WO2016009548A1 - Optical analysis device - Google Patents

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秀治 三上
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering

Abstract

In conventional methods for obtaining quantitative values from CARS microscope measurement data, it has been difficult to obtain data quickly and accurately. To address this problem, this optical analysis device acquires quantitative information from a CARS spectrum including a nonresonant component by using the difference in the absolute values of an electric field corresponding to maximum and minimum spectral values as a quantitative value.

Description

光学分析装置Optical analyzer
　本発明は、光学分析装置の高性能化に関する。 The present invention relates to high performance optical analyzers.
　光学顕微鏡は言うまでも無く自然科学、工学、産業分野において無くてはならない観察ツールである。特に近年は、照明光源としてレーザを用いたより高機能な顕微鏡が先端技術開発において必須となりつつある。その代表例として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡（特許文献１、２、非特許文献１）があり、ＣＡＲＳ顕微鏡は、励起光とストークス光の２種類のレーザ光を試料に照射し、これらの光の差周波が試料分子の固有振動に共鳴した結果生じるアンチストークス光（以下ＣＡＲＳ光と呼ぶ）を観測する顕微鏡である。ＣＡＲＳ光のスペクトルにより試料中の物質を定量的に分析観測することができ、非侵襲な定量分析手段として注目されている。 Needless to say, the optical microscope is an indispensable observation tool in the natural science, engineering, and industrial fields. Particularly in recent years, more advanced microscopes using a laser as an illumination light source have become essential in advanced technology development. A typical example is a coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscope ( Patent Documents 1, 2 and Non-Patent Document 1). The CARS microscope irradiates a sample with two types of laser light, excitation light and Stokes light, It is a microscope for observing anti-Stokes light (hereinafter referred to as CARS light) generated as a result of the difference frequency of these lights resonating with the natural vibration of the sample molecule. The substance in the sample can be quantitatively analyzed and observed by the spectrum of the CARS light, and has attracted attention as a non-invasive quantitative analysis means.
　ここでＣＡＲＳ顕微鏡の動作原理について説明する。ＣＡＲＳは３次の分極による発光であり、ＣＡＲＳを発生させるためには、励起光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。多くの場合、光源の数を少なくするために、プローブ光は励起光で代用される。この場合、誘起される３次の分極はＰ(ω)＝(χr (3)(ω)＋χnr (3))ＥP 2(ωP)Ｅ* S(ωS) で表される。ここに、χr (3)(ω)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、χnr (3)は非共鳴項である。また、励起光及びプローブ光の電場をＥPで表し、ストークス光の電場はＥSで表されている。非共鳴項は周波数依存性がない。式(1)のＥSの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。ＣＡＲＳ光の強度はP（ω）の絶対値の自乗となる。図２２に示した分子のエネルギー準位図を用いて、ＣＡＲＳ光が発生する機構を説明する。図２２は共鳴項のプロセスを示している。１４０１は分子の振動基底状態を表し、１４０２は振動励起状態を表す。周波数ωPの励起光と周波数ωSのストークス光を同時に照射する。このとき分子は仮想準位１４０３を介して、１４０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ωPのプローブ光を照射すると、仮想準位１４０４を介して周波数ωASのＣＡＲＳ光を発生しながら、分子は振動基底状態に戻る。このときのＣＡＲＳ光の周波数はω＝２ωP－ωSと表される。 Here, the operation principle of the CARS microscope will be described. CARS is light emission by third-order polarization, and excitation light, Stokes light, and probe light are required to generate CARS. In many cases, in order to reduce the number of light sources, the probe light is substituted with excitation light. In this case, the induced third-order polarization is represented by P (ω) = (χ r (3) (ω) + χ nr (3) ) E P 2 (ω P ) E * S (ω S ). Here, χ r (3) (ω) is a resonance term of molecular vibration of third-order electrical susceptibility, and χ nr (3) is a non-resonance term. Moreover, the electric field of excitation light and probe light is represented by E P , and the electric field of Stokes light is represented by E S. The non-resonant term has no frequency dependence. An asterisk attached to the shoulder of the E S of the formula (1) denotes a complex conjugate. The intensity of CARS light is the square of the absolute value of P (ω). The mechanism of CARS light generation will be described using the energy level diagram of the molecule shown in FIG. FIG. 22 illustrates the resonance term process. 1401 represents the vibrational ground state of the molecule, and 1402 represents the vibrational excited state. Simultaneously irradiate excitation light with frequency ω P and Stokes light with frequency ω S. At this time, the molecule is excited to a vibration excitation level having 1402 through the virtual level 1403. When this excited molecule is irradiated with probe light having the frequency ω P , the molecule returns to the vibrational ground state while generating CARS light having the frequency ω AS via the virtual level 1404. The frequency of the CARS light at this time is expressed as ω = 2ω P −ω S.
　この共鳴ＣＡＲＳ光は、図２２から明らかなように、励起光とストークス光の周波数の差ωP－ωSが観測試料のある振動励起状態に一致する場合にのみ発生する。但し、ここではプランク単位系を採用しており、プランク定数は１としている。従って、ストークス光として広帯域な光源を用いた場合、発生するＣＡＲＳ光も広帯域な光となるが、振動励起状態に対応する波長において鋭いピークを持つスペクトルを有する。このスペクトルは試料中の分子の振動励起状態の分布を反映しており、分子種の同定に用いることができる。 As is apparent from FIG. 22, this resonance CARS light is generated only when the difference in frequency ω P −ω S between the excitation light and the Stokes light coincides with a certain vibration excitation state of the observation sample. However, the Planck unit system is adopted here, and the Planck constant is 1. Therefore, when a broadband light source is used as Stokes light, the generated CARS light is also broadband light, but has a spectrum having a sharp peak at a wavelength corresponding to the vibrationally excited state. This spectrum reflects the distribution of vibrationally excited states of the molecules in the sample and can be used to identify the molecular species.
　図２３は、式(1)の非共鳴項に関係する一つのプロセスを示す図である。ストークス光の周波数が振動励起状態ではなく、仮想準位１４０５を介したプロセスとなる。周波数ωPの励起光と周波数ω’Pのプローブ光の同時照射により電子等の関与する仮想準位１４０５が励起され、さらに周波数ω’Sのストークス光により、仮想準位１４０６を介して周波数ωの非共鳴のＣＡＲＳ光が発生する。この非共鳴のＣＡＲＳ光は振動励起状態と無関係に発生するため、広帯域なストークス光を使用した場合は、強度の波長依存性を持たない広帯域な非共鳴ＣＡＲＳ光が発生する。これらの共鳴ＣＡＲＳ光と非共鳴ＣＡＲＳ光とは互いにコヒーレントであり、干渉することになる。このため取得された生データから共鳴成分のみに含まれる定量情報を取得する手段が必要であり、多くの方法が提案されている。非特許文献２では最大エントロピー法を用いてラマンスペクトルを抽出し、各ピーク値の大きさを定量情報として用いる。非特許文献３では想定される共鳴成分を用いたデータのフィッティングにより各共鳴成分の大きさを特定する。非特許文献４、５では特定の共鳴周波数に対応するデータの極大値、極小値に対し、それぞれ差、比を共鳴成分の定量値としている。非特許文献６では想定される共鳴周波数と、その周波数に正負に等しく離れた周波数の計３点のデータ値からの演算により定量値を算出する。 FIG. 23 is a diagram illustrating one process related to the non-resonant term of Equation (1). The frequency of the Stokes light is not a vibrationally excited state, but a process through the virtual level 1405. 'Participating virtual level 1405 such as electrons are excited by the simultaneous irradiation of the P of the probe light, yet the frequency omega' exciting light frequency omega P and the frequency omega by Stokes light of S, the frequency omega via a virtual level 1406 Non-resonant CARS light is generated. Since this non-resonant CARS light is generated regardless of the vibration excitation state, when a wide-band Stokes light is used, a wide-band non-resonant CARS light having no wavelength dependency of intensity is generated. These resonant CARS light and non-resonant CARS light are coherent and interfere with each other. For this reason, means for acquiring quantitative information contained only in the resonance component from the acquired raw data is necessary, and many methods have been proposed. In Non-Patent Document 2, a Raman spectrum is extracted using the maximum entropy method, and the magnitude of each peak value is used as quantitative information. In Non-Patent Document 3, the magnitude of each resonance component is specified by fitting data using the assumed resonance component. In Non-Patent Documents 4 and 5, differences and ratios are used as quantitative values of the resonance component for the maximum value and the minimum value of data corresponding to a specific resonance frequency. In Non-Patent Document 6, a quantitative value is calculated by calculation from a total of three data values of an assumed resonance frequency and a frequency equally spaced from the frequency.
　なお、励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の周波数の関係は図24のように図示される。所定の周波数を持った励起光と、それより小さな周波数領域にあるストークス光が試料に入射され、励起光よりも大きな周波数領域にＣＡＲＳ光が発生する。 Note that the relationship between the frequencies of the excitation light, Stokes light, and CARS light is shown in FIG. Excitation light having a predetermined frequency and Stokes light in a lower frequency region are incident on the sample, and CARS light is generated in a frequency region larger than the excitation light.
　ＣＡＲＳ顕微鏡は、上記のようにして求められたラマンスペクトルを、励起光、ストークス光を集光する位置を変化させて複数測定を行い、結果的に分子種ごとの空間分布の画像を取得する。 The CARS microscope performs a plurality of measurements on the Raman spectrum obtained as described above by changing the position where the excitation light and the Stokes light are collected, and as a result, acquires an image of the spatial distribution for each molecular species.
US6108081US6108081 特許第5100461号Patent No. 5100461
　上に述べたＣＡＲＳ顕微鏡における定量情報の取得について、非特許文献２，３はデータ処理が複雑のため、特に多数のスペクトルを処理する場合に長時間を要するため、大量のデータを高速に処理するのに適さないという問題ある。これに対して非特許文献４，５，６はデータ処理が簡便のため、高速なデータ処理に適している。しかしながら、非特許文献４の定量値は共鳴成分が非共鳴成分に比べて十分に小さいという条件を前提としており、本条件が満たされない場合（例えば測定対象物質の濃度が高い場合）に定量値に誤差が生じ、適用可能な試料が限定されるという課題がある。また、非特許文献６で指摘されているように、取得される定量値は非共鳴成分の大きさにも依存するため、非共鳴成分の大きさにばらつきのある試料を評価する際に深刻なエラーを生じる。非特許文献５では予め測定対象物質の濃度と定量値の関係（校正データ）を測定しておくことで共鳴成分、非共鳴成分の大小によらず正確な定量値を取得するが、校正データの測定が事前に必要なことから分析過程が複雑化し、正味の分析時間が長時間になる問題がある。非特許文献６は測定対象の共鳴周波数を予め正確に知っている必要があるが、共鳴周波数は測定対象物質の濃度や周囲の環境により変化することが知られており（例えば非特許文献１を参照）、正確な定量値はごく限られた条件でのみしか得られないという課題がある。 Regarding the acquisition of quantitative information in the CARS microscope described above, Non-Patent Documents 2 and 3 are complicated in data processing, and particularly take a long time to process a large number of spectra, so a large amount of data is processed at high speed. There is a problem that it is not suitable for. On the other hand, Non-Patent Documents 4, 5, and 6 are suitable for high-speed data processing because of simple data processing. However, the quantitative value in Non-Patent Document 4 is based on the premise that the resonance component is sufficiently smaller than the non-resonant component. If this condition is not satisfied (for example, when the concentration of the measurement target substance is high), the quantitative value is obtained. There is a problem that an error occurs and the applicable samples are limited. Further, as pointed out in Non-Patent Document 6, since the obtained quantitative value also depends on the size of the non-resonant component, it is serious when evaluating a sample with a variation in the size of the non-resonant component. Cause an error. In Non-Patent Document 5, an accurate quantitative value is acquired regardless of the magnitude of the resonance component and non-resonance component by measuring the relationship between the concentration of the substance to be measured and the quantitative value (calibration data) in advance. Since the measurement is required in advance, the analysis process becomes complicated, and there is a problem that the net analysis time becomes long. Non-Patent Document 6 needs to know the resonance frequency of the measurement target accurately in advance, but it is known that the resonance frequency changes depending on the concentration of the measurement target substance and the surrounding environment (for example, Non-Patent Document 1). There is a problem that accurate quantitative values can be obtained only under very limited conditions.
