WO2006072587A1 - Device and method for fractionating monosaccharide and/or oligosaccharide structures - Google Patents

Device and method for fractionating monosaccharide and/or oligosaccharide structures Download PDF

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WO2006072587A1
WO2006072587A1 PCT/EP2006/000092 EP2006000092W WO2006072587A1 WO 2006072587 A1 WO2006072587 A1 WO 2006072587A1 EP 2006000092 W EP2006000092 W EP 2006000092W WO 2006072587 A1 WO2006072587 A1 WO 2006072587A1
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PCT/EP2006/000092
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Kerstin Steinert
Peter Porschewski
Simone Cartellieri
Jürgen Kuballa
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Qiagen Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • glycosylations For proteins from eukaryotic cells, three types of glycosylations are described, N-glycosylation, O-glycosylation, and modification with a GPI (glycosylated phosphatidyl-inositol) residue. The latter serves to anchor the protein in membranes.
  • a mono- or oligosaccharide in a concentration of 0.02 to 0.8 mol / L is added to this general buffer for the selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures, preferably in a concentration of 0.05 to 0.5 mol / L and more preferably in one Concentration of 0.1 to 0.4 mol / L.

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Abstract

The invention relates to a device for the affinity chromatographic reversible binding of monosaccharide and/or oligosaccharide structures. Also disclosed is a method for fractionating monosaccharide and/or oligosaccharide structures. In a preferred embodiment, the invention relates to a method for fractionating glycoproteins by means of a single affinity chromatographic step.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Fraktionierung von Mono- und/oder Apparatus and method for fractionating mono- and / or
Oligosaccharid-StrukturenOligosaccharide structures
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur affinitätschromatographischen reversiblen Bindung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Fraktionierung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen. In einer bevorzugten Ausführung betrifft die gegenständliche Erfindung ein Verfahren zur Fraktionierung von Glykoproteinen mittels eines einzigen affinitätschromatographischen Schrittes.The present invention relates to a device for affinity chromatographic reversible binding of mono- and / or oligosaccharide structures. Furthermore, the present invention relates to a process for the fractionation of mono- and / or oligosaccharide structures. In a preferred embodiment, the subject invention relates to a method for fractionating glycoproteins by a single affinity chromatographic step.
Die Funktion vieler eukaryotischer Proteine in vivo wird durch eine posttranslationale Modifikationen bestimmt. Eine Möglichkeit einer solchen posttranslationalen Modifikation ist die Phosphorylierung. Hierbei wird eine Phosphatgruppe enzymatisch auf spezifische Aminosäuregruppen des Ziel-Proteins übertragen. Bei der Glykosylierung von Proteinen handelt es sich ebenfalls um eine posttranslationale Modifikation. Bei dieser Art der Modifikation wird ein Mono- oder Oligosaccharid auf eine spezifische Aminosäure des Ziel-Proteins übertragen. Aufgrund der hohen Anzahl von Monosacchariden und der zahlreichen Möglichkeiten diese chemisch zu verknüpfen, ergibt sich eine große Vielfalt unterschiedlicher Glycanstrukturen, die sich in einer Reihe von Proteinen wieder finden. Für Proteine aus eukaryotischen Zellen werden drei Typen von Glykosylierungen beschrieben, die N-Glykosylierung, die O-Glykosylierung und die Modifikation mit einem GPI (glykosyliertes Phosphatidyl-Inositol)-Rest. Letztere dient der Verankerung des Proteins in Membranen.The function of many eukaryotic proteins in vivo is determined by post-translational modifications. One possibility of such posttranslational modification is phosphorylation. Here, a phosphate group is enzymatically transferred to specific amino acid groups of the target protein. The glycosylation of proteins is also a posttranslational modification. In this type of modification, a mono- or oligosaccharide is transferred to a specific amino acid of the target protein. Due to the high number of monosaccharides and the numerous possibilities of chemically linking them, a large variety of different glycan structures are found, which are found in a number of proteins. For proteins from eukaryotic cells, three types of glycosylations are described, N-glycosylation, O-glycosylation, and modification with a GPI (glycosylated phosphatidyl-inositol) residue. The latter serves to anchor the protein in membranes.
Die aus dem Stand der Technik bekannte Lektin-Affinitätschromatographie nutzt die Eigenschaft von Lektinen, welche eine hohe Affinität zu Kohlenhydraten aufweisen, und an spezifische Bereiche innerhalb einer Glycanstruktur binden können. Diese Bereiche werden durch die enthaltenen Monosaccharide und deren chemische Verknüpfungen bestimmt. Die Bindung erfolgt je nach Lektin selektiv an Mono- oder Oligosaccharid-Strukturen. Mit der Wahl verschiedener Lektin-Affinitätsträger kann neben der Fraktionierung auch eine Differenzierung unterschiedlich glykosilierter Proteine und enthaltener Glykanstrukturen erreicht werden. Zur Isolierung glykosylierter Proteine und der anschließenden Charakterisierung der enthaltenen Glycanstrukturen werden im Stand der Technik derzeit verschiedene Strategien angewendet. Hierzu gehören neben chromatographischen Standardmethoden wie lonenaustausch-, Hydrophobe-Interaktions- oder Größenausschluss-Chromatographie oder auch die Verwendung von Affinitätsträgern mit einem immobilisierten Lektin. So wird beispielsweise in EP 1 333 032 die Aufreinigung eines Antikörpers mittels eines Lektins beschrieben.The lectin affinity chromatography known in the art utilizes the property of lectins which have high affinity for carbohydrates and can bind to specific regions within a glycan structure. These areas are determined by the monosaccharides contained and their chemical linkages. Depending on the lectin, the binding takes place selectively on mono- or oligosaccharide structures. With the choice of different lectin affinity carriers, a differentiation of glycosylated proteins and glycan structures can be achieved in addition to the fractionation. For the isolation of glycosylated proteins and the subsequent characterization of the glycane structures present, various strategies are currently used in the prior art. These include in addition to standard chromatographic methods such as ion exchange, hydrophobic interaction or size exclusion chromatography or the use of affinity carriers with an immobilized lectin. Thus, for example, EP 1 333 032 describes the purification of an antibody by means of a lectin.
Bei der zuletzt genannten Methode erfolgt die spezifische Reinigung von Glykoproteinen, beispielsweise aus Zell-Lysaten oder Serum, mittels eines Affinitätsträgers mit einem immobilisierten Lektin, beispielsweise einer entsprechenden Chromatographie-Säule, oder mittels mehrerer aufeinander folgender Reinigungen über mehrere Affinitätsträger mit jeweils einem aber je Affinitätsträger unterschiedlichen immobilisierten Lektinen. Im letztgenannten Fall wird die Glykoprotein-haltige Probe über den ersten Affinitätsträger gegeben, dass Eluat wird aufgefangen. Das Eluat wird anschließend über den zweiten Affinitätsträger gegeben, usw. Auf diese Weise können verschiedene Gruppen von Glykoproteinen mit jeweils gleichem Glykosilierungstyp fraktioniert werden. Ein solches Verfahren mit zwei aufeinanderfolgenden Reinigungsschritten ist von Hirabayashi und Kasai (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sei.; 771(1- 2):67-87; 2002) beschrieben. Der sich ergebende Nachteil eines solchen Verfahrens ist, dass entsprechend hohe Probenvolumina erforderlich sind, um zwei oder mehr Trennschritte durchzuführen. Die in den Eluat-Fraktionen enthaltenen Glycoproteine können mittels Westem-Blot Analyse, 2D-Gel-Elektrophorese und Massenspektroskopie analysiert werden. Der gleiche Ansatz kann auch mit Peptiden, resultierend aus einem Verdau mit einer Protease, durchgeführt werden. In diesem Fall werden solche Peptide, die über eine Modifikation mit einer Glycanstruktur verfügen, an die Träger gebunden und getrennt. Diese Peptide können anschließend einer Downstream-Analyse, beispielsweise einer Massenspektroskopie, unterzogen werden.In the latter method, the specific purification of glycoproteins, for example from cell lysates or serum, by means of an affinity support with an immobilized lectin, for example a corresponding chromatography column, or by means of several successive purifications over several affinity carriers with one but per affinity carrier different immobilized lectins. In the latter case, the glycoprotein-containing sample is added via the first affinity support, the eluate is collected. The eluate is then passed over the second affinity support, etc. In this way, different groups of glycoproteins each having the same glycosylation type can be fractionated. Such a process with two consecutive purification steps is described by Hirabayashi and Kasai (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life, 771 (1-2): 67-87, 2002). The resulting disadvantage of such a method is that correspondingly high sample volumes are required to perform two or more separation steps. The glycoproteins contained in the eluate fractions can be analyzed by Western blot analysis, 2D gel electrophoresis and mass spectroscopy. The same approach can also be used with peptides resulting from digestion with a protease. In this case, those peptides which have a modification with a glycan structure are bound to the carriers and separated. These peptides may then be subjected to downstream analysis, for example mass spectroscopy.
