WO2005012554A1 - オンチップバイオアッセイ方法及びキット - Google Patents

オンチップバイオアッセイ方法及びキット Download PDF

Info

Publication number
WO2005012554A1
WO2005012554A1 PCT/JP2004/001128 JP2004001128W WO2005012554A1 WO 2005012554 A1 WO2005012554 A1 WO 2005012554A1 JP 2004001128 W JP2004001128 W JP 2004001128W WO 2005012554 A1 WO2005012554 A1 WO 2005012554A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chip
cells
micropore
bioassay
micropores
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/001128
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirofumi Tani
Tamio Kamidate
Koji Maehana
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Agency filed Critical Japan Science And Technology Agency
Priority to CA002534305A priority Critical patent/CA2534305A1/en
Priority to US10/566,861 priority patent/US20060246416A1/en
Publication of WO2005012554A1 publication Critical patent/WO2005012554A1/ja

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B01J2219/00317—Microwell devices, i.e. having large numbers of wells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/0074—Biological products
    • B01J2219/00743—Cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0874—Three dimensional network
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to an on-chip bioassay method and an on-chip bioassay kit used for the method.
  • microchips that integrate elements necessary for chemical analysis, such as microchannels, reactors, and electrodes for detection, on substrates such as silicon glass
  • the analytical instruments used have come to be used.
  • Microchip-based electrophoresis devices for DNA and proteins have already been developed and are commercially available.
  • Analytical devices based on such microfluidic chips are used for integration of chemical analysis experiments, high throughput, resource saving, and resource saving. It enables space and mouth emission.
  • Microarrays can also be cited as microchip-based analytical devices. This is a tool for processing DNA and proteins. Are arranged and immobilized on a solid substrate at high density as probe molecules.
  • a cell-adhesive polymer to provide a culture substrate, a cell array, an automatic chemical injection device, and an Atsey system necessary for easily assembling various chemicals such as drugs and poisons.
  • the area covered by the non-cell-attached hydrophilic polymer is surrounded by a non-cell-adhesive hydrophilic polymer, and the surrounding area is covered by a non-cell-adhesive strong hydrophobic material. It is particularly useful for high-density cell array substrates with a surface where the covered area is continuously enclosing (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-33177), and for performing cell-based comparative analysis.
  • the steps of introducing multiple samples on a lip that can simultaneously assess a wide range of biological or biochemical activities of many species; and b) a porous Assy matrix or not.
  • Using at least one matrix to introduce one or more atsey components into the atsey c) i) washing the matrix used at the atsey to remove excess sample, atsey components or a combination thereof
  • ii) a method of assaying the biological or biochemical activity of a sample which comprises the step of contacting the matrix used in the assay with the additional reagent in a bulk solution or as a liquid (Table 2). (Japanese Patent Publication No. 26390).
  • An object of the present invention is to provide a bio-assay system which is highly versatile and capable of high-throughput analysis without being conscious of handling cells and reducing pre-operation such as culture. It is in.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and have devised a microchip in which a plurality of types of cells are immobilized in a plurality of micropores on a substrate. By immobilizing the cultured cells in a state that can be used for the test, the user can immediately perform the test without any previous operation, and no special equipment is required.
  • the present invention provides a method in which a microfluidic chip for cell introduction is fixed to the lower surface of a microporous chip composed of a substrate through which a plurality of micropores arranged in a lattice are penetrated, and A plurality of micro-cell introduction channels are formed in the micro-pores, and the cells suspended through the channels are formed into micro-pores of the micro-pore chip. Then, a test substance introducing microfluidic chip is placed on the upper surface of the microporous chip so that the plurality of fine test substance introducing flow paths intersect with the plurality of fine cell introducing flow paths.
  • An on-chip bioassay method comprising contacting a cell in a micropore and detecting the degree of influence of a test substance on the cell after a predetermined time or at a predetermined time interval. Before pouring the suspended cells into the micropores of the microporous chip, attach a vented waterproof sealing membrane on the top surface of the microporous chip to prevent the cells from flowing out of the micropores. Claim 1 characterized by the above-mentioned.
  • the on-chip bioassay method according to any one of claims 1 to 4 wherein cells are immobilized in micropores (claim 5), and a low-melting point agarose gel as cells suspended in a gel.
  • the present invention relates to the on-chip bioassay method according to claim 5, wherein cells suspended in a cell are used.
  • the present invention also provides the on-chip bioassay method according to any one of claims 1 to 6, wherein the microfluidic chip for cell introduction and the microfluidic chip for test substance introduction are the same microfluidic chip.
  • (Claim 7) The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the temperature is controlled for each cell row of the micropores of the micropore chip and for each test substance row orthogonal to Z or the cell row. From the biochip method (Claim 8) and the microchip after use 9.
  • An on-chip bioassay method (claim 10) according to any one of claims 1 to 9, wherein one or two or more species selected from the group consisting of cells are used.
  • the on-chip bioassay method according to any one of claims 1 to 10, wherein the cells are used (claim 11), and the use of two or more test substances.
  • the on-chip bioassay method (Claim 12) according to any one of (1) and (2) wherein the means for in situ detecting the degree of the effect of the test substance on the cell has a spatial resolution of detecting a signal generated from the cell.
  • CCD turtle Relates claim 1-1 2 according to any on-chip Baioatsusi method which is a photodiode array or photographic dry plate (claim 1 3).
  • the present invention provides a micropore chip comprising a substrate through which a plurality of micropores arranged in a lattice for penetrating and solidifying cells suspended in a gel such as agarose, and one surface of each of the micropore chips
  • An on-chip bioassay kit (Claim 14), characterized by comprising two microfluidic chips that form a plurality of microchannel groups by adhering to a microfluidic chip.
  • the on-chip bioassay kit according to claim 14 further comprising an air-permeable and waterproof sealing membrane which is fixed to one surface of the micropores to prevent cells from flowing out of the micropores. 16.
  • the on-chip bioassay kit according to any one of claims 14 to 16 (claim 17), and the microfluidic chip is made of polydimethylsiloxane.
  • Clause 1 4 The on-chip bioassay kit according to any one of (1) to (17), and the micropores are through holes of 300 to 900 m X 300 to 900 m square.
  • the on-chip bioassay kit according to any one of claims 14 to 18 (claim 19), and the width of the flow path of the microfluidic chip is equal to the length of the side of the micropore.
  • the bioassay kit according to any one of claims 14 to 19 (claim 20), and the interval between the flow paths of the plurality of microfluidic chips is widened at the end.
  • the present invention relates to an on-chip bioassay kit (claim 21) according to any one of claims 14-20.
  • FIG. 1 is a photograph showing a micro-mosaic type assembly of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a microporous chip (A) and a microfluidic chip (B) of the present invention.
  • FIG. 3 is a photograph showing an on-chip bioassay in a mutagen detection test of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of a mutagen detection test using the on-chip bioassay of the present invention.
  • a microfluidic chip for cell introduction is fixed to the lower surface of a microporous chip composed of a substrate in which a plurality of micropores arranged in a lattice are penetrated.
  • a plurality of fine cell introduction channels are formed between the microfluidic chip and the cell introduction microfluidic chip, and the suspended cells are flowed into the micropores of the micropore chip via the flow channels.
  • a microfluidic chip for introducing a test substance is The input channel is fixed so as to intersect (preferably substantially orthogonal) with the plurality of fine cell introduction channels, and a plurality of fine test samples are inserted between the micropore chip and the test substance introduction microfluidic chip.
  • a substance introduction flow path is formed, and the test substance is poured through the flow path and brought into contact with the cells in the micropores of the micropore chip, and the test substance is supplied after a predetermined time or at a predetermined time interval.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method for detecting the degree of influence on cells in situ, and “detecting in situ” here means that at least a microporous chip, a microfluidic chip for cell introduction, and a coating are used. This means that detection is performed using a microbioassay chip formed from a microfluidic chip for introducing a test substance as it is.
  • micro-hole chip As the micro-hole chip, a plurality of micro-holes arranged in a matrix of m columns in the vertical direction and n rows in the horizontal direction (m and n may be the same or different, mX n is 2 or more) are penetrated.
  • Any substrate made of silicon, glass, plastic, or the like may be used.
  • the size of such a substrate is not particularly limited, but a substrate having a thickness of 300 to 100 m is usually used. .
  • the shape of the micropores is not particularly limited, such as a square, a rectangle, a circle, an ellipse, and a triangle.A square or a circle, especially a square, is the width direction of the flow channel provided in the microfluidic chip. And the opening of the hole are preferable.
  • the size of the micropore is preferably 100 m or less in length of one side or diameter, and for example, has an opening of 300 to 900 mX 300 to 900 / xm square.
  • Micropores can be specifically exemplified, but the lower limit is not particularly limited. Micropores: Even if the dimensions of the microchannels are small, it is possible to distribute the suspension of bacterial cells or the test substance solution to the microchannels and micropores by capillary action, and to spread only by capillary action If this is difficult, it can be pumped by a high-pressure pump or suctioned by a vacuum pump. There is no particular limitation on the method of perforating the substrate to penetrate the fine holes.
  • a case of perforating a silicon substrate will be described below.
  • the substrate from which organic substances etc. were removed from the surface of the silicon substrate was placed in a thermal oxidation furnace, heated to 100 ° C or more under nitrogen ventilation, and steam was introduced into the furnace to oxidize the silicon substrate.
  • An SiO 2 film is formed on the surface.
  • both surfaces of the silicon substrate having the SiO 2 film formed thereon are made lipophilic by HMDS or the like, and then photo-resist is spin-coated and prebaked.
  • the silicon substrate after prebaking is brought into close contact with a photomask whose pattern is output to a transparencies using a laser printer, and photolithography is performed by ultraviolet irradiation.
  • etching of the SiO 2 film with hydrogen fluoride and anisotropic etching of the silicon substrate with KOH are performed from both sides of the substrate, and a fine through hole can be formed by piercing the silicon substrate.
  • a temperature control mechanism on the substrate constituting the micropore chip for each column and / or row of micropores.
  • a temperature control mechanism for each column or row of cells, cells of multiple types of microorganisms with different optimal growth temperatures can be used simultaneously, and temperature control for each column or row of the test substance
  • An example of such a temperature control mechanism is a control mechanism in which a printed wiring board is used as a heater, and is attached to a bioassay chip to set an arbitrary location on the chip to a predetermined temperature.
  • a control mechanism for setting an arbitrary location on a chip to a predetermined temperature by bonding a Peltier element in the same manner can be exemplified.