　以上のように、CARS顕微鏡の測定データから定量値を取得する従来の方法は、高速かつ正確にデータを取得することが困難である。この問題は、CARSによりイメージを取得するCARS顕微鏡だけでなく、１点または複数点のCARS光のスペクトル（以下、ＣＡＲＳスペクトルと呼ぶ）を取得する分析にも当てはまる。 As described above, the conventional method for obtaining a quantitative value from the measurement data of the CARS microscope is difficult to obtain data at high speed and accurately. This problem applies not only to a CARS microscope that acquires an image by CARS, but also to an analysis that acquires a spectrum of CARS light at one or more points (hereinafter referred to as CARS spectrum).
　上記の課題に鑑み、本発明の目的は、高速かつ正確に試料の分析を可能とする光学分析装置を提供することにある。 In view of the above-described problems, an object of the present invention is to provide an optical analyzer that enables analysis of a sample at high speed and accurately.
　本発明の基礎となるのは、測定データより以下のような定量値を算出することである。すなわち、測定対象となる特定の共鳴成分に対し、共鳴周波数の前後におけるスペクトルの極大値と極小値の平方根を演算し、これらの差分を定量値とする。これにより、他の共鳴信号がスペクトル上で重なっていないような孤立共鳴成分に対し、高速かつ正確（共鳴成分と非共鳴成分の大小に関係なく）に定量を行うことができる。具体的には以下の手段を用いた。
（１）短パルスレーザやフォトニック結晶ファイバ、光パラメトリック発振器などの少なくとも２つの光源と、少なくとも2つの光源から生成される光束を試料の同一箇所に照射する対物レンズなどの照射光学系と、試料から生成されるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する分光器、ＣＣＤカメラや光電子増倍管などの検出器と、検出器の出力を取り込み、信号処理を行うコンピュータ等の信号処理部とを備え、信号処理部は、検出器における、コヒーレントアンチストークスラマン散乱が極大になる波長と極小になる波長におけるコヒーレントアンチストークスラマン散乱の電場の絶対値の差に比例する値を演算し、出力することとした。 The basis of the present invention is to calculate the following quantitative value from the measurement data. That is, the square root of the maximum value and the minimum value of the spectrum before and after the resonance frequency is calculated for a specific resonance component to be measured, and the difference between them is used as a quantitative value. Thereby, it is possible to perform quantification at high speed and accurately (regardless of the size of the resonance component and the non-resonance component) with respect to an isolated resonance component in which other resonance signals do not overlap on the spectrum. Specifically, the following means were used.
(1) At least two light sources such as a short pulse laser, a photonic crystal fiber, and an optical parametric oscillator, an irradiation optical system such as an objective lens that irradiates a light beam generated from at least two light sources to the same portion of the sample, and a sample A spectroscope that detects coherent anti-Stokes Raman scattering light generated from the detector, a detector such as a CCD camera or a photomultiplier tube, and a signal processing unit such as a computer that takes in the output of the detector and performs signal processing, The signal processing unit calculates and outputs a value proportional to the difference between the absolute values of the electric field of the coherent anti-Stokes Raman scattering at the wavelength where the coherent anti-Stokes Raman scattering becomes a maximum and the wavelength at which the detector becomes a minimum. .
　これにより、従来より高速かつ精度の高い定量測定が可能となる。
（２）（１）において、検出器は前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光のスペクトルを取得するものであって、電場の絶対値の差は、前記スペクトルの極大値と極小値それぞれの平方根の差であることとした。 As a result, it is possible to perform quantitative measurement at a higher speed and higher accuracy than before.
(2) In (1), the detector acquires the spectrum of the coherent anti-Stokes Raman scattering light, and the difference in the absolute value of the electric field is the difference between the square roots of the maximum and minimum values of the spectrum. It was supposed to be.
　これにより、物質の濃度や周囲の環境などにより共鳴周波数が変化するような試料に対しても精度よく定量測定を行うことができる。
（３）（１）において、検出器はコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を少なくとも２つの波長で検出するものであって、電場の絶対値の差は、ユーザが指定する2種類の所定の波長における前記検出器の出力の平方根の差であることとした。 Thereby, it is possible to perform quantitative measurement with high accuracy even for a sample whose resonance frequency changes depending on the concentration of the substance and the surrounding environment.
(3) In (1), the detector detects coherent anti-Stokes Raman scattered light at at least two wavelengths, and the difference between the absolute values of the electric field is determined at two predetermined wavelengths specified by the user. The difference between the square roots of the detector output was determined.
　これにより、より簡素に定量値を出力することが可能であり、高速な定量分析が可能となる。
（４）（１）において、光源のうち少なくとも１つの波長を2種類の設定波長の間で交互に変調することとした。 Thereby, it is possible to output a quantitative value more simply, and high-speed quantitative analysis becomes possible.
(4) In (1), at least one wavelength of the light sources is alternately modulated between two types of set wavelengths.
　これにより、より高速な定量分析が可能となる。
（５）（４）において、検出器の出力の変調成分を出力するロックインアンプを備えることとした。 Thereby, faster quantitative analysis becomes possible.
(5) In (4), a lock-in amplifier that outputs the modulation component of the detector output is provided.
　これにより、より高いＳ／Ｎ比での測定が可能となり、データの質の向上や測定の高速化に寄与する。
（６）（１）において、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を別の光束と干渉させる干渉光学系と、干渉光学系から生成される少なくとも2つの干渉光を検出する少なくとも1つの検出器を備えることとした。
これにより、より高いＳ／Ｎ比での測定が可能となり、データの質の向上や測定の高速化に寄与する。
（７）光源と、試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、光源からの光束を試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、光照射によって細胞から発生された光を分光する分光部と、分光部により分光された光を検出する検出部と、照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備え、信号処理部は、検出器における、コヒーレントアンチストークスラマン散乱が極大になる波長と極小になる波長における前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱の電場の絶対値の差に比例する値を演算し、出力することとした。 As a result, measurement with a higher S / N ratio becomes possible, contributing to improvement in data quality and speeding up of measurement.
(6) In (1), including an interference optical system that causes coherent anti-Stokes Raman scattering light to interfere with another light beam, and at least one detector that detects at least two interference lights generated from the interference optical system; did.
As a result, measurement with a higher S / N ratio becomes possible, contributing to improvement in data quality and speeding up of measurement.
(7) A light source, a sample holding unit that holds a plurality of cells as a sample, an observation unit that observes the cells held in the sample holding unit, and a light beam from the light source is condensed on the cells held in the sample holding unit The irradiation optical system for irradiating the light, the spectroscopic unit for dispersing the light generated from the cells by the light irradiation, the detection unit for detecting the light dispersed by the spectroscopic unit, and the light irradiation position on the cell by the irradiation optical system A signal processing unit comprising: an irradiation control unit for controlling; a cell destruction means for destroying cells held in the sample holding unit; and a biomolecule capturing device for capturing biomolecules in the cells released from the cells by the destruction. Calculates a value proportional to the difference between the absolute values of the electric field of the coherent anti-Stokes Raman scattering at the wavelength at which the coherent anti-Stokes Raman scattering becomes maximum and the wavelength at which the detector becomes minimum. It decided to.
　これにより、生体試料の高速かつ高精度な解析が可能となる。
（８）（７）において細胞破壊手段はレーザ光照射によって細胞を破壊することした。
これにより、装置を小型化することができる。 Thereby, high-speed and highly accurate analysis of a biological sample is attained.
(8) In (7), the cell destruction means destroyed the cells by laser light irradiation.
Thereby, the apparatus can be reduced in size.
　本発明によると、従来よりも高速かつ正確な光学分析装置の提供が可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide an optical analysis device that is faster and more accurate than before.
　上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。 Issues, configurations, and effects other than those described above will be clarified by the following description of the embodiments.
光学分析装置の構成例を示す模式図。The schematic diagram which shows the structural example of an optical analyzer. ＣＣＤカメラの受光部の模式図。The schematic diagram of the light-receiving part of a CCD camera. データ取得動作のシーケンス図。The sequence diagram of data acquisition operation. 典型的なＣＡＲＳスペクトルを表す図A diagram representing a typical CARS spectrum 本発明の定量値算出の原理を表す図The figure showing the principle of quantitative value calculation of the present invention 測定された脂肪細胞のＣＡＲＳスペクトルと、復元されたラマンスペクトルMeasured adipocyte CARS spectrum and restored Raman spectrum 本発明と従来の方法における定量値を比較する図。The figure which compares the quantitative value in this invention and the conventional method. スキャンミラーを用いる場合の構成図Configuration diagram when using a scan mirror ＣＡＲＳ光の後方散乱を検出する光学分析装置の構成図。The block diagram of the optical analyzer which detects the backscattering of CARS light. ストークス光の波長を2種類に切り替えてデータを取得する実施形態の構成例を示す模式図The schematic diagram which shows the structural example of embodiment which switches the wavelength of Stokes light into two types, and acquires data 2種類の波長の設定値を高速に切り替える実施形態の構成例を示す模式図Schematic diagram showing a configuration example of an embodiment that switches the set values of two types of wavelengths at high speed ヘテロダイン検出を適用する実施形態の構成例を示す模式図The schematic diagram which shows the structural example of embodiment which applies heterodyne detection ヘテロダイン検出を適用する実施形態におけるＣＣＤカメラ上の光の照射状態を表す図The figure showing the irradiation state of the light on the CCD camera in embodiment which applies heterodyne detection ヘテロダイン検出を適用する実施形態における、定量値算出の原理を表す図The figure showing the principle of quantitative value calculation in the embodiment applying heterodyne detection ヘテロダイン検出を適用する実施形態の別の構成例を示す模式図The schematic diagram which shows another structural example of embodiment which applies heterodyne detection 光学分析装置の構成例を示す模式図。The schematic diagram which shows the structural example of an optical analyzer. 光学分析装置の構成例を示す模式図。The schematic diagram which shows the structural example of an optical analyzer. 細孔アレイシートの上面図。The top view of a pore array sheet. 生体分子解析装置の動作を説明するフローチャート。The flowchart explaining operation | movement of a biomolecule analyzer. 遺伝子発現データ解析の手順を示すフローチャート。The flowchart which shows the procedure of gene expression data analysis. 主因子分析の結果を示す図。The figure which shows the result of a main factor analysis. 共鳴ＣＡＲＳ過程を表すエネルギーダイアグラム。An energy diagram representing a resonant CARS process. 非共鳴ＣＡＲＳ過程を表すエネルギーダイアグラム。An energy diagram representing a non-resonant CARS process. 励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の周波数の関係を示す図。The figure which shows the relationship of the frequency of excitation light, Stokes light, and CARS light.
　以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
　図１は、本発明の光学分析装置の基本的な構成例を示す模式図である。以下、図１に従って本実施例の動作を説明する。 FIG. 1 is a schematic diagram showing a basic configuration example of the optical analyzer of the present invention. The operation of this embodiment will be described below with reference to FIG.
　コンピュータ１１からの指示によりドライバ１０を通して発光制御される光源すなわち短パルスレーザ光源１０１（中心波長１０６４ｎｍ、パルス幅９００ｐｓ、繰り返し周波数３０ｋＨｚ、平均出力２００ｍＷ）から出射したレーザ光は、ビームスプリッタ１０２により、励起光である透過光と反射光とに２分割される。反射光は集光レンズ１０３によりフォトニック結晶ファイバ１０４に結合され、ファイバ内部で広帯域なスーパーコンティニューム光が生成される。生成されたスーパーコンティニューム光はコリメートレンズ１０５により平行光とされた後、ロングパスフィルタ１０６に入射して短パルスレーザ光源の波長とそれより短い波長の成分が遮断される。ロングパスフィルタ１０６を通過した励起光よりも波長の長い成分であるストークス光は上記励起光とダイクロイックミラー１０８により合波される。ここでダイクロイックミラー１０８は励起光の波長とそれより短い波長域の光を反射し、励起光よりも長い波長域の光を透過する性質を有する。従って励起光は反射し、ストークス光は透過して結果的に合波される。 A laser beam emitted from a light source whose emission is controlled through the driver 10 according to an instruction from the computer 11, that is, a short pulse laser light source 101 (center wavelength 1064 nm, pulse width 900 ps, repetition frequency 30 kHz, average output 200 mW) is excited by the beam splitter 102. The light is divided into two, that is, transmitted light and reflected light. The reflected light is coupled to the photonic crystal fiber 104 by the condensing lens 103, and broadband supercontinuum light is generated inside the fiber. The generated supercontinuum light is collimated by the collimating lens 105 and then enters the long pass filter 106 to block the wavelength of the short pulse laser light source and the shorter wavelength component. Stokes light, which is a component having a wavelength longer than that of the excitation light that has passed through the long pass filter 106, is combined with the excitation light by the dichroic mirror 108. Here, the dichroic mirror 108 has a property of reflecting light having a wavelength of excitation light and a shorter wavelength region and transmitting light having a wavelength region longer than the excitation light. Therefore, the excitation light is reflected, and the Stokes light is transmitted and combined as a result.