Die sich aus den aus dem Stand der Technik bekannten Ansätzen ergebenden Nachteile sind zum Einen, dass relativ große Probenvolumina erforderlich sind, zum Anderen, dass mehrere experimentelle Schritte notwendig sind, um zwei oder mehr Glykoprotein-Fraktionen herzustellen. Oftmals steht nur eine geringe Probenmenge zur Verfügung; in solchen Fällen ist es umso wünschenswerter die in der Probe enthaltenen Glykoproteine effizient an die Affinitätsträger zu binden. Erfolgt eine Isolierung unterschiedlicher Glykoproteine nacheinander über mehrere entsprechende Vorrichtungen, beispielsweise Chromatographie-Säulen, sind in den meisten Fällen zwischen den einzelnen Affinitäts-Chromatographie-Schritten zusätzliche Schritte, wie z.B. die Entsalzung, Umpufferung oder Auf konzentrierung einer Probe, erforderlich. Diese Schritte werden notwendig, wenn die Probe auf neue Pufferbedingungen oder ein geringeres Volumen für eine optimale Bindung der Glykoproteine an den nächsten Affinitätsträger mit einem anderen Lektin einzustellen. Diese zusätzlichen Schritte führen nicht nur unweigerlich zu einem Verlust an Probenmaterial sondern sind auch kosten- und zeitintensiv und sollten daher tunlichst vermieden werden. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile zu überwinden.The disadvantages resulting from the approaches known from the prior art are, on the one hand, that relatively large sample volumes are required, and, on the other hand, that several experimental steps are necessary, by two or more To produce glycoprotein fractions. Often, only a small amount of sample is available; in such cases, it is more desirable to efficiently bind the glycoproteins contained in the sample to the affinity supports. If isolation of different glycoproteins in succession through several appropriate devices, such as chromatography columns, in most cases between the individual affinity chromatography steps additional steps, such as desalting, rebuffering or concentration on a sample required. These steps become necessary when adjusting the sample for new buffer conditions or a lower volume for optimal binding of the glycoproteins to the nearest affinity support with another lectin. These additional steps not only inevitably lead to a loss of sample material but are also costly and time consuming and should therefore be avoided as much as possible. The object of the present invention is thus to overcome the disadvantages known from the prior art.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Limitierungen und Probleme werden durch die vorliegende Erfindung gelöst. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur affinitätschromatographischen reversiblen Bindung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen umfasst eine feste Matrix ist dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix zwei oder mehrere unterschiedliche selektive Affinitätsliganden für Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aufweist, die eine affinitätschromatographische reversible Bindung der Mono- und/oder Oligosaccharid- Strukturen ermöglichen.The limitations and problems known from the prior art are solved by the present invention. The device according to the invention for the affinity chromatographic reversible binding of mono- and / or oligosaccharide structures comprises a solid matrix is characterized in that the solid matrix has two or more different selective affinity ligands for mono- and / or oligosaccharide structures which have an affinity chromatographic reversible bond allow the mono- and / or oligosaccharide structures.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Fraktionierung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen zur Verfügung, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfasst:The present invention further provides a process for the fractionation of mono- and / or oligosaccharide structures, the process comprising the following process steps:
a) in Kontakt bringen einer Lösung enthaltend zwei oder mehr unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen mit der festen Matrix einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,a) contacting a solution comprising two or more different mono- and / or oligosaccharide structures with the solid matrix of a device according to the invention,
b) entfernen der Lösung aus Schritt a) von der festen Matrix aus Schritt a), c) selektive Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Bindung mit einem oder mehreren unterschiedlichen Affinitätsliganden mittels eines ersten Elutions-Puffers,b) removing the solution from step a) from the solid matrix from step a), c) selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures from binding with one or more different affinity ligands by means of a first elution buffer,
d) selektive Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Bindung mit einem weiteren oder mehreren weiteren unterschiedlichen Affinitätsliganden, von welchen in Schritt c) keine Elution erfolgte, mittels eines zweiten Elutions-Puffers.d) selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures from binding with another one or more further different affinity ligands, of which no elution occurred in step c), by means of a second elution buffer.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Fraktionierung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen.Furthermore, the present invention relates to the use of the device according to the invention for the fractionation of mono- and / or oligosaccharide structures.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass eine Aufreinigung von definierten Teilfraktionen eines Proteoms mittels Lektin- Affinitätschromatographie und die simultane Subfraktionierung von Glycoproteinen in bestimmte Klassen ermöglicht wird. Der Verlust an Probenmaterial und die Anzahl der experimentellen Schritte wird signifikant reduziert. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Puffers (Bindepuffer), der die simultane und effektive Bindung von Glykoproteinen an unterschiedliche Lektine erlaubt. Durch die Wahl geeigneter Elutionsbedingungen können die Glykoproteine anschließend sukzessive eluiert werden.A further advantage of the method according to the invention is that a purification of defined partial fractions of a proteome by means of lectin affinity chromatography and the simultaneous subfractionation of glycoproteins into certain classes is made possible. The loss of sample material and the number of experimental steps is significantly reduced. Another aspect of the present invention is the provision of a buffer (binding buffer) that allows the simultaneous and effective binding of glycoproteins to different lectins. By choosing suitable elution conditions, the glycoproteins can then be successively eluted.
Mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie des erfindungsgemäßen Verfahrens können vorteilhafterweise glykosylierte Proteine, glykosylierte Peptide, beispielsweise aus einem Verdau von glykosylierten Proteinen mit einer Protease stammend, Glykolipide oder auch reine Mono- und/oder Oligosaccharide fraktioniert werden.By means of the device according to the invention and the method according to the invention, it is advantageously possible to fractionate glycosylated proteins, glycosylated peptides, for example from a digestion of glycosylated proteins with a protease, glycolipids or pure mono- and / or oligosaccharides.
Im folgenden sollen die Figuren kurz erläutert werden:In the following, the figures are briefly explained:
Figur 1 zeigt eine Coomassie-gefärbte SDS-PAGE einer Fraktionierung von Ovalbumin (Elution 1 bis 3) und Fetuin (Elution 4 bis 6) sowie den Einfluss des Waschpuffers auf die Elution der beiden Proteine. Weitere Erläuterungen der Abbildung finden sich in Beispiel 1. Figur 2 zeigt die Fraktionierung von Glykoproteinen aus humanem Serum. Weitere Erläuterungen der Abbildung finden sich in Beispiel 2.FIG. 1 shows a Coomassie-stained SDS-PAGE of a fractionation of ovalbumin (elution 1 to 3) and fetuin (elution 4 to 6) and the effect of the wash buffer on the elution of the two proteins. Further explanations of the figure can be found in Example 1. Figure 2 shows the fractionation of glycoproteins from human serum. Further explanations of the figure can be found in Example 2.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist eine Vorrichtung zur affinitätschromatographischen reversiblen Bindung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen umfassend eine feste Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix zwei oder mehrere unterschiedliche selektive Affinitätsliganden für Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aufweist, die eine affinitätschromatographische reversible Bindung der Mono- und/oder Oligosaccharid- Strukturen ermöglichen. Dabei sind die selektiven Affinitätsliganden vorzugsweise an die feste Matrix gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung binden mindestens zwei der unterschiedlichen Affinitätsliganden reversibel unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid- Strukturen.The device according to the invention is a device for affinity chromatographic reversible binding of mono- and / or oligosaccharide structures comprising a solid matrix, characterized in that the solid matrix has two or more different selective affinity ligands for mono- and / or oligosaccharide structures, which have a allow affinity chromatographic reversible binding of the mono- and / or oligosaccharide structures. The selective affinity ligands are preferably bound to the solid matrix. In a preferred embodiment of the device according to the invention, at least two of the different affinity ligands reversibly bind different mono- and / or oligosaccharide structures.
Als selektive Affinitätsliganden im Sinne der Erfindung können unterschiedlichste Stoffgruppen genutzt werden. So können beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Aptamere, Antikörper oder Anticaline als selektive Affinitätsliganden eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Lektine als selektive Affinitätsliganden eingesetzt.As a selective affinity ligands in the context of the invention, a wide variety of substance groups can be used. For example, but not limited to, aptamers, antibodies or anticalins may be used as selective affinity ligands. In a preferred embodiment, lectins are used as selective affinity ligands.