  • Examples of cells that can be used for the on-chip bioassay of the present invention include microbial cells, animal cells, and plant cells. More specifically, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, and Streptococcus Cockas Bacterial prokaryotic cells such as Coccus, eukaryotic cells such as yeast and Aspergillus, insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9, L cells, CH cells, COS cells, HeLa cells, C 127 cells, BAL BZc3T3 cells (including mutants deficient in dihydrofolate reductase, etc.), BHK21 cells, HEK293 cells, Bowes melano Examples include animal cells, plant cells, and the like, such as wild cells, oocytes, and T cells.
  • the cell suspension is poured into the micropores of the micropore chip through a plurality of microcell introduction channels formed between the micropore chip and the microfluidic chip for cell introduction.
  • the immobilized microorganism can be obtained by pouring cells suspended in a gel that solidifies by raising or lowering the temperature into micropores of a micropore chip.
  • gels include agar gel, agarose gel, collagen gel, calcium alginate gel, cross-linked dextran gel, and synthetic polymer gel.
  • a synthetic polymer gel When a synthetic polymer gel is used, polymerization is promoted by using a cross-linking agent, polymerization accelerator, or polymerization initiator in combination with a monomer of the synthetic polymer gel such as acrylamide or polyvinyl alcohol, and gelation occurs. become.
  • a cross-linking agent such as acrylamide or polyvinyl alcohol
  • a monomer of the synthetic polymer gel such as acrylamide or polyvinyl alcohol
  • transformed cells can be used as cells in order to facilitate the in situ detection of the degree of the effect of the test substance on the cells.
  • Examples of such a transformed cell include a transformant in which a reporter gene is ligated downstream of a promoter of a candidate gene that is expressed by contact with a test substance. It can be produced by Reporter genes include DNA encoding a fluorescent protein such as GFP (green fluorescent protein) and firefly.
  • GFP fluorescent protein
  • EYFP Enhanced Yellow Fluorescent Protein
  • ECFP Enhanced CYAN fluorescent protein
  • DsRed red
  • a waterproof membrane (breathable and water-blocking) sealing membrane is attached to the upper surface of the micropore chip to remove the cells from the micropores. Cell outflow can be prevented.
  • a ventilated waterproof sealing membrane When such a ventilated waterproof sealing membrane is used, the cell suspension is passed through a plurality of fine cell introduction channels formed between the microporous chip and the cell introduction microfluidic chip.
  • the vented and waterproof sealing membrane is used to flow the test substance through a plurality of fine test substance introduction channels formed between the microporous tip and the test substance introduction microfluidic chip.
  • the cell introduction microfluidic chip forms a plurality of fine cell introduction channels between the micropore chip and the cell introduction microfluidic chip in cooperation with the micropore chip, and suspends through the channel. Used to flow turbid cells into the micropores of a micropore chip.
  • the width of the cell introduction channel formed by fixing the cell introduction microfluidic chip to the lower surface of the micropore chip is the length of the micropore side. It is preferable that the length be equal, and the length is such that the cell suspension can be spread over all of the plurality of micropores in one column or one row. By flowing different types of cell suspensions into the respective channels, it becomes possible to introduce different cells into each column or each row of the arranged micropores.
  • the cell suspension and cell-encapsulated gel in the micropores in the same row or row are connected via microchannels formed when the micropore chip and the cell introduction microfluidic chip are fixed. There is no need to peel off the microfluidic chip for cell introduction or break the gel, etc., and the analysis can be performed as long as the microfluidic chip for cell introduction and the microporous chip are fixed. It is also possible to remove cells from the used microchip and reuse the microfluidic chip for cell introduction together with the microporous chip.
  • the analyte-introducing microfluidic chip cooperates with the microporous chip to form a plurality of fine analyte-introducing channels between the microporous chip and the analyte-introducing microfluidic chip. It is used to bring the test substance into contact with the cells in the micropores of the micropore chip via a channel.
  • the width of the analyte-introducing channel formed by fixing the analyte-introducing microfluidic chip on the upper surface of the microporous chip so as to be substantially orthogonal to the plurality of microcell-introducing channels is small.
  • the length is preferably equal to the length of the side of the sample, and the length is preferably such that the test substance can be distributed to all of the micropores in one column or one row.
  • test substance By flowing the test substance, it becomes possible to introduce a different test substance for each column or each row of the arranged micropores.
  • the test substance that comes into contact with the cells in the micropores in the same column or row is connected via the microchannel formed when the micropore chip and the microfluidic chip for introducing the test substance are fixed. It is not necessary to peel off the microfluidic chip for introducing the test substance, and the analysis can be performed with the microfluidic chip for introducing the test substance and the microporous chip fixed.
  • the microfluidic chip for introducing the test substance and the microporous chip fixed.
  • test substance examples include various mutagenic substances, environmental hormones, drug candidates, heavy metal ions, neurotransmitters, solutions of chemical substances such as cytokines and interleukin, and body fluids such as serum. can do.
  • a reactant for detecting an enzyme substrate or the like can be simultaneously poured together with the test substance.
  • the microfluidic chip for cell introduction and the microfluidic chip for test substance introduction are preferably of the same shape and made of the same material.
  • the material is not particularly limited as long as it can be fixed by, for example, but is preferably a material that can be detachably attached to the substrate constituting the microporous chip.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • a mold for a PDMS flow channel treated on one side only is prepared in the same manner as in the preparation of the substrate constituting the micropore chip, and unpolymerized PDMS and a polymerization initiator are used for the PDMS flow channel.
  • PDMS can be advantageously used as a microfluidic chip material because it has excellent adhesion to PDMS itself, in addition to silicon, polymers such as glass and acrylic.
  • the on-chip bioassay method of the present invention comprises a microporous chip, a microfluidic chip for cell introduction, and a microfluidic chip for test substance introduction.
  • a suspension of one or more cells is introduced through a plurality of fine cell introduction channels formed between the chip and the microfluidic chip for cell introduction.
  • a plurality of fine analytes formed between the microfluidic chips for introduction One or more analytes flow through the introduction flow channel to narrow the analytes. After a predetermined time or at predetermined time intervals, the degree of the effect of the test substance on the cells is detected in situ.
  • signals generated from cells in each of the micropores can be detected by a CCD camera having a spatial resolution, photodiodes such as a photodiode array, various scanners, and a photoplate.
  • the microfluidic chip for sample introduction is arranged perpendicular to the microfluidic chip for cell introduction, it is possible to perform tests with different combinations of cells and samples for each micropore at the same time, which is equivalent to the number of micropores. Test results can be obtained simultaneously.
  • the microfluidic tip for cell introduction and the flow path design of the microfluidic chip for sample introduction can be changed according to the purpose, but the interval between the flow paths of a plurality of microfluidic chips is increased at the end. With such a configuration, the tubes for liquid sending are connected and the cell suspension / injection of the test substance is facilitated.
  • a micropore chip comprising a substrate through which a plurality of micropores arranged in a lattice for pouring suspended cells are passed;
  • a substrate through which a plurality of micropores arranged in a lattice for pouring suspended cells are passed;
  • two microfluidic chips that are fixed to each side to form a plurality of fine flow channel groups.
  • Escherichia coli for mutagenicity test was immobilized and a mosaic-type mosaic-type on-chip bioassay was performed.
  • Escherichia coli for mutagenicity test Escherichia coli in which a firefly luciferase gene that generates bioluminescence was incorporated on a plasmid instead of the SOS gene whose expression was induced by a mutagen was used. Also, what is the micro-mosaic type Atsushi?
  • a microfluidic chip to introduce a test bacterium into the vertical m rows of micropores and a sample into the horizontal ⁇ row, it is possible to simultaneously perform the mx ⁇ combination test. Atsushi will be.
  • the test was performed with 5 columns and 5 rows.
  • a silicon substrate was used for the microporous chip for cell immobilization, and PDMS, which had high adhesion to silicon and glass, was used for E. coli and a microfluidic chip for sample introduction.
  • microporous chip 3. 0 X 3. 5 cm, the silicon down substrate having a thickness of 6 2 5 m installed in a thermal oxidation furnace, making the S i ⁇ 2 film having a thickness of 2 / m on the surface thereof did.
  • Conductive etching was performed from both sides of the substrate, and fine through-holes of 700 m square were drilled in the silicon substrate at 5 locations in 5 columns and 5 rows, for a total of 25 locations.
  • the spacing between the through holes was 1.5 mm (see Fig. 2A).
  • microfluidic chip A silicon substrate was processed by the same operation as above to produce a ⁇ -shaped chip. Pour PDMS (Dow Corning SYL GARD 184) containing a polymerization initiator into this, and degas under reduced pressure in a glass desiccator to remove mixed air. It was left still. Thereafter, the mixture was polymerized by heating at 60 ° C for 4 hours, and peeled off from the mold ⁇ to obtain a microfluidic chip. The microfluidic chip was provided with five channels with a width of 700 m and a depth of 200 im at 1.5 mm intervals. Two chips were prepared for cell introduction and sample introduction (see Fig. 2B).
  • a microfluidic chip was attached to one side of the microporous chip so that the micropores and the flow path overlap, and the test bacteria mixed with agarose was poured into the chip.
  • a polytetrafluoroethylene membrane filter (manufactured by Adobe Systems Incorporated) was attached to the other surface of the microporous chip to prevent the test bacteria from flowing out.
  • the chip into which the test bacterium was introduced was allowed to stand at 4 ° C for 10 minutes to gel agarose.
  • the membrane filter was peeled off, and this was used as a chip for immobilizing test bacteria (see the upper part of Fig. 3).
  • the same test bacteria were immobilized on all the channels in order to study the reproducibility.
  • On-chip bioassay A similar microfluidic chip was attached to the surface of the test bacteria-immobilized chip on which the microfluidic chip was not attached, so as to be orthogonal to the cell introduction (see the lower part of Fig. 3).
  • mitomycin C was poured as a mutagenic substance to induce expression.
  • the optimal conditions for expression induction were 37 ° C and 1 hour.
  • a mixed solution of luciferin and adenosine triphosphate was introduced, and the resulting luminescence was measured using a CCD camera (C-480, manufactured by Hamamatsu Photonics). Photographed (see Figs. 1 and 3).
  • the microphone mouth bioassay chip and the on-chip bioassay method of the present invention By applying the microphone mouth bioassay chip and the on-chip bioassay method of the present invention to bioassays of various cells and different types, a simple test can be performed at a high throughput.
  • manufacturers provide chips in which multiple types of cells according to test items are immobilized, as in current DNA arrays, and users need to perform pre-culture and other tasks. Various tests and inspections can be performed without any operation. Combined with a highly sensitive detection method, it is possible to integrate cells at high density .