　この合波光束は光源からの光束を試料に集光して照射する照射光学系を構成する対物レンズ１０９（ＮＡ０．９、倍率４０倍）により試料１１０の一点に集光され、試料の集光箇所に存在する分子の共鳴振動を反映したＣＡＲＳ光が生成される。ＣＡＲＳ光はコンデンサレンズ１１１（ＮＡ０．６５）により平行光とされ、ショートパスフィルタ１１２を通過して同軸成分である励起光とストークス光が遮断された後、分光器１１３に入射し、分光部１１４により分光され、検出部１１５により波長ごとに別々に検出されて、スペクトルが検出信号として出力される。 This combined light beam is condensed at one point of the sample 110 by an objective lens 109 (NA 0.9, magnification 40 times) that constitutes an irradiation optical system that collects and irradiates the light beam from the light source onto the sample. CARS light reflecting the resonance vibration of molecules present at the location is generated. The CARS light is converted into parallel light by the condenser lens 111 (NA 0.65), passes through the short-pass filter 112, and the excitation light and the Stokes light, which are coaxial components, are blocked. And is detected separately for each wavelength by the detection unit 115, and the spectrum is output as a detection signal.
　ここで、分光器１１３の検出動作について説明する。分光器１１３は、入射した光を回折格子で波長ごとに異なる方向に回折させる分光部１１４と、分光部１１４により回折した光を１次元もしくは２次元の検出器アレイ（ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等）で検出する検出部１１５からなる。本実施例では検出部１１５としてＣＣＤカメラを用いており、その受光部２０１は図２に示されるように画素２０２が２次元的に配列したものになっている。分光部１１４で分光された光は横長のビーム２０３として受光部に入射し、横方向の位置により波長が異なる。ここで検出部１１５のＣＣＤカメラは外部からの制御により所定時間の間露光状態、すなわち各画素が入射した光に露光され入射光を電荷に変換して電荷を蓄積する状態となる。そして露光終了後、縦に並んだ画素列に蓄積された総電荷量がバッファ２０４に転送され（full vertical binning）、バッファ２０４の電荷が外部にシリアル信号として出力される。このため出力信号は入射光の波長ごとの強度に比例した信号、すなわち入射光のスペクトル信号となっている。 Here, the detection operation of the spectroscope 113 will be described. The spectroscope 113 includes a spectroscopic unit 114 that diffracts incident light in a different direction for each wavelength by a diffraction grating, and a one-dimensional or two-dimensional detector array (CCD camera, CMOS camera, etc.) of the light diffracted by the spectroscopic unit 114. It consists of the detection part 115 detected by. In the present embodiment, a CCD camera is used as the detection unit 115, and the light receiving unit 201 has two-dimensionally arranged pixels 202 as shown in FIG. The light split by the spectroscopic unit 114 enters the light receiving unit as a horizontally long beam 203, and the wavelength varies depending on the position in the horizontal direction. Here, the CCD camera of the detection unit 115 is in an exposure state for a predetermined time by external control, that is, in a state in which each pixel is exposed to incident light and converts incident light into electric charge to accumulate electric charge. After the exposure is completed, the total charge accumulated in the vertically aligned pixel columns is transferred to the buffer 204 (full vertical binning), and the charge in the buffer 204 is output to the outside as a serial signal. Therefore, the output signal is a signal proportional to the intensity of each wavelength of incident light, that is, a spectrum signal of incident light.
　ここで本実施例では、試料１１０を保持しているＸＹＺステージ１２を駆動して、試料への励起光及びストークス光の集光位置が試料を３次元的もしくは２次元的に走査し、集光位置が変わる度にスペクトル信号を取得する。従って、最終的に試料の各位置からのスペクトルデータが得られる。 Here, in the present embodiment, the XYZ stage 12 holding the sample 110 is driven, and the sample is scanned three-dimensionally or two-dimensionally at the condensing position of the excitation light and Stokes light onto the sample. A spectral signal is acquired each time the position changes. Accordingly, spectral data from each position of the sample is finally obtained.
　本実施例のデータ取得のシーケンスは図３のようになっており、露光、データ転送、位置移動の動作をデータ点数分だけ繰り返す。なお、データ転送と位置移動の順番は逆であっても構わないし、同時に行ってもよい。 The data acquisition sequence of this embodiment is as shown in FIG. 3, and the operations of exposure, data transfer, and position movement are repeated for the number of data points. Note that the order of data transfer and position movement may be reversed or may be performed simultaneously.
　データ取得終了後、測定された各スペクトルにおいて、測定対象の物質に対応する共鳴周波数の周囲の極大値Imax、極小値Iminを読み取り、これらの平方根の差、すなわち After the data acquisition, in each measured spectrum, the local maximum value Imax and the local minimum value Imin around the resonance frequency corresponding to the substance to be measured are read, and the difference between these square roots,
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
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を測定対象物質の定量値（濃度もしくは分子数）として取得する。これを試料の各点に対応するスペクトルに対して算出する。この算出結果により、ユーザが測定対象物質の濃度分布や、試料全体に含まれる総分子量を取得し、各種の分析に用いる。 Is obtained as the quantitative value (concentration or number of molecules) of the substance to be measured. This is calculated for the spectrum corresponding to each point of the sample. Based on the calculation result, the user acquires the concentration distribution of the measurement target substance and the total molecular weight contained in the entire sample and uses it for various analyses.
　なお、本実施例ではImax， Iminとして各取得スペクトルの極大値、極小値を用いたが、設定の仕方はこの限りではない、例えば取得したスペクトルのうち代表的な１つを選び、これの極大値、極小値を生じる横軸の値（それぞれλ１、λ２とする。単位は波長もしくは波数）を用いて、全てのスペクトルにおいてλ１、λ２での値をそれぞれImax， Iminとしてもよい。極大値、極小値を生じる横軸の値が試料の全点にわたりほぼ一定であれば、これは実質的に極大値、極小値を読み取ることに等しく、このような設定方法が妥当となる。あるいは、対象物質の共鳴周波数と緩和定数（後述）、非共鳴成分の大きさが既知であれば、極大値、極小値を生じる横軸の値が予め理論計算により計算できるため、これらをλ１’、λ２’として、λ１’、λ２’におけるスペクトル値をImax， Iminとしてもよい。あるいは、事前の測定により取得したスペクトルからλ1’，λ2’を決定し、λ1’，λ2’でのスペクトル値をImax， Iminとしてもよい。 In this embodiment, the maximum value and the minimum value of each acquired spectrum are used as Imax and Imin. However, the setting method is not limited to this. For example, a representative one of the acquired spectra is selected and the maximum value is selected. The values at λ1 and λ2 in all spectra may be set as Imax and に お い て Imin, respectively, using values on the horizontal axis that generate values and local minimum values (respectively λ1 and λ2; the unit is wavelength or wave number). If the values on the horizontal axis that generate the maximum value and the minimum value are substantially constant over all points of the sample, this is substantially equivalent to reading the maximum value and the minimum value, and such a setting method is appropriate. Alternatively, if the resonance frequency and relaxation constant (described later) of the target substance and the magnitude of the non-resonant component are known, the value of the horizontal axis that generates the maximum value and the minimum value can be calculated in advance by theoretical calculation. , Λ2 ′, spectral values at λ1 ′ and λ2 ′ may be Imax and Imin. Alternatively, λ1 ′ and λ2 ′ may be determined from spectra acquired by prior measurement, and the spectrum values at λ1 ′ and λ2 ′ may be Imax and Imin.
　ここで数１により定量値が取得される原理とその特長について述べる。まず、測定対象物質の共鳴周波数が観測スペクトル範囲内でただ１つだとすると、CARSにより試料から発生する光の電場は Here, the principle of obtaining a quantitative value by Equation 1 and its features are described. First, assuming that the resonance frequency of the target substance is only one in the observed spectrum range, the electric field of light generated from the sample by CARS is
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
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と表される。ここでANRは非共鳴成分の電場、ARは共鳴成分の大きさを表す係数、ω分光器で観測される周波数、ω0は共鳴周波数、Γは緩和定数（共鳴成分に固有の値）である。ARは被測定物質の濃度や分子数に比例するため、これが定量すべき値である。ωは励起光の周波数ωp、ストークス光の周波数ωsとω=２ωp-ωsの関係があり、アンチストークス周波数と呼ばれる。上記いずれの変数も正の実数である。観測されるスペクトル（ＣＡＲＳスペクトル）は、この光の電場の強度、すなわち絶対値の自乗であり、 It is expressed. Here, ANR is the electric field of the non-resonant component, AR is a coefficient representing the magnitude of the resonant component, the frequency observed by the ω spectrometer, ω 0 is the resonant frequency, and Γ is a relaxation constant (a value unique to the resonant component). Since AR is proportional to the concentration of the substance to be measured and the number of molecules, this is the value to be quantified. ω has a relationship of the pumping light frequency ωp, the Stokes light frequency ωs, and ω = 2ωp−ωs, and is called an anti-Stokes frequency. Any of the above variables are positive real numbers. The observed spectrum (CARS spectrum) is the intensity of the electric field of this light, that is, the square of the absolute value,
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
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と表される。典型的なCARSスペクトルを図４に示す。このように、ＣＡＲＳスペクトルは共鳴周波数ω０よりも低い周波数で極小値、高い周波数で極大値を取る。ここで、ＣＡＲＳの電場Ｅ（ω）のωを変化させたときの軌跡を複素平面上に図示すると図5のようになる。すなわち、実軸とANRで接する半径AR/Γの円であり、ωの増大によりANRを起点として時計回りに一周し、ω→＋∞で再びANRに戻る。ここで、Γは非測定物質の量によらない定数なので、この円の直径AR/Γが物質の量に比例した定量値となる。ここで、スペクトルの極大、極小と円の直径の関係は以下のようになっている。観測されるスペクトルの値は数３により、図5の軌跡のある１点の絶対値の自乗、すなわち原点からの距離の自乗である。従って、スペクトルの極大値と極小値は、円の軌跡の中で原点から最も近い点と最も遠い点、すなわち図5のように原点から円の中心に向かって引いた直線と円の２つの交点に対応する。ここで幾何学的に明らかなように、円の直径はこれら２つの交点間の距離となるので、結局数１で表される。このように、定量値ＡＲ/Γが数１で表されることが示された。なお、試料が複数の共鳴周波数をもつ場合であっても、それぞれの共鳴周波数が十分離れていれば、個別の共鳴周波数に対して同様の定量を行うことが可能である。 It is expressed. A typical CARS spectrum is shown in FIG. Thus, the CARS spectrum takes a minimum value at a frequency lower than the resonance frequency ω0 and a maximum value at a higher frequency. Here, the locus when the ω of the electric field E (ω) of CARS is changed is illustrated on the complex plane as shown in FIG. That is, it is a circle with a radius AR / Γ that contacts the real axis at ANR, and when it increases ω, it makes a round clockwise starting from ANR, and returns to ANR again at ω → + ∞. Here, since Γ is a constant not depending on the amount of the non-measurement substance, the diameter AR / Γ of this circle is a quantitative value proportional to the amount of the substance. Here, the relationship between the maximum and minimum of the spectrum and the diameter of the circle is as follows. The observed spectrum value is the square of the absolute value of one point having the locus in FIG. 5, that is, the square of the distance from the origin, according to Equation 3. Therefore, the local maximum and minimum values of the spectrum are the closest point and the farthest point from the origin in the circle's trajectory, that is, the two intersections of the straight line drawn from the origin toward the center of the circle as shown in FIG. Corresponding to Here, as apparent geometrically, the diameter of the circle is the distance between these two intersections, and is therefore expressed by the following equation (1). Thus, it was shown that the quantitative value AR / Γ is expressed by Equation 1. Even when the sample has a plurality of resonance frequencies, the same quantification can be performed for individual resonance frequencies as long as the resonance frequencies are sufficiently separated.
