WO2018062073A1 - 培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法 - Google Patents

培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018062073A1
WO2018062073A1 PCT/JP2017/034458 JP2017034458W WO2018062073A1 WO 2018062073 A1 WO2018062073 A1 WO 2018062073A1 JP 2017034458 W JP2017034458 W JP 2017034458W WO 2018062073 A1 WO2018062073 A1 WO 2018062073A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hollow fiber
fiber membrane
cultured
platelets
module
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/034458
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
張本乾一
坂口博一
ハッタコウタ
棚橋一裕
Original Assignee
東レ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東レ株式会社 filed Critical 東レ株式会社
Priority to CN201780059492.3A priority Critical patent/CN109803748A/zh
Priority to EP17856026.4A priority patent/EP3520883B1/en
Priority to JP2017550776A priority patent/JP7139604B2/ja
Priority to US16/338,065 priority patent/US11155785B2/en
Publication of WO2018062073A1 publication Critical patent/WO2018062073A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3496—Plasmapheresis; Leucopheresis; Lymphopheresis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/02—Hollow fibre modules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/08—Hollow fibre membranes
    • B01D69/081—Hollow fibre membranes characterised by the fibre diameter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/66—Polymers having sulfur in the main chain, with or without nitrogen, oxygen or carbon only
    • B01D71/68—Polysulfones; Polyethersulfones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/14—Pressure control
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2313/00—Details relating to membrane modules or apparatus
    • B01D2313/10—Specific supply elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2313/00—Details relating to membrane modules or apparatus
    • B01D2313/24—Specific pressurizing or depressurizing means
    • B01D2313/243—Pumps
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
    • B01D2325/20—Specific permeability or cut-off range
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/18—Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/38—Polyalkenylalcohols; Polyalkenylesters; Polyalkenylethers; Polyalkenylaldehydes; Polyalkenylketones; Polyalkenylacetals; Polyalkenylketals
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/58—Other polymers having nitrogen in the main chain, with or without oxygen or carbon only
    • B01D71/62—Polycondensates having nitrogen-containing heterocyclic rings in the main chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/16—Hollow fibers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a cultured platelet concentration module and a method for producing a platelet preparation using the same.
  • Non-patent Document 1 a culture method for producing platelets from hematopoietic stem cells derived from bone marrow and umbilical cord blood
  • Non-patent Document 2 a culture method for producing platelets from pluripotent stem cells
  • cultured platelets refers to platelets produced by a production process including an in vitro culture process.
  • centrifugal methods are mainly used to concentrate platelets derived from whole blood.
  • the processing time becomes longer. Since the function of platelets easily deteriorates due to the centrifugal load, it cannot be applied practically.
  • Patent Documents 1 and 2 Conventionly, a method using a hollow fiber membrane module has been used for separation of red blood cells and plasma (Patent Documents 1 and 2).
  • a porous membrane of a polysulfone resin Patent Document 3 which is less likely to be clogged and soiled, and a stock solution composed of a polysulfone polymer and a hydrophilic polymer is spun for durability.
  • An improved technique such as a film (Patent Document 4) with improved resistance has also been developed.
  • a technique for purifying plasma components from blood donation-derived platelet suspension has also been developed (Patent Document 5).
  • the hollow fiber membrane can easily adjust the number and length of the hollow fiber membranes accommodated in the module in accordance with the amount of liquid to be processed, it can cope with a large amount of processing.
  • cultured platelets are exposed to a culture environment unsuitable for storage of platelets for a long time, and are more likely to deteriorate than donated platelets that are manufactured in a short time after blood collection and stored in an appropriate environment. Therefore, when the culture solution is removed using the hollow fiber membrane, the cultured platelets are broken and the function is deteriorated.
  • An object of the present invention is to provide a hollow fiber membrane module capable of efficiently removing water from a cultured platelet suspension containing cultured platelets and concentrating them while suppressing functional deterioration of the cultured platelets. .
  • the present invention provides a casing in which a hollow fiber membrane having an average pore diameter of 2 ⁇ m or less on the surface has at least one inlet for supplying cultured platelet suspension before concentration into the hollow fiber membrane.
  • a value (X / Y1) obtained by dividing the total cross-sectional area (X) of the plurality of hollow fiber membranes by the total cross-sectional area (Y1) of the inflow port is 4
  • a platelet preparation module comprising a cultured platelet concentration module of 0.0 or less, and a step of concentrating cultured platelets using the module.
  • the liquid can be removed from the cultured platelet suspension without degrading the cultured platelets, and the cultured platelet suspension can be efficiently concentrated while maintaining high quality.
  • the hollow fiber membrane filled in the cultured platelet concentration module of the present invention has a size of human platelets of 3 to 4 ⁇ m.
  • the average pore diameter (hereinafter sometimes simply referred to as “average pore diameter”) is 2 ⁇ m or less.
  • the “surface” of the hollow fiber membrane refers to the “outer surface” that is the outer surface of the hollow fiber membrane formed in a straw shape, and the “inner surface” that is the inner surface of the straw-like hollow fiber membrane. Both of them shall be indicated.
  • the average pore size is larger than that of human platelets, platelets enter into the pores of the hollow fiber membrane, resulting in clogging, not only reducing water removal efficiency, but also reducing platelets passing through the module, The recovery rate is significantly reduced.
  • the above average pore diameter is equal to that of human platelets, platelets block pores existing on the inner surface of the hollow fiber membrane, so that not only the water removal efficiency is lowered but also the blockage is tried to be removed. This can lead to platelet degradation. If the average pore diameter is 2 ⁇ m or less, although a cake layer is laminated on the surface of the hollow fiber membrane and the water removal efficiency is lowered, such a cake layer can often be removed without deteriorating platelets.
  • the cultured platelet concentration module of the present invention is formed by filling a plurality of such hollow fiber membranes in a casing.
  • the casing has at least one inlet for supplying the liquid to the inside of the hollow fiber membrane and one outlet for allowing the liquid to flow out from the inside of the hollow fiber membrane.
  • a value (X / Y1) obtained by dividing the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane by the total cross-sectional area (Y1) of the inflow port is set to 4.0 or less.
  • a value (X / Y2) obtained by dividing the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane by the total cross-sectional area (Y2) of the outlet is 4.0 or less.
  • the hollow fiber membrane module shown in FIG. 1 has a cylindrical casing 51 and headers 52 and 53 connected and fixed to both ends of the casing 51.
  • the top of the header 52 has a hollow fiber membrane before concentration into the hollow fiber membrane.
  • An inflow port 41 for supplying the cultured platelet suspension liquid is projected and formed at the top of the header 53, and an outlet for discharging the concentrated cultured platelet suspension liquid that has passed through the inside of the hollow fiber membrane. 42 protrudes.
  • a discharge port 43 is formed in the side portion of the casing 51 for discharging waste liquid that has passed through the hole on the surface of the hollow fiber membrane from the inside of the hollow fiber membrane and has exuded to the outside of the hollow fiber membrane.
  • the plurality of hollow fiber membranes are arranged in a bundle over the entire length in the long axis direction in the cylindrical casing 51. Both ends of the hollow fiber membrane are fixed to the inner peripheral surface of the casing 51 by a partition wall on the header 52 side and a partition wall on the header 53 side formed by a hardened potting agent so that the lumen of the hollow fiber membrane is not blocked.
  • the number of the hollow fiber membranes held in the module is preferably 400 or more, more preferably 1000 or more because the platelet suspension for concentrating is several tens to several hundreds of liters as described above. More preferably, it is 2500 or more, more preferably 4000 or more.
  • the cross-sectional area of the hollow fiber membrane is the area of the inner circle when the straw-like hollow fiber membrane is cut into circles, and is calculated by the following equation.
  • the inner diameter of the hollow fiber membrane was determined by measuring the film thickness of 16 hollow fiber membranes randomly selected in the module with a 1000 ⁇ lens (for example, VH-Z100; KEYENCE Inc.) of a microwatcher.
  • the hollow fiber membrane outer diameter means an average value obtained by measuring the outer diameters of 16 randomly selected hollow fiber membranes with a laser displacement meter (for example, LS5040T; KEYENCE Inc.).
  • Hollow fiber membrane inner diameter hollow fiber membrane outer diameter ⁇ 2 ⁇ average value of film thickness
  • the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane appears in a cross section obtained by cutting the module in a direction perpendicular to the fiber axis direction of the hollow fiber membrane. It is the sum total of the cross-sectional areas of a plurality of hollow fiber membranes.
  • the cross-sectional area of the inflow port and the cross-sectional area of the outflow port are cross-sectional areas obtained by cutting the narrowest part of the inflow port or the outflow port perpendicularly to the flow direction.
  • the inflow port or the outflow port is a cylinder
  • the total cross-sectional area (Y1) of the inlet or the total cross-sectional area (Y2) of the outlet is the cross-sectional area of the inlet when there is one inlet or outlet, and each inlet or This is the sum of the cross-sectional areas at the exit.
  • the value (X / Y1) obtained by dividing the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane by the total cross-sectional area (Y1) of the inlet is preferably 4.0 or less, more preferably 2.0 or less, Most preferred is 0.8 or more and 1.2 or less.
  • the value (X / Y2) obtained by dividing the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane by the total cross-sectional area (Y2) of the outlet is preferably 4.0 or less, more preferably 2.0 or less. Preferably, 0.8 or more and 1.2 or less are the most preferable.
  • the total membrane area of the hollow fiber membranes contained in the module is 0.1 m 2 or more 1 m 2 or less.
  • the total membrane area (Z) of the hollow fiber membrane is the area of the inner surface of the hollow fiber membrane, and is determined by the following formula.
  • Inner surface area of hollow fiber membrane ⁇ ⁇ hollow fiber membrane inner diameter ⁇ effective length