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　培養などの前操作を軽減した、汎用性が高く、ハイスループットな分析が可能なオンチップバイオアッセイシステムを提供することである。　格子状に配列した複数の微細孔が貫通された基板からなる微細孔チップの下面に、細胞導入用微小流体チップを固着して、微細孔チップと細胞導入用微小流体チップ間に複数の微細な流路を形成し、該流路を介して懸濁した細胞を微細孔に流し込み、次いで、微細孔チップの上面に、被検物質導入用微小流体チップを、その複数の微細な被検物質導入用流路が前記細胞導入用流路と直交するように固着して、微細孔チップと被検物質導入用微小流体チップ間に複数の微細な流路を形成し、該流路を介して被検物質を流し込み、微細孔チップの微細孔内の細胞と接触させ、所定時間後あるいは所定の時間間隔で、被検物質が細胞に及ぼす影響の程度をインサイチューに検出する。

Description

明 細 書 オンチップバイオアツセィ方法及びキッ ト 技術分野
本発明は、 オンチップバイオアッセィ方法及びそれに用いられるオン チップバイオアツセィキッ 卜に関する。 背景技術
近年の半導体産業における微細加工技術の発展に伴い、 シリコンゃガ ラスなどの基板上に微小な流路ゃ反応器、 検出のための電極など化学分 祈に必要な要素を集積化したマイクロチップを用いる分析機器が用いら れるようになってきた。 D N Aやタンパク質のためのマイクロチップべ ースの電気泳動装置は既に開発 · 市販されている。 このような微小流体 チップをべ一スとする分析デバイス （マイクロ分析システム、 - To t a l Ana lys i s Sys t em, -TAS) は、 化学分析実験の集積化、 ハイスル一プッ 卜、 省資源、 省スペース、 口一ェミッショ ンを可能にするものであり、 現在、 生化学分析を中心に前述の電気泳動ゃク口マトグラフィーを行う 分離用チップ、 ィムノアツセィゃ酵素分析を行うアツセィ用チップ、 ポ リメラ一ゼチェーンリアクション （P C R ) を行う合成反応用チップな どの開発が世界的規模で活発に行なわれている。 これらは、 持ち運びが 容易であることから、 環境分析をサンプリ ングしたその場で行ったり、 高精度な臨床試験をべッ ドサイ ドで行うことも可能になると期待されて いる。
また、 マイクロチップをベースとした分析デバィスとしてマイクロア レイも挙げることができる。 これは、 D N Aやタンパク質などをプロ一 ブ分子として固体基板上に高密度に配列、 固定化したもので、 試料中の
D N Aや R N A、 タンパク質、 基質分子などとの結合をモニターするこ とで、 m R N Aやタンパク質の発現、 生体分子間相互作用の解析を行う ことができる。 これらのアレイタイプのマイクロチップでは、 一つの基 板に多数のプローブが固定化されているが、 基板上のそれらと反応させ ることのできる試料は、 単一の検体であり、 多数の検体との組合せを同 時にモニタ一することを目的としていない。
従来のマイクロチップをベースとした分析システムでは、 プローブ分 子と標的分子の相互作用や、それに引き続く反応をモニターすることで、 標的分子の定量や相互作用の評価を行っている。 しかし、 環境汚染物質 や新規化学物質の特性を評価する際には、 濃度や生体分子との相互作用 に関する情報だけではなく、 それによつて引き起こされる生物学的な応 答をモニターする必要がある。 そのためには、 生体や臓器、 特定の細胞 やその機能を遺伝子組換えによって形質転換した細胞を用いる生物学的 定量 （バイオアツセィ） を行う必要がある。
他方、 多種の薬物 ·毒物等の化学物質を簡便にアツセィするために必 要な培養基板、 細胞アレイ 、 化学物質の自動注入装置、 アツセィ系を提 供するために、 細胞付着性高分子に被覆された領域が不連続に微細に規 則正しく並べられ、 そのまわりを細胞非付着性の親水性高分子に被覆さ れた領域が囲み、 さらにそのまわりを細胞非付着性の強疎水性材料に被 覆された領域が連続的に囲んでいる表面を持つ高密度細胞ァレイ用基板 (特開 2 0 0 3— 3 3 1 7 7号公報） や、 細胞ベースの比較解析を行う うえで特に有用であり、 シグナル伝達経路のモジュレーター候補の高ス ループッ トスクリーニングを可能にする、 （a) それぞれ 1以上の内腔を 備え、 該内腔内に細胞群を収めた一連の管からなる管アレイを準備する 工程； （b) 該管アレイを横断的に切断して、 複数個の管横断薄片を得る 工程；及び （C) 該複数個の管薄片を固相支持体上に固定する工程を含む 細胞ァレイの調製法 （特表 2 0 0 3— 5 1 6 7 4 7号公報） など細胞ァ レイや細胞チップに関する技術 （例えば、 特開 2 0 0 2 _ 2 9 7 9 2 2 号公報、 特表 2 0 0 2— 54 342 9号公報、 特表 2 0 0 2 - 5 2 3 7 8 1号公報） が提案されている。
その他、 多数の化学種の広範な生物又は生化学活性を同時にアツセィ することが可能なリックス上に複数の試料を導入する段階と、 b) 多孔 質アツセィマトリックスでもよいし、 そうでなくてもよい少なくとも 1 種のマトリックスを使用して 1種以上のアツセィ成分をアツセィに導入 する段階と、 c ) i ) アツセィで使用したマトリックスを洗浄し、 過剰 量の試料、 アツセィ成分又はその組み合わせを除去するか、 又は i i ) アツセィで使用したマトリックスをバルク溶液中で又は液体として付加 試薬と接触させる付加段階を実施する段階を含む試料の生物又は生化学 活性のアツセィ方法 （特表 2 0 0 1 - 5 2 6 3 9 0号公報） が提案され ている。
細胞や細菌を利用した様々な分析や検査を行う場合、 通常は試験管や マイクロタイ夕一プレートなどで、 細胞培養から試料の添加、 検出など の一連の作業を行う必要がある。 これら細胞を扱う作業には、 無菌操作 が可能な特別な施設やスキルが必要となるため、 汎用性が低いという問 題があった。 また、 通常試験の直前に行う細胞の培養には長時間を要す るため、 多数の試料を扱う場合や、 多くの情報を引き出すために複数種 の細胞を用いる場合には特に問題となっていた。
こうした問題を解決するためには、 細胞を扱っていることを意識する ことなく、 かつ培養などの前操作を軽減した、 汎用性の高い検査システ ムが要求される。 現在の化学分析や生化学分析ではこうした要求に応え る各種試験紙や検査キッ ト、 センサーなどが開発 ·市販されているが、 バイオアツセィでは、こうした簡易試験法は実用化されていない。また、 ハイスル一プットな分析を行うためには、 多数の試料と多数のプローブ (バイオアッセィでは細胞など） 同士の掛け合わせが同時に達成できる ようなシステムも必要となる。 最近では、 マイクロチップを用いて化学 物質や生理活性物質が細胞に及ぼす影響をモニターする試みがなされて いるが、 汎用性のある細胞固定化技術やシグナル検出法が十分確立され ておらず、 実用化には至っていないのが現状である。
本発明の課題は、 細胞を扱っていることを意識することなく、 かつ培 養などの前操作を軽減した、 汎用性が高く、 ハイスル一プッ トな分析が 可能なバイオアツセィシステムを提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究し、 複数種の細胞 を基板上の複数の微細孔に固定化したマイクロチップを考案した。 試験 に使用可能な状態に培養済みの細胞を固定化することで、 使用者は前操 作なしですぐに試験に供することが可能となり、 特別な設備も必要とし ない。 また、 複数の微小流路を有するチップを用いて微細孔の列ごとに 異なる細胞を固定化し、 これと直交するように複数の微小流路を有する 別のチップを用いて異なる試料を導入することで、 各微細孔ごとに細胞 と試料の組合せが異なる試験を行うことが可能となり、 微細孔の数に相 当する試験結果を同時に得ることができる。 本発明は以上の知見に基づ いて完成するに至ったものである。 発明の開示