　数１とＡＲが比例関係になっているということは、単に数１が定量値であるということ以上の意味を持つ。なぜなら、真に定量したい量（ここでは物質の濃度もしくは分子数）と定量値が比例関係であることにより、複数の空間点から取得された定量値の和を取ることで、試料全体の定量値となるからである。仮に数１がＡＲに比例しない場合、測定点ごとの数１の値の和は全体の定量値とならず、全体の定量値を得るためには追加の演算もしくは校正が必要になる。（このことは、例えば仮に数１がＡＲの自乗に比例する場合などを考えれば明白である。）従って本発明の定量方法は、所定の領域内の物質量を定量する際に特に有効である。 The fact that number 1 and AR are in a proportional relationship means more than simply that number 1 is a quantitative value. Because the amount to be truly quantified (in this case, the concentration of the substance or the number of molecules) and the quantitative value are in a proportional relationship, the sum of the quantitative values obtained from multiple spatial points is taken, and the quantitative value of the entire sample Because it becomes. If equation 1 is not proportional to AR, the sum of the values of equation 1 for each measurement point is not the entire quantitative value, and additional calculation or calibration is required to obtain the entire quantitative value. (This is obvious if the number 1 is proportional to the square of AR, for example.) Therefore, the quantification method of the present invention is particularly effective in quantifying the amount of a substance in a predetermined region. .
　数１で表される定量値は以下のような特長がある。（１）非共鳴成分の大きさＡＮＲによらない（２）共鳴周波数が変化しても値が変化しない、（３）共鳴成分、非共鳴成分の大小関係によらず定量値として扱える、（４）共鳴周波数が未知であっても適用可能、（５）複雑な信号処理が不要。従来の定量方法でこれらの特長を同時に満たすものはなく、孤立した共鳴信号に対しては本定量値は従来に比べ高速、かつ正確な定量を可能とする。 Quantitative value expressed by Equation 1 has the following features. (1) The magnitude of the non-resonant component does not depend on the ANR. (2) The value does not change even if the resonance frequency changes. (3) It can be treated as a quantitative value regardless of the magnitude relationship between the resonant component and the non-resonant component. Applicable even when the resonance frequency is unknown. (5) No complicated signal processing is required. None of the conventional quantification methods satisfy these features at the same time, and this quantification value enables faster and more accurate quantification for isolated resonance signals.
　上記の説明では共鳴信号が孤立していることを前提としていたが、厳密にはこれは必ずしも必要でなく、例えば類似した複数の共鳴周波数に対応する複数の物質の量の合計を求めるのにも有効である。このことを確かめるため、脂肪細胞に対してＣＡＲＳスペクトル測定を行った。脂肪細胞は2900cm-1付近に脂肪分子のＣＨ２，ＣＨ３骨格に由来する複数の共鳴周波数を有しており、これらが混在したスペクトルが観測される。脂肪分子の種類は複数存在し、観測場所により組成比が異なることが推定される（後述するラマンスペクトルの形状が場所により異なることから推定される。）取得されたＣＡＲＳスペクトルの1例を図6に示す。本実施例では2900cm-1付近の極大値と極小値を読み取り、数１に基づき定量値を算出した。また比較のため、従来の定量値である極大値と極小値の差（非特許文献４）、比（非特許文献５）も併せて算出した。さらに定量性の指標として、最大エントロピー法と特異値分解を用いてラマンスペクトルを復元し、2900cm-1付近のピーク面積を参照値とした（この定量値の算出には数10分程度の時間を要する）。上記3種類の定量値と参照値との相関をプロットしたものを図7に示す。従来の定量値は参照値に対して比例関係が成立していないのに対し、本発明の定量値は明らかに線形な相関が認められる。従って複数の非測定分子が混在し、共鳴周波数が孤立していないような状況でも、それらの総量に対する定量値として数１を用いることができる。 In the above explanation, it is assumed that the resonance signal is isolated. However, strictly speaking, this is not always necessary. For example, the total amount of a plurality of substances corresponding to a plurality of similar resonance frequencies may be obtained. It is valid. In order to confirm this, CARS spectrum measurement was performed on fat cells. A fat cell has a plurality of resonance frequencies derived from the CH2 and CH3 skeletons of fat molecules in the vicinity of 2900 cm-1, and a spectrum in which these are mixed is observed. There are a plurality of types of fat molecules, and it is estimated that the composition ratio varies depending on the observation location (estimated because the shape of the Raman spectrum described later varies depending on the location). An example of the acquired CARS spectrum is shown in FIG. Shown in In this example, the maximum value and the minimum value near 2900 cm −1 were read, and the quantitative value was calculated based on Equation 1. For comparison, the difference between the local maximum value and the local minimum value (Non-Patent Document 4) and the ratio (Non-Patent Document 5) were also calculated. Furthermore, as an index of quantification, the Raman spectrum was restored using the maximum entropy method and singular value decomposition, and the peak area near 2900 cm-1 was used as a reference value. Cost). FIG. 7 shows a plot of the correlation between the three types of quantitative values and the reference value. Whereas the conventional quantitative value is not proportional to the reference value, the quantitative value of the present invention clearly has a linear correlation. Therefore, even in a situation where a plurality of non-measurement molecules are mixed and the resonance frequency is not isolated, Equation 1 can be used as the quantitative value for the total amount.
　本実施例では照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部としてＸＹＺステージ１２を用い、測定点の走査のために試料位置を走査したが、照射制御部による光照射位置の制御方法はこの限りではない。例えば、照射制御部として励起光・ストークス光の試料への入射角度を外部制御により走査するガルバノミラー、MEMSミラーなどのスキャンミラーを用いてもよいし、対物レンズ１０９の位置を走査しても構わない。あるいは上に述べた方法の組み合わせであっても構わない。特にガルバノミラーを用いて1軸をスキャンする場合の例について図8を用いて説明する。この場合、ダイクロイックミラー108と対物レンズ109の間にガルバノミラー1601を挿入し、励起光・ストークス光が反射してから対物レンズ109に入射する構成とする。ここで、ガルバノミラーはコンピュータ13からの外部制御により設置角度が制御され、これにより励起光・ストークス光の光束の角度を制御することができる。ガルバノミラーにより角度が変化した励起光・ストークス光は試料中で角度変化前と異なる位置に集光され、CCDカメラの受光面においても発生したCARS光が異なる位置に入射される。ここでガルバノミラーの角度走査方向を、CCDカメラの受光面においてCARS光の位置が図204の垂直方向（分光される方向と垂直な方向）に変化するように設定する。この場合、CARS光のビーム203が垂直方向に移動するが、上述のようにデータ取得時には垂直方向に積算されたデータが出力されるため、ビームの位置が変化しても出力信号には影響がない。他の軸はXYZステージ12を用いて走査する。この動作はMEMSミラーなどの他のスキャンミラーを用いても同様である。これらのスキャンミラーは通常、XYZステージなどに比べると高速に動作するため、これらを適用することにより、より高速な測定が可能である。 In this embodiment, the XYZ stage 12 is used as an irradiation control unit for controlling the light irradiation position on the sample by the irradiation optical system, and the sample position is scanned for scanning the measurement point. However, the light irradiation position is controlled by the irradiation control unit. The method is not limited to this. For example, a scanning mirror such as a galvanometer mirror or a MEMS mirror that scans the incident angle of the excitation light / Stokes light to the sample by external control may be used as the irradiation control unit, or the position of the objective lens 109 may be scanned. Absent. Alternatively, a combination of the methods described above may be used. An example in which one axis is scanned using a galvanometer mirror will be described with reference to FIG. In this case, a galvanometer mirror 1601 is inserted between the dichroic mirror 108 and the objective lens 109 so that the excitation light / Stokes light is reflected before entering the objective lens 109. Here, the installation angle of the galvanometer mirror is controlled by the external control from the computer 13, and thereby the angle of the luminous flux of the excitation light / Stokes light can be controlled. The excitation light and Stokes light whose angle has been changed by the galvanometer mirror is condensed at a position different from that before the angle change in the sample, and the generated CARS light also enters the light receiving surface of the CCD camera at a different position. Here, the angular scanning direction of the galvanometer mirror is set so that the position of the CARS light on the light receiving surface of the CCD camera changes in the vertical direction in FIG. In this case, the beam 203 of the CARS light moves in the vertical direction. However, since the data accumulated in the vertical direction is output at the time of data acquisition as described above, the output signal is not affected even if the beam position changes. Absent. The other axes are scanned using the XYZ stage 12. This operation is the same when another scan mirror such as a MEMS mirror is used. Since these scan mirrors usually operate at a higher speed than an XYZ stage, it is possible to perform a higher-speed measurement by applying them.
　また、本実施例で分光器は励起光・ストークス光の試料への入射側と反対側に配置されているが、同じ側に配置し、試料からの後方散乱光を対物レンズ１０９で平行光として分光器で検出してもよい。この場合、図9の模式図に示すように、励起光・ストークス光とＣＡＲＳ光が同軸となるため、ビームスプリッタ３０１などを用いてＣＡＲＳ光を励起光・ストークス光と分離する必要がある。 In this embodiment, the spectroscope is arranged on the side opposite to the excitation light / Stokes light incident side of the sample. However, the spectroscope is arranged on the same side, and the backscattered light from the sample is converted into parallel light by the objective lens 109. You may detect with a spectrometer. In this case, as shown in the schematic diagram of FIG. 9, since the excitation light / Stokes light and the CARS light are coaxial, it is necessary to separate the CARS light from the excitation light / Stokes light using a beam splitter 301 or the like.
　本実施例では検出器としてＣＣＤカメラを想定したが、検出器はこの限りではなく、ＣＯＭＳカメラや１次元の検出器アレイであるラインセンサを用いた場合も同様の効果を得ることができる。 In this embodiment, a CCD camera is assumed as a detector. However, the detector is not limited to this, and a similar effect can be obtained when a line sensor that is a COMS camera or a one-dimensional detector array is used.
　本実施例は試料の位置ごとに異なるスペクトルを出力してイメージングが可能なものとなっているが、試料の１点あるいは複数点のスペクトルを分析する分析手段にも同一の方法が適用できることは言うまでもない。 In this embodiment, imaging is possible by outputting different spectra for each position of the sample, but it goes without saying that the same method can be applied to analysis means for analyzing the spectrum of one or more points of the sample. Yes.
　本実施例では励起光源として短パルスレーザ、ストークス光源としてフォトニック結晶ファイバを用いたが、光源の構成に関してはこの限りではない。例えばフォトニック結晶の代わりにパルス幅10fs程度のモード同期レーザを用いてもよいし、励起光とプローブ光を別々の短パルスレーザ光源から用いてもよい。 In this embodiment, a short pulse laser is used as the excitation light source and a photonic crystal fiber is used as the Stokes light source. However, the configuration of the light source is not limited to this. For example, a mode-locked laser having a pulse width of about 10 fs may be used instead of the photonic crystal, or excitation light and probe light may be used from separate short pulse laser light sources.