  • the effective length is the total length of the hollow fiber membrane filled in the hollow fiber membrane module, excluding the portion where the potting material is attached.
  • the length of the portion that is, the length of the portion that can actually function for platelet concentration.
  • the total membrane area (Z) of the hollow fiber membrane is the sum of the inner surface areas of the hollow fiber membranes filled in the module. When the hollow fiber membrane is uniform, it is calculated by the following formula.
  • the total membrane area of the hollow fiber membrane the inner surface area of the hollow fiber membrane ⁇ the number When the number of platelets to be processed increases with respect to the total membrane area (Z) of the hollow fiber membrane, the cake layer deposited on the membrane surface becomes thicker and the platelets It is easy to deteriorate.
  • the total membrane area (Z) of the hollow fiber membrane filled in the module is preferably 0.1 m 2 or more.
  • the total membrane area of the hollow fiber membrane is preferably 1.0 m 2 or less in order to prevent the cake layer from being widely laminated on the membrane surface and reducing the platelet recovery rate.
  • the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane is relative to the linear velocity of the liquid passing through the inside of the hollow fiber membrane (the linear velocity passing through the membrane cavity), and the total membrane area (Z) of the hollow fiber membrane is The following equation affects the linear velocity at which the liquid passes from the inside to the outside (linear velocity through the membrane surface).
  • Intramembrane passage linear velocity Inflow flow rate / Hollow fiber membrane total cross-sectional area (X)
  • Membrane surface linear velocity discharge flow rate / hollow fiber membrane total membrane area (Z)
  • the platelets that are collected are relatively platelets with relatively degraded functions. End up. If the inflow flow rate is increased or the hollow fiber membrane total cross-sectional area (X) is decreased in order to increase the intra-membrane passage linear velocity, the pressure change increases and the platelets are likely to deteriorate. Therefore, the total cross-sectional area of the hollow fiber membrane is preferably 2 cm 2 or more and 10 cm 2 or less, and more preferably 2 cm 2 or more and 5 cm 2 or less.
  • the membrane surface linear velocity increases relative to the intramembrane passage linear velocity
  • platelets are easily laminated on the surface of the hollow fiber membrane to form a cake layer, and the function of the module deteriorates and is collected through the module.
  • the number of platelets that can be produced tends to decrease.
  • the cake layer is mainly formed on the hollow fiber membrane surface by normal platelets, that is, annexin-negative platelets, the platelets collected are relatively deteriorated in function, ie, annexin-positive platelets. End up.
  • the inflow rate and the outflow rate can be increased or decreased to adjust the intramembrane passage linear velocity and the membrane surface passage linear velocity, but in that case, it becomes difficult to achieve a sufficient concentration rate.
  • the value (X / Z) obtained by dividing the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane by the total membrane area (Z) of the hollow fiber membrane is preferably 0.0005 or less, and is 0.0004 or less. Is more preferable.
  • the hollow fiber membrane used in the cultured platelet concentration module of the present invention preferably has a water permeability of 30 mL / hr / Pa / m 2 or more.
  • the water permeability of the hollow fiber membrane is less than 30 mL / hr / Pa / m 2 , the water removal efficiency may be reduced, or platelet activation may easily occur.
  • the hollow fiber membrane used in the cultured platelet concentration module of the present invention is preferably a polysulfone-based hollow fiber membrane.
  • the “polysulfone-based hollow fiber membrane” refers to a hollow fiber membrane formed by using a polysulfone-based polymer as a main raw material (a raw material occupying 50% by mass or more of all raw materials).
  • the “polysulfone-based polymer” refers to a polymer having an aromatic ring, a sulfonyl group, and an ether group in the main chain.
  • polysulfone-based polymer examples include polysulfone represented by the following general formula (I), polysulfone represented by the following general formula (II), polyether sulfone, or polyallyl ether sulfone.
  • the polysulfone shown or the polysulfone shown by the general formula (II) is preferable, and those having an n number of 50 to 80 are more preferable.
  • block copolymers of polysulfone or the like represented by the general formula (I) with other monomers and modified products such as polysulfone represented by the general formula (I) are also included in the “polysulfone-based polymer”.
  • the structure derived from “another monomer” in the block copolymer of the polysulfone or the like represented by the general formula (I) and another monomer is preferably 10% by mass or less based on the entire block copolymer.
  • polysulfone for example, Udel (registered trademark) polysulfone P-1700, P-3500 (manufactured by Solvay), Ultrason S3010, S6010 (BASF), Radel A (Solvay), Ultrason E ( BASF).
  • the hollow fiber membrane used in the cultured platelet concentration module of the present invention preferably has a hydrophilic polymer supported on the inner surface.
  • the hydrophilic component is supported on the inner surface of the hollow fiber membrane is not limited to the case where the hydrophilic polymer is covalently bonded to the inner surface of the hollow fiber membrane, but in some form the inner surface of the hollow fiber membrane. The state that is fixed to.
  • the hydrophilic polymer is a water-soluble polymer compound or a polymer that interacts with water molecules by electrostatic interaction or hydrogen bonding even if it is water-insoluble.
  • the hydrophilic polymer include methacrylic acid, acrylic acid, itaconic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxypropyl acrylate, glycerol methacrylate, polyethylene glycol methacrylate, N , N′-dimethylacrylamide, N-methylacrylamide, dimethylaminoethyl methacrylate, methylene bisacrylamide, diacetone acrylamide, vinyl pyrrolidone, vinyl alcohol, ethylene glycol or propylene glycol as a monomer or at least one of these compounds As a monomer, and polyvinylpyrrolidone (a polymer of vinylpyrrolidone ( VP), a copolymer of vinylpyrrolidone and vinyl a
  • the abundance of the hydrophilic polymer on the inner surface of the hollow fiber membrane is preferably 30 to 60%.
  • the abundance of the hydrophilic polymer on the inner surface of the hollow fiber membrane is determined by measuring the value of the hydrophobic polymer-specific atoms obtained by measuring the inner surface of the hollow fiber membrane by X-ray photoelectron analysis (XPS) and increasing the hydrophilicity. It can be determined from the measured values of molecule-specific atoms.
  • XPS X-ray photoelectron analysis
  • the abundance of the hydrophilic polymer is the content (R VP ) (% by mass) of vinyl pyrrolidone units on the inner surface of the hollow fiber membrane.
  • R VP content of vinyl pyrrolidone units on the inner surface of the hollow fiber membrane.
  • 111 is the molecular weight of the vinylpyrrolidone unit
  • 442 is the molecular weight of the repeating unit constituting the polysulfone.
  • RVP ( RN * 111) / ( RN * 111 + RS * 442) * 100
  • the hydrophilic polymer is a vinylpyrrolidone-vinyl acetate copolymer
  • it can be determined as follows. The molecular weight of the vinylpyrrolidone unit is 111, the molecular weight of the repeating unit constituting the polysulfone is 442, and the molecular weight of the vinyl acetate unit is 86.
  • the content (R VA ) (mass%) of vinyl acetate units on the surface is the amount of nitrogen (R N ) (number of atoms%), the amount of sulfur (R S ) (number of atoms%), the amount of carbon derived from ester groups (R Coo ) (number of atoms%) is calculated from the following equation.
  • Content of vinyl acetate on the surface of the hollow fiber membrane (R VA ) (mass%) (R Coo ⁇ 86) / (R N ⁇ 111 + R S ⁇ 442 + R Coo ⁇ 86) ⁇ 100
  • the content rate ( RVP ) (mass%) of the vinyl pyrrolidone unit on the surface of a hollow fiber membrane is computed from the following formula.
  • R VP (R N ⁇ 111) / (R N ⁇ 111 + R S ⁇ 442 + R Coo ⁇ 86) ⁇ 100
  • the abundance of the vinylpyrrolidone-vinyl acetate copolymer on the inner surface of the hollow fiber membrane can be calculated as the sum of the vinylpyrrolidone content (R VP ) and the vinyl acetate content (R VA ).
  • Abundance of hydrophilic group-containing polymer on the inner surface of the hollow fiber membrane R VP + R VA If the abundance of the hydrophilic polymer on the inner surface of the hollow fiber membrane is 30% by mass or more, the platelets attached to the inner surface of the hollow fiber membrane can be easily peeled off.
  • the abundance of the hydrophilic polymer on the inner surface of the hollow fiber membrane is more preferably 35% by mass.
  • the hydrophilic polymer is excessively present, so that swelling occurs on the inner surface of the hollow fiber membrane, and the filtration resistance is reduced. It can be prevented from becoming large.
  • Examples of the method of supporting the hydrophilic component on the inner surface of the hollow fiber membrane include, for example, a method of coating by physical adsorption, a method of cross-linking the hollow polymer membrane and the hollow fiber membrane with a hydrophilic polymer by heat or radiation, and Examples include a method of forming a chemical bond between the hydrophilic polymer and the hollow fiber membrane by a chemical reaction.
  • the injection solution is flowed inward when discharging the membrane-forming stock solution from the double annular die.
  • a hydrophilic polymer is added to the injection solution, the hollow fiber membrane is phase-separated.
  • the hydrophilic polymer in the injection solution diffuses to the membrane forming stock solution side, so that the hydrophilic polymer can be efficiently attached to the inner surface of the hollow fiber membrane.
  • the cultured platelet concentration module of the present invention preferably has an annexin positivity rate of 20% or less due to passage of the cultured platelet suspension before concentration (liquid before treatment) through the module.
  • Annexin positivity means that phosphatidylserine appears on the cell surface of cultured platelets contained in the cultured platelet suspension while it passes through the module and becomes detected by the annexin after passing through the module.
  • the difference in the annexin positive rate before and after passing through the module is the annexin positive rate.
  • Platelet suspensions with a high annexin positive rate have been reported to promote thrombus formation and shorten circulation time when transfused, and cannot be used directly in drug product production.
  • the annexin positivity rate of the module is more preferably 5% or less, and further preferably 2% or less.
  • the cultured platelet concentration module of the present invention preferably has a pressure loss of 10 kPa or less when liquid is supplied from the inlet to the outlet at a flow rate of 2 L / min.
  • the module pressure loss is a pressure difference measured at the inlet and outlet of the module, and can be measured as follows.
  • a circuit branched perpendicularly to the flow direction is provided immediately before the inlet of the module and immediately after the outlet, and a pressure gauge is installed at the end of the circuit.
  • the pre-treatment liquid is caused to flow through the module at a flow rate of 2 L / min, the pressure on the inlet side and the pressure on the outlet side are measured, and the pressure loss is obtained from the following equation.