In der vorliegenden Erfindung können grundsätzlich alle Lektine eingesetzt werden, die eine Affinität zu Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen zeigen. Bevorzugt werden jedoch Lektine aus der Gruppe von Wheat Germ Agglutinin (WGA), Concanavalis Agglutinin (Con A), Peanut Agglutinin (PNA), Dolichus biflorus- Agglutinin (DBA)1 Sojabohnen-Agglutinin (SBA), Lentil-Lektin (LCH), Phaseolus- Agglutinin I (PHA-I), Pealectin-I (PSA), Ricinus communis-Agg\uX\n\n (RCA 60), Ricinus commt/π/s-Agglutinin (RCA 120), Elderberry Lectin (SNA), Snowdrop Lectin (GNA), Maackia amurensis-LekWn (MAL), Jacalin (AIL), Hairy Vetch Lectin (VVL), Japanese Wisteria Agglutinin (WFA), Lycopersicon esculentum-Lekün (LEL), Amaranthus caudatus-Lektm (ACL), Bauhinia purpurea a/öa-Agglutinin (BPA), Datura stramonium-Agg\uϊm\n (DSA), Erythrina cristagalli-LekWn (ECL), Euonymus cristagalli-Lektin (EEL), Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia-LekWn (GSL), Hippeastrum-Lek\\n (HHL), Lotus tetragonolobus-Lektin (LTL), Maclura pomifera- Lektin (MPL), Narcissus pseudonarcissus-Lektin (NPL), Psophocaφus tetragonolobus-Lektin (PTL), Solanum tuberosum-Lektln (STL), Sophora japonica- Agglutinin (SJA), Agaricus b/sporas-Agglutinin (ABA), Viscum a/bum-Agglutinin (VAA), Anguilla anguilla-Agglutmln (AAA), Caragena
Figure imgf000007_0001
(CAA), HeIIx pomaf/a-Agglutinin (HPA), Helix aspersa-Agglutinin (HAA), Phytolacca americana-Lektin (Pokeweed mitogen; PWM), Vicia faba-Agglutinin (VFA), Sumbucus sieboldiena Lektin (SSA), Cytisus scoparius Agglutinin (CSA) und UIΘX europaeus-Agglutinin (UEA) eingesetzt, besonders bevorzugt aus dieser Gruppe sind jedoch Wheat Germ Agglutinin (WGA), Concanavalis Agglutinin (Con A), Peanut Agglutinin (PNA), Jacalin (AIL), Dolichus biflorus-Agg\ut\n\n (DBA), Sojabohnen- Agglutinin (SBA), Lentil-Lektin (LCH), Phaseolus-Agglutinin I (PHA-I), Ricinus communis-Agglutirύn (RCA 60), Ricinus co/n/m/π/s-Agglutinin (RCA 120), Elderberry Lectin (SNA), Snowdrop Lectin (GNA), Maackia amurensis-Lektm (MAL), Hairy Vetch Lectin (VVL), Lotus tetragonolobus-Lektin (LTL), Narcissus pseudonarcissus-Lektin (NPL), Sophora yapoπ/ca-Agglutinin (SJA), Agaricus bisporus-Agg\u\\n\n (ABA), Datura stramonium agglutinin (DSA), Sumbucus sieboldiena lektin (SSA), Cytisus scoparius agglutinin (CSA) und Ulex europaeus-Agglutmin (UEA).In the present invention, it is possible in principle to use all lectins which have an affinity for mono- and / or oligosaccharide structures. However, preference is given to lectins from the group of Wheat Germ agglutinin (WGA), Concanavalis agglutinin (Con A), peanut agglutinin (PNA), Dolichus biflorus agglutinin (DBA) 1 soybean agglutinin (SBA), Lentil lectin (LCH), Phaseolus agglutinin I (PHA-I), pealectin I (PSA), Ricinus communis agg \ uX \ n \ n (RCA 60), Ricinus commt / π / s agglutinin (RCA 120), Elderberry lectin (SNA) , Snowdrop Lectin (GNA), Maackia amurensis LekWn (MAL), Jacalin (AIL), Hairy Vetch Lectin (VVL), Japanese Wisteria Agglutinin (WFA), Lycopersicon esculentum-Lekün (LEL), Amaranthus caudatus Lectm (ACL), Bauhinia purpurea a / öa-agglutinin (BPA), Datura stramonium agg \ uϊm \ n (DSA), Erythrina cristagalli-LekWn (ECL), Euonymus cristagalli lectin (EEL), Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia LekWn (GSL), Hippeastrum-Lek \\ n (HHL), Lotus tetragonolobus lectin (LTL), Maclura pomifera Lectin (MPL), Narcissus pseudonarcissus lectin (NPL), Psophocaφus tetragonolobus lectin (PTL), Solanum tuberosum lectin (STL), Sophora japonica agglutinin (SJA), Agaricus b / sporas agglutinin (ABA), Viscum a / bum agglutinin (VAA), Anguilla anguilla agglutinous (AAA), Caragena
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(CAA), Helix pomaf / a-agglutinin (HPA), Helix aspersa-agglutinin (HAA), Phytolacca americana lectin (Pokeweed mitogen; PWM), Vicia faba agglutinin (VFA), Sumbucus sieboldiena lectin (SSA), Cytisus scoparius Agglutinin (CSA) and UIΘX europaeus agglutinin (UEA) are used, but especially preferred from this group are Wheat Germ agglutinin (WGA), Concanavalis agglutinin (Con A), Peanut agglutinin (PNA), Jacalin (AIL), Dolichus biflorus agg DBA, soybean agglutinin (SBA), Lentil lectin (LCH), Phaseolus agglutinin I (PHA-I), Ricinus communis agglutin (RCA 60), Ricinus co / n / m / π / s agglutinin (RCA 120), Elderberry Lectin (SNA), Snowdrop Lectin (GNA), Maackia amurensis Lektm (MAL), Hairy Vetch Lectin (VVL), Lotus tetragonolobus lectin (LTL), Narcissus pseudonarcissus lectin ( NPL), Sophora yapoπ / ca-agglutinin (SJA), Agaricus bisporus agg \ u \ n \ n (ABA), Datura stramonium agglutinin (DSA), Sumbucus sieboldiena lectin (SSA), Cytisus scoparius agglutinin (CSA) and Ulex europaeus Agglutinin (UEA).
Diverse Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfassend eine feste Matrix sind für den Fachmann vorstellbar. In einer Ausführungsform der Erfindung liegt die Vorrichtung in Form einer Chromatographie-Säule vor, welche die feste Matrix umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Chromatographie-Säule in Form einer so genannten 'spin column1 vor. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Chromatographie- Säule in Form einer HPLC- oder FPLC-Säule vor. Die feste Matrix, welche sich in der Chromatographie-Säule befindet, kann aus jedem Material bestehen, welches der Fachmann als sinnvoll erachtet. Bevorzugt besteht die feste Matrix jedoch aus einem Material umfassend Sepharose, Agarose, Nitrocellulose, Cellulose, Latex, Polyethylen-Polymere, vorzugsweise Polystyrol, Polyacrylat, Polyacrylamid, Polymethacrylat oder Polyvinylalkohol, Silicium-Sauerstoff-Verbindungen, vorzugsweise Glass-Partikel, Silica oder Silikate, Metalloxide, vorzugsweise Titanoxid, Zinnoxid oder Apatit oder aus Kombinationen dieser Materialien. In einer alternativen Ausführungsform besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung oder die von der Vorrichtung umfasste feste Matrix aus einer Vielzahl von Partikeln, auf deren Oberfläche die selektiven Affinitätsliganden gebunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Partikel magnetische Partikel, besonders bevorzugt ferromagnetische und/oder paramagnetische und/oder superparamagnetische Partikel.Various embodiments of the device according to the invention comprising a solid matrix are conceivable for the person skilled in the art. In one embodiment of the invention, the device is in the form of a chromatography column comprising the solid matrix. In a preferred embodiment, the chromatography column is in the form of a so-called spin column 1 . In a further preferred embodiment of the invention, the chromatography column is in the form of an HPLC or FPLC column. The solid matrix, which is located in the chromatography column, can be made of any material that the expert considers useful. However, the solid matrix preferably consists of a material comprising sepharose, agarose, nitrocellulose, cellulose, latex, polyethylene polymers, preferably polystyrene, polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate or polyvinyl alcohol, silicon-oxygen compounds, preferably glass particles, silica or silicates, Metal oxides, preferably titanium oxide, tin oxide or apatite or combinations of these materials. In an alternative embodiment, the device according to the invention or the solid matrix encompassed by the device consists of a multiplicity of particles on whose surface the selective affinity ligands are bound. In a preferred embodiment, the particles are magnetic particles, particularly preferably ferromagnetic and / or paramagnetic and / or superparamagnetic particles.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Fraktionierung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei die folgenden Verfahrensschritte:The device according to the invention can be used in the process according to the invention for the fractionation of mono- and / or oligosaccharide structures. The method according to the invention comprises the following method steps:
a) in Kontakt bringen einer Lösung enthaltend zwei oder mehr unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen mit der festen Matrix einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,a) contacting a solution comprising two or more different mono- and / or oligosaccharide structures with the solid matrix of a device according to the invention,
b) entfernen der Lösung aus Schritt a) von der festen Matrix aus Schritt a),b) removing the solution from step a) from the solid matrix from step a),
c) selektive Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Bindung mit einem oder mehreren unterschiedlichen Affinitätsliganden mittels eines ersten Elutions-Puffers,c) selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures from binding with one or more different affinity ligands by means of a first elution buffer,
d) selektive Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Bindung mit einem weiteren oder mehreren weiteren unterschiedlichen Affinitätsliganden, von welchen in Schritt c) keine Elution erfolgte, mittels eines zweiten Elutions-Puffers.d) selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures from binding with another one or more further different affinity ligands, of which no elution occurred in step c), by means of a second elution buffer.
Die Vorraussetzung für ein Gelingen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass die Lösung, welche in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der festen Matrix der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Kontakt gebracht wird, zwei oder mehr unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammen die Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Glycanstruktur von Glykoproteinen. Beispielsweise sind diese Glykoproteine Teil eines Proteoms oder eines Partialproteoms. Entsprechend kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise für die Fraktionierung von Glykoproteinen genutzt werden.The prerequisite for the success of the process according to the invention is that the solution which is brought into contact with the solid matrix of the device according to the invention in step a) of the process according to the invention contains two or more different mono- and / or oligosaccharide structures. In a preferred embodiment of the invention, the mono- and / or oligosaccharide structures are derived from the glycan structure of glycoproteins. For example, these glycoproteins are part of a proteome or a Partial proteome. Accordingly, the method according to the invention can be used advantageously for the fractionation of glycoproteins.
