker's yeast. The mixture was filtered, evaporated to dryness and the residue dissolved in 50 ml of ethyl acetate and 50 ml of water. The organic layer was washed with water and the combined aqueous layers acidified to pH 3 with 5M HCl and extracted several times with ethyl acetate. After drying, the combined extracts were evaporated to an oil.
Chromatography on 8 g of silica gel H (Type 60) while eluting with a gradient of 0 to 6% methanol / chloroform gave 150 mg (67%) of pseudomonic acid C, which was identical to the material obtained in Example 1 by chromatography and spectroscopy.
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: Potassium carbonate and 21 ml methyl iodide stirred at room temperature. The reaction mixture was filtered and the filtrate evaporated to dryness, then taken up in ethyl acetate / water and worked up as in Example 2 to give methyl pseudomonate C.
The methyl ester can be hydrolyzed as in Example 3.
Example 5: Sodium Pseudomonat C (Sodium 10,11 Deoxypseudomonat A)
A solution of 0.330 g of methyl pseudomonate C in 20 ml of distilled tetrahydrofuran and 20 ml of 10N sodium hydroxide solution was stirred at room temperature for 2 hours. The tetrahydrofuran was removed in vacuo to give a cloudy aqueous solution which was washed with ether-ethyl acetate to remove unreacted esters. The aqueous layer was saturated with sodium chloride, covered with ethyl acetate and acidified to pH 1.5 with dilute hydrochloric acid. The ethyl acetate layer was separated, washed with brine, dried (MgSO4) and evaporated to dryness. The pseudomonic acid C obtained was suspended in water / tetrahydrofuran and 10N sodium hydroxide solution was added to a pH of 7.5.
The aqueous solution obtained was evaporated to dryness in vacuo. The residue was dissolved in 5 ml of dry methanol and filtered, and excess dry ether was added to the filtrate with stirring. The white precipitate of sodium pseudomonate C obtained was collected and dried in vacuo; Yield 0.153 g. The compound was homogeneous by thin layer chromatography and high pressure liquid chromatography;
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Example 6: Sodium Pseudomat C
1 g of methyl pseudomonate C was dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran and 50 ml of water and the
PH adjusted to 12 and held for 2 1/2 hours. The solution was adjusted to pH 7, evaporated to dryness and then redissolved in 30 ml of water and washed with ethyl acetate.
The aqueous fraction was acidified to pH 2 and extracted with ethyl acetate. After drying (MgSO 4) the combined extracts were evaporated in vacuo.
The oil obtained (0.55 g) was treated with 95 mg (1 equivalent) of sodium bicarbonate in 20 ml of water / 20 ml of methanol and evaporated to dryness. The sodium salt was dissolved in ethanol (minimum) and added dropwise to 300 ml of ether and the precipitate was filtered off (0.58 g, 57%);
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smal (C3'-C8 '), 20.3 (C14), 19.4 (C15), 16.6 (C17).
Calculated for C26H43O8Na.H2O: C 59, 5, H 8, 6, Na 4, 4% found: C 59, 4, H 8, 4, Na 4, 9%.
Biological data
1. Antibacterial effectiveness - human organisms
Table I shows the antibacterial spectrum of sodium pseudomonat C and methyl pseudomonat C, expressed as the minimum inhibitory concentration (pg / ml), measured by serial dilution in nutrient agar containing 5% horse blood with chocolate added.
Table I
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<tb>
<tb> organism <SEP> minimum <SEP> inhibitory concentration <SEP> (µg / ml)
<tb> sodium pseudo- <SEP> methyl pseudomonate <SEP> C <SEP> month <SEP> C <SEP>
<tb> E. <SEP> coli <SEP> NCTC <SEP> 10418 <SEP>> 100 <SEP>> 100 <SEP>
<tb> E. <SEP> coli <SEP> ESS <SEP> 1.0 <SEP> 2.5
<tb> P. <SEP> mirabilis <SEP> 889 <SEP>> 100 <SEP>> 100 <SEP>
<tb> K.