  • Pressure loss pressure on the inlet side ⁇ pressure loss of the pressure module on the outlet side is more preferably 5 kPa or less.
  • a concentrated platelet suspension is produced by flowing a culture solution containing cultured platelets from the inlet of the cultured platelet concentration module of the present invention and performing a cross flow for discharging the liquid from the outlet on the outside of the hollow fiber membrane.
  • the concentration rate can be determined by the flow rate of the pre-treatment liquid supplied to the module and the flow rate of the waste liquid discharged from the module.
  • the supply flow rate liquid and the discharge flow rate are preferably 1 L / min and 800 ml / min, respectively, and more preferably 500 mL / min and 400 mL / min.
  • the platelet preparation can be produced by replacing the liquid component of the concentrated cultured platelet suspension with a preservation solution by centrifugation or the like.
  • a hollow fiber membrane was inserted into a plastic tube, and both ends of the hollow fiber membrane were bonded and fixed to the inner walls of both ends of the plastic tube to produce a module having an effective length of 10 cm.
  • a water pressure of 1.3 ⁇ 10 4 Pa was applied from the outside of the hollow fiber membrane, the amount of water per unit time flowing out to the inside of the hollow fiber membrane was measured, and calculated from the following formula.
  • the measured value R coo of the ester group was measured as follows.
  • the amount of carbon derived from the ester group was determined by dividing the peak derived from the ester group (COO) from the main peak derived from C1s CH or C—C at +4.0 to 4.2 eV. By calculating the ratio of the peak area with respect to all elements, the carbon amount (number of atoms%) derived from the ester group can be obtained.
  • C O-derived component and COO-derived component. Therefore, peak splitting is performed with five components.
  • the COO-derived component is a peak appearing at +4.0 to 4.2 eV from the main peak of CHx or C—C (around 285 eV).
  • the peak area ratio of each component was calculated by rounding off the first decimal place. It calculated
  • the amount of the hydrophilic polymer on the inner surface of the hollow fiber membrane was calculated from the measured value obtained from XPS by the above formula.
  • a phosphate buffer solution (PBS) is put into the supply bag 11, and bubbles are not generated from the outlet 42 by the roller pump 21 at a flow rate of 2 L / min.
  • the solution was fed and priming was performed. Thereafter, the pressure loss of the module was calculated from the numerical values indicated by the pressure gauges 31 and 32.
  • sample A a sample mixed with anti-CD42a antibody, anti-CD42b antibody, anti-CD62P antibody and PAC-1
  • sample B a sample mixed with anti-CD42a antibody, anti-CD42b antibody, anti-CD62P antibody and PAC-1
  • sample B a sample mixed with anti-CD42a antibody, anti-CD42b antibody, anti-CD62P antibody and PAC-1
  • sample B a sample mixed with anti-CD42a antibody, anti-CD42b antibody, anti-CD62P antibody and PAC-1
  • the gated platelet fraction was developed with a fluorescent label of PAC-1 and a fluorescent label of anti-CD62P, and positive gates were set as close as possible to 100% and 0% of negative and positive, respectively.
  • sample B was measured instead of sample A, and the ratio of platelets measured in the positive gates of both PAC-1 and anti-CD62P antibody was defined as the PAC-1 response rate.
  • Annexin positive rate was measured using a flow cytometer (for example, FACSVerse; BD Biosciences) as follows. First, the platelet suspension before flowing into the module is sampled and used as a measurement sample (before treatment). Next, the platelet suspension is introduced from the inlet of the module by a roller pump or the like at 2 L / min to pass through the module, and the platelet suspension flowing out of the outlet is sampled and used as a measurement specimen (after treatment).
  • a flow cytometer for example, FACSVerse; BD Biosciences
  • sample A Samples (hereinafter referred to as sample A) mixed with anti-CD41a antibody (BD Pharmingen, 555467) and anti-CD42b antibody (BD Pharmingen, 555473), and Sample A, Annexin V (BD Horizon, 560506) and Annexin buffer ( BD Pharmingen, 556454) is prepared (hereinafter referred to as sample B). If the sample is thick, it may be diluted with the Annexin buffer at an appropriate dilution rate. In the measurement of the flow cytometer, first, using the sample A, in addition to the gate based on the scattered light pattern with the flow cytometer, the CD41a and CD42b fluorescent labels were used, and the co-positive region was used as the platelet gate.
  • the total number of platelets can be calculated by the following formula from the number measured in the platelet gate.
  • Total number of platelets (pieces) measured value in platelet gate (pieces) ⁇ measurement volume (L) x dilution rate x platelet suspension volume (L)
  • the gated platelet fraction is developed with Annexin V fluorescent label, and a positive gate is set at the boundary where negative and positive are 100% and 0%. With this setting fixed, sample B was measured instead of sample A, and the ratio of platelets measured in the positive gate was defined as the annexin positive rate of each specimen.
  • the end of the collection bag 12 was sealed and separated from the circuit. After mixing by inversion several times, the treated solution was sampled from the collection bag 12, and the platelet count, annexin positive rate and PAC-1 reaction rate were measured as measurement samples (treated solution).
  • the annexin positivity rate was determined by subtracting the annexin positivity rate of the measurement specimen (pretreatment liquid) from the annexin positivity ratio of the measurement specimen (treatment liquid).
  • the ratio of the total platelet count after concentration when the total platelet count before concentration was 100% was calculated as the platelet recovery rate.
  • Example 1 It consists of 15 parts by weight of Udel® polysulfone (P3500; Solvay), 8 parts by weight of polyvinylpyrrolidone (PVP) (K90; ISP), 75 parts by weight of dimethylacetamide (DMAC) and 2 parts by weight of water. After the mixture was mixed and dissolved at 90 ° C., it was kept at 50 ° C. as a film forming stock solution. Further, a core solution was prepared by adding 30 parts by mass of PVP (K30; ISP) to a mixed solution composed of 80 parts by mass of DMAC and 20 parts by mass of water and mixing and dissolving them.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • DMAC dimethylacetamide
  • a film-forming stock solution was discharged from the outer cylinder and a core liquid was simultaneously discharged from the inner cylinder, and the length was set to 30 ° C.
  • a dry part having a thickness of 70 mm After passing through a dry part having a thickness of 70 mm, it is immersed in a 90 ° C. coagulation bath containing a mixed solution of 85 parts by mass of water and 15 parts by mass of DMAC, and further washed with warm water in an 80 ° C. hot water bath. Then, it was wound up on a cassette frame to obtain a wet hollow fiber membrane.
  • the film forming speed was 40 mm / min
  • the inner diameter of the hollow fiber membrane was 300 ⁇ m
  • the film thickness of the hollow fiber membrane was 80 ⁇ m.
  • the wet hollow fiber membrane thus obtained was cut into 0.4 m lengths and subdivided, immersed in a 90 ° C. warm water bath for 50 minutes and washed with warm water, and then subjected to a drying treatment at 100 ° C. for 10 hours, Furthermore, PVP was crosslinked by heating at 170 ° C. for 5 hours with a dry heat dryer to obtain a hollow fiber membrane.
  • the average pore diameter, water permeability, and abundance of hydrophilic polymer (PVP) on the inner surface of the obtained hollow fiber membrane were calculated according to the measurement examples described above.
  • a hollow fiber membrane module was produced from the obtained hollow fiber membrane as follows. First, 5243 hollow fiber membranes obtained as described above were inserted into a cylindrical casing having an inner diameter of 44 mm and a length of 220 mm, and the ends were immersed in a 60% aqueous glycerin solution at 40 ° C. Dry for 3 days. Subsequently, the end was sealed with a potting agent made of polyurethane resin, and then the potting agent was cut along a direction parallel to the cross section of the case so that both sides of the hollow fiber membrane opened toward the outside. Headers with one port (inlet and outlet) having a cross-sectional area of 2 were attached to both sides. Hot water (3.5 L) at 80 ° C.
  • VA64 vinylpyrrolidone-vinyl acetate copolymer
  • Example 2 It carried out to the process of normal temperature water washing
  • Example 3 A module was produced in the same manner as in Example 1 except that the case length of the module case was cut and changed to a half length (effective length 101.5 mm).
  • Example 3 the annexin positivity rate shown in Table 1 is 19%, which is a poor result. However, this is an apparent result that occurs because the ratio of the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane to the total area of the hollow fiber membrane (Z) exceeds 0.0004, and the recovery rate of platelets is reduced. .
  • the total cross-sectional area (X) of the hollow fiber membrane is relative to the linear velocity of the liquid passing through the inside of the hollow fiber membrane (the linear velocity passing through the membrane cavity), and the total membrane area (Z) of the hollow fiber membrane is This has an influence on the linear velocity (membrane surface linear velocity) through which the liquid passes from the inside to the outside.
  • the membrane surface passage linear velocity is larger than the intramembrane passage linear velocity, a cake layer in which platelets are laminated on the hollow fiber membrane surface is easily formed.
  • the cake layer is formed by annexin-negative normal platelets, and thus the collected platelets are relatively more annexin-positive platelets, and the annexin-positive rate is apparently increased.
  • the number of annexin positive platelets in the evaluation of Example 3 was 3.4 ⁇ 10 9 before passing through the module and 2.8 ⁇ 10 9 after passing through the module, which was slightly reduced by concentration. Even if annexin-positive platelets are mixed with normal platelets and remain in the hollow fiber membrane, the number is considered to be small. From this result, the concentration using the module of Example 3 is also considered. It can be seen that the absolute number of annexin positive platelets has hardly increased.
  • Example 1 A module was produced in the same manner as in Example 1 except that the header of the module case was changed to a luer lock type having one port (inlet and outlet) having a cross-sectional area of 0.8 cm 2 . .
  • Comparative Example 2 A module was produced in the same manner as in Comparative Example 1 except that the case length of the module case was cut and changed to a half length (effective length 101.5 mm).
  • a film-forming stock solution was discharged from the outer cylinder and a core liquid was simultaneously discharged from the inner cylinder, and the length was set to 30 ° C.
  • a dry part having a thickness of 100 mm After passing through a dry part having a thickness of 100 mm, it is immersed in a coagulation bath at 90 ° C. containing a mixed solution of 90 parts of water and 10 parts of dimethyl sulfoxide, and further solidified by washing in a warm bath at 80 ° C. From 75% by weight, an aqueous glycerin solution was applied and wound around a cassette frame to obtain a hollow fiber membrane.
  • the film forming speed was 50 m / min
  • the inner diameter of the hollow fiber membrane was 300 ⁇ m
  • the film thickness of the hollow fiber membrane was 90 ⁇ m.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Abstract