Um eine effektive und simultane Bindung der unterschiedlichen Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen an die zwei oder mehr unterschiedlichen selektiven Affinitätsliganden in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens zu gewährleisten, müssen entsprechende Pufferbedingungen gegeben sein. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit, einen Puffer (Bindepuffer) zur Verfügung zu stellen, der vorteilhafterweise die simultane und effektive Bindung von unterschiedlichen Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen an zwei oder mehr unterschiedliche selektive Affinitätsliganden ermöglicht. Erfindungsgemäß enthält die Lösung enthaltend zwei oder mehr unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid- Strukturen aus Schritt a) weiterhin 0.01 bis 0.5 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH- Bereich von 6.0 bis 7.0, 0.01 bis 0.5 mol/L NaCI, 0.01 bis 20 mmol/L CaCI2, 0.01 bis 20 mmol/L MnCI2 und 0.02 bis 0.2%(w/v) NaN3, vorzugsweise 0.01 bis 0.1 mol/L Bis- Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 6.5, 0.05 bis 0.25 mol/L NaCI, 0.3 bis 3 mmol/L CaCI2, 0.3 bis 3 mmol/L MnCI2 und 0.03 bis 0.08%(w/v) NaN3 und besonders bevorzugt 0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer mit einem pH von 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3.To ensure effective and simultaneous binding of the different mono- and / or oligosaccharide structures to the two or more different selective affinity ligands in step a) of the method according to the invention, appropriate buffer conditions must be present. Another aspect of the present invention is thus to provide a buffer (binding buffer) which advantageously allows the simultaneous and effective binding of different mono- and / or oligosaccharide structures to two or more different selective affinity ligands. According to the invention, the solution containing two or more different mono- and / or oligosaccharide structures from step a) further contains 0.01 to 0.5 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 7.0, 0.01 to 0.5 mol / L NaCl , 0.01 to 20 mmol / L CaCl 2 , 0.01 to 20 mmol / L MnCl 2 and 0.02 to 0.2% (w / v) NaN 3 , preferably 0.01 to 0.1 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 6.5, 0.05 to 0.25 mol / L NaCl, 0.3 to 3 mmol / L CaCl 2 , 0.3 to 3 mmol / L MnCl 2 and 0.03 to 0.08% (w / v) NaN 3 and particularly preferably 0.01 mol / L bis-tris Buffer with a pH of 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 .
Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich das Entfernen der Lösung aus Schritt a) von der festen Matrix aus Schritt a), erfolgt üblicherweise mit aus dem Stand der Technik bekannten Methoden, beispielsweise, für den Fall, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung in Form einer 'spin column1 vorliegt, mittels Zentrifugation oder alternativ mittels eines Vakuums (Lösung wird durch die 'spin column1 gesaugt) oder mittels eines Überdrucks (Lösung wird durch die 'spin column' gedrückt). Für den Fall, dass die Vorrichtung in Form einer Vielzahl von Partikeln vorliegt, werden die Partikel aus der Lösung entfernt, beispielsweise im Falle von magnetischen Partikeln durch Entnahme der Partikel mittels eines Magneten oder umgekehrt durch Immobilisierung der Partikel mittels eines Magneten und Entnahme der Lösung. In der vorliegenden Erfindung kann auch jedes weitere dem Fachmann sinnvoll erscheinende Verfahren genutzt werden, um in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Lösung aus Schritt a) von der festen Matrix aus Schritt a) zu entfernen. Zwischen Schritt b) und Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens können optional ein oder mehrere Waschschritte eingefügt werden. Die Waschschritte werden in einer dem Fachmann als sinnvoll erscheinenden Anzahl durchgeführt. Ein Waschschritt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Schritt, in dem nach Entfernung der Lösung aus Schritt a) in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens die feste Matrix sowie die daran gebundenen Mono- und /oder Oligosaccharid-Strukturen mit einer Pufferlösung gewaschen werden und die Waschlösung anschließend entsprechend Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wieder entfernt wird. Als Waschpuffer kann vorteilhafterweise ein Puffer verwendet werden, wie auch für die Lösung aus Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben ist, jedoch enthält die Waschlösung keine Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen. Der Waschpuffer enthält demnach 0.01 bis 0.5 mol/L Bis- Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 7.0, 0.01 bis 0.5 mol/L NaCI, 0.01 bis 20 mmol/L CaCI2, 0.01 bis 20 mmol/L MnCI2 und 0.02 bis 0.2%(w/v) NaN3, vorzugsweise 0.01 bis 0.1 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 6.5, 0.05 bis 0.25 mol/L NaCI, 0.3 bis 3 mmol/L CaCI2, 0.3 bis 3 mmol/L MnCI2 und 0.03 bis 0.08%(w/v) NaN3 und besonders bevorzugt 0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer mit einem pH von 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3.Step b) of the process according to the invention, namely the removal of the solution from step a) from the solid matrix from step a), is usually carried out by methods known from the prior art, for example, in the event that the device according to the invention in the form of a ' Spin column 1 is present, by centrifugation or alternatively by means of a vacuum (solution is sucked through the spin column 1 ) or by means of an overpressure (solution is pressed through the spin column). In the event that the device is in the form of a plurality of particles, the particles are removed from the solution, for example in the case of magnetic particles by removal of the particles by means of a magnet or vice versa by immobilization of the particles by means of a magnet and removal of the solution. In the present invention, it is also possible to use any further process which appears expedient to the person skilled in the art in order to remove the solution from step a) from the solid matrix from step a) in step b) of the process according to the invention. Between step b) and step c) of the method according to the invention optionally one or more washing steps can be inserted. The washing steps are carried out in a number that appears appropriate to a person skilled in the art. A washing step in the context of the present invention is a step in which, after removal of the solution from step a) in step b) of the process according to the invention, the solid matrix and the mono- and / or oligosaccharide structures bound thereto are washed with a buffer solution and Washing solution is then removed according to step b) of the process according to the invention again. A wash buffer can advantageously be a buffer, as also described for the solution from step a) of the process according to the invention, but the wash solution contains no mono- and / or oligosaccharide structures. The wash buffer accordingly contains 0.01 to 0.5 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 7.0, 0.01 to 0.5 mol / L NaCl, 0.01 to 20 mmol / L CaCl 2 , 0.01 to 20 mmol / L MnCl 2 and 0.02 to 0.2% (w / v) NaN 3 , preferably 0.01 to 0.1 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 6.5, 0.05 to 0.25 mol / L NaCl, 0.3 to 3 mmol / L CaCl 2 , 0.3 to 3 mmol / L MnCl 2 and 0.03 to 0.08% (w / v) NaN 3 and more preferably 0.01 mol / L bis-Tris buffer with a pH of 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 .
In Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt eine selektive Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Bindung mit einem oder mehreren unterschiedlichen Affinitätsliganden mittels eines ersten Elutions-Puffers. Bevorzugt entspricht ein allgemeiner Eiutionspuffer dem oben beschriebenen Waschpuffer, enthält also 0.01 bis 0.5 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 7.0, 0.01 bis 0.5 mol/L NaCI, 0.01 bis 20 mmol/L CaCI2, 0.01 bis 20 mmol/L MnCI2 und 0.02 bis 0.2%(w/v) NaN3, vorzugsweise 0.01 bis 0.1 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 6.5, 0.05 bis 0.25 mol/L NaCI, 0.3 bis 3 mmol/L CaCI2, 0.3 bis 3 mmol/L MnCI2 und 0.03 bis 0.08%(w/v) NaN3 und besonders bevorzugt 0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer mit einem pH von 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3. Der Eiutionspuffer enthält weiterhin eine Substanz, welche selektiv die reversibel gebundene Mono- und/oder Oligosaccharid-Struktur kompetitiv aus der Bindung an die Affinitätsliganden verdrängt. Bei dieser Substanz handelt es sich vorzugsweise um Strukturhomologe. Strukturhomoioge im Sinne der Erfindung sind Substanzen, deren Struktur homolog der Struktur der entsprechenden Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen ist. Die Substanzen werden im Sinne der Erfindung so ausgewählt, dass selektiv die reversibel gebundenen Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen kompetitiv aus der Bindung an die Affinitätsliganden verdrängt werden. Bei den Strukturhomologen handelt es sich etwa um entsprechende Aptamere oder Ribozyme, besonders bevorzugt jedoch um Mono- oder Oligosaccharide. Der hier beschriebene Elutionspuffer wird bevorzugt in allen Elutionsschritten des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt und unterscheidet sich in den unterschiedlichen Elutionsschritten nur durch den Zusatz unterschiedlicher Strukturhomologe, beispielsweise unterschiedlicher Mono- und/oder Oligosaccharide.In step c) of the process according to the invention, a selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures from binding with one or more different affinity ligands takes place by means of a first elution buffer. Preferably, a general elution buffer corresponds to the wash buffer described above, ie contains 0.01 to 0.5 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 7.0, 0.01 to 0.5 mol / L NaCl, 0.01 to 20 mmol / L CaCl 2 , 0.01 to 20 mmol / L MnCl 2 and 0.02 to 0.2% (w / v) NaN 3 , preferably 0.01 to 0.1 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 6.5, 0.05 to 0.25 mol / L NaCl , 0.3 to 3 mmol / L CaCl 2 , 0.3 to 3 mmol / L MnCl 2 and 0.03 to 0.08% (w / v) NaN 3 and more preferably 0.01 mol / L bis-Tris buffer with a pH of 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 . The elution buffer further contains a substance which selectively displaces the reversibly bound mono- and / or oligosaccharide structure competitively from binding to the affinity ligands. This substance is preferably a structural homologue. Strukturhomoioge in the context of the invention are substances whose structure is homologous to the structure of the corresponding mono- and / or oligosaccharide structures. For the purposes of the invention, the substances are selected so that the reversibly bound mono- and / or oligosaccharide structures are selectively displaced from the binding to the affinity ligands. The structural homologues are, for example, corresponding aptamers or ribozymes, but more preferably mono- or oligosaccharides. The elution buffer described here is preferably used in all elution steps of the method according to the invention and differs in the different elution steps only by the addition of different structural homologs, for example different mono- and / or oligosaccharides.