　本実施例は、ストークス光の波長を2種類に切り替えてデータを取得する実施形態である。本実施例の構成図を図10に示す。実施例１との違いは、ストークス光の発生源として光パラメトリック発振器1001を用いる点と、ＣＡＲＳ信号の検出に光電子増倍管1002を用いている点である。光パラメトリック発振器1001は、励起光が非線形結晶1003を通過して半分の波長になったものが入力され、非線形光学過程のひとつであるパラメトリック過程により異なる波長のシグナル光、アイドラ光を出力するものであり、励起光、シグナル光、アイドラ光の周波数をそれぞれωｐ、ωsig、ωidlerとすると、 This example is an embodiment in which data is acquired by switching the wavelength of Stokes light to two types. A configuration diagram of this embodiment is shown in FIG. The difference from the first embodiment is that an optical parametric oscillator 1001 is used as a Stokes light generation source, and a photomultiplier tube 1002 is used to detect a CARS signal. The optical parametric oscillator 1001 is input with pumping light that has passed through the nonlinear crystal 1003 and having a half wavelength, and outputs signal light and idler light of different wavelengths by a parametric process, which is one of the nonlinear optical processes. Yes, if the frequencies of excitation light, signal light, and idler light are ωp, ωsig, and ωidler,
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
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の関係があり、この関係を保ったまま所定の範囲でシグナル光、アイドラ光の波長を調整することができるものである。本実施例ではこのうちシグナル光をストークス光として用いる。本実施例における励起光とストークス光のスペクトル幅は同程度であり、ＣＡＲＳ光はω=２ωp-ωsのほぼ単一周波数となっている。ここで本実施例では光パラメトリック発振器の調整によりストークス光の波長を2通りに設定し、それぞれの波長においてＣＡＲＳ光を光電子増倍管で検出する。ストークス光の設定波長は、予備測定により予め以下のように定めておく。すなわち、光パラメトリック発振器の波長を、ＣＡＲＳ光がちょうど測定対象の共鳴周波数に等しくなる波長の前後で連続的にスキャンをし、ＣＡＲＳ信号が極大値と極小値を取る波長を設定波長とする。あるいは、想定される緩和定数、非共鳴信号の大きさなどからＣＡＲＳ信号が極大値、極小値になると推測される波長を任意に設定してもよい。これら2つの設定波長での試料の各点からのＣＡＲＳ信号の検出器出力をＩmax， Iminとし、実施例１と同様に数１により定量値を算出する。本実施例では実施例１におけるＣＡＲＳスペクトルのうち定量値の算出に使用する2点のみを測定する場合と考えることができ、実施例１と同様の結果が得られることは自明である。 The wavelength of signal light and idler light can be adjusted within a predetermined range while maintaining this relationship. In this embodiment, signal light is used as Stokes light. In this embodiment, the excitation light and the Stokes light have the same spectral width, and the CARS light has a substantially single frequency of ω = 2ωp−ωs. Here, in this embodiment, two wavelengths of Stokes light are set by adjusting the optical parametric oscillator, and CARS light is detected by a photomultiplier tube at each wavelength. The set wavelength of Stokes light is determined in advance as follows by preliminary measurement. That is, the wavelength of the optical parametric oscillator is continuously scanned before and after the wavelength at which the CARS light is just equal to the resonance frequency to be measured, and the wavelength at which the CARS signal takes the maximum value and the minimum value is set as the set wavelength. Or you may set arbitrarily the wavelength estimated that a CARS signal will become the maximum value and the minimum value from the relaxation constant assumed, the magnitude | size of a non-resonance signal, etc. The detector output of the CARS signal from each point of the sample at these two set wavelengths is set to Imax and Imin, and the quantitative value is calculated by Equation 1 as in the first embodiment. In this example, it can be considered that only two points used for calculation of the quantitative value in the CARS spectrum in Example 1 are measured, and it is obvious that the same result as in Example 1 can be obtained.
　本実施例におけるストークス光の光源は光パラメトリック発振器とは限らず、別個に用意したもう一台の短パルスレーザ光源であっても構わない。この場合は2台の短パルス光源のパルス発振のタイミングを同期させる必要があるが、非特許文献７などで報告されているように実現可能である。また、ＣＡＲＳ光の検出器としては光電子増倍管に限らず、アバランシェフォトダイオードもしくはＰＩＮフォトダイオードを用いてもよい。 The Stokes light source in this embodiment is not limited to the optical parametric oscillator, and may be another short pulse laser light source prepared separately. In this case, it is necessary to synchronize the pulse oscillation timings of the two short pulse light sources, but this can be realized as reported in Non-Patent Document 7 and the like. The CARS light detector is not limited to a photomultiplier tube, and an avalanche photodiode or PIN photodiode may be used.
　本実施例は、実施例２における2種類の波長の設定値を高速に切り替える実施例である。本実施例の構成図を図11に示す。本実施例では実施例２の構成に加え、別の短パルスレーザ光源1101（本実施例では発振波長800nm付近のチタンサファイアレーザ）を備える。本実施例では実施例１，２で励起光として用いていた光をストークス光として用い、光パラメトリック発振器のアイドラ光を第一の励起光、短パルスレーザ光源の出射光を第二の励起光として用いる。第一の励起光と第二の励起光はそれぞれ偏光が直交した状態で偏光ビームスプリッタ1102により合波され、合波光束はポッケスルセル1103で所定の偏光状態に変換されたのち、ポラライザ1104を通過して励起光と同一の偏光成分のみが出力される。ポッケルスセル1103は駆動電圧に応じて入力される光の偏光状態を変換する素子であり、本実施例では2種類の駆動電圧に応じ、ポラライザ1104の出力が第一の励起光、第二の励起光のいずれかになるように設定されている。すなわち、励起光がポッケルスセルの駆動電圧に応じて切り替わる構成となっている。ポッケルスセルへの駆動電圧はファンクションジェネレータ1105により生成さており、周波数500kHz、デューティー比１の矩形波信号である。この矩形波信号の参照周波数信号はロックインアンプ1106に送られ、ロックインアンプに入力された光電子増倍管からの出力のうち参照周波数成分が増幅されて出力される。このように励起光の波長を高速に切り替えてＣＡＲＳ信号を測定する方法はFrequency Modulation CARS(FM-CARS)と呼ばれ、非特許文献８に詳しく述べられている。本実施例では第一の励起光、第二の励起光がそれぞれＣＡＲＳスペクトルの極大値、極小値となるよう波長を予め設定しておく。従ってロックインンプ1106の出力aはImax-Iminとなる。また、光電子増倍管の出力は分岐されてローパスフィルタにも送られ、ＤＣ成分b=(Imax＋Imin)/2が出力される。このとき、数１に相当する出力は This example is an example in which the setting values of the two types of wavelengths in Example 2 are switched at high speed. FIG. 11 shows a configuration diagram of this embodiment. In this embodiment, in addition to the configuration of Embodiment 2, another short pulse laser light source 1101 (in this embodiment, a titanium sapphire laser having an oscillation wavelength of about 800 nm) is provided. In this embodiment, the light used as the pump light in the first and second embodiments is used as the Stokes light, the idler light of the optical parametric oscillator is used as the first pump light, and the light emitted from the short pulse laser light source is used as the second pump light. Use. The first excitation light and the second excitation light are combined by the polarization beam splitter 1102 in a state where the polarizations are orthogonal to each other, and the combined light flux is converted into a predetermined polarization state by the pocket lens 1103 and then passes through the polarizer 1104. Thus, only the same polarization component as the excitation light is output. The Pockels cell 1103 is an element that converts the polarization state of light input according to the drive voltage. In this embodiment, the output of the polarizer 1104 is the first excitation light and the second excitation light according to the two types of drive voltages. It is set to be one of the light. That is, the excitation light is switched according to the driving voltage of the Pockels cell. The drive voltage to the Pockels cell is generated by the function generator 1105 and is a rectangular wave signal having a frequency of 500 kHz and a duty ratio of 1. The reference frequency signal of the rectangular wave signal is sent to the lock-in amplifier 1106, and the reference frequency component of the output from the photomultiplier tube input to the lock-in amplifier is amplified and output. A method for measuring the CARS signal by switching the wavelength of the excitation light at this high speed is called Frequency Modulation CARS (FM-CARS), and is described in detail in Non-Patent Document 8. In this embodiment, the wavelengths are set in advance so that the first excitation light and the second excitation light have the maximum value and the minimum value of the CARS spectrum, respectively. Therefore, the output a of the lock amplifier 1106 is Imax-Imin. Further, the output of the photomultiplier tube is branched and sent to a low-pass filter, and a DC component b = (Imax + Imin) / 2 is output. At this time, the output corresponding to Equation 1 is
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により得られる。すなわち、ロックインアンプ1106とローパスフィルタ1107の出力はそれぞれコンピュータ11により取り込まれ、コンピュータ11において数５の演算が実施されて定量値が取得される。本実施例では実施例2に比べ、高速に波長を切り替えることができるため高速な測定が可能であり、またロックインアンプを使用することでＳ／Ｎ比の改善をはかることができる。 Is obtained. That is, the outputs of the lock-in amplifier 1106 and the low-pass filter 1107 are taken in by the computer 11 and the calculation of Formula 5 is performed in the computer 11 to obtain a quantitative value. In this embodiment, the wavelength can be switched at a higher speed than in the second embodiment, so that a high-speed measurement is possible, and the S / N ratio can be improved by using a lock-in amplifier.
　なお、データの取得方法としては上記に限らず、例えば光電子増倍管1002の出力を直接コンピュータ11で取り込み、最大値と最小値をそれぞれImax、Iminとして数１により定量値を算出してもよい。あるいは光電子増倍管1002の出力をアナログ平方根演算回路に入力し、その出力をロックインアンプで検出してもよい。また、光源の構成としては3種類の波長の光束が用意できればよく、3台の別々のレーザを用いるなどしてもよい。 Note that the data acquisition method is not limited to the above, and for example, the output of the photomultiplier tube 1002 may be directly captured by the computer 11 and the quantitative value may be calculated by Equation 1 with the maximum value and the minimum value as Imax and Imin, respectively. . Alternatively, the output of the photomultiplier tube 1002 may be input to an analog square root arithmetic circuit and the output may be detected by a lock-in amplifier. Further, as the configuration of the light source, it is sufficient that light beams of three types of wavelengths can be prepared, and three separate lasers may be used.