本発明は、培養血小板の機能劣化を抑制しながら、培養血小板を含有する培養血小板浮遊液から効率的に除水し、濃縮することを可能とする中空糸膜モジュールを提供することを目的とする。本発明は、表面に存在する孔の平均孔径が２μｍ以下の中空糸膜が、中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板懸濁液を供給するための流入口を少なくとも一つ有するケーシングに複数本充填されてなる培養血小板濃縮モジュールであって、複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下である培養血小板濃縮モジュールである。

Description

培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法
　本発明は、培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法に関する。
　輸血に用いられる血小板製剤は現在すべて献血により採取された血液成分から製造されている。しかし、高齢社会到来によるドナー不足の懸念から献血に依存しない培養血小板の製剤製造に関する研究開発が進められている。培養血小板を得る方法として、例えば骨髄や臍帯血由来の造血幹細胞から血小板を産生する培養法（非特許文献１）や多能性幹細胞から血小板を産生する培養法がある（非特許文献２）。いずれの手法でも、一回の輸血に必要な血小板個数が約二千億個と莫大であるため、数十リットルから数百リットル規模での培養が必須である。それに対して一回の輸血に投与する輸液量は数百ミリリットルであるため、培養血小板製剤の製造には培養血小板の濃縮工程が必須となる。なお、本明細書において「培養血小板」とは、生体外での培養工程を含む製造工程により作製された血小板を指す。
　現在、全血由来の血小板の濃縮には、主に遠心法も用いられているが、培養血小板を濃縮する場合のように大量の液体を処理する必要がある際には、処理時間が長くなり、遠心の負荷により血小板の機能が劣化しやすくなるため、事実上適用することができない。
　一方、従来から、赤血球と血漿との分離には、中空糸膜モジュールを用いる方法が用いられてきた（特許文献１及び２）。このような方法に適用する中空糸膜としては、目詰まり汚れが生じにくいポリスルホン系樹脂の多孔質膜（特許文献３）やポリスルホン系ポリマーおよび親水性高分子からなる原液を紡糸することで耐久性を向上させた膜（特許文献４）といった改良技術も開発されている。さらに、献血由来の血小板浮遊液から血漿成分を浄化する技術も開発されている（特許文献５）。
日本国特開昭６２－２９０４６９号公報 日本国特開昭５４－１５４７６号公報 日本国特開昭６１－２３８８３４号公報 日本国特開２０００－３３４２７７号公報 日本国特開２０１２－１４３５５４号公報
ＢＬＯＯＤ，　１　ＪＵＮＥ　１９９３　　ＶＯＬ．　８１，　Ｎｏ．　１１　ｐ２８４４－２８５３ ＢＬＯＯＤ，　１　ＪＵＮＥ　２００８　　ＶＯＬ．　１１１，　Ｎｏ．　１１　ｐ５２９８－５３０６
　そこで、培養血小板の濃縮工程において、中空糸膜を用いて培養液を除液して濃縮する方法が考えられる。中空糸膜は、処理する液体の量に応じて、モジュール内に収容する中空糸膜の数や長さを容易に調整することができるため、大量処理への対応が可能となる。
　しかし、培養血小板は、血小板の保存に適さない培養環境に長時間さらされており、採血後短時間で製造され適切な環境で保存される献血血小板よりも劣化しやすい。そのため、中空糸膜を用いて培養液を除液する際に培養血小板が壊れて機能が劣化することが問題となっている。
　本発明は、培養血小板の機能劣化を抑制しながら、培養血小板を含有する培養血小板浮遊液から効率的に除水し、濃縮することを可能とする中空糸膜モジュールを提供することを課題とする。
　すなわち、本発明は、表面に存在する孔の平均孔径が２μｍ以下の中空糸膜が、中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板懸濁液を供給するための流入口を少なくとも一つ有するケーシングに複数本充填されてなる培養血小板濃縮モジュールであって、複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下である培養血小板濃縮モジュール、および当該モジュールを用いて培養血小板を濃縮する工程を含む血小板製剤の製造方法である。
　本発明により、培養血小板を劣化させることなく、培養血小板浮遊液から液体を除去することができ、高い品質を維持しながら効率よく培養血小板浮遊液を濃縮することが可能となる。
本発明の培養血小板濃縮モジュールを用いた濃縮装置の模式図である。
　以下、本発明の培養血小板濃縮モジュールについて説明する。一部、図面を参照して本発明の実施形態を説明する場合があるが、本発明は図示された実施態様に限定されるものではない。
　本発明の培養血小板濃縮モジュール（以下、単に「モジュール」という場合がある。）に充填される中空糸膜は、ヒト血小板の大きさが３～４μｍであることから、その表面に存在する孔の平均孔径（以下、単に「平均孔径」という場合がある）を２μｍ以下とする。ここで、中空糸膜の「表面」とは、ストロー状に成形された中空糸膜の外側の表面である「外表面」、およびストロー状の中空糸膜の内側の表面である「内表面」の双方を指すものとする。ヒト血小板に比べて上記の平均孔径が大きい場合には、血小板が中空糸膜の孔内部へ侵入し目詰まりが生じて、除水効率が低下するばかりか、モジュールを通過する血小板が減少し、回収率が著しく低下してしまう。また、上記の平均孔径がヒト血小板と同等の場合には、血小板が中空糸膜の内表面に存在する孔を閉塞することから、やはり除水効率が低下するばかりか、閉塞を除去しようとすれば血小板の劣化につながりかねない。平均孔径が２μｍ以下であれば、中空糸膜の表面にケーク層が積層し除水効率が低下するものの、このようなケーク層は血小板を劣化することなく除去できる場合が多い。
　本発明の培養血小板濃縮モジュールは、このような中空糸膜がケーシングに複数本充填されてなる。ケーシングは、中空糸膜の内側へ液を供給するための流入口と、前記中空糸膜の内側から液を流出させるための流出口を少なくとも一つずつ有する。そして、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下となるようにする。好ましくは、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流出口の総断面積（Ｙ２）で除した値（Ｘ／Ｙ２）も４．０以下となるようにする。
　図１に示す中空糸膜モジュールは、筒状のケーシング５１と、ケーシング５１の両端に接続固定されたヘッダー５２及び５３とを有し、ヘッダー５２の頂部には、中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板浮遊液を供給するための流入口４１が突出して形成されており、ヘッダー５３の頂部には、中空糸膜の内部を通過した濃縮後の培養血小板浮遊液を流出させるための流出口４２が突出して形成されている。さらに、ケーシング５１の側部には、中空糸膜の内部から中空糸膜表面の孔を通過して中空糸膜の外部に滲出した廃液を排出するための排出口４３が形成されている。
　複数本の中空糸膜は、筒状のケーシング５１内の長軸方向の全長にわたって束状に配置されている。中空糸膜の両端部は、中空糸膜の内腔が閉塞されないようにして、硬化したポッティング剤によって形成されたヘッダー５２側の隔壁及びヘッダー５３側の隔壁により、ケーシング５１の内周面に固定されている。特に限定されないが、モジュール内に保持される中空糸膜は、前述の通り濃縮するための血小板浮遊液が数十リットル～数百リットルに上るため、４００本以上であることが好ましく、１０００本以上であることがより好ましく、２５００本以上であることがさらに好ましく、４０００本以上であることが一層好ましい。
　中空糸膜の断面積とは、ストロー状の中空糸膜を輪切りにした際の内円の面積であり、下記の式により算出される。
中空糸膜断面積＝π（中空糸膜内径／２）２　（π＝円周率）
　ここで、中空糸膜内径は、モジュール内でランダムに選別した１６本の中空糸膜の膜厚をマイクロウォッチャーの１０００倍レンズ（例えば、ＶＨ－Ｚ１００；株式会社ＫＥＹＥＮＣＥ）で測定して平均値を求め、以下の式より算出した値をいう。なお、中空糸膜外径とは、ランダムに選別した１６本の中空糸膜の外径をレーザー変位計（例えば、ＬＳ５０４０Ｔ；株式会社ＫＥＹＥＮＣＥ）で測定して求めた平均値をいう。
中空糸膜内径＝中空糸膜外径－２×膜厚の平均値
　中空糸膜の総断面積（Ｘ）とは、モジュールを中空糸膜の繊維軸方向と垂直な方向で切断した断面に表れる複数本の中空糸膜の断面積の総和である。
　流入口の断面積、流出口の断面積とは、流入口または流出口の最狭窄部分を流れ方向に対して垂直に切断した断面の面積であり、例えば流入口または流出口が円筒であれば、円筒の内径から算出される円の面積である。流入口の総断面積（Ｙ１）または流出口の総断面積（Ｙ２）とは、流入口または流出口が１つの場合はその流入口の断面積であり、複数の場合は各流入口または流出口の断面積の総和である。
　培養血小板は献血血小板よりも圧力変化に弱く、中空糸膜の総断面積と流入口または流出口の総断面積の差が大きいと、工程中の圧力変化が大きくなり劣化しやすい。そのため、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）は４．０以下が好ましく、２．０以下であることがより好ましく、０．８以上１．２以下が最も好ましい。また同様に、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流出口の総断面積（Ｙ２）で除した値（Ｘ／Ｙ２）は４．０以下が好ましく、２．０以下であることがより好ましく、０．８以上１．２以下が最も好ましい。