すなわち本発明は、 格子状に配列した複数の微細孔が貫通された基板 からなる微細孔チップの下面に、細胞導入用微小流体チップを固着して、 微細孔チップと細胞導入用微小流体チップ間に複数の微細な細胞導入用 流路を形成し、 該流路を介して懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔に 流し込み、 次いで、 微細孔チップの上面に、 被検物質導入用微小流体チ ップを、 その複数の微細な被検物質導入用流路が前記複数の微細な細胞 導入用流路と交叉するように固着して、 微細孔チップと被検物質導入用 微小流体チップ間に複数の微細な被検物質導入用流路を形成し、 該流路 を介して被検物質を流し込み、 微細孔チップの微細孔内の細胞と接触さ せ、 所定時間後あるいは所定の時間間隔で、 被検物質が細胞に及ぼす影 響の程度をィンサイチユーに検出することを特徴とするオンチップバイ オアッセィ方法 （請求項 1 ) や、 懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔 に流し込むに先だって、 微細孔チップの上面に通気防水性の封孔メンブ ランを貼着して、 微細孔からの細胞の流出を防止することを特徴とする 請求項 1記載のオンチップバイオアツセィ方法（請求項 2 )や、基板が、 シリコン基板であることを特徴とする請求項 1又は 2記載のオンチップ バイオアツセィ方法 (請求項 3 ) や、 微小流体チップが、 ポリジメチル シロキサン製であることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のォ ンチップバイオアツセィ方法 （請求項 4 ) や、 ゲルに懸濁した細胞を微 細孔チップの微細孔に流し込み、 微細孔内で細胞を固定化することを特 徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載のオンチップバイオアツセィ方法 (請求項 5 ) や、 ゲルに懸濁した細胞として、 低融点のァガロースゲル に懸濁した細胞を使用することを特徴とする請求項 5記載のオンチップ バイオアツセィ方法 （請求項 6 ) に関する。
また本発明は、 細胞導入用微小流体チップと被検物質導入用微小流体 チップとが同一の微小流体チップであることを特徴とする請求項 1〜 6 のいずれか記載のオンチップバイオアツセィ方法 （請求項 7 ) や、 微細 孔チップの微細孔の細胞列毎及び Z又は細胞列に直交する被検物質列毎 に温度制御することを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載のオンチ ップバイオアツセィ方法 （請求項 8 ) や、 使用後のマイクロチップから 細胞を除去し、 チップを再利用することを特徴とする請求項 1〜 8のい ずれか記載のオンチップバイオアツセィ方法 （請求項 9 ) や、 細胞とし て、 微生物細胞、 動物細胞、 植物細胞からなる群から選ばれる 1種又は 2種以上を用いることを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか記載のオン チップバイオアツセィ方法 （請求項 1 0 ) や、 細胞として、 形質転換細 胞を用いることを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか記載のオンチッ プバイオアツセィ方法 （請求項 1 1 ) や、 2種以上の被検物質を用いる ことを特徴とする請求項 1〜 1 1のいずれか記載のオンチップバイオア ッセィ方法 （請求項 1 2 ) や、 被検物質が細胞に及ぼす影響の程度をィ ンサイチューに検出する手段が、 細胞から生じるシグナルを検出する、 空間分解能を有する C C Dカメラ、 フォトダイオードアレイ又は写真乾 板であることを特徴とする請求項 1〜 1 2のいずれか記載のオンチップ バイオアツセィ方法 （請求項 1 3 ) に関する。
さらに本発明は、 ァガロースなどのゲルに懸濁した細胞を流し込み固 化するための格子状に配列した複数の微細孔が貫通された基板からなる 微細孔チップと、 該微細孔チップのそれぞれの片面に固着して複数の微 細な流路群を形成する 2つの微小流体チップとを備えたことを特徴とす るオンチップバイオアツセィキット （請求項 1 4 ) や、 さらに微細孔チ ップの片面に固着して微細孔からの細胞の流出を防止する通気防水性の 封孔メンブランを備えたことを特徴とする請求項 1 4記載のオンチップ バイオアツセィキッ ト （請求項 1 5 ) や、 基板の微細孔の列毎及び/又 は行毎に温度制御機構が設けられていることを特徴とする請求項 1 4又 は 1 5記載のオンチップバイオアツセィキッ ト （請求項 1 6 ) や、 基板 が、 シリコン基板であることを特徴とする請求項 1 4〜 1 6のいずれか 記載のオンチップバイオアツセィキッ ト （請求項 1 7 ) や、 微小流体チ ップが、 ポリジメチルシロキサン製であることを特徴とする請求項 1 4 〜 1 7のいずれか記載のオンチップバイオアツセィキッ ト（請求項 1 8 ) や、 微細孔が、 3 0 0〜 9 0 0 m X 3 0 0〜 9 0 0 m角の貫通孔で あることを特徴とする請求項 1 4 ~ 1 8のいずれか記載のオンチップバ ィオアッセィキッ ト （請求項 1 9 ) や、 微小流体チップの流路の幅が、 微細孔の辺の長さと等しいことを特徴とする請求項 1 4〜 1 9のいずれ か記載のバイオアツセィキッ ト （請求項 2 0 ) や、 複数の微小流体チッ プの流路の間隔が、 その端部において拡がっていることを特徴とする請 求項 1 4〜 2 0のいずれか記載のオンチップバイオアツセィキッ ト （請 求項 2 1 ) に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、本発明のマイクロモザイク型のアツセィを示す写真である。 第 2図は、 本発明の微細孔チップ （A ) と微小流体チップ （B ) を示 す図である。
第 3図は、 本発明の変異原検出試験におけるオンチップバイオアツセ ィを示す写真である。
第 4図は、 本発明のオンチップバイオアツセィによる変異原検出試験 の結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のオンチップバイオアツセィ方法としては、 格子状に配列した 複数の微細孔が貫通された基板からなる微細孔チップの下面に、 細胞導 入用微小流体チップを固着して、 微細孔チップと細胞導入用微小流体チ ップ間に複数の微細な細胞導入用流路を形成し、 該流路を介して懸濁し た細胞を微細孔チップの微細孔に流し込み、 次いで、 微細孔チップの上 面に、 被検物質導入用微小流体チップを、 その複数の微細な被検物質導 入用流路が前記複数の微細な細胞導入用流路と交叉（好ましくは略直交） するように固着して、 微細孔チップと被検物質導入用微小流体チップ間 に複数の微細な被検物質導入用流路を形成し、 該流路を介して被検物質 を流し込み、 微細孔チップの微細孔内の細胞と接触させ、 所定時間後あ るいは所定の時間間隔で、 被検物質が細胞に及ぼす影響の程度をインサ イチユーに検出する方法であれば特に制限されるものではなく、 ここで 「インサイチューに検出する」 とは、 少なくとも微細孔チップと細胞導 入用微小流体チップと被検物質導入用微小流体チップから形成されてい るマイクロバイオアツセィチップをそのまま使用して検出することを意 味する。