　本実施例はヘテロダイン検出を適用する実施形態である。本実施例の構成図を図12に示す。本実施例では実施例１と同様に励起光、ストークス光が生成さて合波されたのち、ビームスプリッタ1201により合波光束が2分岐され、それぞれ別の対物レンズ109，1202により別々の試料に110、1203に集光される。試料110が測定試料であり、実施例１と同様にＣＡＲＳ光が発生して対物レンズ111で平行光とされ、フィルタ112を通過して励起光、ストークス光が遮断される。試料1203(本実施例ではガラス板)は共鳴成分を含まない、非共鳴成分のみからなるＣＡＲＳ光を生成し、このＣＡＲＳ光は対物レンズ1204で平行光とされ、フィルタ1205を通過して励起光、ストークス光が遮断される。これら２つのＣＡＲＳ光はビームスプリッタ1206で合波され、2つの干渉光束が生成される。これらの干渉光束はともに分光器114に入射し、ＣＣＤカメラ115により検出される。ここで、2つの干渉光束は分光器の入射スリットおいてスリット方向の異なる位置に集光される。このためＣＣＤカメラ上において図13の203、1301に示すように分離されて照射され、別々のスペクトル信号として出力される（これらの光を別々に検出するため、実施例１で述べたfull vertical binningは行わない）。これらのスペクトル(それぞれI1(ω)、I2(ω)とする)はコンピュータ11で取り込まれる。コンピュータ11においてこれらのスペクトルの差分ΔI(ω)=I1(ω)-I2(ω)をとり、ΔI(ω)の極大値ΔImax、極小値ΔIminの差ΔImax-ΔIminを計算し、これを定量値とする。これが実施例１の数１に相当することを以下に説明する。試料110から生成されたＣＡＲＳ光の電場をE1(ω)、試料1203から生成されたＣＡＲＳ光の電場をE2(ω)とすると、２つの干渉光束の電場は This example is an embodiment to which heterodyne detection is applied. A configuration diagram of this embodiment is shown in FIG. In the present embodiment, the excitation light and Stokes light are generated and combined in the same manner as in the first embodiment, and then the combined light beam is split into two by the beam splitter 1201. , 1203 is condensed. The sample 110 is a measurement sample, and CARS light is generated and converted into parallel light by the objective lens 111, and the excitation light and Stokes light are blocked through the filter 112 as in the first embodiment. A sample 1203 (a glass plate in this embodiment) generates CARS light that does not include a resonance component and includes only a non-resonance component. This CARS light is converted into parallel light by an objective lens 1204 and passes through a filter 1205 to be excitation light. , Stokes light is blocked. These two CARS lights are combined by a beam splitter 1206 to generate two interference light beams. Both of these interference light beams enter the spectroscope 114 and are detected by the CCD camera 115. Here, the two interference light beams are condensed at different positions in the slit direction in the entrance slit of the spectrometer. For this reason, as shown by 203 and 1301 in FIG. 13, they are separated and irradiated and output as separate spectral signals (in order to detect these lights separately, full vertical binning described in Embodiment 1). Do not do). These spectra (referred to as I1 (ω) and I2 (ω), respectively) are captured by the computer 11. The computer 11 calculates the difference ΔI (ω) = I1 (ω) -I2 (ω) of these spectra, calculates the difference ΔImax-ΔImin between the maximum value ΔImax and the minimum value ΔImin of ΔI (ω), and calculates this quantitative value. And It will be described below that this corresponds to the number 1 in the first embodiment. If the electric field of the CARS light generated from the sample 110 is E1 (ω) and the electric field of the CARS light generated from the sample 1203 is E2 (ω), the electric fields of the two interference light fluxes are
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となり、これらの検出信号、すなわち強度の差は These detection signals, that is, the difference in intensity,
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
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と表される。φはＥ１（ω）、Ｅ２（ω）の位相差である。数7は、電場Ｅ１（ω）を、複素平面上で原点を通り実軸と角度φをなす直線状に射影した値と｜Ｅ２（ω）｜の積である。Ｅ２（ω）は非共鳴成分のみを含むため、ここではωによらず一定値とみなす。ここで、図１４のように、Ｅ１（ω）の複素平面上での軌跡は既に述べたように直径ＡＲ／Γの円なので、φの大きさによらず、この軌跡の射影は長さＡＲ／Γの線分となる。この線分の両端は数7の最大値、最小値に相当するため、これらの差分はＡＲ／Γに比例し、実施例１の数１と同様の定量値となる。加えて本実施例では定量値が｜Ｅ２（ω）｜との積となっているため、Ｅ２（ω）として強度の高い光を用いることで増幅効果がある。通常、このように観測対象となる光を別の同一波長の光と干渉させて検出するヘテロダイン検出においては、φの値により出力が変動するため、干渉させる２つの光の位相を安定化させるか、もしくは互いに異なる2通りの位相（多くの場合0度と90度）での干渉光を検出してφの変化を補正する必要があるが（例えば非特許文献９を参照のこと）、本実施例においてはＥ１（ω）の軌道が円形であることに由来し、φの値に関係なく数７の演算により定量値ＡＲ／Γを算出することが可能である。なお、φの値が0-2πの全範囲の値を取り得る場合、取得するスペクトル範囲は共鳴周波数の前後にわたり十分広くする必要がある（そうでない場合、円形の軌道のＡＮＲに近い部分が欠けることになるため）。 It is expressed. φ is the phase difference between E1 (ω) and E2 (ω). Equation 7 is the product of | E2 (ω) | and a value obtained by projecting the electric field E1 (ω) in a straight line passing through the origin on the complex plane and forming an angle φ with the real axis. Since E2 (ω) includes only non-resonant components, it is regarded as a constant value here regardless of ω. Here, as shown in FIG. 14, the locus of E1 (ω) on the complex plane is a circle of diameter AR / Γ as described above, and therefore the projection of this locus has a length AR regardless of the size of φ. / Γ line segment. Since both ends of this line segment correspond to the maximum value and the minimum value of Formula 7, these differences are proportional to AR / Γ and become the same quantitative values as in Formula 1 of Example 1. In addition, since the quantitative value is a product of | E2 (ω) | in the present embodiment, there is an amplification effect by using high intensity light as E2 (ω). Normally, in heterodyne detection, in which the light to be observed is detected by interfering with light of the same wavelength, the output varies depending on the value of φ. Alternatively, it is necessary to detect interference light at two different phases (in many cases, 0 degrees and 90 degrees) to correct the change in φ (see, for example, Non-Patent Document 9). In the example, the orbit of E1 (ω) is circular, and the quantitative value AR / Γ can be calculated by the calculation of Equation 7 regardless of the value of φ. If the value of φ can take the entire range of 0-2π, the acquired spectrum range needs to be sufficiently wide before and after the resonance frequency (otherwise, the portion close to the ANR of the circular orbit is missing. Because it will be.)
　なお、試料110からのＣＡＲＳ光と干渉させる別の光は別の試料からのＣＡＲＳ光である必要はなく、例えばフォトニック結晶ファイバ104から発生するスーパーコンティニューム光のうち、ＣＡＲＳ光と同一波長の成分を用いてもよい。また、実施例２のごとくストークス光の帯域が広くない場合においても、ＣＡＲＳ光と同一波長の光を用意することによりヘテロダイン検出を行うことができ、本実施例と同様の定量値の算出が可能である。例えば実施例２において光パラメトリック発振器のアイドラ光はＣＡＲＳ光と同一の波長となるため、図15の構成によりこれをＣＡＲＳ光と干渉させ、干渉光を検出すればよい。この場合、2つの干渉光は別々の光電子増倍管1002、1501で検出され、これらの出力の差分が差動回路1502により演算され、その出力がコンピュータ11に入力される。差分の演算はコンピュータ上で行ってもよい。極大値、極小値にの設定波長については実施例２に述べた方法により同様に決定することができる。 The other light that interferes with the CARS light from the sample 110 need not be the CARS light from another sample. For example, of the supercontinuum light generated from the photonic crystal fiber 104, the same wavelength as the CARS light is used. Ingredients may be used. Further, even when the Stokes light band is not wide as in the second embodiment, heterodyne detection can be performed by preparing light having the same wavelength as the CARS light, and the same quantitative value as in the present embodiment can be calculated. It is. For example, in the second embodiment, the idler light of the optical parametric oscillator has the same wavelength as the CARS light. Therefore, the interference light may be detected by causing it to interfere with the CARS light with the configuration shown in FIG. In this case, the two interference lights are detected by separate photomultiplier tubes 1002 and 1501, the difference between these outputs is calculated by the differential circuit 1502, and the output is input to the computer 11. The calculation of the difference may be performed on a computer. The setting wavelength for the maximum value and the minimum value can be determined in the same manner by the method described in the second embodiment.
　本実施例では干渉光が２つ生成される構成としたが、干渉光が3つ以上であってもそのうち2つに対して上記のような検出を行えば同様の効果が得られることは言うまでもない。 In this embodiment, two interference lights are generated, but it goes without saying that the same effect can be obtained if the above detection is performed on two of the interference lights even if there are three or more. Yes.
　本実施例は、本発明の光学分析装置を単一細胞解析に適用した生体分子解析装置の実施例であり、細胞解析の一つの形態としてＣＡＲＳスペクトルを取得する実施例である。 This example is an example of a biomolecule analysis device in which the optical analysis device of the present invention is applied to single cell analysis, and is an example of acquiring a CARS spectrum as one form of cell analysis.
　図16、図17は、本実施例に係る生体分子解析装置の構成例を示す模式図である。図16は本装置の光学系部分を示した概略図であり、図17は生体分子採取システムの構成例を示す試料の周辺の詳細図である。図17には遺伝子発現解析を行うために試料である細胞のｍＲＮＡを捕捉する生体分子採取システム２が含まれている。光学系部分及び生体分子採取システムはコンピュータ１１により制御され、またデータの取得が行われる。 FIG. 16 and FIG. 17 are schematic views showing a configuration example of the biomolecule analyzing apparatus according to the present embodiment. FIG. 16 is a schematic view showing an optical system portion of the present apparatus, and FIG. 17 is a detailed view of the periphery of a sample showing a configuration example of a biomolecule collection system. FIG. 17 includes a biomolecule collection system 2 that captures the mRNA of a sample cell for gene expression analysis. The optical system part and the biomolecule collection system are controlled by the computer 11 and data acquisition is performed.
　（光学系部分の説明）
図１６に示した装置の光学系部分は、構成に加え、微分観察系と、細胞破壊用レーザ５（波長３５５ｎｍ、平均出力２Ｗ、繰り返し周波数５ｋＨｚのパルスレーザ）及びドライバ６０２、レーザ５からの出射光を励起光と同軸にするためのダイクロイックミラー６０３を備える。光学系部分には、（１）微分干渉顕微鏡像の取得、（２）ＣＡＲＳスペクトルの取得、（３）細胞の破壊、の３つの機能が含まれる。それぞれについて以下に説明する。（１）について、まず照明４０１（ハロゲンランプ）からの照明光を、ウォラストンプリズム４０２を通過させてからダイクロイックミラー４０３で反射させてコンデンサレンズ１１１によって試料１１０に集光し、試料１１０の微分干渉像を対物レンズ１０９、ダイクロイックミラー４０４、ウォラストンプリズム４０５、ポラライザ４０６、結像レンズ４０７を用いてＣＣＤカメラ４０８等の撮像装置上に結像させて試料のイメージを取得する。この構成はよく知られた微分干渉顕微鏡のそれと同一である。なお、ダイクロイックミラー４０３，４０４は照明４０１の可視光域の波長（４００－７００ｎｍ）は反射し、励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光（いずれも７００ｎｍ以上の近赤外域の波長を有する）は透過するように設計されており、ＣＡＲＳ信号の生成、検出には影響を及ぼさない。（２）の機能については実施例１で述べたとおりである。（３）の機能は、細胞破壊用レーザ５からの出射光を対物レンズ１０９により観測対象の細胞に集光し、細胞を破壊して細胞内部のｍＲＮＡ等の生体分子を外部に放出させる機能である。放出されたｍＲＮＡは、後述するように生体分子採取システム２により捕捉・解析される。 (Explanation of optical system part)
The optical system portion of the apparatus shown in FIG. 16 includes, in addition to the configuration, a differential observation system, a cell destruction laser 5 (pulse laser with a wavelength of 355 nm, an average output of 2 W, and a repetition frequency of 5 kHz), a driver 602, and an output from the laser 5. A dichroic mirror 603 for making the incident light coaxial with the excitation light is provided. The optical system portion includes three functions: (1) acquisition of differential interference microscope images, (2) acquisition of CARS spectra, and (3) destruction of cells. Each will be described below. As for (1), first, the illumination light from the illumination 401 (halogen lamp) passes through the Wollaston prism 402, is reflected by the dichroic mirror 403, is condensed on the sample 110 by the condenser lens 111, and is subjected to differential interference of the sample 110. The image is imaged on an imaging device such as a CCD camera 408 using the objective lens 109, the dichroic mirror 404, the Wollaston prism 405, the polarizer 406, and the imaging lens 407 to obtain an image of the sample. This configuration is identical to that of the well-known differential interference microscope. The dichroic mirrors 403 and 404 reflect the wavelength (400 to 700 nm) of the visible light region of the illumination 401, and transmit the excitation light, Stokes light, and CARS light (both have a near infrared wavelength of 700 nm or more). It does not affect the generation and detection of CARS signals. The function (2) is as described in the first embodiment. The function (3) is a function of condensing the emitted light from the cell destruction laser 5 on the cell to be observed by the objective lens 109, destroying the cell, and releasing biomolecules such as mRNA inside the cell to the outside. is there. The released mRNA is captured and analyzed by the biomolecule collection system 2 as described later.
　（生体分子採取システムの説明）
図17に示す生体分子採取システム２は、細胞から放出されたｍＲＮＡ等の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスを備える。例えば、単一細胞ごとにアレイデバイスの複数の領域にｍＲＮＡを捕捉し、アレイデバイスにおいて逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。本実施例では、アレイデバイスは、多数の貫通孔が面に垂直に形成された透明な多孔質メンブレンから構築され、以下、これを細孔アレイシート３０と呼ぶ。また、細孔アレイシート３０にｃＤＮＡライブラリーが形成されたものをｃＤＮＡライブラリー細孔アレイシートと呼ぶ。 (Description of biomolecule collection system)
The biomolecule collection system 2 shown in FIG. 17 includes an array device in which regions for capturing biomolecules such as mRNA released from cells are arranged. For example, a cDNA library can be constructed by capturing mRNA in a plurality of regions of the array device for each single cell and performing a reverse transcription reaction in the array device. In this embodiment, the array device is constructed of a transparent porous membrane in which a large number of through holes are formed perpendicular to the surface, and this will be referred to as a pore array sheet 30 hereinafter. A structure in which a cDNA library is formed on the pore array sheet 30 is referred to as a cDNA library pore array sheet.