　また、本発明のモジュールにおいては、モジュールに含まれる中空糸膜の総膜面積が０．１ｍ２以上１ｍ２以下であることが好ましい。
　中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は、中空糸膜の内側の表面の面積であり、下記式で求められる。
中空糸膜の内表面面積＝π×中空糸膜内径×有効長
ここで、有効長とは、中空糸膜モジュールに充填された中空糸膜の全長からポッティング材が付着している部分を除いた部分の長さ、すなわち実際に血小板の濃縮に機能し得る部分の長さである。中空糸膜の総膜面積（Ｚ）とは、モジュールに充填された中空糸膜の内表面面積の総和であり、中空糸膜が均一である場合には、下記式によって算出される。
中空糸膜の総膜面積＝中空糸膜の内表面面積×本数
　中空糸膜の総膜面積（Ｚ）に対して処理する血小板数が増えると、膜表面へ堆積するケーク層が厚くなり、血小板を劣化させやすい。モジュールに充填する中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は０．１ｍ２以上であることが好ましい。一方、ケーク層が膜表面に広く積層して血小板の回収率が低減することを防ぐため、中空糸膜の総膜面積は１．０ｍ２以下であることが好ましい。
　中空糸膜の総断面積（Ｘ）は、中空糸膜内側を通過する液の線速度（膜腔内通過線速度）に対し、また中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は中空糸膜の内側から外側に液が通過する線速度（膜面通過線速度）に対し、以下の式のように影響している。
膜腔内通過線速度＝流入流量÷中空糸膜総断面積（Ｘ）
膜面通過線速度＝排出流量÷中空糸膜総膜面積（Ｚ）
　膜腔内通過線速度が小さい場合には血小板が中空糸膜表面に積層したケーク層が形成しやすくなり、モジュールの機能が劣化する傾向がある。ケーク層を形成した分モジュールを通過して回収できる血小板数が減少し、さらにケーク層を形成するのは正常な血小板であるため、回収される血小板は相対的に機能が劣化した血小板が多くなってしまう。膜腔内通過線速度を大きくするために流入流量を増やすもしくは中空糸膜総断面積（Ｘ）を小さくすると圧力変化が大きくなり血小板が劣化しやすい。そのため中空糸膜の総断面積が２ｃｍ２以上１０ｃｍ２以下であることが好ましく、２ｃｍ２以上５ｃｍ２以下であることがより好ましい。
　膜面通過線速度が膜腔内通過線速度に対して大きくなると、血小板が中空糸膜表面に積層してケーク層を形成しやすくなり、モジュールの機能が劣化するとともに、モジュールを通過して回収できる血小板数が減少する傾向がある。さらに、中空糸膜表面にケーク層を形成するのは主として正常な血小板、すなわちアネキシン陰性の血小板であるため、回収される血小板は相対的に機能が劣化した血小板、すなわちアネキシン陽性の血小板が多くなってしまう。膜腔内通過線速度と膜面通過線速度を調整するのに流入流量と排出流量を増減させることもできるが、その場合十分な濃縮率を達成しにくくなってしまう。そのため、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を中空糸膜の総膜面積（Ｚ）で除した値（Ｘ／Ｚ）が０．０００５以下であることが好ましく、０．０００４以下であることがより好ましい。
　本発明の培養血小板用濃縮モジュールに用いる中空糸膜は、透水性が３０ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２以上であることが好ましい。中空糸膜の透水性が３０ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２未満の場合には、除水効率が低下する場合や、血小板の活性化が起こりやすくなる場合がある。
　本発明の培養血小板用濃縮モジュールに用いる中空糸膜は、ポリスルホン系中空糸膜であることが好ましい。「ポリスルホン系中空糸膜」とは、ポリスルホン系ポリマーを主たる原料（全原料のうち５０質量％以上を占める原料）として製膜した中空糸膜をいう。ここで「ポリスルホン系ポリマー」とは、その主鎖に芳香環、スルフォニル基及びエーテル基を有するポリマーをいう。
　ポリスルホン系ポリマーとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン、下記一般式（ＩＩ）で示されるポリスルホン、ポリエーテルスルホン又はポリアリルエーテルスルホン等が挙げられるが、一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン又は一般式（ＩＩ）で示されるポリスルホンが好ましく、中でもｎ数が５０～８０であるものがより好ましい。なお、一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン等と、他のモノマーとのブロック共重合体や、一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン等の変性体も「ポリスルホン系ポリマー」に包含される。一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン等と、他のモノマーとのブロック共重合体における「他のモノマー」由来の構造は、ブロック共重合体全体に対して１０質量％以下であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　より具体的なポリスルホンとしては、例えば、ユーデル（登録商標）ポリスルホンＰ－１７００、Ｐ－３５００（ソルベイ社製）、ウルトラソンＳ３０１０、Ｓ６０１０（ＢＡＳＦ社）、レーデルＡ（ソルベイ社）、ウルトラソンＥ（ＢＡＳＦ社）が挙げられる。
　本発明の培養血小板用濃縮モジュールに用いる中空糸膜は、内表面に親水性高分子が担持されたものであることが好ましい。中空糸膜の内表面に親水性成分が担持されている、とは、親水性高分子が中空糸膜の内表面に共有結合している場合に限られず、何らかの形で中空糸膜の内表面に固定されている状態を指す。
　親水性高分子とは、水溶性の高分子化合物であるか、又は非水溶性であっても静電相互作用や水素結合により水分子と相互作用する高分子をいう。親水性高分子としては、例えば、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、２－ヒドロキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシプロピルメタクリレート、２－ヒドロキシプロピルアクリレート、グリセロールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタクリレート、メチレンビスアクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、エチレングリコール若しくはプロピレングリコールをモノマーとする単独重合体又はこれら化合物の少なくとも一つをモノマーとして含む共重合体が挙げられるが、ビニルピロリドンの重合体であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体、および酢酸ビニルとビニルカプロラクタムの共重合体が好ましい。
　中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率は、３０～６０％であることが好ましい。中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率は、中空糸膜の内表面をＸ線光電子分析（ＸＰＳ）により測定して得た疎水性高分子特異的原子の測定値と親水性高分子特異的原子の測定値によって求めることができる。
　例えば、疎水性高分子がポリスルホンであり、親水性高分子がポリビニルピロリドンである場合、親水性高分子の存在率は中空糸膜内表面のビニルピロリドン単位の含有率（ＲＶＰ）（質量％）として測定できる。つまり、ビニルピロリドン単位由来の窒素量の測定値（ＲＮ）（原子数％）とポリスルホンのスルホン基由来の硫黄量の測定値（ＲＳ）（原子数％）から、次の式により中空糸膜内表面でのＲＶＰ（質量％）を算出できる。ここで、１１１はビニルピロリドン単位の分子量であり、４４２はポリスルホンを構成する繰り返し単位の分子量である。
ＲＶＰ＝（ＲＮ×１１１）／（ＲＮ×１１１＋ＲＳ×４４２）×１００
　特異的原子がない場合にはＸＰＳにより測定した官能基の測定値からも算出できる。例えば、親水性高分子がビニルピロリドン－酢酸ビニル共重合体である場合は、下記のように求めることができる。ビニルピロリドン単位の分子量は１１１、ポリスルホンを構成する繰り返し単位の分子量は４４２、酢酸ビニル単位の分子量は８６である。表面の酢酸ビニル単位の含有率（ＲＶＡ）（質量％）は、窒素量（ＲＮ）（原子数％）と硫黄量（ＲＳ）（原子数％）、エステル基由来の炭素量（ＲＣｏｏ）（原子数％）の値から、下式より算出される。
中空糸膜表面の酢酸ビニルの含有率（ＲＶＡ）（質量％）
　＝（ＲＣｏｏ×８６）／（ＲＮ×１１１＋ＲＳ×４４２＋ＲＣｏｏ×８６）×１００
また、中空糸膜表面のビニルピロリドン単位の含有率（ＲＶＰ）（質量％）は、下式より算出される。
　ＲＶＰ＝（ＲＮ×１１１）／（ＲＮ×１１１＋ＲＳ×４４２＋ＲＣｏｏ×８６）×１００
　そして、中空糸膜内表面のビニルピロリドン－酢酸ビニル共重合体の存在率は、ビニルピロリドン含有率（ＲＶＰ）と酢酸ビニル含有率（ＲＶＡ）の和として算出できる。
中空糸膜内表面の親水性基含有高分子の存在率（質量％）＝ＲＶＰ＋ＲＶＡ
