<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure unter Verwendung von Enzymzubereitungen, u. zw. von solchen aus Deacylaseenzymen, welche die Amidbindung in Penicillinen spalten.
Ziel der Erfindung ist somit die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure unter Anwendung von wasserunlöslichen Enzymzubereitungen, die aus einem Reaktionsmedium zur Wiederverwendung gewonnen werden können und eine zweckmässige Form zum Lagern und Transportieren des Enzyms darstellen. Auch wenn 6-Aminopenicillansäure unter Anwendung der Zubereitungen hergestellt wird, ist sie reiner als bei Verwendung von wasserlöslicher Penicillindeacylase, da Spuren des Enzyms selbst im Produkt gewöhnlich nicht vorhanden sind.
Weiterhin kann die Enzymzubereitung für die enzymatische Trennung bestimmter N-Acyl-Dl-Aminosäuren verwendet werden.
Die erfindungsgemäss eingesetzten wasserunlöslichen Enzymzubereitungen weisen ein Deacylaseenzym, das bekanntlich die Amidbindung in Penicillinen spaltet, mittels eines wasserlöslichen Dialdehyds an ein im nachstehenden definiertes wasserunlösliches Absorptionsmittel gebunden, auf.
Vorzugsweise wird das Deacylaseenzym aus Bakterien, wie Stämmen von Escherichia coli, wenn es zum Spalten von Benzylpenicillin in 6-Aminopenicillansäure verwendet wird, oder beispielsweise aus Pilzen und Actinomyceten, wenn es zum Spalten von Phenoxymethylpenicillin verwendet wird, erhalten.
Vorzugsweise ist der wasserlösliche Dialdehyd Glyoxal oder Glutaraldehyd.
Das wasserunlösliche Absorptionsmittel ist vorzugsweise ein fein zerteiltes Polymermaterial, da dann die Enzymzubereitung besser wirksam ist. Das wasserunlösliche Absorptionsmittel muss derartige Eigenschaften aufweisen, dass mindestens 25 g der Endenzymzubereitung, wenn sie in eine 30, 4 X 2, 43 cm Säule gepackt ist, 5 ml/h einer 0, 5% G/V wässerigen DL-Phenylacetamid-p-hydroxyphenylglycin-Lösung mit einer Wirksamkeit von mindestens 90% nach mindestens 12 h bei 370C lösen. Weiterhin müssen mindestens 50 g der Enzymzubereitung in einem gerührten Reaktor mindestens 70% des Kaliumbenzylpenicillins in 100 ml einer 1% G/V wässerigen Lösung bei einem PH-Wert von 7, 8 nach 6 h bei 370C in 6-Aminopenicillansäure umwandeln.
Geeignete Absorptionsmittel sind Zellulosepulver und verschiedene Zellulosederivate, Ionenaustauscherharze, Silikagel, kolloidales Siliziumoxyd und Polymermaterialien.
Ein besonders geeignetes Polymermaterial ist Nylon, vorzugsweise in fein zerteilter Form. Eine bevorzugte
EMI1.1
500 Grammäquivalente/l06 g. Das Nylon kann teilweise hydrolysiert sein, beispielsweise mit verdünnter Mineralsäure, um die Anzahl an freien Aminogruppen zur Bindung an das Enzym durch den Dialdehyd zu erhöhen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der 6-Aminopenicillansäure besteht darin, dass Benzylpenicillin oder ein Salz hievon in wässeriger Lösung mit einer wasserunlöslichen Enzymzubereitung, hergestellt durch Inberührungbringen eines wasserunlöslichen Absorptionsmittels, in feinzerteilter Form, wie ein Zellulosepulver oder Zellulosederivat, ein Ionenaustauscherharz, Silikagel, kolloidales Siliziumoxyd oder ein Polymermaterial, vorzugsweise Nylon, mit einer Penicillindeacylase, vorzugsweise ein Deacylaseenzym aus Bakterien, insbesondere Escherichia coli, und mit einem wasserlöslichen Dialdehyd, wie Glutaraldehyd oder Glyoxal, in wässeriger Lösung, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 5 bis 9, behandelt wird.
Das wasserabsorbierende Material kann zuerst mit der Deacylase oder mit dem Dialdehyd oder mit beiden gleichzeitig in Berührung gebracht werden.
Wenn das Absorptionsmittel zuerst mit dem Enzym in wässeriger Lösung in Berührung gebracht wird, ist für eine gute Absorption eine Verweilzeit von 12 bis 24 h erwünscht. Dann wird das Produkt gewöhnlich während 1 bis 24 h bei 0 bis 300C mit dem Dialdehyd in Berührung gebracht. Wenn das Absorptionsmittel zuerst mit dem Dialdehyd und dann mit dem Enzym oder mit beiden gleichzeitig in Berührung gebracht wird, ist ähnlich eine verlängerte Berührungszeit erwünscht. Das feste Produkt kann mit Wasser zur Entfernung von nicht gebundenem Protein und nicht reagiertem Glutaraldehyd gewaschen werden.