Bevorzugt wird diesem allgemeinen Puffer zur selektiven Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen ein Mono- oder Oligosaccharid in einer Konzentration von 0.02 bis 0.8 mol/L zugesetzt, vorzugsweise in einer Konzentration von 0.05 bis 0.5 mol/L und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0.1 bis 0.4 mol/L. Beispielsweise wird für die Elution von an WGA (Wheat Germ Agglutinin) gebundenen Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen N-Acetyl-Glucosamin eingesetzt, für die Elution von an Concanavalis Agglutinin (Con A) gebundenen Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen Methyl-α-D-mannopyranosid. Dem Fachmann sind die jeweiligen zu verwendenden Mono- oder Oligosaccharide geläufig, welche für eine kompetitve Verdrängung einer Mono- und/oder Oligosaccharid-Struktur aus der Bindung mit einem spezifischen Lektin eingesetzt werden können.Preferably, a mono- or oligosaccharide in a concentration of 0.02 to 0.8 mol / L is added to this general buffer for the selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures, preferably in a concentration of 0.05 to 0.5 mol / L and more preferably in one Concentration of 0.1 to 0.4 mol / L. For example, for the elution of WGA (Wheat Germ Agglutinin) bound mono- and / or oligosaccharide structures N-acetyl-glucosamine is used for the elution of Concanavalis agglutinin (Con A) bound mono- and / or oligosaccharide structures methyl -α-D-mannopyranoside. The person skilled in the art is familiar with the particular mono- or oligosaccharides to be used, which can be used for competitive displacement of a mono- and / or oligosaccharide structure from binding with a specific lectin.
Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens entspricht Schritt c) mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere weitere, an die Affinitätsliganden gebundene und nicht in Schritt c) eluierte Mono- und/oder Olgosaccharid-Strukturen mittels eines zweiten Elutionspuffers eluiert werden. Hierfür werden andere Substanzen, welche die reversibel gebundene Mono- und/oder Oligosaccharid-Struktur kompetitiv aus der Bindung mit dem oder den Affinitätsliganden verdrängen, als in dem zuvor durchgeführten Schritt c) dem oben beschriebenen Elutionspuffer zugesetzt. Vorzugsweise wird dem Elutionspuffer ein oder mehrere andere Mono- und/oder Oligosaccharide zugesetzt. Alternativ können in Schritt c) und/oder d) des erfindungsgemäßen Verfahrens auch unterschiedliche Substanzen zugesetzt werden, die unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen kompetitiv aus der Bindung an unterschiedliche Affinitätsliganden verdrängen. Beispielsweise können zwei oder mehr unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharide zugesetzt werden. So können zwei oder mehrere Gruppen von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen gleichzeitig eluiert werden, das heißt, sie können simultan kompetitiv aus der Bindung an unterschiedliche Affinitätsliganden, beispielsweise Lektine, verdrängt werden.Step d) of the process according to the invention corresponds to step c), with the exception that one or more further mono- and / or oligosaccharide structures which are bound to the affinity ligands and are not eluted in step c) are eluted by means of a second elution buffer. For this purpose, other substances which displace the reversibly bound mono- and / or oligosaccharide structure competitively from the binding with the affinity ligand (s) are added to the elution buffer described above in step c) previously carried out. Preferably, one or more other mono- and / or oligosaccharides are added to the elution buffer. Alternatively, in step c) and / or d) of the method according to the invention, it is also possible to add different substances which competitively displace different mono- and / or oligosaccharide structures from binding to different affinity ligands. For example, two or more different mono- and / or oligosaccharides can be added. Thus, two or more groups of mono- and / or oligosaccharide structures can be eluted simultaneously, that is, they can be simultaneously competitively displaced from binding to different affinity ligands, e.g., lectins.
Optional können zwischen Schritt c) und Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein oder mehrere Waschschritte eingefügt werden. Diese optionalen Waschschritte laufen analog der oben beschriebenen Waschschritte zwischen Schritt b) und Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens ab. Auch hier kommt der oben beschriebene Waschpuffer zum Einsatz.Optionally, one or more washing steps can be inserted between step c) and step d) of the process according to the invention. These optional washing steps proceed analogously to the washing steps described above between step b) and step c) of the process according to the invention. Again, the wash buffer described above is used.
Sollte es dem Fachmann sinnvoll erscheinen, kann so beispielsweise die Ausbeute an kompetitiv verdrängten Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen gesteigert werden, können die Schritte c) und/oder d) des erfindungsgemäßen Verfahrens auch einmal oder mehrfach wiederholt werden. Eine Wiederholung dieser Schritte im Sinne der Erfindung bedeutet, dass zwei oder mehr Elutionschritte c) und/oder d) nacheinender durchgeführt werden, wobei die Elutionsschritte optional durch Waschschritte getrennt sein können, oder aber dass die Elutionsschritte c) und d) alternierend durchgeführt werden, die Elutionsschritte sind dabei optional durch Waschschritte getrennt. Diese der Optimierung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienenden Versuchsparameter lassen sich vom Fachmann durch Routinetätigkeiten mit Leichtigkeit bestimmen.Should it appear reasonable to those skilled in the art, for example, the yield of competitively displaced mono- and / or oligosaccharide structures can be increased, the steps c) and / or d) of the process according to the invention can also be repeated once or several times. A repetition of these steps in the context of the invention means that two or more elution steps c) and / or d) are carried out in succession, the elution steps optionally being able to be separated by washing steps, or else the elution steps c) and d) being carried out alternately, the elution steps are optionally separated by washing steps. These experimental parameters serving to optimize the method according to the invention can easily be determined by the person skilled in the art by means of routine activities.
Optional kann Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens von einem oder mehreren weiteren selektiven Elutionsschritten gefolgt werden. Dies bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass ein oder mehrere Schritte analog zu Schritt c) und d) des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Schritt d) folgen können. Auch für diese optionalen zusätzlichen Elutionsschritte gilt, dass ein oder mehrere weitere, an die Affinitätsliganden gebundene und nicht in Schritt c) oder d) eluierte Mono- und/oder Olgosaccharid-Strukturen mittels eines weiteren Elutionspuffers eluiert werden. Hierfür werden andere Substanzen, welche die reversibel gebundene Mono- und/oder Oligosaccharid-Struktur kompetitiv aus der Bindung mit dem oder den Affinitätsliganden verdrängen, als in den zuvor durchgeführten Schritten c) und d) des erfindungsgemäßen Verfahrens dem allgemeinen Elutionspuffer zugesetzt. Vorzugsweise wird dem allgemeinen Elutionspuffer ein oder mehrere andere Mono- und/oder Oligosaccharide zugesetzt. Optional können zwischen den zusätzlichen Elutionsschritten und/oder zwischen Schritt d) und dem ersten zusätzlichen Elutionsschritt weitere Waschschritte analog der oben beschriebenen Waschschritte zwischen Schritt b) und Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingefügt werden. Auch hier kommt der oben beschriebene Waschpuffer zum Einsatz.Optionally, step d) of the method of the invention may be followed by one or more further selective elution steps. This means for the purposes of the present invention that one or more steps analogous to step c) and d) of the method according to the invention can follow step d). It is also true for these optional additional elution steps that one or more other mono- and / or oligosaccharide structures bound to the affinity ligands and not eluted in step c) or d) are eluted by means of a further elution buffer become. For this purpose, other substances which displace the reversibly bound mono- and / or oligosaccharide structure competitively from the binding with the affinity ligand (s) are added to the general elution buffer as in steps c) and d) of the method according to the invention. Preferably, one or more other mono- and / or oligosaccharides are added to the general elution buffer. Optionally, between the additional elution steps and / or between step d) and the first additional elution step further washing steps can be inserted analogously to the washing steps described above between step b) and step c) of the method according to the invention. Again, the wash buffer described above is used.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt 2 bis 10 unterschiedliche Affinitätsliganden für Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt, besonders bevorzugt werden zwischen 2 und 6 unterschiedliche Affinitätsliganden eingesetzt.In the method according to the invention, preferably 2 to 10 different affinity ligands for mono- and / or oligosaccharide structures are used in a device according to the invention, more preferably between 2 and 6 different affinity ligands are used.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) durchgeführt.The inventive method is preferably carried out at room temperature (20 to 25 ° C).
Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung soll durch die folgenden nicht- limitierenden Beispiele weiter verdeutlicht werden.The description of the present invention will be further clarified by the following nonlimiting examples.
Beispiel 1example 1
Sämtliche Verfahrensschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Sämtliche verwendeten Puffer-Lösungen sowie 'spin-columns' wurden auf 4°C vorgekühlt.All process steps were carried out at room temperature. All buffer solutions used and 'spin-columns' were pre-cooled to 4 ° C.
200 μg Fetuin und 200 μg Ovalbumin (beide GALAB Technologies GmbH, Geesthacht, Deutschland) wurden gemischt, mit einem Bindepuffer (0.01 mol/L Bis- Tris-Puffer pH 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3) auf ein Gesamtvolumen von 500 μ\ aufgefüllt und gemischt. Das Gemisch wurde anschließend auf eine 'spin column1 aufgetragen und für 1 min inkubiert. Die 'spin column1 wies eine feste Matrix aus Polymethacrylat auf. Die an die feste Matrix gebundenen Affinitätsliganden waren Wheat Germ Agglutinin (WGA), Concanavalis Agglutinin (Con A).200 μg fetuin and 200 μg ovalbumin (both GALAB Technologies GmbH, Geesthacht, Germany) were mixed with a binding buffer (0.01 mol / L bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 ) to a total volume of 500 μ \ filled and mixed. The mixture was then applied to a spin column 1 and incubated for 1 min. The spin column 1 had a solid matrix of polymethacrylate. The to the solid matrix bound affinity ligands were Wheat Germ agglutinin (WGA), Concanavalis agglutinin (Con A).