　中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率が３０質量％以上であれば、中空糸膜の内表面に付着した血小板の剥離が容易になる。中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率は３５質量％がより好ましい。一方、中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率が６０質量％以下であると、親水性高分子が過剰に存在することで中空糸膜の内表面で膨潤が生じ、濾過抵抗が大きくなるのを防止することができる。
　中空糸膜の内表面に親水性成分を担持させる方法としては、例えば、物理的吸着によってコーティングする方法、熱もしくは放射線によって親水性高分子を中空糸膜と中空糸膜とを架橋する方法、および化学反応によって親水性高分子と中空糸膜との間に化学結合を形成させる方法が挙げられる。
　中空糸膜の製膜時には二重環状口金から製膜原液を吐出する際に内側に注入液を流すが、この注入液に親水性高分子を添加しておくと、中空糸膜が相分離して膜構造が決定する前に注入液中の親水性高分子が製膜原液側に拡散するため、効率的に中空糸膜の内表面に親水性高分子を付着させることができる。この方法により中空糸膜の内表面に親水性高分子を付着させた状態で、前述の熱処理、放射線処理、化学反応等を行うことにより、親水性高分子を中空糸膜の内表面に容易に固定することができる。
　本発明の培養血小板用濃縮モジュールは、濃縮前の培養血小板浮遊液（処理前液）のモジュールの通過によるアネキシン陽性化率が２０％以下であることが好ましい。アネキシン陽性化とは、培養血小板浮遊液がモジュールを通過する間に、そこに含まれる培養血小板の細胞表面にホスファチジルセリンが出現し、モジュールの通過後アネキシンによって検出されるようになることを意味し、モジュール通過前後のアネキシン陽性率の差分がアネキシン陽性化率である。アネキシン陽性率が高い血小板浮遊液は、輸血した場合に血栓形成の促進や循環時間の短縮が起こることが報告されており、直接製剤製造に用いることができない。モジュールのアネキシン陽性化率は５％以下であることがより好ましく、２％以下であることがさらに好ましい。
　培養血小板は圧力変化によって劣化するため、本発明の培養血小板濃縮モジュールは、流入口から流出口へ２Ｌ／ｍｉｎの流量で液を供給した場合の圧力損失が１０ｋＰａ以下であることが好ましい。モジュールの圧力損失とは、モジュールの流入口と流出口で測定される圧力差であり、以下のようにして測定することができる。モジュールの流入口の直前と流出口の直後に、流れ方向に対して垂直に分岐させた回路を設け、その先に圧力計を設置する。そして、ローラーポンプ等を使用して流量２Ｌ／ｍｉｎでモジュールに処理前液を流すとともに、流入口側の圧力および流出口側の圧力を測定し、下記式から圧力損失を求める。
圧力損失＝流入口側の圧力－流出口側の圧力
モジュールの圧力損失は、５ｋＰａ以下であることがより好ましい。
　本発明の培養血小板濃縮モジュールの流入口から培養血小板を含む培養液を流入させ、中空糸膜の外側の排出口から液体を排出するクロスフローを行うことで、濃縮された血小板浮遊液を製造することができる。クロスフローにおいては、モジュールへ供給する処理前液の流量とモジュールから排出される廃液の流量によって濃縮率を決定することができる。例えば、培養血小板浮遊液を５倍に濃縮し、血小板回収率を８０％以上にするには、総膜面積が１ｍ２の中空糸膜が収容された濃縮モジュールの場合、供給流量液と排出流量をそれぞれ１Ｌ／ｍｉｎと８００ｍｌ／ｍｉｎにすることが好ましく、５００ｍＬ／ｍｉｎと４００ｍＬ／ｍｉｎにすることがより好ましい。そして、濃縮後の培養血小板浮遊液の液体成分を遠心などによって保存液に置換することで血小板製剤を製造することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　［測定例１：平均孔径］
　「表面に存在する孔の平均孔径」は、以下の方法により測定及び算出した。まず、電界放射型走査型電子顕微鏡（例えば、Ｓ－８００；日立製作所）で中空糸膜の表面の１０００倍画像を撮影した。次に、Ｍａｔｒｏｘ　Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ２．２（Ｍａｔｒｏｘ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｔｄ．）で、孔の部分を白く、それ以外の部分を黒く反転させる画像処理を行い、白い孔の個数（以下、「総開孔数」）及び白い孔の部分のピクセル数の総和（以下、「総開孔面積」）を求め、以下の式１により、画像１枚当たりの平均孔径を算出した。これらの測定作業を中空糸５本につきそれぞれランダムに１０箇所ずつ、計５０回繰り返し、全５０枚の画像についての平均値を「表面に存在する孔の平均孔径」とした。なお、上記の１０００倍画像の撮影条件は以下のとおりであった。
［撮影条件］
　画像サイズ　：　６５５×７４０ピクセル
　画像解像度　：　０．１４０８４５μｍ／ピクセル
　画像面積Ｓ　：　９６１５．２μｍ２（縦９２．３μｍ×横１０４．２μｍ角）
　平均孔径（μｍ）＝総開孔面積／総開孔数　・・・・式１
　［測定例２：透水性］
中空糸膜の透水性は、以下の方法により測定及び算出した。まず、プラスチック管に中空糸膜を挿入し、中空糸膜の両端をプラスチック管両端部の内壁に接着固定して、有効長１０ｃｍのモジュールを作成した。次に、中空糸膜の外側から１．３×１０４Ｐａの水圧をかけ、中空糸膜の内側に流出してくる単位時間当たりの水の量を測定し、下記式より算出した。
透水性（ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２）＝ＱＷ／（Ｔ×Ｐ×Ａ）
　　ＱＷ　：　中空糸膜の内側に流出した水の量（ｍＬ）
　　Ｔ　　：　水圧をかけた時間（ｈｒ）
　　Ｐ　　：　水圧（Ｐａ）
　　Ａ　　：　中空糸膜の外表面の面積（ｍ２）
　［測定例３：親水性高分子の存在率］
　Ｘ線電子分光法（ＸＰＳ）を用いて、ＲＮ、ＲＳ、Ｒｃｏｏをそれぞれ測定した。測定角９０°で測定し、表面からの深さが約１０ｎｍまでの領域が検出された。また、測定値は３箇所の平均値を用いた。
　エステル基の測定値Ｒｃｏｏは下記のように測定した。エステル基由来の炭素量を、エステル基（ＣＯＯ）由来の炭素ピークはＣ１ｓのＣＨやＣ－Ｃ由来のメインピークから＋４．０～４．２ｅＶに現れるピークをピーク分割することによって求めた。全元素に対する該ピーク面積の割合を算出することで、エステル基由来の炭素量（原子数％）が求まる。より具体的には、Ｃ１ｓには、主にＣＨｘ、Ｃ－Ｃ、Ｃ＝Ｃ、Ｃ－Ｓ由来の成分、主にＣ－Ｏ、Ｃ－Ｎ由来の成分、π―π＊サテライト由来の成分、Ｃ＝Ｏ由来の成分、ＣＯＯ由来の成分の５つの成分から構成される。したがって、５つの成分でピーク分割を行う。ＣＯＯ由来の成分は、ＣＨｘやＣ－Ｃのメインピーク（２８５ｅＶ付近）から＋４．０～４．２ｅＶに現れるピークである。この各成分のピーク面積比は、小数点第１桁目を四捨五入し、算出した。Ｃ１ｓの炭素量（原子数％）から、ＣＯＯ由来の成分のピーク面積比を乗ずることで求めた。ピーク分割の結果、０．４％以下となるものは検出限界以下として切り捨てた。
　中空糸膜内表面の親水性ポリマー量は、ＸＰＳから得られた測定値から前述の計算式により算出した。
　［測定例４：圧力損失］
　図１に示すように、流入口４１にローラーポンプ２１と圧力計３１を接続し、ローラーポンプ２１の先には供給バッグ１１を接続した。濾液の排出口４３にローラーポンプ２２を備えた流路を接続し、その先に廃液バッグ１３を接続した。また、流出口４２に、圧力計３２と回収バック１２を接続した。
　次に、中空糸膜モジュール５１の内部の空気を除去するため、供給バッグ１１にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を入れ、ローラーポンプ２１によって２Ｌ／ｍｉｎの流量で流出口４２から気泡が出なくなるまで送液し、プライミングを行った。その後、圧力計３１および３２が示す数値から、モジュールの圧力損失を算出した。
　［測定例５：ＰＡＣ－１反応率］
　測定検体を二つに分け、それぞれ抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４２ｂ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体およびＰＡＣ－１と混合したサンプル（以下サンプルＡ）と、サンプルＡに終濃度０．２μＭとなるようＰＭＡを添加したサンプル（以下サンプルＢ）を用意した。まず、サンプルＡを用いて、フローサイトメーターで散乱光パターンによるゲートに加えて、ＣＤ４１ａとＣＤ４２ｂの蛍光標識を用いて、共陽性領域を血小板のゲートとした。次にゲートされた血小板分画をＰＡＣ－１の蛍光標識と抗ＣＤ６２Ｐの蛍光標識で展開し、陰性と陽性が１００％と０％となるぎりぎりにそれぞれ陽性ゲートを設定した。この設定を固定したまま、サンプルＡの代わりにサンプルＢを測定し、ＰＡＣ－１と抗ＣＤ６２Ｐ抗体の双方の陽性ゲート中に測定された血小板の割合をＰＡＣ－１反応率とした。
　［測定例６：アネキシン陽性率、血小板総数］
