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Die übliche hystologisehe Technik gestattet nur die mikroskopische Beobachtung von Organschnitten. Dabei kann man nur ein Augenblicksbild erfassen und auch das nur in einer schwer kontrollierbaren, durch Tod und Präpariermethoden veränderten Form. Funktionsstudien sind nur an lebendem Gewebe möglich. Bisher war eine solche Untersuchung nur dann in einfacher Weise durchführbar, wenn es sich um die spärlich vorhandenen durchscheinenden
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lichen Mikroskops unter Verwendung durchfallenden Lichtes. Alle dickeren Organe konnten nur in auffallendem Licht beobachtet werden. Dieser Beobachtung haften schwere methodisch Fehler an.
Es gelingt nur die oberflächlichsten Schichten des Organs zu erkennen und auch in diesem ist eine feinere Differenzierung nur schwer möglich. Versuche zur Verbesserung der Differenzierungsmöglichkeit durch Einführung von Reflektoren ins Gewebe verbesserten wohl in gewissem Ausmass die Differenzierungsmöglichkeit, beeinflussten aber in erheblichem Masse die Organfunktion, so dass etwaige Verbesserungen in der Sichtbarkeit der Strukturen durch die Organschädigungen voll aufgehoben wurden.
Zu überraschenden Ergebnissen führte die Einführung einer neuen Methode der Fluoreszenzmikroskopie, die zur Untersuchung menschlicher, tierischer und pflanzlicher Organe in Funktion geeignet ist. Der grundlegende Gedanke der hier vorliegenden Erfindung ist der, die zur mikroskopischen Beobachtung notwendige Lichtquelle in das Objekt selbst zu verlegen. Das gelingt dadurch, dass man z. B. dem zu untersuchenden Tier fluoreszierende Stoffe in das Unterhaut4 zellgewebe einführt, die von dort durch das Blut aufgenommen in den verschiedensten Organen abgelagert werden. Die zu diesem Zweck eingeführten Fluoreszenzstoffe sind zweckmässig so beschaffen, dass sie, wie z.
B. das Fluoreszein. sich lediglich mit den basischen oder, wie das Trypaflavin, mit den sauren Zellbestandteilen verbinden und so eine Differenzierung der Zellstruktur erkennen lassen. Sie müssen ferner ungiftig sein, um die Funktion der Organe nicht zu schädigen. Benutzt man znr Erregung der Fluoreszenz sichtbares Licht. so ergibt sich eine Störung der Beobachtung dadurch, dass ein Teil dieses auf das Ob. jek-t auffilleiiden Lichtes zerstreut reflektiert vom Objekt ins Auge gelangt und so durch Üherstrahlung des Bildes des Objekts die Beobachtung fast unmöglich macht.
Diesen Fehler vermeidet man, wenn man zur Erregung der Fluoreszenz unsichtbares, ultraviolettes Licht, benutzt und etwaige reflektierende Anteile dieses Lichtes durch ein Filter abfängt, das das erregte Fluorf'szenzlicht fast ungehindert durchlässt, die kurzwelligen erregenden Strahlen aber absorbiert.
Da die Organe bei der Beobachtung mit Trockensystemen zur Austrocknung gelangen würden und die austrocknende Oberfläche des Orgaus die Bestrahlung unmöglich machen würde, ist es zweckmässig, die Oberfläche sowie das Objektiv, das sich durch die Feuchtigkeit des Organs sonst beschlagen würde, dauernd nit einer physiologischen Nährlösung z. B. Ringerseher Lösung, zu berieseln. Man sieht daher zweckmässig von der Verwendung von Trockensystemen ab. benutzt auch für schwache Vergrösserungen. Immersionssysteme, die eine dauernde Berieselung ermöglichen, und ordnet eine Berieselungsvorrichtung an. die die Flüssigkeit dauernd der Frontlinse zuführt. Man kann z.
B. einen Flüssigkeitshehälter mit regelbarem
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durch eine Röhre zuführt. Die Objektive müssen dann für die zugleich als Immersionsfüssigkcit wirkende Spülflüssigkeit korrigiert werden. Der Objekttisch ist zweckmässig mit einer Abfluss- vorrichtung zu versehen und in drei aufeinander senkrechten Richtungen verschiebbar zu machen, um das Objekt bequem an das Objektiv heranzuführen.
In der Zeichnung ist eine Längsansicht eines Beispiels der Erfindung. seilweise im
Schnitt. wiedergegeben.
A stellt eine als Lichtquelle verwandte Bogenlampe dar. deren Licht durch die sammeln. den Linsen B' und B" durchläuft. Die Linsen B und B sind in einer Liehtschutzvorrichtung C angebracht, innerhalb deren noch eine mit Kupfersulfat gefüllte Kühlküvette E und eine Iris- blende F angeordnet sind. Am Ende der Lichtschutzvorrichtung sitzt ein Filterhalter G. Mit
Hilfe zweier zueinander senkrecht stehender Zahn-und Triebbewegungen J) ist die Lichtschutz- vorrichtung der Höhe und der Seite nach einstellbar. In dem Filterhalter G ist ein Filter a' befestigt, das nur ultraviolettes Licht durchlässt. Die Lichtschutzvorrichtung ist auf einem Grund. brett I befestigt, auf dem auch ein Mikroskopstativ H steht.