Die 'spin column1 wurde anschließend für 2 min bei 500 x g zentrifugiert. Der Durchbruch wurde verworfen und 750 μ\ Waschpuffer (0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer pH 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3) auf die Säule gegeben. Die 'spin column1 wurde anschließend für 2 min bei 500 x g zentrifugiert.The spin column 1 was then centrifuged for 2 min at 500 xg. The breakthrough was discarded and 750 μL wash buffer (0.01 mol / L Bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 ) placed on the column. The spin column 1 was then centrifuged for 2 min at 500 xg.
Zur Elution des Ovalbumins wurden 100 μ\ Elutionspuffer 1 (0.01 mol/L Bis-Tris- Puffer pH 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) UaRz, 0.2 mol/L Methyl-α-D-mannopyranosid) auf die Säule gegeben, 1 min inkubiert und anschließend 2 min bei 500 x g zentrifugiert (Elutionsschritt 1). Elutionsschritt 1 wird in der folge noch zweimal wiederholt (Elutionsschritt 2 und 3).100 μl of elution buffer 1 (0.01 mol / L bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v)) were used to elute the ovalbumin. UaRz, 0.2 mol / L methyl-α-D-mannopyranoside) was added to the column, incubated for 1 min and then centrifuged for 2 min at 500 xg (elution step 1). Elution step 1 is repeated twice in succession (elution steps 2 and 3).
750 μ\ Waschpuffer wurden auf die 'spin column1 gegeben und 2 min bei 500 x g zentrifugiert.750 μL wash buffer was added to spin column 1 and centrifuged at 500 xg for 2 min.
Zur Elution des Fetuin wurden 100 μ\ Elutionspuffer 2 (0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer pH 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3, 0.2 mol/L N-Acetylglucosamin) auf die Säule gegeben, 1 min inkubiert und anschließend 2 min bei 500 x g zentrifugiert (Elutionsschritt 4). Elutionsschritt 1 wird in der folge noch zweimal wiederholt (Elutionsschritt 5 und 6).100 μL elution buffer 2 (0.01 mol / L Bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v)) were used to elute the fetuin. NaN 3 , 0.2 mol / L N-acetylglucosamine) was added to the column, incubated for 1 min and then centrifuged for 2 min at 500 xg (elution step 4). Elution step 1 is repeated twice in succession (elution step 5 and 6).
Anschließend wurde mit den Durchbrüchen des ersten Waschrittes (Wash 1), der ersten drei Elutionsschritte (Elution 1 bis 3), des folgenden Waschrittes (Wash 2) sowie der letzten drei Elutionsschritte (Elution 4 bis 6) eine SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung durchgeführt. Zum Vergleich wurde ein Aliquot der Ausgangslösung (Probe) zugefügt. Das Gel ist in Figur 1 dargestellt. Es konnte mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine klare Fraktionierung der Proteine erreicht werden. Ebenso ist klar ersichtlich, dass durch den Waschpuffer im Wesentlichen keine Elution der Proteine erfolgt. Beispiel 2Subsequently, with the breakthroughs of the first wash step (wash 1), the first three elution steps (elution 1 to 3), the following wash step (wash 2) and the last three elution steps (elution 4 to 6), an SDS-PAGE with subsequent Coomassie Staining performed. For comparison, an aliquot of the starting solution (sample) was added. The gel is shown in FIG. It was possible to achieve a clear fractionation of the proteins by means of the method according to the invention. It is also clear that essentially no elution of the proteins takes place through the wash buffer. Example 2
Sämtliche Verfahrensschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Sämtliche verwendeten Puffer-Lösungen sowie 'spin-columns' wurden auf 4°C vorgekühlt.All process steps were carried out at room temperature. All buffer solutions used and 'spin-columns' were pre-cooled to 4 ° C.
50 μ\ humanes Serum (~4 mg Protein) wurde mit einem Bindepuffer (0.01 mol/L Bis- Tris-Puffer pH 6.0, 0.15 moi/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3) auf ein Gesamtvolumen von 500 μ\ aufgefüllt und gemischt. Das Gemisch wurde anschließend auf eine 'spin column' aufgetragen und für 1 min inkubiert. Die 'spin column' wies eine feste Matrix aus Polymethacrylat auf. Die an die feste Matrix gebundenen Affinitätsliganden waren Wheat Germ Agglutinin (WGA), Concanavalis Agglutinin (Con A).50 μM human serum (~ 4 mg protein) was incubated with a binding buffer (0.01 mol / L bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 moi / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05%). (w / v) NaN 3 ) to a total volume of 500 μ \ filled and mixed. The mixture was then applied to a spin column and incubated for 1 min. The 'spin column' had a solid matrix of polymethacrylate. The affinity ligands bound to the solid matrix were Wheat Germ agglutinin (WGA), Concanavalis agglutinin (Con A).
Die 'spin column' wurde anschließend für 2 min bei 500 x g zentrifugiert. Der Durchbruch wurde verworfen und 750 μ\ Waschpuffer (0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer pH 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3) auf die Säule gegeben. Die 'spin column' wurde anschließend für 2 min bei 500 x g zentrifugiert.The 'spin column' was then centrifuged for 2 min at 500 xg. The breakthrough was discarded and 750 μL wash buffer (0.01 mol / L Bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 ) placed on the column. The 'spin column' was then centrifuged for 2 min at 500 xg.
Zur Elution der an Con A gebundenen Glykoproteine wurden 100 //I Elutionspuffer 1 (0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer pH 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3, 0.2 mol/L Methyl-α-D-mannopyranosid) auf die Säule gegeben, 1 min inkubiert und anschließend 2 min bei 500 x g zentrifugiert (Elutionsschritt 1). Elutionsschritt 1 wird in der folge noch zweimal wiederholt (Elutionsschritt 2 und 3).100 μl elution buffer 1 (0.01 mol / L Bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05%) were used to elute the glycoproteins bound to Con A. (w / v) NaN 3 , 0.2 mol / L methyl-α-D-mannopyranoside) was added to the column, incubated for 1 min and then centrifuged for 2 min at 500 xg (elution step 1). Elution step 1 is repeated twice in succession (elution steps 2 and 3).
750 μ\ Waschpuffer wurden auf die 'spin column1 gegeben und 2 min bei 500 x g zentrifugiert.750 μL wash buffer was added to spin column 1 and centrifuged at 500 xg for 2 min.
Zur Elution der an WGA gebundenen Glykoproteine wurden 100 μ\ Elutionspuffer 2 (0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer pH 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3, 0.2 mol/L N-Acetylglucosamin) auf die Säule gegeben, 1 min inkubiert und anschließend 2 min bei 500 x g zentrifugiert (Elutionsschritt 4). Elutionsschritt 1 wird in der folge noch zweimal wiederholt (Elutionsschritt 5 und 6). Die erhaltenen Fraktionen der Elutionsschritte 1 bis 3 wurden gepoolt (siehe Figur 2 A-1 , B-1, C-1), ebenso wie die erhaltenen Fraktionen der Elutionsschritte 4 bis 6 (siehe Figur 2 A-2, B-2, C-2). Zur Darstellung der Fraktionierung wurden die gepoolten Eluate mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteine mit Coomassie gefärbt (siehe Figur 2 A). Es lässt sich auch in diesem Beispiel ein klare Fraktionierung erkennen. Zur weiteren Charakterisierung wurden die gepoolten Fraktionen in zwei weiteren Versuchsansätzen mittels SDS-PAGE getrennt und anschließend auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Nitrocellulose- Membran wurde nachfolgend mit BSA geblockt. Jeweils eine Membran wurde darauf folgend mit biotinyliertem Con A (siehe Figur 2 B) und eine Membran mit biotinyliertem WGA (siehe Figur 2 C) inkubiert. Die Detektion der Proteine erfolgte über Streptavidin-Peroxidase-Konjugat und ECL-System (Amersham, Piscataway, USA). Es ist auch in dieser Darstellungsweise deutlich zu erkennen, dass die Glykoproteinen des humanen Serums entsprechend ihrer Glycanstrukturen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens spezifisch fraktioniert wurden. To elute WGA-bound glycoproteins, 100 μL of Elution Buffer 2 (0.01 mol / L Bis-Tris buffer pH 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2, and 0.05% (w / w)) were added / v) NaN 3 , 0.2 mol / L N-acetylglucosamine) was added to the column, incubated for 1 min and then centrifuged for 2 min at 500 xg (elution step 4). Elution step 1 is repeated twice in succession (elution step 5 and 6). The obtained fractions of the elution steps 1 to 3 were pooled (see Figure 2 A-1, B-1, C-1), as well as the resulting fractions of the elution steps 4 to 6 (see Figure 2 A-2, B-2, C -2). To illustrate the fractionation, the pooled eluates were separated by SDS-PAGE and the proteins stained with Coomassie (see FIG. 2A). A clear fractionation can also be seen in this example. For further characterization, the pooled fractions were separated by SDS-PAGE in two further assays and then transferred to a nitrocellulose membrane. The nitrocellulose membrane was subsequently blocked with BSA. One membrane each was subsequently incubated with biotinylated Con A (see FIG. 2 B) and a membrane with biotinylated WGA (see FIG. 2 C). Detection of the proteins was via streptavidin-peroxidase conjugate and ECL system (Amersham, Piscataway, USA). It can also be clearly seen in this presentation that the glycoproteins of the human serum were specifically fractionated according to their glycan structures by means of the method according to the invention.