　アネキシン陽性率は、フローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ；ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて以下のように測定した。まず、モジュールに流入させる前の血小板浮遊液をサンプリングし、測定検体（処理前）とする。次にモジュールの流入口からローラーポンプ等によって、２Ｌ／ｍｉｎで血小板浮遊液を流入させてモジュールを通過させ、流出口から流出した血小板浮遊液をサンプリングし測定検体（処理後）とする。測定検体をそれぞれ抗ＣＤ４１ａ抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，　５５５４６７）および抗ＣＤ４２ｂ抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，　５５５４７３）と混合したサンプル（以下サンプルＡ）と、サンプルＡにさらにＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ（ＢＤ　Ｈｏｒｉｚｏｎ，　５６０５０６）とＡｎｎｅｘｉｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，　５５６４５４）を混合したサンプル（以下サンプルＢ）を用意する。サンプルが濃い場合には前記Ａｎｎｅｘｉｎ　ｂｕｆｆｅｒで適当な希釈率で希釈してもよい。フローサイトメーターの測定においては、まず、サンプルＡを用いて、フローサイトメーターで散乱光パターンによるゲートに加えて、ＣＤ４１ａとＣＤ４２ｂの蛍光標識を用いて、共陽性領域を血小板のゲートとした。血小板ゲート内に測定された数から下記式によって血小板総数を算出することができる。
血小板総数（個）＝血小板ゲート内測定値（個）÷測定容量（Ｌ）×希釈率×血小板浮遊液の容量（Ｌ）
　次にゲートされた血小板分画をＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖの蛍光標識で展開し、陰性と陽性が１００％と０％となる境界に陽性ゲートを設定する。この設定を固定したまま、サンプルＡの代わりにサンプルＢを測定し、陽性ゲート中に測定された血小板の割合を各検体のアネキシン陽性率とした。
　［測定例７：アネキシン陽性化率、血小板回収率］
　１６Ｌの培養血小板を含む培養液にＡＣＤ－Ａ液（テルモ）を１０％添加した血小板浮遊液を測定検体（処理前液）とし、処理前液中の血小板数、アネキシン陽性率およびＰＡＣ－１反応率を測定した。
　測定例４のようにプライミングを行った後、供給バッグ１１の中身を血小板浮遊液（処理前液）に変更し、回収バッグ１２も空にした。そして、ローラーポンプ２１を５００ｍＬ／ｍｉｎ、ローラーポンプ２２を４００ｍＬ／ｍｉｎで同時に送液を開始し、血小板浮遊液を濃縮した。供給バッグ１１内の血小板培養浮遊液（処理前液）がなくなった後、両方のポンプを止め、供給バッグ１１に再びＰＢＳを添加し、ローラーポンプ２１を５００ｍＬ／ｍｉｎの流量で１分間送液した。
　送液終了後、回収バッグ１２の端部を封じて回路から切り離した。数回転倒混和した後に、回収バッグ１２から処理後液をサンプリングし、測定検体（処理後液）として血小板数、アネキシン陽性率およびＰＡＣ－１反応率を測定した。
　アネキシン陽性化率は、測定検体（処理後液）のアネキシン陽性率から測定検体（処理前液）のアネキシン陽性率を引くことにより求めた。
　また、濃縮前の血小板総数を１００％とした場合の濃縮後の血小板総数の割合を血小板回収率として算出した。
　［実施例１］
　１５質量部のユーデル（登録商標）ポリスルホン（Ｐ３５００；ソルベイ社）、８質量部のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｋ９０；ＩＳＰ社）、７５質量部のジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）及び２質量部の水からなる混合物を、９０℃で混合溶解した後に、５０℃に保温したものを製膜原液とした。また、８０質量部のＤＭＡＣ及び２０質量部の水からなる混合溶液に、３０質量部のＰＶＰ（Ｋ３０；ＩＳＰ社）を加え混合溶解したものを芯液とした。
　外径１．０ｍｍ／内径０．７ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金を用いて、外側の筒から製膜原液を、内側の筒から芯液を、それぞれ同時に吐出し、３０℃に設定した長さ７０ｍｍの乾式部を通過させた後、８５質量部の水及び１５質量部のＤＭＡＣからなる混合溶液を入れた９０℃の凝固浴に浸漬して凝固させ、さらに８０℃の温水浴で温水洗浄してからカセ枠に巻き取り、湿潤状態の中空糸膜を得た。製膜速度を４０ミリ／分としたところ、中空糸膜内径は３００μｍ、中空糸膜の膜厚は８０μｍとなった。
　得られた湿潤状態の中空糸膜を０．４ｍの長さに切断して小分けし、９０℃の温水浴に５０分間浸漬して温水洗浄した後、１００℃で１０時間の乾燥処理を行い、さらに乾熱乾燥機により１７０℃で５時間の加熱により、ＰＶＰの架橋を行って中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の平均孔径、透水性、内表面における親水性高分子（ＰＶＰ）の存在率を、前述の測定例に従ってそれぞれ算出した。
　得られた中空糸膜から、以下のようにして中空糸膜モジュールを作製した。まず、内径４４ｍｍ、長さ２２０ｍｍのサイズの円筒状のケーシングに、上記のようにして得られた中空糸膜を５２４３本束にして挿入し、端部を６０％グリセリン水溶液に浸し、４０℃で３日間乾燥させた。続いて端部をポリウレタン樹脂からなるポッティング剤によって封止した後、中空糸膜が両面とも外側に向かって開口するように、ポッティング剤をケース断面と平行な方向に沿ってカットし、２．１ｃｍ２の断面積を有する口（流入口および流出口）を１つ備えたヘッダーを両側に取り付けた。中空糸膜を充填したケーシング内に８０℃の熱水（３．５Ｌ）を５００ｍＬ／ｍｉｎで流し込んで洗浄し、その後さらに常温水（２Ｌ）を５００ｍＬ／ｍｉｎ流し込んで洗浄した。洗浄後、０．１質量％のエタノールを溶解したビニルピロリドン－酢酸ビニル共重合体（ＶＡ６４；ＢＡＳＦ社）の１０００ｐｐｍ水溶液を充填し、ケースの外側からγ線２５ｋＧｙを照射して、放射線照射架橋処理によりＶＡ６４を中空糸膜表面に固定し、有効長１９５ｍｍのモジュールを作製した。
　［実施例２］
　実施例１と同様にして常温水洗浄の工程まで実施し、その後のＶＡ６４付加工程を実施せずにモジュールを作製した。
　［実施例３］
　モジュールケースのケース長を切断し、１／２の長さ（有効長１０１．５ｍｍ）に変更した以外は実施例１と同一の方法でモジュールを作製した。
　実施例３の結果において、表１に示すアネキシン陽性化率は１９％と成績の悪い結果となっている。しかしこれは中空糸膜総断面積（Ｘ）と中空糸総膜面積（Ｚ）の比が０．０００４を超えているために、血小板の回収率が低下したために生じた見かけ上の結果である。中空糸膜の総断面積（Ｘ）は、中空糸膜内側を通過する液の線速度（膜腔内通過線速度）に対し、また中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は中空糸膜の内側から外側に液が通過する線速度（膜面通過線速度）に対し影響している。膜面通過線速度が膜腔内通過線速度に対して大きくなると、血小板が中空糸膜表面に積層したケーク層が形成しやすくなる。このときケーク層を形成するのはアネキシン陰性の正常な血小板であるため、回収される血小板は相対的にアネキシン陽性の血小板が多くなり、アネキシン陽性化率も見かけ上上昇してしまうと考えられる。
　実際には、実施例３の評価におけるアネキシン陽性血小板数は、モジュール通過前が３．４×１０９個、モジュール通過後が２．８×１０９個であり、濃縮により微減していた。一部、アネキシン陽性の血小板も正常な血小板に混じって中空糸膜に残留しているとしても、その数は少ないと考えられるため、この結果からは、実施例３のモジュールを用いた濃縮によってもアネキシン陽性の血小板の絶対数はほとんど増えていないことが伺える。
　［比較例１］
　モジュールケースのヘッダーを、０．８ｃｍ２の断面積を有する口（流入口および流出口）を１つ備えたルアーロックタイプのものに変更した以外は実施例１と同一の方法でモジュールを作製した。
　［比較例２］
　モジュールケースのケース長を切断し、１／２の長さ（有効長１０１．５ｍｍ）に変更した以外は比較例１と同一の方法でモジュールを作製した。
　［比較例３］
　１５部のポリメチルメタクリレート（パラスチレンスルホン酸／カチオン性ポリマー＝３／２；以下、「ＰＭＭＡ」）及び８５部のジメチルスルホキシド／グリセリン混合液（ジメチルスルホキシド／グリセリン＝８５／１５）からなる混合物を、１２０℃で溶解した後に、１０５℃に保温したものを製膜原液とした。また、９３部のジメチルスルホキシド及び７部の水からなる混合物を、芯液とした。
　外径０．９ｍｍ／内径０．６５ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金を用いて、外側の筒から製膜原液を、内側の筒から芯液を、それぞれ同時に吐出し、３０℃に設定した長さ１００ｍｍの乾式部を通過させた後、９０部の水及び１０部のジメチルスルホキシドからなる混合溶液を入れた９０℃の凝固浴に浸漬して凝固させ、さらに８０℃の温浴で温水洗浄してから７５質量％のグリセリン水溶液を付与し、カセ枠に巻き取って中空糸膜を得た。なお、製膜速度を５０ｍ／分としたところ、中空糸膜内径は３００μｍ、中空糸膜の膜厚は９０μｍとなった。
　得られた中空糸膜を用いて、比較例１と同一の方法でモジュールを作製した。
　各実施例、比較例で作製した中空糸膜の素材、平均孔径および透水性、ならびに、それを用いて作製した培養血小板濃縮モジュールにおける流入口総断面積（Ｙ１）、流出口総断面積（Ｙ２）、中空糸膜総断面積（Ｘ）、中空糸膜総膜面積（Ｚ）、Ｘ／Ｙ１、Ｘ／Ｙ２、Ｘ／Ｚ、圧力損失および濃縮した培養血小板に関する各種評価各測定例に従って測定した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　１１・・・供給バッグ、１２・・・回収バッグ、１３・・・廃液バッグ、２１・・・ローラーポンプ、２２・・・ローラーポンプ、３１・・・圧力計、３２・・・圧力計、４１流入口、４２・・・流出口、４３・・・排出口、５１・・・ケーシング、５２・・・ヘッダー、５３・・・ヘッダー
 