Wenn der Träger keine chemischen Gruppen aufweist, die imstande sind, mit dem Dialdehyd zu reagieren, werden die absorbierten Enzymmoleküle miteinander durch den Dialdehyd vernetzt. Wenn der Träger Gruppen enthält, die mit dem Dialdehyd reagieren können, tritt zusätzlich zur Vernetzung der Enzymmoleküle miteinander durch den Dialdehyd eine mehrfache Vernetzung der Enzymmoleküle mit dem Träger auf.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass sie jedoch hierauf beschränkt sein soll.
Beispiel l : al) Eine teilweise gereinigte Zubereitung von Penicillindeacylase wurde hergestellt, indem das Enzym aus den Zellen eines Penicillindeacylase erzeugenden Stammes von Escherichia coli NC 1B 8743 auf mechanische Weise in einem Homogenisator freigesetzt, zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu 40% niger Sättigung behandelt, der Niederschlag verworfen, weiteres Ammoniumsulfat bis zu 75%iger Sättigung zugesetzt, der Niederschlag gesammelt und in Wasser gelöst, dann gegen Wasser dialysiert und schliesslich gefriergetrocknet wurde.
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
<Desc/Clms Page number 3>
Glutaraldehyd wurde bis 5% (G/V) zugesetzt und die Mischung 30 min lang gerührt. 2, 5 g teilweise gereinigte Penicillinacylase wurden dann zugesetzt und die Mischung 2 h lang gerührt. Das feste Produkt wurde dann durch Filtrieren isoliert und durch das in Beispiel 2a beschriebene Verfahren gewaschen. b) 20 g des behandelten Enzyms wurden verwendet, um 100 ml einer 2% G/V Kaliumbenzylpenicillinlösung in 2 h bei PH 7, 8 und 370C enzymatisch zu deacylieren. In zwei aufeinanderfolgenden Versuchen wurden 95% des Substrats in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.
Beispiel 7 : a) Das in Beispiel 5a beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei Aminoäthylzellulose als Träger an Stelle von Diäthylaminoäthylzellulose verwendet wurde. b) 20 g der Zubereitung wurden verwendet, um 100 ml einer 1% G/V Kaliumbenzylpenicillinlösung in 2 h
EMI3.1
Substrats in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.
Beispiel 8 : a) 2 g Nylon (Teilchengrösse 53 bis 75,Lt ; 472 Grammäquivalente NH2 Gruppen/106 g) wurden mit 200 ml Enzymlösung (hergestellt durch Lösen von 240 mg Enzym, hergestellt wie in Beispiel la, beschrieben, in
EMI3.2
lang gerührt. Der Feststoff wurde durch Zentrifugieren gesammelt und gut mit Wasser gewaschen.
Die Wirksamkeit der festen Enzymzubereitung bei Verwendung von Phenylacetamid als Substrat betrug 13, 950 Mol/h/g. b) 4 g feste Enzymzubereitung, hergestellt wie oben beschrieben, wurden verwendet, um 750 ml 15 mM Lösung von Benzylpenicillin in 0, 05 M Natriumphosphatpuffer bei PH 8 und 370C zu trennen. Nach 17 min hatten sich 70% des Substrats in 6-Aminopenicillansäure, nach 25 min 90% und nach 33 min 95% umgewandelt.
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to a process for the preparation of 6-aminopenicillanic acid using enzyme preparations, u. between those from deacylase enzymes which cleave the amide bond in penicillins.
The aim of the invention is thus the production of 6-aminopenicillanic acid using water-insoluble enzyme preparations which can be obtained from a reaction medium for reuse and which represent an expedient form for storing and transporting the enzyme. Even if 6-aminopenicillanic acid is produced using the preparations, it is more pure than if water-soluble penicillin deacylase is used, since traces of the enzyme itself are usually not present in the product.
Furthermore, the enzyme preparation can be used for the enzymatic separation of certain N-acyl-Dl-amino acids.
The water-insoluble enzyme preparations used according to the invention have a deacylase enzyme, which is known to cleave the amide bond in penicillins, bound to a water-insoluble absorbent as defined below by means of a water-soluble dialdehyde.
Preferably, the deacylase enzyme is obtained from bacteria such as strains of Escherichia coli when it is used to break down benzylpenicillin into 6-aminopenicillanic acid or, for example, from fungi and actinomycetes when it is used to break down phenoxymethylpenicillin.
Preferably the water soluble dialdehyde is glyoxal or glutaraldehyde.