上記微細孔チップとしては、 縦方向 m列 X横方向 n行 （mと nは同一 又は相異なっていてもよく、 mX nは 2以上） の格子状に配列した複数 の微細孔が貫通されたシリコン、 ガラス、 プラスチックなどの基板から なるものであればどのようなものでもよく、 かかる基板の大きさは特に 制限されないが、 3 0 0〜 1 0 0 0 mの厚さのものが通常用いられる。 また、 微細孔は微細孔の形状としては、 正方形、 長方形、 円形、 楕円形、 3角形など特に制限されないが、 中でも正方形や円形、 特に正方形が微 小流体チップに設けられた流路の幅方向と孔開口部とがー致させうる点 で好ましい。 また、 微細孔の大きさは一辺又は直径の長さが 1 0 0 0 m以下のものが好ましく、 例えば、 3 0 0〜 9 0 0 mX 3 0 0〜 9 0 0 /xm角の開口を有する微細孔を具体的に例示することができるが、 そ の下限は特に限定されるものでない。 微細孔ゃ微小流路の寸法が小さい 場合でも， 毛管現象で微小流路と微細孔に菌体の懸濁液や被験物質溶液 をいきわたらすことが可能であり、 毛管現象だけでいきわたらすことが 困難な場合には、 高圧ポンプで圧送したり、 真空ポンプで吸引すること も可能である。 また、基板に穿孔して微細孔を貫通させる方法も特に制限されないが、 例えば、 シリコン基板に穿孔する場合を以下説明する。 シリコン基板表 面の有機物等を除去した基板を熱酸化炉内に設置し、 窒素通気下で 1 0 0 o °c以上に加熱し、 炉内に水蒸気を導入してシリコン基板を酸化し、 その表面に S i 0 2膜を形成する。 次に、 その表面に S i 0 2膜を形成し たシリコン基板の両表面を H M D S等により親油性とした後、 フオ トレ ジス トをスピンコートし、 プリべークする。 プリべーク後のシリコン基 板と、 O H Pフィルムにレーザープリンタを用いてパターン出力したフ オ トマスクとを密着させ、 紫外線照射によりフォ トリソグラフィ一を実 施する。 続いて、 フッ化水素による S i 0 2膜のエッチングならびに K O Hによるシリコン基板の異方性エッチングを基板の両面から行い、 シリコン基板に穿孔して微細貫通孔を形成することができる。
かかる微細孔チップを構成する基板には、 微細孔の列毎及び/又は行 毎に温度制御機構を設けることが好ましい。 細胞の列毎又は行毎に温度 制御機構を設けることにより、 至適生育温度が異なる複数種の微生物等 の細胞を同時に使用することができ、 被検物質の列毎又は行毎に温度制 御機構を設けることにより、 被検物質の各種温度における影響を同時に 検出することができる。 かかる温度制御機構としては、 プリント配線基 板を用いて、 これをヒータ一とし、 バイオアツセィ用のチップに貼り合 わせることで、 チップ上の任意の場所を所定の温度に設定する制御機構 を例示することができ、 他方、 冷却についても、 ペルチェ素子を同様に 貼り合わせることで、 チップ上の任意の場所を所定の温度に設定する制 御機構を例示することができる。
本発明のオンチップバイオアツセィに使用しうる細胞としては、 微生 物細胞、 動物細胞、 植物細胞を例示することができ、 より具体的には、 大腸菌、 ス トレプトミセス、 枯草菌、 ス 卜レプトコッカス、 ス夕フイ ロ コッカス等の細菌原核細胞や、 酵母、 ァスペルギルス等の真核細胞や、 ドロソフイラ S 2、 スポドプテラ S f 9等の昆虫細胞や、 L細胞、 CH 〇細胞、 CO S細胞、 H e L a細胞、 C 1 2 7細胞、 BAL BZ c 3 T 3細胞 （ジヒドロ葉酸レダク夕一ゼゃチミ.ジンキナーゼなどを欠損した 変異株を含む）、 B HK 2 1細胞、 HEK 2 9 3細胞、 B owe sメラノ 一マ細胞、 卵母細胞、 T細胞等の動物細胞や植物細胞などを挙げること ができる。
細胞が大腸菌等の微生物細胞の場合、 微細孔チップと細胞導入用微小 流体チップ間に形成された複数の微細な細胞導入用流路を介して細胞懸 濁液を微細孔チップの微細孔に流し込むこともできるが、 温度の上昇又 は下降により固化するゲルに懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔に流 し込むことにより、 固定化微生物とすることができる。 かかるゲルとし ては、 寒天ゲル、 ァガロースゲル、 コラーゲンゲル、 アルギン酸カルシ ゥムゲル、 架橋デキス卜ランゲル、 合成高分子ゲル等を挙げることがで きる。 合成高分子ゲルを用いる場合は、 アクリルアミ ド、 ポリビニール アルコール等の合成高分子ゲルのモノマーに架橋剤や重合促進剤や重合 開始剤を併用することにより重合が促進し、ゲル化が生じることになる。 また、 細胞が動物細胞の場合、 コラーゲンゲルや支持体 (担体） に付着 させた動物細胞の懸濁液を用いることができる。
また、 被検物質が細胞に及ぼす影響の程度をインサイチューに検出す ることを容易ならしめるため、 細胞として形質転換細胞を用いることが できる。 かかる形質転換細胞として、 例えば、 被験物資との接触により 発現する候補遺伝子のプロモータ一の下流にレポ一タ一遺伝子が連結さ れた形質転換体を挙げることができ、 これら形質転換体は常法により作 製することができる。 レポーター遺伝子としては、 G F P (グリーン蛍 光タンパク質） 等の蛍光発光タンパク質をコードする D N Aや、 ホタル
0 ルシフェラーゼ、 バクテリアルシフェラーゼ等のルシフェラ一ゼ、 3— ガラク トシダーゼ等の酵素遺伝子などを具体的に挙げることができるが. これらの中でも GF P遺伝子等の蛍光性夕ンパク質をコードする DNA が検出 ·確認の容易さからして好ましい。 かかる GF Pには、 E GF P (Enhanced GFP), EYF P (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), E C F P (enhanced CYAN fluorescent protein) (青色）、 D s R e d (赤 色） 等の蛍光波長の異なる誘導体が存在し、 多重ラベルを行うこともで きる。 GF Pの利点は生細胞のままで簡単に解析できることであり、 そ のため経時的な観察が容易となる。
上記の懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔に流し込むに先だって、 微細孔チップの上面に通気防水性 （通気性かつ遮水性） の封孔メンブラ ンを貼着することにより、 微細孔からの細胞の流出を防止することがで きる。 かかる通気防水性の封孔メンブランを用いると、 微細孔チップと 細胞導入用微小流体チップ間に形成された複数の微細な細胞導入用流路 を介して細胞懸濁液を微細孔チップの微細孔に流し込んだ際、 通気性に より背圧がかからず、 防水性により細胞懸濁液が微細孔から漏出するこ ともない。 この通気防水性の封孔メンブランは、 微細孔チップと被検物 質導入用微小流体チップ間に形成される複数の微細な被検物質導入用流 路を介して被検物質を流し込む前には剥離されることになるが、 低融点 のァガロースゲルに懸濁した細胞を使用する場合など、 微細孔中の細胞 が固化される場合、 特に有用である。
細胞導入用微小流体チップは、 微細孔チップと協働して、 微細孔チッ プと細胞導入用微小流体チップ間に複数の微細な細胞導入用流路を形成 し、 該流路を介して懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔に流し込むた めに用いられる。 細胞導入用微小流体チップを微細孔チップの下面に固 着することにより形成される細胞導入用流路の幅は微細孔の辺の長さと 等しくすることが好ましく、 その長さは 1列又は 1行の複数の微細孔の すべてに細胞懸濁液をいきわたすことができる長さが好ましい。 各流路 に異なる種類の細胞懸濁液を流入することで、 配列した微細孔の各列毎 又は各行毎に異なる細胞を導入することが可能となる。 同一列又は同一 行にある微細孔内の細胞懸濁液や細胞封入ゲルは、 微細孔チップと細胞 導入用微小流体チップを固着した際に形成される微小流路を介して繋が つているが、 細胞導入用微小流体チップを剥離したり、 ゲル等を分断す る必要はなく、 細胞導入用微小流体チップと微細孔チップを固着したま まで分析を行うことができる。 また、 使用後のマイクロチップから細胞 を除去し、 微細孔チップと共に細胞導入用微小流体チップを再利用する ことも可能である。