<SEP> aerogenic <SEP> A <SEP>> 100 <SEP>> 100
<tb> Ps <SEP> aeruginosa <SEP> NCTC <SEP> 10701 <SEP>> 100 <SEP>> 100
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 1633 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Haemophilus <SEP> infl <SEP> uenzae <SEP> Ql <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> <0, <SEP> 2
<tb> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> Wy <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0.5
<tb> Neisseria <SEP> flavescens <SEP> 6633 <SEP> 0.2 <SEP> 0.5
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> <0, <SEP> 2
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 9755 <SEP>> 100 <SEP>> 100 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP>> 100 <SEP>> 100 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> Oxford <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> <0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Staph.
<SEP> aureus <SEP> Russell <SEP> 0.2 <SEP> 0.5
<tb>
<Desc / Clms Page number 8>
Table I (continued)
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<tb>
<tb> organism <SEP> minimal <SEP> inhibitory concentration <SEP> (pg / ml)
<tb> Sodium pseudo-methyl pseudomonate <SEP> C <SEP> month <SEP> C <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 1517 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> I <SEP> 100 <SEP>> 100
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> A <SEP> 64/848 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> B <SEP> 2788 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> C <SEP> 2761 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Strep. <SEP> pneumoniae <SEP> CN33 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
2nd
Antimycoplasma activity
Methyl pseudomonate C has good antimycoplasma activity in vitro against mycoplasma from human and veterinary sources, as shown in Table II.
Method:
The minimal inhibitory concentrations (MIC) of methyl pseudomonate C were determined in microtiter plates by a modification of the metabolic inhibition test (Taylor-Robinson, 1967).
The compounds were serially diluted in sterile deionized water in order to obtain a concentration range from 250 to 0.5 pg / ml. Mycoplasma broth containing 1% (mass / vol.) Glucose and 0.005% (mass / vol.) Phenol red was added in a starch to compensate for its dilution by the aqueous medicinal solution. Approximately 104 colony forming units of Mycoplasma were added to each concentration of the drug. Medicinally infected, uninfected and pH control holes were placed in each plate. The plates were sealed with a cellophane tape and incubated at 370C for 7 days. The minimum inhibitory concentration was the lowest concentration of the compound that prevented color change in the mycoplasma broth caused by metabolism.
Reference: Taylor-Robinson, 1967. Mycoplasmas of varios hosts and their antibiotic sensitivities; Post Office. Degree. Med. J., Suppl. (Maroh), 100.
Table II
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<tb>
<tb> Mycoplasma <SEP> MIC <SEP> (pg / ml) <SEP>
<tb> M. <SEP> gallisepticum <SEP> S. <SEP> 6 <SEP> 62.5
<tb> M. <SEP> synoviae <SEP> 25204 <SEP> <0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> M. <SEP> Pulmonis <SEP> JB <SEP> <0, <SEP> 5
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> Läber <SEP> <0.5
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> 427a <SEP> 1.0
<tb> M. <SEP> fermentans <SEP> MW <SEP> KL4 <SEP> <0, <SEP> 5
<tb>
Table III shows MIC values for sodium pseudomonat C and methyl pseudomonat C against other mycoplasma species, determined in a Friis broth using the microtiter method.
<Desc / Clms Page number 9>
Table III
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<tb>
<tb> organism <SEP> MIC <SEP> (µg / ml) <SEP>
<tb> methyl pseudo <SEP> sodium pseudo <SEP>
<tb> month <SEP> C <SEP> month <SEP> C <SEP>
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> Str. <SEP> 11 <SEP>> 10 <SEP>> 10
<tb> M. <SEP> suipneumoniae <SEP> J2206 / 183b <SEP>> 10 <SEP> 10
<tb> M. <SEP> dispar <SEP> H225 <SEP> 10 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP>
<tb> M. <SEP> dispar <SEP> NCTC <SEP> 10125 <SEP> 50 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> 427a <SEP>> 10 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> M. <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 15492 <SEP> 10 <SEP> - <SEP>
<tb> M. <SEP> fermentans <SEP> MWKL4 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP> <0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> M. <SEP> pulmonis <SEP> JB <SEP> 0, <SEP> 312 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP>
<tb>