The water-insoluble absorbent is preferably a finely divided polymer material because the enzyme preparation is more effective. The water-insoluble absorbent must have properties such that at least 25 g of the end enzyme preparation, when packed in a 30.4 X 2.4.3 cm column, 5 ml / h of a 0.5% w / v aqueous DL-phenylacetamide-p- Dissolve hydroxyphenylglycine solution with an effectiveness of at least 90% after at least 12 hours at 370C. Furthermore, at least 50 g of the enzyme preparation in a stirred reactor must convert at least 70% of the potassium benzylpenicillin in 100 ml of a 1% w / v aqueous solution at a pH of 7.8 after 6 hours at 370C in 6-aminopenicillanic acid.
Suitable absorbents are cellulose powder and various cellulose derivatives, ion exchange resins, silica gel, colloidal silicon oxide and polymer materials.
A particularly suitable polymer material is nylon, preferably in finely divided form. A preferred one
EMI1.1
500 gram equivalents / 106 g. The nylon can be partially hydrolyzed, for example with dilute mineral acid, to increase the number of free amino groups for attachment to the enzyme by the dialdehyde.
The process according to the invention for the production of 6-aminopenicillanic acid consists in that benzylpenicillin or a salt thereof in aqueous solution with a water-insoluble enzyme preparation, produced by contacting a water-insoluble absorbent, in finely divided form, such as a cellulose powder or cellulose derivative, an ion exchange resin, silica gel, colloidal silica, colloidal silica gel, an ion exchange resin, silica gel or a polymer material, preferably nylon, is treated with a penicillin deacylase, preferably a deacylase enzyme from bacteria, in particular Escherichia coli, and with a water-soluble dialdehyde, such as glutaraldehyde or glyoxal, in aqueous solution, preferably with a pH of 5 to 9.
The water-absorbing material can be brought into contact first with the deacylase or with the dialdehyde or with both at the same time.
If the absorbent is first contacted with the enzyme in aqueous solution, a residence time of 12 to 24 hours is desirable for good absorption. The product is then brought into contact with the dialdehyde, usually for 1 to 24 hours at 0 to 30 ° C. Similarly, if the absorbent is contacted first with the dialdehyde and then with the enzyme, or both at the same time, an extended contact time is desirable. The solid product can be washed with water to remove unbound protein and unreacted glutaraldehyde.
If the carrier does not have chemical groups capable of reacting with the dialdehyde, the absorbed enzyme molecules will be crosslinked with one another by the dialdehyde. If the carrier contains groups which can react with the dialdehyde, in addition to the crosslinking of the enzyme molecules with one another by the dialdehyde, multiple crosslinking of the enzyme molecules with the carrier occurs.
The following examples are intended to explain the invention in more detail without, however, being restricted thereto.
Example 1: al) A partially purified preparation of penicillin deacylase was produced by releasing the enzyme from the cells of a penicillin deacylase-producing strain of Escherichia coli NC 1B 8743 in a homogenizer in a mechanical manner, centrifuging the supernatant liquid with ammonium sulfate up to 40% niger Treated saturation, the precipitate discarded, added further ammonium sulfate up to 75% saturation, the precipitate was collected and dissolved in water, then dialyzed against water and finally freeze-dried.
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
<Desc / Clms Page number 3>
Glutaraldehyde was added to 5% (w / v) and the mixture stirred for 30 minutes. 2.5 g of partially purified penicillin acylase was then added and the mixture was stirred for 2 hours. The solid product was then isolated by filtration and washed by the procedure described in Example 2a. b) 20 g of the treated enzyme were used to enzymatically deacylate 100 ml of a 2% w / v potassium benzylpenicillin solution in 2 h at pH 7, 8 and 370C. In two consecutive experiments, 95% of the substrate was converted to 6-aminopenicillanic acid.
Example 7: a) The procedure described in Example 5a was repeated, using aminoethyl cellulose as the carrier instead of diethylaminoethyl cellulose. b) 20 g of the preparation were used to make 100 ml of a 1% w / v potassium benzylpenicillin solution in 2 h
EMI3.1
Substrate converted into 6-aminopenicillanic acid.
Example 8: a) 2 g of nylon (particle size 53 to 75, Lt; 472 gram equivalents of NH 2 groups / 106 g) were mixed with 200 ml of enzyme solution (prepared by dissolving 240 mg of enzyme, prepared as described in Example 1a, in
EMI3.2
long stirred. The solid was collected by centrifugation and washed well with water.
The effectiveness of the solid enzyme preparation using phenylacetamide as the substrate was 13.950 mol / h / g. b) 4 g of solid enzyme preparation, prepared as described above, were used to separate 750 ml of 15 mM solution of benzylpenicillin in 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 8 and 370C. After 17 minutes, 70% of the substrate had converted to 6-aminopenicillanic acid, after 25 minutes 90% and after 33 minutes 95%.