被検物質導入用微小流体チップは、 微細孔チップと協働して、 微細孔 チップと被検物質導入用微小流体チップ間に複数の微細な被検物質導入 用流路を形成し、 該流路を介して被検物質を微細孔チップの微細孔内の 細胞と接触させるために用いられる。 被検物質導入用微小流体チップを 微細孔チップの上面に前記複数の微細な細胞導入用流路と略直交するよ うに固着することにより形成される被検物質導入用流路の幅は微細孔の 辺の長さと等しくすることが好ましく、 その長さは 1列又は 1行の複数 の微細孔のすべてに被検物質をいきわたすことができる長さが好ましい, 各流路に異なる種類の被検物質を流入することで、 配列した微細孔の各 列毎又は各行毎に異なる被検物質を導入することが可能となる。 同一列 又は同一行にある微細孔内の細胞と接触する被検物質は、 微細孔チップ と被検物質導入用微小流体チップを固着した際に形成される微小流路を 介して繋がっているが、 被検物質導入用微小流体チップを剥離する必要 はなく、 被検物質導入用微小流体チップと微細孔チップを固着したまま で分析を行うことができる。 また、 使用後のマイクロチップから被検物
2 質を除去し、 微細孔チップと共に被検物質導入用微小流体チップを再利 用することも可能である。 また、 被検物質としては、 各種の変異原性物 質、 環境ホルモン、 医薬候補物質、 重金属イオン、 神経伝達物質、 サイ トカイン、 ィンタ一ロイキンなどの化学物質の溶液や血清等の体液を例 示することができる。 なお、 被検物質と共に、 酵素基質等検出のための 反応物質を同時に流し込むこともできる。
これら細胞導入用微小流体チップと被検物質導入用微小流体チップは- 同一形状、 同一材料から作製された同一物を用いることが好ましく、 そ の材質としては微細孔チップを構成する基板に固定手段等により固着し うるものであれば特に制限されないが、 微細孔チップを構成する基板に 着脱自在に貼着しうるものが好ましい。 例えば、 シリコン基板の場合、 シリコンとの密着性が高いポリジメチルシロキサン （P D M S ) を特に 好適に例示することができる。 P D M Sを用いる場合、 前記の微細孔チ ップを構成する基板作製と同様な方法により片面のみ処理した P D M S 流路用铸型を作製し、 未重合の P D M Sと重合開始剤を P D M S流路用 铸型に流し込むことにより、 細胞導入用微小流体チップゃ被検物質導入 用微小流体チップを作製することができる。 P D M Sは、シリコンの他、 ガラス、 アクリルなどポリマー、 P D M S自身との密着性に優れている ことカゝら微小流体チップ素材として有利に用いることができる。
本発明のオンチップバイオアツセィ方法は、 微細孔チップと細胞導入 用微小流体チップと被検物質導入用微小流体チップを有し、 以上のよう にして組み立てたマイクロバイオアツセイチップに、 微細孔チップと細 胞導入用微小流体チップ間に形成された複数の微細な細胞導入用流路を 介して 1又は 2種以上の細胞の懸濁液を流入し、 次いで、 微細孔チップ と被検物質導入用微小流体チップ間に形成された複数の微細な被検物質 導入用流路を介して 1又は 2種以上の被検物質を流入して被検物質を細 胞と接触させ、 所定時間後あるいは所定の時間間隔で、 被検物質が細胞 に及ぼす影響の程度をインサイチューに検出する。 例えば、 それぞれの 微細孔の細胞から生じるシグナルを、空間分解能を有する C C Dカメラ、 フォトダイオードアレイ等のフォトダイオード類、 各種スキャナー、 写 真乾板などで検出することができる。 試料導入用微小流体チップを細胞 導入用微小流体チップと直交するように配置すると、 各微細孔ごとに細 胞と試料の組合せが異なる試験を同時に行うことが可能となり、 微細孔 の数に相当する試験結果を同時得ることができる。 また、 細胞導入用微 小流体テツプゃ試料導入用微小流体チップの流路デザィンを目的に応じ て変更することもできるが、複数の微小流体チップの流路同士の間隔を、 その端部において拡がるように構成すると、 送液用のチューブ類が接続 しゃすく、 細胞懸濁液ゃ被検物質の注入が容易になる。
次に、 本発明のオンチップバイオアツセィキッ トとしては、 懸濁した 細胞を流し込むための格子状に配列した複数の微細孔が貫通された基板 からなる微細孔チップと、 該微細孔チップのそれぞれの片面に固着して 複数の微細な流路群を形成する 2つの微小流体チップとを備えたもので あれば特に制限されず、 微細孔チップや微小流体チップは、 上述のもの を有利に使用することができる。
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明の技術 的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
本発明の具体的な実施例として、 変異原性試験用大腸菌を固定化し、 マイク口モザィク型のオンチップバイオアツセィを行った。 変異原性試 験用大腸菌は、 変異原物質によって発現誘導される S O S遺伝子の代わ りに生物発光を生じるホタルルシフェラーゼの遺伝子をプラスミ ド上に 組み込んだ大腸菌を用いた。 また、 マイクロモザイク型のアツセィとは
4 第 1図に示すように、 微小流体チップを用いて微細孔の縦の m列に試験 菌を、 横の η行に試料を導入することで、 mx ηの組み合わせの試験を 同時に行うことを可能とするアツセィとなる。 ここでは、 縦 5列 X横 5 行で試験を行った。 細胞固定化用の微細孔チップにはシリコン基板を、 大腸菌ならびに試料導入用の微小流体チップにはシリコンやガラスと密 着性の高い P D M Sを用いた。
微細孔チップの作製： 3. 0 X 3. 5 c m、 厚さ 6 2 5 mのシリコ ン基板を熱酸化炉内に設置し、その表面に厚さ 2 / mの S i 〇2膜を作製 した。 次に、 フォ トリソグラフィ一、 フッ化水素による S i 〇2膜のエツ チングならびに KOHによるシリコン基板の異方
性エッチングを基板の両面から行い、 シリコン基板に 7 0 0 m角の微 細貫通孔を縦 5列、 横 5行の計 2 5箇所あけた。 各貫通孔の間隔は 1. 5 mmとした （第 2図 A参照）。
実施例 2
微小流体チップの作製：シリコン基板を、上記と同様の操作で加工し、 铸型を作製した。 これに重合開始剤を添加した PDMS (ダウコーニン グ S YL GARD 1 8 4) を流し込み、 混入している空気を除去するた めに、ガラスデシケ一夕内で減圧脱気したのち、 4 Cで一時間静置した。 その後、 6 0 °Cで 4時間加熱重合し、 錶型からはがしとつてこれを微小 流体チップとした。 微小流体チップは幅 7 0 0 ^m、 深さ 2 0 0 imの 流路を 1. 5 mm間隔で 5本設けた。 また、 このチップは細胞導入用と 試料導入用の 2枚用意した （第 2図 B参照）。
変異原検出用細菌の導入と固定化 ： 1 0 0 / gZmLアンピシリンを 含む L B培地に一晩培養した変異原試験用大腸菌 KT 1 0 0 8 /p R S S Lを体積比で 1 Z 5 0加え、 3 7 °Cで波長 6 0 0 n mの吸光度がおよ そ 0. 4になるまで振とう培養した。 1 0， 0 0 0 r p mで 5分間遠心 分離し、 沈殿した菌体をトリス緩衝生理食塩水に懸濁した。 この懸濁液 と 3 . 0 % ( wZ v ) 低融点ァガロース （S i gma社製、 タイプ VI I ) を体 積比 1 ： 1で混合した。 微細孔チップの片面に微細孔と流路が重なるよ うに微小流体チップを張り合わせ、 ここにァガロースと混合した試験菌 を流し込んだ。 このとき、 微細孔チップのもう一方の面には試験菌が流 出しないようポリテトラフルォロエチレン製メンブランフィルター （ァ ドバンテック社製） を張り合わせた。 試験菌を導入したチップは 4 °Cで 1 0分間静置し、 ァガロースをゲル化させた。 メンブランフィルタ一を 剥離し、 これを試験菌固定化チップとした （第 3図上段参照）。 なおここ では、 再現性等の検討を行うため、 全ての流路に同じ試験菌を固定化し た。