　本実施例においては、細孔アレイシート３０として、直径０．２μｍの貫通孔が陽極酸化によって多数形成された、厚さ８０μｍ、大きさ２ｍｍ×２ｍｍの酸化アルミニウム製多孔質メンブレンを用いている。細孔アレイシート３０には、生体分子を捕捉する領域同士を分離するため分離壁３１を形成することができる。この分離壁３１は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用い、半導体プロセスにより形成することができ、厚さは８０μｍ程度で細孔アレイシート３０に密着させることができる。 In this example, a porous membrane made of aluminum oxide having a thickness of 80 μm and a size of 2 mm × 2 mm, in which a large number of through-holes having a diameter of 0.2 μm are formed by anodic oxidation, is used as the pore array sheet 30. A separation wall 31 can be formed on the pore array sheet 30 to separate regions that capture biomolecules. The separation wall 31 can be formed by a semiconductor process using polydimethylsiloxane (PDMS), for example, and can be brought into close contact with the pore array sheet 30 with a thickness of about 80 μm.
　図18は、細孔アレイシート３０の上面図である。細孔アレイシート３０（大きさ２ｍｍ×２ｍｍ、厚さ８０μｍ）には、多数の生体分子、例えばｍＲＮＡを捕捉するための領域３００が形成される。領域３００のサイズは、ここでは、一辺を１００μｍとし、間隔を８０μｍとしている（１８０μｍ周期で配置）。領域３００のサイズは、捕捉対象とする生体分子の量や面内での拡散しやすさ（分子の大きさ）に応じて１μｍ程度から１０ｍｍ程度まで自由に設計することが可能である。 FIG. 18 is a top view of the pore array sheet 30. In the pore array sheet 30 (size 2 mm × 2 mm, thickness 80 μm), a region 300 for capturing a large number of biomolecules such as mRNA is formed. Here, the size of the region 300 is set such that one side is 100 μm and the interval is 80 μm (arranged at a cycle of 180 μm). The size of the region 300 can be freely designed from about 1 μm to about 10 mm in accordance with the amount of biomolecules to be captured and the ease of diffusion in the plane (molecule size).
　アレイデバイスとしては、アルミニウムを陽極酸化することによって形成した多孔質メンブレンからなる細孔アレイシート３０の他、シリコン等の材料を陽極酸化することによって多数の貫通孔を形成したものを用いても良い。さらに、半導体プロセスを用いて、シリコン酸化物やシリコン窒化物薄膜に多数の貫通孔を設けることによって、アレイデバイスを構築しても良い。 As the array device, in addition to the pore array sheet 30 made of a porous membrane formed by anodizing aluminum, a device in which a large number of through holes are formed by anodizing a material such as silicon may be used. . Furthermore, an array device may be constructed by providing a large number of through holes in a silicon oxide or silicon nitride thin film using a semiconductor process.
　図17に示すように、細胞から放出される生体分子を、電気泳動によって細孔アレイシート３０における特定の領域まで導く手段として、ループ状の白金電極３２をシールド線３３の先端に接合している。白金電極３２の線材の直径は３０μｍであり、線材を２つ折にして、リード線接合部分を捻って一本化した後、ループ側を直径１００μｍの円形に加工する。このような電極を２つ作製し、細孔アレイシート３０を挟むように配置し、電源３５によって直流１．５Ｖを印加する。放出されるｍＲＮＡ３６は負の電荷を持つので、上側の白金電極３２を正極とする。ただし、銀－塩化銀の参照電極３９を設けて、下側の白金電極３２に０．２Ｖを印加する。このような操作によって、生体分子を捕捉する領域３００の内部にｍＲＮＡ３６を電気泳動によって誘導することができる。また、生体分子の捕捉効率をより向上するために、横方向の電気泳動によるｍＲＮＡの濃縮を実現するため、上側の白金電極３２のループの直径を５０μｍにしても良い。この場合、線材の直径は１０μｍとする。 As shown in FIG. 17, a loop-shaped platinum electrode 32 is joined to the tip of a shield wire 33 as a means for guiding biomolecules released from cells to a specific region in the pore array sheet 30 by electrophoresis. . The diameter of the wire of the platinum electrode 32 is 30 μm. After the wire is folded in half and the lead wire joint portion is twisted into a single piece, the loop side is processed into a circle with a diameter of 100 μm. Two such electrodes are prepared, arranged so as to sandwich the pore array sheet 30, and a direct current of 1.5 V is applied by the power source 35. Since the released mRNA 36 has a negative charge, the upper platinum electrode 32 is used as a positive electrode. However, a silver-silver chloride reference electrode 39 is provided, and 0.2 V is applied to the lower platinum electrode 32. By such an operation, mRNA 36 can be induced by electrophoresis inside the region 300 for capturing biomolecules. Further, in order to further improve the capture efficiency of biomolecules, the diameter of the loop of the upper platinum electrode 32 may be set to 50 μm in order to realize concentration of mRNA by lateral electrophoresis. In this case, the wire has a diameter of 10 μm.
　（動作フローの説明）
次に、本実施例に係る生体分子解析装置の動作フローについて説明する。図19にフローチャートの一例を示す。 (Explanation of operation flow)
Next, an operation flow of the biomolecule analyzer according to the present embodiment will be described. FIG. 19 shows an example of a flowchart.
　最初に接着系培養細胞２１，２２，２３からなる試料をシャーレ２０に載せる。この実施例では測定対象が培養細胞であるから、シャーレ２０を使って事前に培養し、測定対象の細胞が底面に接着するようにする。試料が凍結切片の場合には、これをシャーレ２０の上に載せる。あるいは、複数の細胞をゲル中に３次元的に配置したものを試料としても良い。次に、顕微鏡システムを用いて、対象となる細胞群の微分干渉像を取得し、生体分子を採取、測定する対象細胞をユーザが決定する。次に、コンピュータ１１は、ユーザから測定対象とする細胞又は細胞の部分に関する情報の入力を受ける。一般に、ユーザは複数の細胞を測定対象とする場合が多い。その場合には、生体分子を捕捉する細胞の順序をコンピュータ１１が決定し、まず、１番最初に対象となった細胞が視野の中心に配置されるようにＸＹＺステージ１２を駆動する。ここで、実施例１に述べた方法により視野の中心に配置された細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、取得スペクトルから実施例１に述べる方法により得られた定量値データをコンピュータ１１に保存する。 First, a sample composed of adherent cultured cells 21, 22, and 23 is placed on the petri dish 20. In this embodiment, since the measurement target is a cultured cell, the cell is cultured in advance using the petri dish 20 so that the measurement target cell adheres to the bottom surface. When the sample is a frozen section, it is placed on the petri dish 20. Alternatively, a sample in which a plurality of cells are three-dimensionally arranged in a gel may be used. Next, a differential interference image of a target cell group is acquired using a microscope system, and a user determines a target cell from which a biomolecule is collected and measured. Next, the computer 11 receives input of information regarding a cell or a cell portion to be measured from a user. In general, a user often uses a plurality of cells as a measurement target. In that case, the computer 11 determines the order of cells that capture biomolecules, and first drives the XYZ stage 12 so that the first target cell is placed at the center of the field of view. Here, the CARS spectrum of the cell arranged at the center of the visual field is acquired by the method described in the first embodiment, and the quantitative value data obtained by the method described in the first embodiment is stored in the computer 11 from the acquired spectrum.
　次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を用いて、ＣＡＲＳスペクトルを取得した細胞の近傍（図17の例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，１）番地の領域３００）を接近させる。本実施例では細孔アレイシート３０の下面とシャーレ２０との間の距離を３００μｍに設定しているが、この距離は、採取する生体分子の種類や、電極構造によって変化させることができる。例えば、１μｍから１０ｍｍ程度が好適である。ＸＹＺステージ３４による細孔アレイシート３０の移動は、コンピュータ１１が事前のプログラムに従って自動的に行う。移動の完了をコンピュータ１１が確認した後、電気泳動用の白金電極３２に電圧を印加すると同時に、測定対象とする細胞の細胞膜を破壊するために、細胞破壊用レーザ光源５からのレーザ光を細胞に照射する。ここで照射時間は、例えば１０秒とし、電気泳動駆動時間は６０秒とすることができる。 Next, the computer 11 uses the XYZ stage 34 to locate a specific region (for example, (1, 1)) of the pore array sheet 30 in the vicinity of the cell from which the CARS spectrum was acquired (in the example of FIG. 17, directly above the cell). The address area 300) is approached. In this embodiment, the distance between the lower surface of the pore array sheet 30 and the petri dish 20 is set to 300 μm, but this distance can be changed depending on the type of biomolecule to be collected and the electrode structure. For example, about 1 μm to 10 mm is preferable. The movement of the pore array sheet 30 by the XYZ stage 34 is automatically performed by the computer 11 according to a prior program. After the computer 11 confirms the completion of the movement, a voltage is applied to the platinum electrode 32 for electrophoresis, and at the same time, in order to destroy the cell membrane of the cell to be measured, the laser light from the cell destruction laser light source 5 is applied to the cell. Irradiate. Here, the irradiation time can be, for example, 10 seconds, and the electrophoresis driving time can be 60 seconds.
　一つの細胞の破壊とその細胞中の生体分子の捕捉が終了した後、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ１２を駆動して登録された２番目の対象細胞を視野の中心に位置づける。その後、２番目の細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、コンピュータ１１にデータを保存する。次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を駆動して２番目の対象細胞の近傍（図17の構成例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，２）番地の領域３００）を接近させる。そして、コンピュータ１１に登録された２番目の細胞へ細胞破壊用レーザ５からのレーザ光を照射する。このとき、前記と同様に、同時に白金電極３２に電圧を印加する。その後、順次指定された細胞に対し、上記のＣＡＲＳスペクトル取得を行い、細胞を破壊して、その細胞中の生体分子を細孔アレイシート３０の特定の領域３００に捕捉した後、捕捉した生体分子を測定するための処理を実行する。最後に、微分干渉像における破壊された細胞に相当する部分と、細孔アレイシート３０における生体分子を捕捉した領域３００、取得したＣＡＲＳスペクトルとそこから取得した定量値を対応付けて、ユーザに提示する。 After the destruction of one cell and the capture of the biomolecule in the cell are completed, the computer 11 drives the XYZ stage 12 to position the registered second target cell at the center of the visual field. Thereafter, the CARS spectrum of the second cell is acquired, and the data is stored in the computer 11. Next, the computer 11 drives the XYZ stage 34 to locate a specific region (for example, (1, 2) of the pore array sheet 30 in the vicinity of the second target cell (immediately above the cell in the configuration example of FIG. 17). The address area 300) is approached. Then, the second cell registered in the computer 11 is irradiated with the laser beam from the cell destruction laser 5. At this time, a voltage is simultaneously applied to the platinum electrode 32 as described above. Thereafter, the CARS spectrum is acquired for the sequentially designated cells, the cells are destroyed, the biomolecules in the cells are captured in the specific region 300 of the pore array sheet 30, and then the captured biomolecules are captured. The process for measuring is executed. Finally, the portion corresponding to the destroyed cell in the differential interference image, the region 300 in which the biomolecule is captured in the pore array sheet 30, the acquired CARS spectrum and the quantitative value acquired therefrom are associated with each other and presented to the user To do.
　ここでは破壊する細胞を１細胞としたが、より粗い分解能のデータを取得したい場合は、アレイデバイス上の一つの領域３００に対して、複数の細胞を破壊したときに放出され、電気泳動されるｍＲＮＡを捕捉しても良い。その際の破壊は複数の細胞を同時に破壊しても良いし、アレイデバイスを動かさずに１細胞ずつ順次破壊しても良い。また、本実施例ではＣＡＲＳスペクトルの取得と生体分子の捕捉を異なる細胞に対して順次行うフローとしたが、例えば試料の微分干渉像の取得後、対象となる細胞のＣＡＲＳスペクトルを全て測定したのち、各細胞を順次破壊して生体分子を補足する、というフローであっても構わない。 Here, the cell to be destroyed is one cell. However, if it is desired to acquire data with coarser resolution, one cell 300 on the array device is released and electrophoresed when a plurality of cells are destroyed. mRNA may be captured. In this case, a plurality of cells may be destroyed at the same time, or the cells may be destroyed one by one without moving the array device. In this embodiment, the CARS spectrum is acquired and the biomolecule is captured sequentially for different cells. For example, after acquiring the differential interference image of the sample, all the CARS spectra of the target cells are measured. Alternatively, the flow may be such that each cell is sequentially destroyed to supplement biomolecules.