Claims (10)

  1. 表面に存在する孔の平均孔径が２μｍ以下の中空糸膜が、前記中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板懸濁液を供給するための流入口を少なくとも一つ有するケーシングに複数本充填されてなる培養血小板濃縮モジュールであって、前記複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下である培養血小板濃縮モジュール。
  2. 前記ケーシングは、前記中空糸膜の内部を通過した濃縮後の培養血小板懸濁液を流出させるための流出口を少なくとも一つ有するとともに、前記複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流出口の総断面積（Ｙ２）で除した値（Ｘ／Ｙ２）が４．０以下である、請求項１に記載の培養血小板濃縮モジュール。
  3. 前記複数の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記複数の中空糸膜の総膜面積（Ｚ）で除した値（Ｘ／Ｚ）が０．０００４以下である、請求項１または２に記載の培養血小板濃縮モジュール。
  4. 流入口から流出口へ２Ｌ／ｍｉｎの流量で液を供給した場合の圧力損失が１０ｋＰａ以下である、請求項１～３のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
  5. 前記中空糸膜の総膜面積（Ｚ）が０．１ｍ２以上１ｍ２以下である、請求項１～４のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
  6. 前記中空糸膜の内表面に親水性高分子が担持されてなる、請求項１～５のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
  7. 前記親水性高分子が、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体、および酢酸ビニルとビニルカプロラクタムの共重合体からなる群より選択される１または２以上の高分子である、請求項６に記載の培養血小板濃縮モジュール。
  8. 前記中空糸膜の透水性が３０ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２以上である、請求項１～７のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール
  9. 前記中空糸膜がポリスルホン系中空糸膜である、請求項１～８のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュールを用いて培養血小板を濃縮する工程を含む血小板製剤の製造方法。
     
PCT/JP2017/034458 2016-09-30 2017-09-25 培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法 WO2018062073A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201780059492.3A CN109803748A (zh) 2016-09-30 2017-09-25 培养血小板浓缩组件及使用其的血小板制剂的制造方法
EP17856026.4A EP3520883B1 (en) 2016-09-30 2017-09-25 Module for concentrating incubated platelets and method for producing platelet preparation using same
JP2017550776A JP7139604B2 (ja) 2016-09-30 2017-09-25 培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法
US16/338,065 US11155785B2 (en) 2016-09-30 2017-09-25 Incubated platelet concentration module and method for producing platelet preparation using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016193154 2016-09-30
JP2016-193154 2016-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018062073A1 true WO2018062073A1 (ja) 2018-04-05

Family

ID=61760606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/034458 WO2018062073A1 (ja) 2016-09-30 2017-09-25 培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11155785B2 (ja)
EP (1) EP3520883B1 (ja)
JP (1) JP7139604B2 (ja)
CN (1) CN109803748A (ja)
WO (1) WO2018062073A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7177016B2 (ja) * 2019-07-24 2022-11-22 富士フイルム株式会社 多孔質膜およびフィルターカートリッジ

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007089432A (ja) * 2005-09-27 2007-04-12 Reprocell Inc 幹細胞由来血小板産生増加法
WO2009139177A1 (ja) * 2008-05-15 2009-11-19 国立大学法人大阪大学 血小板の誘導方法
JP2012143554A (ja) * 2010-12-24 2012-08-02 Toray Ind Inc ポリスルホン系中空糸膜及び血小板浮遊液浄化用中空糸膜モジュール並びに血小板浮遊液の浄化方法
WO2013147001A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 東レ株式会社 血液製剤浄化用のポリスルホン系中空糸膜及び中空糸膜モジュール
US20160074569A1 (en) * 2013-06-27 2016-03-17 Mann+Hummel Gmbh Polymeric Whole Blood Hollow Fiber Membrane Filter Medium and Use Thereof For Separating Blood Plasma/Serum From Whole Blood
JP2016116465A (ja) * 2014-12-19 2016-06-30 株式会社カネカ 細胞濃縮液の製造方法
JP2016190824A (ja) * 2015-03-31 2016-11-10 東レ株式会社 血小板製剤の製造方法および製造装置、およびこの製造方法またはこの製造装置で製造された血小板製剤

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3373876A (en) * 1966-05-12 1968-03-19 Dow Chemical Co Artificial body organ apparatus
JPS5318692A (en) 1976-08-05 1978-02-21 Hitachi Chem Co Ltd Molding resin material compositions of low shrinkability
US4787974A (en) 1981-06-29 1988-11-29 Ambrus Clara M Blood purification
JPH0757825B2 (ja) 1985-04-17 1995-06-21 東レ株式会社 ポリスルホン系樹脂多孔膜
JPS62290469A (ja) 1986-06-09 1987-12-17 旭メデイカル株式会社 膜型血漿分離器
US5139529A (en) * 1987-01-20 1992-08-18 Terumo Kabushiki Kaisha Porous polypropylene membrane and methods for production thereof
JPH0347268A (ja) 1989-01-13 1991-02-28 Terumo Corp 流体処理装置及びその駆動方法
JP2888607B2 (ja) 1990-05-30 1999-05-10 テルモ株式会社 人工肺用複合膜、その製造方法およびそれを用いた複合膜型人工肺
US5240614A (en) * 1992-01-10 1993-08-31 Baxter International Inc. Process for removing unwanted materials from fluids and for producing biological products
JPH0999064A (ja) * 1995-10-04 1997-04-15 Nikkiso Co Ltd 中空糸型血液浄化器
JPH09108338A (ja) * 1995-10-16 1997-04-28 Toray Ind Inc 血液ポートおよびそれを用いた血液処理装置
JP3921873B2 (ja) 1999-05-31 2007-05-30 東レ株式会社 ポリスルホン系中空糸膜の製造方法
WO2010035793A1 (ja) 2008-09-26 2010-04-01 旭化成ケミカルズ株式会社 清澄化されたバイオ医薬培養液を製造するための多孔質中空糸膜の使用
AU2011315839B2 (en) * 2010-10-15 2016-02-18 Seastar Medical Inc. Cytopheresic cartridge and use thereof
CN202740496U (zh) * 2012-06-21 2013-02-20 甘布罗伦迪亚股份公司 毛细管透析器
JP6196222B2 (ja) * 2012-08-30 2017-09-13 株式会社カネカ 細胞濃縮液の製造方法
JP6203186B2 (ja) 2012-09-27 2017-09-27 川澄化学工業株式会社 血液処理装置
EP2926820B1 (en) * 2012-11-30 2017-08-30 Toray Industries, Inc. Method for preparing platelet solution replaced with artificial preservation solution
JP6298649B2 (ja) 2014-02-19 2018-03-20 東レ株式会社 洗浄血小板の製造方法
US20160339159A1 (en) 2014-02-19 2016-11-24 Toray Industries, Inc. Hollow fiber membrane module for cleaning platelet suspension

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007089432A (ja) * 2005-09-27 2007-04-12 Reprocell Inc 幹細胞由来血小板産生増加法
WO2009139177A1 (ja) * 2008-05-15 2009-11-19 国立大学法人大阪大学 血小板の誘導方法
JP2012143554A (ja) * 2010-12-24 2012-08-02 Toray Ind Inc ポリスルホン系中空糸膜及び血小板浮遊液浄化用中空糸膜モジュール並びに血小板浮遊液の浄化方法
WO2013147001A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 東レ株式会社 血液製剤浄化用のポリスルホン系中空糸膜及び中空糸膜モジュール
US20160074569A1 (en) * 2013-06-27 2016-03-17 Mann+Hummel Gmbh Polymeric Whole Blood Hollow Fiber Membrane Filter Medium and Use Thereof For Separating Blood Plasma/Serum From Whole Blood
JP2016116465A (ja) * 2014-12-19 2016-06-30 株式会社カネカ 細胞濃縮液の製造方法
JP2016190824A (ja) * 2015-03-31 2016-11-10 東レ株式会社 血小板製剤の製造方法および製造装置、およびこの製造方法またはこの製造装置で製造された血小板製剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3520883A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109803748A (zh) 2019-05-24
EP3520883B1 (en) 2023-07-26
US11155785B2 (en) 2021-10-26
JP7139604B2 (ja) 2022-09-21
JPWO2018062073A1 (ja) 2019-07-11
US20200024575A1 (en) 2020-01-23
EP3520883A1 (en) 2019-08-07
EP3520883A4 (en) 2020-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102144703B1 (ko) 중공사막 모듈, 중공사막의 제조 방법 및 중공사막 모듈의 제조 방법
KR101590666B1 (ko) 세포 증식을 위한 조사된 멤브레인
JP6497318B2 (ja) 血小板浮遊液洗浄用の中空糸膜モジュール
US9795932B2 (en) Porous hollow fiber membrane and a porous hollow fiber membrane for the treatment of a protein-containing liquid
US20060016748A1 (en) Microporous hydrophilic membrane
JP6211000B2 (ja) 人工保存液置換血小板溶液の製造方法
EP3130392B1 (en) Virus removal membrane
JP6171931B2 (ja) 血液製剤浄化用のポリスルホン系中空糸膜及び中空糸膜モジュール
EP3130393B1 (en) Virus removal membrane
US20230026019A1 (en) Virus removal membrane and method for manufacturing virus removal membrane
JP2012143554A (ja) ポリスルホン系中空糸膜及び血小板浮遊液浄化用中空糸膜モジュール並びに血小板浮遊液の浄化方法
WO2018062073A1 (ja) 培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法
JP5644328B2 (ja) 中空糸膜モジュールおよび中空糸膜モジュールの製造方法
JP2012019891A (ja) 血液処理用の中空糸膜の製造方法
JP2023008851A (ja) 分離膜モジュール
JP2012019890A (ja) 血液処理用中空糸膜、及び、中空糸膜型血液処理器
JP2019135967A (ja) 培養細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017550776

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17856026

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017856026

Country of ref document: EP

Effective date: 20190430