オンチップバイオアツセィ ：試験菌固定化チップの、 微小流体チップ を張り合わせていない面に、 同様の微小流体チップを細胞導入時と直交 するように張り合わせた （第 3図下段参照）。 ここに、 変異原性物質とし てマイ トマイシン Cを流し込み、 発現誘導を行った。 発現誘導の最適条 件は 3 7 °C、 1時間であった。 次に、 発現されたホタルルシフェラーゼ を生物発光による検出を行うために、 ルシフェリンとアデノシン三リン 酸の混合溶液を導入し、 生じた発光を C C Dカメラ （浜松ホトニクス製 C— 4 8 0 0型） で撮影した （第 1図及び第 3図参照）。 5本の流路に、 それぞれ濃度の異なるマイ トマイシン Cを流し込んだ結果、 試験菌を固 定化した各微細孔からの発光を観察することができた。 また、 発光強度 はマイ トマイシン C濃度に依存し、 試験管を用いて培養液中で行った場 合と同様の濃度依存性が見られた。 さらに、 同じ濃度のマイ トマイシン Cを添加した同一行内にある各微細孔からの発光にばらつきがほとんど 見られず、 全ての微細孔に均一に試験菌が固定化されていることが確認 できた （第 4図参照）。 以上の結果から、 微細孔チップと微小流体チップを用いて作製された マイク口バイオアツセィチップを用いて変異原性物質のオンチップバイ オアッセィを行うことができた。 このマイクロバイオアツセィチップと オンチップバイオアツセィ方法を、 様々な細胞やタイプの異なるバイォ アツセィに応用することで、 簡便な試験をハイスループッ 卜に行うこと が可能となり、 バイオアツセィを必要とする様々な分野において有用性 が高いといえる。 産業上の利用可能性
本発明のマイク口バイオアツセィチップとオンチップバイオアツセィ 方法を、様々な細胞やタイプの異なるバイオアツセィに応用することで、 簡便な試験をハイスループッ トに行うことが可能となる。 このようなチ ップフォーマッ トのバイオアツセィシステムにより、 現在の D N Aァレ ィのようにメーカーが試験項目に応じた複数種の細胞を固定化したチッ プを提供し、 ユーザ一は培養などの前操作をなしで、 各種試験や検査を 行うことができる。 高感度な検出法と組み合わせれば細胞を高密度に集 積化 ·固定化したチップの開発や超小型化も可能であり、 医薬 ·生化学 · 環境など様々な分野での利用が可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 格子状に配列した複数の微細孔が貫通された基板からなる微細孔チ ップの下面に、 細胞導入用微小流体チップを固着して、 微細孔チップと 細胞導入用微小流体チップ間に複数の微細な細胞導入用流路を形成し、 該流路を介して懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔に流し込み、 次い で、 微細孔チップの上面に、 被検物質導入用微小流体チップを、 その複 数の微細な被検物質導入用流路が前記複数の微細な細胞導入用流路と交 叉するように固着して、 微細孔チップと被検物質導入用微小流体チップ 間に複数の微細な被検物質導入用流路を形成し、 該流路を介して被検物 質を流し込み、 微細孔チップの微細孔内の細胞と接触させ、 所定時間後 あるいは所定の時間間隔で、 被検物質が細胞に及ぼす影響の程度をィン サイチューに検出することを特徴とするオンチップバイオアッセィ方法,
2 . 懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔に流し込むに先だって、 微細 孔チップの上面に通気防水性の封孔メンブランを貼着して、 微細孔から の細胞の流出を防止することを特徵とする請求項 1記載のオンチップバ ィオアッセィ方法。
3 . 基板が、 シリコン基板であることを特徴とする請求項 1又は 2記載 のオンチップバイオアツセィ方法。
4 . 微小流体チップが、 ポリジメチルシロキサン製であることを特徴と する請求項 1〜 3のいずれか記載のオンチップバイオアツセィ方法。
5 . ゲルに懸濁した細胞を微細孔チップの微細孔に流し込み、 微細孔内 で細胞を固定化することを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載のォ ンチップバイオアツセィ方法。
6 . ゲルに懸濁した細胞として、 低融点のァガロースゲルに懸濁した細 胞を使用することを特徴とする請求項 5記載のオンチップバイオアツセ ィ方法。
7 . 細胞導入用微小流体チップと被検物質導入用微小流体チップとが同 一の微小流体チップであることを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか記 載のオンチップバイオアツセィ方法。
8 . 微細孔チップの微細孔の細胞列毎及び Z又は細胞列に直交する被検 物質列毎に温度制御することを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載 のオンチップバイオアツセィ方法。
9 . 使用後のマイクロチップから細胞を除去し、 チップを再利用するこ とを特徵とする請求項 1〜 8のいずれか記載のオンチップバイオアツセ ィ方法。
1 0 . 細胞として、 微生物細胞、 動物細胞、 植物細胞からなる群から選 ばれる 1種又は 2種以上を用いることを特徴とする請求項 1〜 9のいず れか記載のオンチップバイオアツセィ方法。
1 1 . 細胞として、 形質転換細胞を用いることを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか記載のオンチップバイオアツセィ方法。
1 2 . 2種以上の被検物質を用いることを特徴とする請求項 1〜 1 1の いずれか記載のオンチップバイオアツセィ方法。
1 3 . 被検物質が細胞に及ぼす影響の程度をインサイチューに検出する 手段が、 細胞から生じるシグナルを検出する、 空間分解能を有する C C Dカメラ、 フォトダイオードアレイ又は写真乾板であることを特徴とす る請求項 1〜 1 2のいずれか記載のオンチップバイオアツセィ方法。
1 4 . ァガロースなどのゲルに懸濁した細胞を流し込み固化するための 格子状に配列した複数の微細孔が貫通された基板からなる微細孔チップ と、 該微細孔チップのそれぞれの片面に固着して複数の微細な流路群を 形成する 2つの微小流体チップとを備えたことを特徴とするオンチップ バイオアツセィキッ ト。
1 5. さらに微細孔チップの片面に固着して微細孔からの細胞の流出を 防止する通気防水性の封孔メンブランを備えたことを特徴とする請求項 1 4記載のオンチップバイオアツセィキッ ト。
1 6. 基板の微細孔の列毎及び/又は行毎に温度制御機構が設けられて いることを特徴とする請求項 1 4又は 1 5記載のオンチップバイオアツ セィキッ 卜。
1 7. 基板が、 シリコン基板であることを特徴とする請求項 1 4〜 1 6 のいずれか記載のオンチップバイオアツセィキッ ト。
1 8. 微小流体チップが、 ポリジメチルシロキサン製であることを特徴 とする請求項 1 4〜 1 7のいずれか記載のオンチップバイオアツセィキ ッ 卜。
1 9. 微細孔が、 3 0 0〜 9 0 0 mX 3 0 0〜 9 0 0 xm角の貫通孔 であることを特徴とする請求項 1 4〜 1 8のいずれか記載のオンチップ バイオアツセィキッ ト。
2 0. 微小流体チップの流路の幅が、 微細孔の辺の長さと等しいことを 特徴とする請求項 1 4〜 1 9のいずれか記載のバイオアツセィキッ ト。
2 1. 複数の微小流体チップの流路の間隔が、 その端部において拡がつ ていることを特徴とする請求項 1 4〜 2 0のいずれか記載のオンチップ バイオアツセィキット。
PCT/JP2004/001128 2003-07-31 2004-02-04 オンチップバイオアッセイ方法及びキット WO2005012554A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002534305A CA2534305A1 (en) 2003-07-31 2004-02-04 On-chip bioassay method and kit
US10/566,861 US20060246416A1 (en) 2003-07-31 2004-02-04 On-chip bioassay method and kit