　本実施例により、個々の細胞に対してＣＡＲＳスペクトルと遺伝子発現データを取得することができる。この機能を利用して、細胞の動的特性を高い精度で確認することが可能となる。このような解析を実行するためのフローチャートを図20に示す。 This example makes it possible to acquire CARS spectra and gene expression data for individual cells. Using this function, it is possible to confirm the dynamic characteristics of cells with high accuracy. A flowchart for performing such an analysis is shown in FIG.
　まず、ＣＡＲＳスペクトルを取得する。取得したＣＡＲＳスペクトルと細胞の詳細な状態との対応を確認したいと考えた時点で、ユーザが選択した細胞について細胞を破壊し、その細胞内の生体分子をアレイデバイス上に捕捉して、その量を計測する。この生体分子の定量によって詳細な細胞の状態や種類を同定し、ＣＡＲＳスペクトルとの対応をとることによって、ＣＡＲＳスペクトルと細胞の状態や種類との対応付けを高精度に行うことが可能となる。ＣＡＲＳスペクトルは、通常単一細胞の解析に用いられる蛍光共焦点顕微鏡に比べてラマンスペクトルを取得可能であるという点で測定対象の化学種に対してより多くの情報を得ることが可能であり、このような高精度な解析が可能となる。 First, the CARS spectrum is acquired. When it is desired to confirm the correspondence between the acquired CARS spectrum and the detailed state of the cell, the cell is destroyed for the cell selected by the user, the biomolecule in the cell is captured on the array device, and the amount of the cell is selected. Measure. By identifying the detailed cell state and type by quantification of the biomolecule and taking the correspondence with the CARS spectrum, the CARS spectrum and the cell state and type can be associated with each other with high accuracy. The CARS spectrum can obtain more information on the chemical species to be measured in that a Raman spectrum can be obtained compared to a fluorescent confocal microscope that is usually used for single cell analysis. Such highly accurate analysis is possible.
　次に、細胞の分類をＣＡＲＳスペクトルで行うための方法について示す。ＣＡＲＳスペクトルとそこから得られる定量値を取得後、例えば１８０個の細胞の２０個の遺伝子発現解析を行って、主因子分析を行い、上位２つの主因子についてプロットした図を図21に示す。図中のＰＣはprincipal componentの略であり、ＰＣ１が第一の主因子、ＰＣ２が第２の主因子を指す。個々の点は１つの細胞の遺伝子発現データに対応する。多くの場合に細胞の状態や種類に対応して複数のクラスター（この例では６個のクラスター）に分かれる。図21において、一つ一つの点は細胞に対応するので、どの細胞がどのような種類の細胞であるかをＣＡＲＳスペクトルだけでは判定できなくても、遺伝子発現解析データに基づいて対応させることができる。この対応付けをメモリに保存しておくことで、どのようなＣＡＲＳスペクトル、定量値が得られたときにどのような細胞の状態や種類になるかを判定させるような機械学習をコンピュータシステムにさせることができ、学習が完了した後はＣＡＲＳスペクトルと定量値の取得のみで細胞の状態や種類の分類が可能となる。 Next, a method for classifying cells by CARS spectrum will be described. After acquiring the CARS spectrum and the quantitative value obtained therefrom, for example, 20 gene expression analyzes of 180 cells are performed, the main factor analysis is performed, and the top two main factors are plotted in FIG. PC in the figure is an abbreviation for principal-component, where PC1 indicates the first main factor and PC2 indicates the second main factor. Each point corresponds to gene expression data for one cell. In many cases, it is divided into a plurality of clusters (in this example, 6 clusters) corresponding to the state and type of cells. In FIG. 21, since each point corresponds to a cell, even if it is not possible to determine which cell is what kind of cell only by CARS spectrum, it is possible to correspond based on gene expression analysis data. it can. By storing this association in a memory, the computer system is caused to perform machine learning that determines what type of CARS spectrum and quantitative value the cell state and type of when obtained. After learning is completed, it is possible to classify cell states and types only by acquiring CARS spectra and quantitative values.
　なお、この例では、細胞の遺伝子発現に基づくクラスタリングに主因子分析を用いたが、階層的クラスタリングやk-means法等様々の方法を適用することができる。また、機械学習の方法としては、サポートベクタマシン等、データマイニングに用いられる様々な方法が知られており、それらのいずれを用いても良い。 In this example, principal factor analysis is used for clustering based on gene expression of cells, but various methods such as hierarchical clustering and k-means method can be applied. Also, as a method of machine learning, various methods used for data mining such as a support vector machine are known, and any of them may be used.
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。 In addition, this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included. For example, the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described. Further, a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment. Further, it is possible to add, delete, and replace other configurations for a part of the configuration of each embodiment.
　本発明により、大量の試料から高速に情報を取得可能な分析装置を提供することが可能となり、医療や製薬分野における研究開発を加速することができる。 The present invention makes it possible to provide an analyzer capable of acquiring information from a large amount of sample at a high speed, and accelerate research and development in the medical and pharmaceutical fields.
　２：生体分子採取システム、５：細胞破壊用レーザ、１１：コンピュータ、２１，２２，２３：接着系培養細胞、３０：細孔アレイシート、３２：白金電極、１０１：短パルスレーザ光源、１０４：フォトニック結晶ファイバ、１０９：対物レンズ、１１０：試料、１１３：分光器、１１４：分光部、１１５：検出部、２０１：ＣＣＤカメラ受光部、４０１：照明、４０７：結像レンズ、４０８：ＣＣＤカメラ 2: Biomolecule collection system, 5: Laser for cell disruption, 11: Computer, 21, 22, 23: Adherent cultured cells, 30: Pore array sheet, 32: Platinum electrode, 101: Short pulse laser light source, 104: Photonic crystal fiber, 109: objective lens, 110: sample, 113: spectroscope, 114: spectroscopic unit, 115: detection unit, 201: CCD camera light receiving unit, 401: illumination, 407: imaging lens, 408: CCD camera

Claims (10)

  1. 　少なくとも２つの光源と、
    　前記少なくとも2つの光源から生成される光束を試料に照射する照射光学系と、
    　前記試料から生成されるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する検出器と、
    　前記検出器の出力を取り込み、信号処理を行う信号処理部とを備え、
    前記信号処理部は、前記検出器における、コヒーレントアンチストークスラマン散乱が極大になる波長と極小になる波長における前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱の電場の絶対値の差に比例する値を演算し、出力することを特徴とする光学分析装置。     At least two light sources;
    An irradiation optical system for irradiating the sample with a light beam generated from the at least two light sources;
    A detector for detecting coherent anti-Stokes Raman scattered light generated from the sample;
    A signal processing unit that captures the output of the detector and performs signal processing;
    The signal processing unit calculates and outputs a value proportional to a difference between the absolute values of the electric field of the coherent anti-Stokes Raman scattering at a wavelength at which the coherent anti-Stokes Raman scattering becomes a maximum and a wavelength at which the detector becomes a minimum. An optical analyzer characterized by that.
  2. 　請求項１に記載の光学分析装置において、前記検出器は前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光のスペクトルを取得するものであって、
    　前記電場の絶対値の差は、前記スペクトルの極大値と極小値それぞれの平方根の差であることを特徴とする光学分析装置。     The optical analyzer according to claim 1, wherein the detector acquires a spectrum of the coherent anti-Stokes Raman scattering light,
    The difference in absolute value of the electric field is a difference in square root between the maximum value and the minimum value of the spectrum.
  3. 　請求項１に記載の光学分析装置において、前記検出器は前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を少なくとも２つの波長で検出するものであって、
    　前記電場の絶対値の差は、指定された2種類の所定の波長における前記検出器の出力の平方根の差であることを特徴とする光学分析装置。     The optical analyzer according to claim 1, wherein the detector detects the coherent anti-Stokes Raman scattered light at at least two wavelengths,
    The difference between the absolute values of the electric field is a difference between the square roots of the output of the detector at two designated predetermined wavelengths.
  4. 　請求項１に記載の光学分析装置において、前記光源のうち少なくとも１つの波長を2種類の設定波長の間で交互に変調するものであることを特徴とする光学分析装置。 2. The optical analyzer according to claim 1, wherein at least one wavelength of the light source is alternately modulated between two kinds of set wavelengths.
  5. 　請求項４に記載の光学分析装置において、前記検出器の出力の変調成分を出力するロックインアンプを備えることを特徴とする光学分析装置。 5. The optical analyzer according to claim 4, further comprising a lock-in amplifier that outputs a modulation component of the output of the detector.
  6. 　請求項１に記載の光学分析装置において、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を別の光束と干渉させる干渉光学系と、前記干渉光学系から生成される少なくとも2つの干渉光を検出する少なくとも1つの検出器を備えることを特徴とする光学分析装置。 The optical analyzer according to claim 1, wherein the coherent anti-Stokes Raman scattering light interferes with another light beam, and at least one detection that detects at least two interference lights generated from the interference optical system. An optical analyzer comprising a vessel.
  7. 　請求項６の光学分析装置において、前記２つの干渉光のスペクトルをI1(ω)とI2(ω)、これらの差分をΔI（ω)、ΔI（ω)の極大値をΔIｍａｘ、ΔI（ω)の極小値をΔIｍｉｎとしたとき、前記電場の絶対値の差に相当する信号として、ΔIｍａｘ－ΔIｍｉｎを出力することを特徴とする光学分析装置。 7. The optical analyzer according to claim 6, wherein the two interference light spectra are I1 (ω) and I2 (ω), the difference between them is ΔI (ω), and the maximum value of ΔI (ω) is ΔImax, ΔI (ω). An optical analyzer characterized in that ΔImax−ΔImin is output as a signal corresponding to the difference between the absolute values of the electric field when the minimum value of ΔImin is ΔImin.
  8. 　光源と、
    　試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、
    　前記試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、
    　前記光源からの光束を前記試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、
    　光照射によって細胞から発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を分光する分光部と、
    　前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
    　前記検出器の出力を取り込み、信号処理を行う信号処理部と、
    　前記照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、
    　前記試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、
    　破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備え、
    　前記検出部は、前記信号処理部は、前記検出器における、コヒーレントアンチストークスラマン散乱が極大になる波長と極小になる波長における前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱の電場の絶対値の差に比例する値を演算し、出力することを特徴とする生体分子解析装置。     A light source;
    A sample holder for holding a plurality of cells as a sample;
    An observation unit for observing cells held in the sample holding unit;
    An irradiation optical system for condensing and irradiating the light beam from the light source onto the cells held in the sample holder;
    A spectroscopic unit that separates coherent anti-Stokes Raman scattering light generated from cells by light irradiation;
    A detection unit for detecting light split by the spectroscopic unit;
    A signal processing unit that captures the output of the detector and performs signal processing;
    An irradiation control unit for controlling the light irradiation position on the cell by the irradiation optical system;
    Cell disrupting means for destroying cells held in the sample holder;
    A biomolecule capture device that captures biomolecules in the cells released from the cells by destruction,
    In the detector, the signal processing unit has a value proportional to a difference between absolute values of the electric field of the coherent anti-Stokes Raman scattering at a wavelength at which the coherent anti-Stokes Raman scattering becomes a maximum and a wavelength at which the coherent anti-Stokes Raman scattering becomes a minimum. A biomolecule analyzer characterized by calculating and outputting.
  9. 　請求項８に記載の生体分子解析装置において、
    　前記細胞破壊手段はレーザ光照射によって細胞を破壊することを特徴とする生体分子解析装置。     The biomolecule analyzer according to claim 8,
    The biomolecule analyzer characterized in that the cell destruction means destroys cells by laser beam irradiation.
  10. 　請求項８に記載の生体分子解析装置において、
    　前記出力されたスペクトルと、前記生体分子捕捉デバイスを用いて解析されたデータとを対応づけて保存するメモリを有することを特徴とする生体分子解析装置。     The biomolecule analyzer according to claim 8,
    A biomolecule analyzing apparatus comprising: a memory that stores the output spectrum and data analyzed using the biomolecule capturing device in association with each other.
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CN109827943A (en) * 2019-02-27 2019-05-31 山东省食品药品检验研究院 A kind of discrimination method of zopiclone piece

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