Das Licht wird mit Hilfe eines total reflektierenden. Prismas J durch das Mikroslopobjeltiv K in das Objekt L geworfen und erregt hier das Fluoreszenzlicht. Das aus den Fluoreszenzlichtstrahlen durch das Objektiv K erzeugte Bild wird durch das Okular J. 1 dem Auge N des Beobachters sichtbar oder wird in ein registrierendes Instrument (eine photographische Kamera. eine lichtelektrische Vorrichtung) geleitet. Zwischen das Objektiv K und das Ocular if ist ein Filter 0 geschaltet. das alles ultraviolette Licht zurückhält, für sichtbares Licht aber gut durchlässig ist. Der Objekttisch P ist in drei zueinander senkrechten Richtungen verschiebbar und trägt eine Platte Q mit auf- gebogenem Rand und einem Ablaufröhrchen Q.
Die Immersionsflüssigkeit befindet sich in einem Flüssigkeitsbehälter T und wird durch eine Rohrleitung S an das Objektiv herangeführt. Eine Nut R an der Fassung des Objektivs führt die Immersionsflüssigkeit an die Frontlinse heran. Der Ausfluss der Flüssigkeit aus dem Behälter kann geregelt und in seiner Geschwindigkeit beobachtet werden.
PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung lebender Objekte in Funktion in auffallendem erregendem Licht, dadurch gekennzeichnet, dass diese Objekte durch Einführung fluoreszierender Stoffe, wie beispielsweise Fluoreszein oder Trypaflavin zur Fluoreszenzerregung geeignet gemacht werden.
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The usual hystological technique only allows microscopic observation of organ sections. One can only capture a momentary image and that only in a form that is difficult to control and changed by death and dissection methods. Functional studies are only possible on living tissue. Up to now, such an examination could only be carried out in a simple manner if it concerned the sparsely available translucent ones
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normal microscope using transmitted light. All the thicker organs could only be observed in incident light. Serious methodological errors are attached to this observation.
It is only possible to recognize the most superficial layers of the organ and even in this a finer differentiation is difficult. Attempts to improve the differentiation possibilities by introducing reflectors into the tissue improved the differentiation possibilities to a certain extent, but influenced the organ function to a considerable extent, so that any improvements in the visibility of the structures due to the organ damage were completely canceled out.
The introduction of a new method of fluorescence microscopy, which is suitable for examining human, animal and plant organs in function, led to surprising results. The basic idea of the present invention is to relocate the light source necessary for microscopic observation into the object itself. This is achieved by z. B. the animal to be examined introduces fluorescent substances into the subcutaneous cell tissue, which from there are absorbed by the blood and deposited in various organs. The fluorescent substances introduced for this purpose are expediently designed so that they, such as.
B. fluorescein. only combine with the basic or, like trypaflavin, with the acidic cell components and thus reveal a differentiation of the cell structure. They also have to be non-toxic so as not to damage the function of the organs. Visible light is used to excite the fluorescence. thus a disturbance of the observation results from the fact that part of this is due to the ob jek-t auffilleiiden light scattered reflected from the object enters the eye and thus makes observation almost impossible by over-radiation of the image of the object.
This error can be avoided if one uses invisible, ultraviolet light to excite the fluorescence and intercepts any reflective components of this light by a filter that allows the excited fluorescent light to pass through almost unhindered, but absorbs the short-wave exciting rays.
Since the organs would become dehydrated when observing with dry systems and the drying surface of the organ would make irradiation impossible, it is advisable to keep the surface and the lens, which would otherwise be fogged up by the moisture of the organ, permanently covered with a physiological nutrient solution z. B. Ringerseher solution to sprinkle. It is therefore advisable not to use dry systems. also used for weak enlargements. Immersion systems that allow continuous sprinkling and arranges a sprinkler device. which continuously supplies the liquid to the front lens. You can z.
B. a liquid container with adjustable
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feeds through a tube. The objectives must then be corrected for the rinsing liquid, which also acts as an immersion liquid. It is advisable to provide the specimen table with a drainage device and to make it displaceable in three mutually perpendicular directions in order to comfortably bring the specimen to the objective.
In the drawing is a longitudinal view of an example of the invention. by ropes in
Cut. reproduced.
A represents an arc lamp that is used as a light source. Its light collects through the. Lenses B 'and B ″. Lenses B and B are mounted in a light protection device C, inside which a cooling cuvette E filled with copper sulfate and an iris diaphragm F are arranged. At the end of the light protection device there is a filter holder G. With
The height and side of the light protection device can be adjusted with the aid of two mutually perpendicular tooth and drive movements J). In the filter holder G, a filter a 'is attached, which only allows ultraviolet light to pass through. The light protection device is on a ground. Board I attached, on which a microscope stand H is also located.
The light is made using a totally reflective. Prism J thrown through the microscope objective K into the object L and excites the fluorescent light here. The image generated from the fluorescent light rays through the objective K is visible to the observer's eye N through the eyepiece J. 1 or is passed into a recording instrument (a photographic camera, a photoelectric device). A filter 0 is connected between the lens K and the ocular if. that holds back all ultraviolet light, but is well permeable to visible light. The object table P can be displaced in three mutually perpendicular directions and carries a plate Q with a curved edge and a drainage tube Q.
The immersion liquid is located in a liquid container T and is brought to the objective through a pipe S. A groove R on the mount of the lens guides the immersion liquid to the front lens. The outflow of the liquid from the container can be regulated and its speed observed.
PATENT CLAIMS:
1. A method for the microscopic examination of living objects in function in incident exciting light, characterized in that these objects are made suitable for fluorescence excitation by introducing fluorescent substances such as fluorescein or trypaflavin.