Claims

Ansprüche claims
1. Vorrichtung zur affinitätschromatographischen reversiblen Bindung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen umfassend eine feste Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix zwei oder mehrere unterschiedliche selektive Affinitätsliganden für Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aufweist, die eine affinitätschromatographische reversible Bindung der Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen ermöglichen.1. An apparatus for the affinity chromatographic reversible binding of mono- and / or oligosaccharide structures comprising a solid matrix, characterized in that the solid matrix has two or more different selective affinity ligands for mono- and / or oligosaccharide structures which have an affinity chromatographic reversible bond allow the mono- and / or oligosaccharide structures.
2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die selektiven Affinitätsliganden an die feste Matrix gebunden sind.2. Device according to claim 1, characterized in that the selective affinity ligands are bound to the solid matrix.
3. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der unterschiedlichen selektiven Affinitätsliganden unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen reversibel binden.3. Device according to one of the preceding claims, characterized in that at least two of the different selective affinity ligands reversibly bind different mono- and / or oligosaccharide structures.
4. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die selektiven Affinitätsliganden unterschiedliche Lektine sind.4. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the selective affinity ligands are different lectins.
5. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lektine aus der Gruppe von Wheat Germ Agglutinin (WGA), Concanavalis Agglutinin (Con A), Peanut Agglutinin (PNA), Jacalin (AIL), Dolichus ό/f/orüs-Agglutinin (DBA), Sojabohnen-Agglutinin (SBA), Lentil-Lektin (LCH), Phaseolus-Agglutinin I (PHA-I), Ricinus co/πmun/s-Agglutinin (RCA 60), Ricinus commun/s-Agglutinin (RCA 120), Elderberry Lectin (SNA), Snowdrop Lectin (GNA), Maackia amurensis-Lekün (MAL), Hairy Vetch Lectin (VVL), Lotus tetragonolobus-Lekün (LTL), Narcissus pseudonarcissus-Lektln (NPL), Sophora /apon/ca-Agglutinin (SJA), Agaricus b/spoms-Agglutinin (ABA), Datum stramonium agglutinin (DSA), Sumbucus sieboldiena lektin (SSA), Cytisus scoparius agglutinin (CSA) und UIΘX ei/ropaeus-Agglutinin (UEA) stammen. 5. The device according to claim 4, characterized in that the lectins from the group of wheat germ agglutinin (WGA), Concanavalis agglutinin (Con A), peanut agglutinin (PNA), jacalin (AIL), Dolichus ό / f / orüs agglutinin (DBA), soybean agglutinin (SBA), lentil lectin (LCH), Phaseolus agglutinin I (PHA-I), Ricinus co / πmun / s agglutinin (RCA 60), Ricinus commun / s agglutinin (RCA 120 ), Elderberry Lectin (SNA), Snowdrop Lectin (GNA), Maackia amurensis Lekün (MAL), Hairy Vetch Lectin (VVL), Lotus tetragonolobus Lekün (LTL), Narcissus pseudonarcissus lectin (NPL), Sophora / apon / ca Agglutinin (SJA), Agaricus b / spoms agglutinin (ABA), date stramonium agglutinin (DSA), Sumbucus sieboldiena lectin (SSA), Cytisus scoparius agglutinin (CSA) and UIΘX oviparous agglutinin (UEA).
6. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lektine aus der Gruppe von Pealectin-I (PSA), Japanese Wisteria Agglutinin (WFA), Lycopersicon esculentum-Lekim (LEL), Amaranthus caudatus-Lekün (ACL), Bauhinia purpurea a/ba-Agglutinin (BPA), Erythrina cristagalli-Lektin (ECL), Euonymus cristagalli-Lektm (EEL), Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia-Lektin (GSL), Hippeastrum-Lektm (HHL), Maclura po/n/fera-Lektin (MPL), Psophocarpus tetragonolobus-Lektln (PTL), Solanum tuberosum-Lekün (STL), Viscum a/jbu/77-AggIutinin (VAA), Anguilla angu/7/a-Agglutinin (AAA), Caragena anborescens-Agglutinin (CAA), Helix pomatfa-Agglutinin (HPA)1 Helix aspersa- Agglutinin (HAA), Phytolacca americana-Lektin (Pokeweed mitogen; PWM) und Vicia faöa-Agglutinin (VFA) stammen.6. The device according to claim 4, characterized in that the lectins from the group of pealectin-I (PSA), Japanese Wisteria agglutinin (WFA), Lycopersicon esculentum-Lekim (LEL), Amaranthus caudatus Lekün (ACL), Bauhinia purpurea a / ba-agglutinin (BPA), Erythrina cristagalli lectin (ECL), Euonymus cristagalli-Lektm (EEL), Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin (GSL), Hippeastrum lectm (HHL), Maclura po / n / fera lectin (MPL), Psophocarpus tetragonolobus lectin (PTL), Solanum tuberosum-Lekün (STL), Viscum a / jbu / 77 agglutinin (VAA), Anguilla angu / 7 / a-agglutinin (AAA), Caragena anborescens agglutinin (CAA ) Helix pomatfa agglutinin (HPA) 1 Helix aspersag agglutinin (HAA), Phytolacca americana lectin (Pokeweed mitogen; PWM) and Vicia faöa agglutinin (VFA).
7. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die selektiven Affinitätsliganden unterschiedliche Aptamere sind.7. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the selective affinity ligands are different aptamers.
8. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die selektiven Affinitätsliganden unterschiedliche Antikörper und/oder Anticaline sind.8. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the selective affinity ligands are different antibodies and / or anticalins.
9. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung in Form einer Chromatographie-Säule, welche die feste Matrix umfasst, vorliegt.9. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the device is in the form of a chromatography column comprising the solid matrix.
10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Chromatographie-Säule befindliche feste Matrix aus einem Material umfassend Sepharose, Agarose, Nitrocellulose, Cellulose, Latex, Polyethylen-Polymere, vorzugsweise Polystyrol, Polyacrylat, Polyacrylamid, Polymethacrylat oder Polyvinylalkohol, Silicium-Sauerstoff-Verbindungen, vorzugsweise Glass- Partikel, Silica oder Silikate, Metalloxide, vorzugsweise Titanoxid, Zinnoxid oder Apatit besteht oder aus Kombinationen dieser Materialien.A device according to claim 9, characterized in that the solid matrix in the chromatography column is made of a material comprising sepharose, agarose, nitrocellulose, cellulose, latex, polyethylene polymers, preferably polystyrene, polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate or polyvinyl alcohol, silicon Oxygen compounds, preferably glass particles, silica or silicates, metal oxides, preferably titanium oxide, tin oxide or apatite, or combinations of these materials.
11. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie-Säule in Form einer 'spin column1 vorliegt. 11. Device according to one of claims 9 or 10, characterized in that the chromatography column is in the form of a spin column 1 .
12. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie-Säule in Form einer HPLC-Säule oder FPLC-Säule vorliegt.12. Device according to one of claims 9 or 10, characterized in that the chromatography column is in the form of an HPLC column or FPLC column.
13. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung oder die feste Matrix aus einer Vielzahl von Partikeln besteht, und dass die selektiven Affinitätsliganden an die Oberfläche der Partikel gebunden sind.13. Device according to one of claims 1 to 9, characterized in that the device or the solid matrix consists of a plurality of particles, and that the selective affinity ligands are bonded to the surface of the particles.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel magnetische Partikel, vorzugsweise ferromagnetische und/oder paramagnetische und/oder superparamagnetische Partikel, sind.14. The device according to claim 13, characterized in that the particles are magnetic particles, preferably ferromagnetic and / or paramagnetic and / or superparamagnetic particles.
15. Verwendung einer Vorrichtung gemäß der Ansprüche 1 bis 14 zur Fraktionierung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen.15. Use of a device according to claims 1 to 14 for the fractionation of mono- and / or oligosaccharide structures.
16. Verfahren zur Fraktionierung von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:16. A process for the fractionation of mono- and / or oligosaccharide structures, comprising the following process steps:
a) in Kontakt bringen einer Lösung enthaltend zwei oder mehr unterschiedliche Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen mit der festen Matrix einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14,a) contacting a solution comprising two or more different mono- and / or oligosaccharide structures with the solid matrix of a device according to one of claims 1 to 14,
b) entfernen der Lösung aus Schritt a) von der festen Matrix aus Schritt a),b) removing the solution from step a) from the solid matrix from step a),
c) selektive Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Bindung mit einem oder mehreren unterschiedlichen Affinitätsliganden mittels eines ersten Elutions-Puffers,c) selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures from binding with one or more different affinity ligands by means of a first elution buffer,
d) selektive Elution von Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Bindung mit einem weiteren oder mehreren weiteren unterschiedlichen Affinitätsliganden, von welchen in Schritt c) keine Elution erfolgte, mittels eines zweiten Elutions-Puffers. d) selective elution of mono- and / or oligosaccharide structures from binding with another one or more further different affinity ligands, of which no elution occurred in step c), by means of a second elution buffer.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen aus der Glycanstruktur von Glykoproteinen stammen.17. The method according to claim 16, characterized in that the mono- and / or oligosaccharide structures derived from the glycan structure of glycoproteins.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykoproteine Teil eines Proteoms oder eines Partialproteoms sind, welches in einer Lösung in Schritt a) mit der festen Matrix in Kontakt gebracht wird.18. The method according to claim 17, characterized in that the glycoproteins are part of a proteome or a partial proteome, which is brought into contact with the solid matrix in a solution in step a).