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003284208A JP2005046121A (ja) 2003-07-31 2003-07-31 オンチップバイオアッセイ方法及びキット
JP2003-284208 2003-07-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005012554A1 true WO2005012554A1 (ja) 2005-02-10

Family

ID=34113835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/001128 WO2005012554A1 (ja) 2003-07-31 2004-02-04 オンチップバイオアッセイ方法及びキット

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20060246416A1 (ja)
JP (1) JP2005046121A (ja)
CA (1) CA2534305A1 (ja)
WO (1) WO2005012554A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110207791A1 (en) * 2008-10-28 2011-08-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Composition of a 5-ht2a serotonin receptor modulator useful for the treatment of disorders related thereto
CN109655383A (zh) * 2017-10-11 2019-04-19 南京大学 一种基于血小板投影成像的检测装置及其方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070243573A1 (en) * 2006-02-14 2007-10-18 Kimio Sumaru Method and apparatus for immobilizing cells, and cell-immobilized substrate
US20080020368A1 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Mengsu Yang Method and apparatus for exposing cells to different concentrations of analytes or drugs
ATE553387T1 (de) 2006-10-19 2012-04-15 Sekisui Chemical Co Ltd Mikroanalyse-messvorrichtung und mikroanalyse- messverfahren unter verwendung davon
ITMI20072099A1 (it) 2007-10-30 2009-04-30 St Microelectronics Srl Metodo di fabbricazione di un dispositivo elettronico comprendente dispositivi mems incapsulati per stampaggio
ATE539348T1 (de) * 2009-08-13 2012-01-15 Hoffmann La Roche Testelement zur analyse einer körperflüssigkeit
JP5854686B2 (ja) * 2011-07-29 2016-02-09 亮平 神崎 匂いセンサ
CN106179543A (zh) * 2016-07-12 2016-12-07 重庆大学 一种基于焦糖倒模制作微流控芯片的方法及其应用
CN108620144A (zh) * 2018-07-10 2018-10-09 南京宝沃生物科技有限公司 一种用于wb实验中的微流体芯片
CN111334403A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 深圳先进技术研究院 基于微流控的微泡发生芯片及其制备方法和应用
JPWO2021045233A1 (ja) * 2019-09-06 2021-03-11

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999030154A2 (en) * 1997-12-12 1999-06-17 Abbott Laboratories Continuous format high throughput screening
WO2000061198A1 (en) * 1999-04-12 2000-10-19 Hitachi Chemical Co., Ltd. Method of producing probe arrays for biological materials using fine particles
JP2001343385A (ja) * 2000-06-02 2001-12-14 Teruhisa Shibahara プローブアレイ用固相基材、およびプローブアレイ
EP1271557A2 (en) * 2001-06-20 2003-01-02 Fuji Photo Film Co., Ltd. Stimulable phosphor sheet and method for manufacturing the same
JP2003107198A (ja) * 2001-09-28 2003-04-09 Fuji Photo Film Co Ltd 生化学解析システム

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999030154A2 (en) * 1997-12-12 1999-06-17 Abbott Laboratories Continuous format high throughput screening
WO2000061198A1 (en) * 1999-04-12 2000-10-19 Hitachi Chemical Co., Ltd. Method of producing probe arrays for biological materials using fine particles
JP2001343385A (ja) * 2000-06-02 2001-12-14 Teruhisa Shibahara プローブアレイ用固相基材、およびプローブアレイ
EP1271557A2 (en) * 2001-06-20 2003-01-02 Fuji Photo Film Co., Ltd. Stimulable phosphor sheet and method for manufacturing the same
JP2003107198A (ja) * 2001-09-28 2003-04-09 Fuji Photo Film Co Ltd 生化学解析システム

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAEBANA, H. ET AL.: "Daichokin Koteika Chip o Mochiita Hen'i Gensei Busshitsu no Bioassay", DAI 64 KAI BUNSEKI KAGAKU TORONKAI KOEN YOSHISHU, 10 May 2003 (2003-05-10), pages 16, XP002986810 *
MAEBANA, H. ET AL.: "Hen'i Gensei Busshitsu no On Chip Bioassay ni Okeru Kokandoka", DAI 52 KAI NIHON BUNSEKI KAGAKUKAI NENKAI KOEN YOSHISHU, 9 September 2003 (2003-09-09), pages 127, XP002986808 *
MAEBANA, H. ET AL.: "Luciferase Idenshi o Mochiita Hen'I Gensei Shiken no Kokandoka to On Chip Keisoku heno Oyo", CSJ: THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN HOKKAIDO SHIBU, 2003 NEN TOKI KENKYU HAPPYOKAI KOEN YOSHISHU, 31 January 2003 (2003-01-31), pages 52, XP002986809 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110207791A1 (en) * 2008-10-28 2011-08-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Composition of a 5-ht2a serotonin receptor modulator useful for the treatment of disorders related thereto
US9034911B2 (en) * 2008-10-28 2015-05-19 Arena Pharmaceuticals, Inc. Composition of a 5-HT2A serotonin receptor modulator useful for the treatment of disorders related thereto
CN109655383A (zh) * 2017-10-11 2019-04-19 南京大学 一种基于血小板投影成像的检测装置及其方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005046121A (ja) 2005-02-24
CA2534305A1 (en) 2005-02-10
US20060246416A1 (en) 2006-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6227059B2 (ja) ＳｌｉｐＣｈｉｐ装置および方法
JP7490610B2 (ja) 核酸分析および定量化のための方法ならびにシステム
TWI329741B (en) Integrated solid-phase hydrophilic matrix circuits,micro-arrays,and micro reactor devices with integrated fluidic i/o and the bioassay devices contain thereof
EP2548647B1 (en) Assay devices and methods for the detection of analytes
Najah et al. Teaching single-cell digital analysis using droplet-based microfluidics
US20040197905A1 (en) Methods and devices for monitoring cellular metabolism in microfluidic cell-retaining chambers
US20070017812A1 (en) Optimized Sample Injection Structures in Microfluidic Separations
US20060246573A1 (en) Bio-chip
CN102215966A (zh) 微流体多路细胞和分子分析装置和方法
WO2005012554A1 (ja) オンチップバイオアッセイ方法及びキット
Kim et al. Mini‐scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures
WO2005054431A9 (en) Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
Hamon et al. New tools and new biology: Recent miniaturized systems for molecular and cellular biology
CN104698064A (zh) 一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置及制备方法
EP1535064B1 (en) Monitoring of cells
US7510637B2 (en) Microelectronic arrays for cell-based functional genomics/high throughput phenotyping by electrokinetic assembly
US20090253194A1 (en) Dna analysis apparatus
Prado et al. Microbioreactors as engineering tools for bioprocess development
US20190374945A1 (en) Method for assaying biological sample on microfabricated chip
Fang Microfluidic chip
Kumar et al. Development and implementation of portable biosensors in microfluidic point-of-care devices for pathogen detection
Zhan et al. Enabling systems biology approaches through microfabricated systems
KR102475225B1 (ko) R2r 공정을 이용한 오가노이드 실시간 모니터링 장치 제조
Hsu et al. The portable fluorescence detection system matched with PDMS microfluidic biochip for DNA hybridization detection
EP2012126A1 (en) Porous biological assay substrate and method for producing such substrate

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2534305

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006246416

Country of ref document: US

Ref document number: 10566861

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase
WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10566861

Country of ref document: US