AR033697A1 - Alteracion de la expresion de genes con adnss producido in vivo - Google Patents

Abstract

Un método para alterar la expresión de una secuencia de ácido nucleico objetivo en una célula objetivo mediante la producción de ADNc de una sola cadena (ADNc-ss) en la célula objetivo in vivo. La célula objetivo es transfectada con un cartucho que comprende una secuencia de interés, una repetición invertida en tándem, un sitio de ligadura de cebador 3' a la repetición invertida en tándem. La transcripción del cartucho por la célula objetivo produce una plantilla de ARN que es transcrita en forma inversa para producir ADNc-ss de una secuencia especificada. Un gen que codifica transcriptasa inversa /RNAsa H puede también ser transfectado a la célula objetivo. El ADNc-ss es modificado para remover todas las secuencias de vector de flanco aprovechando la estructura de ''tallo-espira'' del ADNc-ss, que se forma como resultado de la repetición invertida en tándem que permite al ADNc-ss plegarse sobre si mismo, formando un tallo de ADN de doble cadena. EL tallo de doble cadena contiene uno o mas sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción y la espira, que permanece como ADNss, comprende la secuencia de interés, que puede ser cualquier secuencia de nucleótidos deseada. Este diseno permite cortar el tallo de doble cadena del intermediario de tallo-espira por la(s) endonucleasa(s) de restricción correspondiente (s) deseada (s) y la porción de espira, o secuencia de interés, es entonces liberada como un pedazo de una sola cadena, linealizado de ADN. Este pedazo de ADNss liberado (o cortado) contiene información mínima, si acaso, de secuencia, ya sea corriente arriba 5' o corriente abajo 3' del tallo de doble cadena. El ADNss resultante se liga a una secuencia de ácido nucleico objetivo, endógena, para alterar la expresión de esa secuencia para fines terapéuticos tales como inactivación de genes usando ligadura dúplex o triplex de ácidos nucleicos, mutagénesis dirigida en sitio, interrupción de función celular por ligadura a proteínas celulares específicas, e interferencia con funciones de empalme de ARN