19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Schritt b) und c) ein oder mehrere Waschschritte eingefügt sind, in welchen die feste Matrix gewaschen wird.19. The method according to any one of claims 16 to 18, characterized in that between step b) and c) one or more washing steps are inserted, in which the solid matrix is washed.
20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Schritt c) und d) ein oder mehrere Waschschritte eingefügt sind, in welchen die feste Matrix gewaschen wird.20. The method according to any one of claims 16 to 19, characterized in that between step c) and d) one or more washing steps are inserted, in which the solid matrix is washed.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte c) und/oder d) einmal oder mehrfach wiederholt werden.21. The method according to any one of claims 16 to 20, characterized in that the steps c) and / or d) are repeated once or several times.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass Schritt d) von einem oder mehreren weiteren selektiven Elutionsschritten gefolgt wird.22. The method according to any one of claims 16 to 21, characterized in that step d) is followed by one or more further selective elution steps.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den zusätzlichen Elutionsschritten und/oder zwischen Schritt d) und dem ersten zusätzlichen Elutionsschritt jeweils ein oder mehrere Waschschritte eingefügt sind, in welchen die feste Matrix gewaschen wird.23. The method according to claim 22, characterized in that between the additional elution steps and / or between step d) and the first additional elution step in each case one or more washing steps are inserted, in which the solid matrix is washed.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen 2 und 10 unterschiedlichen Affinitätsliganden in der Vorrichtung gemäß der Ansprüche 1 bis 14 eingesetzt werden. 24. The method according to any one of claims 16 to 23, characterized in that between 2 and 10 different affinity ligands in the device according to claims 1 to 14 are used.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen 2 und 6 unterschiedlichen Affinitätsliganden in der Vorrichtung gemäß der Ansprüche 1 bis 14 eingesetzt werden.25. The method according to claim 24, characterized in that between 2 and 6 different affinity ligands are used in the device according to claims 1 to 14.
26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferbedingungen in der Lösung aus Schritt a) so eingestellt werden, dass im Wesentlichen alle verwendeten unterschiedlichen Affinitätsliganden selektiv die jeweilige Mono- und/oder Oligosaccharid-Struktur reversibel binden können.26. The method according to any one of claims 16 to 25, characterized in that the buffer conditions in the solution of step a) are adjusted so that substantially all the different affinity ligands used can selectively reversibly bind the respective mono- and / or oligosaccharide structure.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass Pufferbedingungen dadurch erhalten werden, dass die Lösung aus Schritt a) 0.01 bis 0.5 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 7.0, 0.01 bis 0.5 mol/L NaCI, 0.01 bis 20 mmol/L CaCi2, 0.01 bis 20 mmol/L MnCI2 und 0.02 bis 0.2%(w/v) NaN3, vorzugsweise 0.01 bis 0.1 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 6.5, 0.05 bis 0.25 mol/L NaCI, 0.3 bis 3 mmol/L CaCI2, 0.3 bis 3 mmol/L MnCI2 und 0.03 bis 0.08%(w/v) NaN3 und besonders bevorzugt 0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer mit einem pH von 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCl2 und 0.05%(w/v) NaN3 enthält.27. The method according to claim 26, characterized in that buffer conditions are obtained in that the solution from step a) 0.01 to 0.5 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 7.0, 0.01 to 0.5 mol / L NaCI, 0.01 to 20 mmol / L CaCi 2 , 0.01 to 20 mmol / L MnCl 2 and 0.02 to 0.2% (w / v) NaN 3 , preferably 0.01 to 0.1 mol / L Bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 6.5, 0.05 to 0.25 mol / L NaCl, 0.3 to 3 mmol / L CaCl 2 , 0.3 to 3 mmol / L MnCl 2 and 0.03 to 0.08% (w / v) NaN 3 and particularly preferably 0.01 mol / L bis Tris buffer with a pH of 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 contains.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionspuffer 0.01 bis 0.5 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 7.0, 0.01 bis 0.5 mol/L NaCI, 0.01 bis 20 mmol/L CaCI2, 0.01 bis 20 mmol/L MnCI2 und 0.02 bis 0.2%(w/v) NaN3, vorzugsweise 0.01 bis 0.1 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 6.5, 0.05 bis 0.25 mol/L NaCl, 0.3 bis 3 mmol/L CaCI2, 0.3 bis 3 mmol/L MnCI2 und 0.03 bis 0.08%(w/v) NaN3 und besonders bevorzugt 0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer mit einem pH von 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3 enthält sowie weiterhin eine Substanz, welche selektiv die reversibel gebundene Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen kompetitiv aus ihrer Bindung mit den Affinitätsliganden verdrängt.28. The method according to any one of claims 16 to 27, characterized in that the elution buffer 0.01 to 0.5 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 7.0, 0.01 to 0.5 mol / L NaCl, 0.01 to 20 mmol / L CaCl 2 , 0.01 to 20 mmol / L MnCl 2 and 0.02 to 0.2% (w / v) NaN 3 , preferably 0.01 to 0.1 mol / L Bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 6.5, 0.05 to 0.25 mol / L NaCl, 0.3 to 3 mmol / L CaCl 2 , 0.3 to 3 mmol / L MnCl 2 and 0.03 to 0.08% (w / v) NaN 3 and more preferably 0.01 mol / L bis-Tris buffer with a pH of of 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 and furthermore a substance which selectively contains the reversibly bound monosaccharide and / or oligosaccharide Structures competitively displaced from their binding with the affinity ligands.
29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Strukturhomolog ist. 29. The method according to claim 28, characterized in that the substance is a structural homolog.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturhomolog ein Aptamer oder Ribozym, bevorzugt jedoch ein Mono- oder Oligosaccharid ist.30. The method according to claim 29, characterized in that the structural homologue is an aptamer or ribozyme, but preferably a mono- or oligosaccharide.
31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Waschschritt mit einem Waschpuffers enthaltend 0.01 bis 0.5 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 7.0, 0.01 bis 0.5 mol/L NaCI, 0.01 bis 20 mmol/L CaCI2, 0.01 bis 20 mmol/L MnCI2 und 0.02 bis 0.2%(w/v) NaN3, vorzugsweise 0.01 bis 0.1 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 6.5, 0.05 bis 0.25 mol/L NaCI, 0.3 bis 3 mmol/L CaCl2, 0.3 bis 3 mmol/L MnCl2 und 0.03 bis 0.08%(w/v) NaN3 und besonders bevorzugt 0.01 mol/L Bis- Tris-Puffer mit einem pH von 6.0, 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3 erfolgt.31. The method according to any one of claims 16 to 30, characterized in that the washing step with a washing buffer containing 0.01 to 0.5 mol / L bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 7.0, 0.01 to 0.5 mol / L NaCl, 0.01 to 20 mmol / L CaCl 2 , 0.01 to 20 mmol / L MnCl 2 and 0.02 to 0.2% (w / v) NaN 3 , preferably 0.01 to 0.1 mol / L Bis-Tris buffer in a pH range of 6.0 to 6.5, 0.05 to 0.25 mol / L NaCl, 0.3 to 3 mmol / L CaCl 2 , 0.3 to 3 mmol / L MnCl 2 and 0.03 to 0.08% (w / v) NaN 3 and particularly preferably 0.01 mol / L bis-tris Buffer with a pH of 6.0, 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 .
32. Puffer zur simultanen Bindung zweier oder mehrerer Mono- und/oder Oligosaccharid-Strukturen an zwei oder mehrere unterschiedliche Lektine enthaltend 0.01 bis 0.5 mol/L Bis-Tris-Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 7.0, 0.01 bis 0.5 mol/L NaCI, 0.01 bis 20 mmol/L CaCI2, 0.01 bis 20 mmol/L MnCI2 und 0.02 bis 0.2%(w/v) NaN3, vorzugsweise 0.01 bis 0.1 mol/L Bis-Tris- Puffer in einem pH-Bereich von 6.0 bis 6.5, 0.05 bis 0.25 mol/L NaCl, 0.3 bis 3 mmol/L CaCl2, 0.3 bis 3 mmol/L MnCI2 und 0.03 bis 0.08%(w/v) NaN3 und besonders bevorzugt 0.01 mol/L Bis-Tris-Puffer mit einem pH von 6.0; 0.15 mol/L NaCI, 1 mmol/L CaCI2, 1 mmol/L MnCI2 und 0.05%(w/v) NaN3. 32. Buffer for the simultaneous binding of two or more mono- and / or oligosaccharide structures to two or more different lectins containing from 0.01 to 0.5 mol / L of bis-Tris buffer in a pH range from 6.0 to 7.0, 0.01 to 0.5 mol / L NaCl, 0.01 to 20 mmol / L CaCl 2 , 0.01 to 20 mmol / L MnCl 2 and 0.02 to 0.2% (w / v) NaN 3 , preferably 0.01 to 0.1 mol / L bis-Tris buffer in a pH range from 6.0 to 6.5, 0.05 to 0.25 mol / L NaCl, 0.3 to 3 mmol / L CaCl 2 , 0.3 to 3 mmol / L MnCl 2 and 0.03 to 0.08% (w / v) NaN 3 and more preferably 0.01 mol / L Bis Tris buffer with a pH of 6.0; 0.15 mol / L NaCl, 1 mmol / L CaCl 2 , 1 mmol / L MnCl 2 and 0.05% (w / v) NaN 3 .
PCT/EP2006/000092 2005-01-10 2006-01-09 Device and method for fractionating monosaccharide and/or oligosaccharide structures WO2006072587A1 (en)

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